KR20150024574A - 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 OsMYB4P 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 OsMYB4P 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 코딩하는 유전자는 식물체의 인산 흡수 효율을 증진시키므로, 식물체에서 OsMYB4P 유전자의 발현 조절을 통해 인산 흡수율이 증진되고 인산 결핍 스트레스를 효과적으로 극복할 수 있는 식물체를 개발하는데 이용할 수 있다.

Description

식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 OsMYB4P 유전자 및 이의 용도 {OsMYB4P gene improving phosphate uptake efficiency in plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 OsMYB4P 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P), 상기 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 OsMYB4P 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMYB4P 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 인산 흡수 효율을 증가시키는 방법, 상기 OsMYB4P 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 야생형에 비해 인산 흡수 효율이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 인산 흡수 효율이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 벼 유래의 OsMYB4P 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 인산 흡수 효율 증진용 조성물에 관한 것이다.

인산은 식물이 필요로 하는 필수 영양소 중 하나로 에너지 전달, 신호 전달, 효소 활성 조절, 대사산물의 생합성, 광합성 및 호흡 등 식물 세포 내에서 일어나는 모든 물질대사 과정에서 중요한 기능을 수행한다. 인산은 또한 인지질 및 핵산의 중요한 구성 성분이기 때문에 질소와 함께 식물체가 가장 많이 필요로 하는 영양원소이다.

지구의 암석권에는 인산이 많이 존재하지만 대부분의 토양 내 인산은 주로 식물이 이용할 수 없는 유기물 또는 철이나 알루미늄과 같은 금속 이온과 결합한 형태로 존재하기 때문에, 실제 식물이 이용할 수 있는 유효 인산의 양은 토양 속에 극히 적은 양으로 존재하고 있다. 따라서, 인산은 작물의 생산성을 제한하는 인자로 작용한다. 이에 따라 식물체의 성장에 필요한 인산을 비료 형태로 공급하고 있으나, 공급된 대부분의 인산이 토양에 존재하는 유기물 또는 금속 이온과 결합하여 식물이 이용할 수 없는 형태로 고정화되며, 특히, 산성 토양의 경우 과다 축적된 알루미늄 이온으로 인해 더 활발한 인산 고정화가 일어나기 때문에 토양의 인산 유효성이 더욱 낮다.

이처럼 작물 생장에 필요한 토양의 유효 인산 농도를 증가시키기 위해 처리되는 비료는 농업 생산 비용을 증가시키는 원인이 된다. 뿐만 아니라 비료의 과다 사용으로 인해 미처 흡수되지 못한 비료는 토양에 집적되고 토양 산성화를 일으켜 작물의 생육에 악영향을 미치며, 지하수 오염 및 지표수의 부영양화를 초래한다. 농업 환경의 오염은 농산물 생산에 있어서 양적 및 질적 저하를 가져올 뿐만 아니라, 생활 환경도 오염시켜 국민 건강을 위협하므로 그 오염원의 제거는 매우 중요한 문제이다. 이러한 문제는 투입되는 화학 비료의 양을 줄임으로써 해결할 수 있다. 현재 화학 비료를 대체하기 위한 여러 가지 유기질 비료가 개발되어 사용되고 있으나, 아직 많은 문제점이 남아있다. 이러한 문제의 근본적인 해결 방안은 식물의 인산 흡수력을 향상시킴으로써 비료의 사용량을 줄이는 것이다. 따라서 인산 결핍 조건에서도 효율적으로 생장 가능한 작물의 개발이 요구되고 있다.

한편, 작물의 양분 이용 효율 개선을 위한 연구는 세계적으로 가장 중요한 식량 작물 중 하나인 벼를 대상으로 많이 수행되고 있으며, 벼의 전체 유전자 서열이 밝혀진 이후 유용 유전자를 확보하고 이를 선점하기 위해 많은 노력이 행해지고 있다. 식물의 무기양분 흡수와 관련된 연구는 재배학적 측면의 연구와 식물 생리학적 측면의 연구가 오래전부터 이루어져 왔으나, 최근에는 무기양분 흡수에 대한 분자 수준의 기초 연구를 토대로 무기양분 흡수와 관련한 유전자들을 이용하여 작물의 생육과 수량을 증가시키고, 극도로 양분이 제한된 조건에서도 생장이 가능한 작물을 육종하기 위한 연구들이 세계적으로 활발히 진행되고 있다.

인산이 결핍된 조건에서 식물은 뿌리의 생장과 뿌리털의 형성을 촉진하여 표면적을 넓히고, 고친화성 인산 운반체, 탈인산화효소 및 유기산의 생합성과 분비에 관련된 유전자들의 발현을 유도함으로써 인산 흡수 능력을 향상시키고, 인산 이용성을 증진시킨다. 본 발명은 인산 결핍 조건에서 발현되는 벼 유래의 R2R3-MYB 전사 조절 유전자 (OsMYB4P)의 기능을 분석하고, 상기 유전자를 이용하여 식물의 인산 흡수 효율을 증진시킴으로써 인산 결핍 조건에 적응할 수 있는 식물체를 개발하고자 한다.

한편, 한국등록특허 제0640284호에는 '인산 농도의 변화에 관계없이 벼의 모든 조직에서 항상 발현하는 고친화성 인산 운반체 유전자, 상기 유전자의 프로모터 및 상기 유전자를 이용하여 형질전환된 식물체의 생산 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0770203호에는 '담배 유래의 인산 수송자 유전자를 이용한 식물의 인산 흡수 증대 방법과 동 방법을 이용하여 인산 흡수율이 증대된 형질전환 식물체'가 개시되어 있다. 그러나, 본 발명에서와 같이 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 OsMYB4P 유전자 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 벼 식물체의 인산 흡수 효율이 증진되고, 인산 결핍 조건에서 식물체 내 인산 함량이 야생형에 비해 증가하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 OsMYB4P 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMYB4P 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 인산 흡수 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 OsMYB4P 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 이용한 야생형에 비해 인산 흡수 효율이 증진된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 인산 흡수 효율이 증진된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 벼 유래의 OsMYB4P 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 인산 흡수 효율 증진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 코딩하는 유전자는 식물체의 인산 흡수 효율을 증진시키므로, 식물체에서 OsMYB4P 유전자의 발현 조절을 통해, 인산 흡수율이 증진된 식물체를 개발하는데 이용할 수 있다. 또한, 인산 흡수 능력이 향상된 식물체는 인산 결핍 스트레스를 효과적으로 극복할 수 있으므로 비료 투입량 절감에 따른 농업 생산 비용 감소는 물론 환경 오염 방지에도 기여할 수 있을 것으로 예상된다.

도 1은 인산 결핍 조건에서 발현량이 증가하는 벼의 전사조절 유전자인 OsMYB4P 유전자의 염기서열을 나타낸다.
도 2는 인산 결핍 조건에서 발현량이 증가하는 벼의 전사조절 유전자인 OsMYB4P 유전자의 cDNA로부터 연역된 아미노산 서열을 나타낸다.
도 3은 벼 캘러스 배양세포를 이용하여 인산 결핍 조건에서 OsMYB4P 유전자의 발현 양상을 조사한 결과를 나타낸다. (A) 인산 결핍 시간에 따른 OsMYB4P 유전자의 발현 양상 (0, 0.5, 1, 2, 4 및 6 시간). (B) 질소, 인산, 칼륨 또는 철 결핍에 따른 OsMYB4P 유전자의 발현 양상.
도 4는 인산 결핍 조건에서 야생형 벼 OsMYB4P 유전자의 조직 특이적 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸다. (A) 줄기의 OsMYB4P 유전자 발현 양상. (B) 뿌리의 OsMYB4P 유전자 발현 양상.
도 5는 형질전환된 벼 식물체의 OsMYB4P 유전자 도입 여부, OsMYB4P 유전자 발현 양상 및 식물체 내 인산 함량을 측정한 결과를 나타낸다. (A) PCR 분석. (B) 노던 블럿. (C) 인산 함량 측정 결과.
도 6은 인산 충분 조건 및 결핍 조건에서 야생형 식물체와 OsMYB4P 과발현 형질전환체의 생육 특성을 확인한 결과를 나타낸다. (A) 야생형 및 OsMYB4P 과발현 형질전환체의 사진. (B) 줄기 길이 측정 결과. (C) 뿌리 길이 측정 결과. (D) 줄기의 인산 함량 측정 결과. (E) 뿌리의 인산 함량 측정 결과. 야생형 및 형질전환 식물체는 인산 충분 조건 및 결핍 조건에서 3주 동안 배양하였다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 제공한다.

본 발명에 따른 OsMYB4P 단백질의 범위는 벼 (Oryza sativa)로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 인산 흡수 효율 증진 활성을 의미한다. 본 발명은 또한 OsMYB4P 단백질의 단편, 유도체 및 유사체 (analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 "단편", "유도체" 및 "유사체"는 본 발명의 OsMYB4P 폴리펩티드와 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다.

또한, 본 발명은 상기 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 유전자는 식물의 인산 흡수 효율을 증진시키는 특징이 있으며, OsMYB4P 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열 (추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제 (즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 OsMYB4P 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 OsMYB4P 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소 (translation control element)를 가지는 것이다. 진핵세포에서 이용가능한 번역 조절 요소인 인핸서 (enhancer), 리보솜 결합 부위, 종결신호, 폴리아데닐레이션 신호 및 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 상기 발현 벡터는 당업계에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부의 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제 (NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 (phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인 (Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 유전자 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트 (glyphosate) 또는 포스피노트리신 (phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신 (Bleomycin), 하이그로마이신 (hygromycin), 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다. 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포의 예로는, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 재조합 벡터는 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 숙주세포 내로 운반될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)) 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 숙주세포 내로 벡터를 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMYB4P 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 인산 흡수 효율을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 OsMYB4P 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 식물세포에 형질전환시키는 경우에 숙주세포는 바람직하게는 벼과 (Poaceae) 식물세포일 수 있으며, 더 바람직하게는 벼 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같다.

또한, 본 발명은 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 인산 흡수 효율이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 OsMYB4P 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 인산 흡수 효율이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명에 이용되는 식물은 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수 수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있으며, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼과 (Poaceae) 식물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 벼 (Oryza sativa)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 인산 흡수 효율 증가용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 포함하며, 상기 유전자를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 인산 흡수 효율을 증가시킬 수 있는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 벼 유래 R2R3-MYB 전사조절 유전자 ( OsMYB4P )의 분리

본 발명에는 우리나라 재배 품종인 동진벼를 사용하였다. 동진벼의 잎에서 게놈 DNA를 분리하였고, 벼의 전체 유전체 염기서열을 토대로 벼 유래의 R2R3-MYB 전사조절 유전자 (OsMYB4P)에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 (정방향 프라이머 5'-CACCATGGGGAGACCTCCATGCTG-3' (서열번호 3) 및 역방향 프라이머 5'-TCAGAACATGATAGGGTCTGCACT-3' (서열번호 4))를 제작했으며, PCR 방법을 이용하여 유전자의 코딩 영역을 증폭하였다. 증폭된 산물은 pEntr 벡터에 클로닝한 후, 염기서열 분석을 통해 유전자의 염기서열을 확인하였다. 인산결핍 조건에서 발현되는 전사조절 유전자인 OsMYB4P는 기존에 밝혀지지 않은 새로운 유전자로 전체 993 bp의 염기서열을 가지고 있으며, 330개의 아미노산을 코딩한다. OsMYB4P 유전자의 cDNA 염기서열 및 아미노산 서열은 각각 도 1 및 2에 상세히 표기하였다. 이어서 본 발명에서 분리된 OsMYB4P 유전자, 이전에 밝혀진 벼 유래의 R2R3-MYB2P-1 전사조절 유전자 및 인산 결핍시 발현되는 벼 유래의 다른 MYB 유전자들 간의 상동성을 비교하였다. 그 결과, 이들 유전자들은 70%의 상동성을 갖는 것으로 나타났다 (데이터 미제시).

실시예 2. 인산 결핍 조건에서 벼 캘러스의 OsMYB4P 유전자 발현 양상

일반적으로 유사한 기능을 수행하는 유전자의 발현은 조직 특이적 또는 유도인자 특이적으로 조절되므로 분리된 전사조절 유전자의 발현 양상을 RNA 블럿 방법을 이용하여 조사하였다. 이때 전사조절 유전자 특이적인 염기서열을 가진 프라이머 (정방향: 5'-TGAAGCCATCACCAGCAACA-3' (서열번호 5) 및 역방향: 5'-GGTCTGCACAGCAGTATCCA-3' (서열번호 6))를 프로브로 사용하였다.

동진벼 종자에서 유도된 캘러스 세포는 R2 배지 (NaH₂PO₄·2H₂O, KNO₃, (NH₄)₂SO₄, MgSO₄·7H₂O, CaCl₂·2H₂O, Fe-EDTA, MnSO₄·H₂O, H₃Bo₃, NaMo₄·2H₂O, ZnSO₄·7H₂O, CuSO₄, 티아민 HCl, L-프롤린, 카제인 가수분해물, 수크로오스, 2.4-D; pH 5.8)에서 배양하였다. 인산이 충분한 배지 (1.25 mM NaH₂PO₄·2H₂O)에서 배양한 캘러스를 인산이 결핍된 배지 (0.0125 mM NaH₂PO₄·2H₂O)에 옮긴 후, 28℃의 온도에서 6시간 동안 암배양하였고, 결핍 처리 시간별 (0.5, 1, 2, 4 및 6 시간)로 캘러스 샘플을 수집하였다. 수집한 샘플은 Trizol 시약 (Invitrogen)을 이용하여 RNA를 분리하였다. 또한, 벼의 생육에 영향을 미치는 질소 (0.25 mM (NH₄)₂SO₄, KNO₃), 인산 (0.0125 mM NaH₂PO₄·2H₂O), 칼륨 (0.01mM KNO₃) 및 철 (0.01mM Fe-EDTA) 결핍 조건의 R2 배양 배지로 옮겨 OsMYB4P 유전자의 발현 정도를 확인하기 위해, 상기 성분이 결핍된 배지에서 캘러스를 인산결핍시 가장 강하게 발현한 2시간 동안 배양한 후, 각 샘플에서 RNA를 분리하여 영양결핍조건에서 유전자 발현을 확인하였다.

각각의 분리한 RNA 10 ㎍을 1.2% (W/V) 변성 (denaturing) 포름알데하이드 아가로스 겔에서 전기영동한 후, 나일론 막 (Amersham)에 RNA를 부착시켰다. RNA가 부착된 나일론 막은 [³²P] dCTP로 표지된 프로브와 함께 20% (W/V) SDS, 20×SSPE, 100 g/L PEG (8,000 mwt), 250 mg/L 헤파린 및 10 ml/L 청어 정자 (Herring sperm) DNA (10 mg/ml)를 포함하는 용액으로 65℃에서 밤새 반응시켜 혼성화하였다.

RNA 블럿을 수행하여 인산 결핍 처리 시간별로 OsMYB4P 유전자의 발현 양상을 측정한 결과, 인산 결핍 처리 초기 단계인 30분부터 OsMYB4P 유전자의 발현량이 급격히 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 3A). 또한, 질소, 칼륨 또는 철이 결핍된 경우보다 인산이 결핍된 경우에 OsMYB4P 유전자 발현이 현저하게 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (도 3B). 이러한 결과는 OsMYB4P 유전자가 인산 결핍 조건에서 유도된다는 것을 나타낸다.

실시예 3. 인산 결핍 조건에서 벼 식물체의 OsMYB4P 유전자 발현 양상

벼 캘러스의 OsMYB4P 유전자 발현 양상을 기초로 인산 결핍 조건에서 야생형 벼의 줄기 및 뿌리의 OsMYB4P 유전자 발현을 조사하였다. 야생형 동진벼는 2주간 증류수에서 수경재배한 후, 인산 결핍 조건 (0.02 mM KH₂PO₄)의 호글랜드 용액 (Hogland solution)[Ca(NO₃)₂·4H₂O, K₂SO₄, MgSO₄·7H₂O, KH₂PO₄, KCl, MnSO₄, H₃BO₃, ZnSO₄, CuSO₄, Na₂MoO₄, Fe-Sequestrate, K₂SO₄; pH 5.5]에서 28℃, 16시간 광 및 8시간 암주기로 7일 동안 배양하였다. 배양 시간별 (0, 1, 3, 5 및 7일)로 줄기 및 뿌리 샘플을 수집하였고, Trizol 시약 (Invitrogen)을 이용하여 RNA를 분리한 후 상기와 같은 방법으로 RNA 블럿을 수행하였다.

식물체 내에서 OsMYB4P 유전자의 조직 특이적인 발현 여부를 조사한 결과, 줄기는 배양 7일째에 높은 발현 양상을 나타냈고 (도 4A), 뿌리는 배양 초기부터 OsMYB4P 유전자의 발현양이 증가하기 시작하여 배양 7일째 가장 높게 발현되는 것으로 나타났다 (도 4B).

실시예 4. OsMYB4P 유전자 과발현 형질전환 식물체의 제작

벼에서 분리한 MYB 전사조절 유전자의 식물체 내에서의 기능을 조사하기 위해, 동진벼에 OsMYB4P 유전자를 형질전환하여 OsMYB4P 과발현 형질전환체를 만들었다. 벼의 형질전환체 생산 과정은 다음과 같다. OsMYB4P 유전자의 코딩 영역을 강한 항시성 프로모터인 CaMV 35S 프로모터에 의해 발현이 조절되는 데스티네이션 벡터 (destination vector; pH7WG2D,1)에 클로닝한 구축물을 제작했다. 클로닝된 구축물은 삼친교배 (triparental mating) 방법으로 아그로박테리움 튜머파시엔스 EHA105에 도입하였고, 상기 아그로박테리움 튜머파시엔스 EHA105를 이용하여 동진벼 캘러스를 형질전환하였다. 형질전환하여 얻은 T0 식물체에서 OsMYB4P 유전자의 도입 여부를 PCR로 확인하였고 (도 5A), RNA 블럿으로 유전자의 발현량을 측정하였다 (도 5B).

이어서 OsMYB4P 유전자의 도입 및 발현이 확인된 식물체 종자를 파종하여 2주간 증류수에서 수경재배한 후, 인산 결핍 조건 (0.02 mM KH₂PO₄)의 호글랜드 용액 (Hogland solution)[Ca(NO₃)₂·4H₂O, K₂SO₄, MgSO₄·7H₂O, KH₂PO₄, KCl, MnSO₄, H₃BO₃, ZnSO₄, CuSO₄, Na₂MoO₄, Fe-Sequestrate, K₂SO₄; pH 5.5]에서 28℃, 16시간 광 및 8시간 암주기로 7일 동안 배양하여 whole seeding에서 인산함량을 확인하였다. 인산 함량 분석 방법은 다음과 같다. 액체질소를 이용하여 식물체 조직을 분쇄하고, 분쇄한 샘플 1 mg 당 10 ㎕의 추출버퍼 (100 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.1 % 머캅토에탄올)를 넣은 후, 9배 부피의 1% 빙초산 (glacial acetic acid)을 첨가하여 42℃에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 13,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 상등액을 분리하였고, 분리한 샘플 60 ㎕를 140 ㎕의 혼합 용액 [0.35% (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O, 0.86 NH₂SO₄, 1.43% 아스코르브산]에 넣어 42℃에서 20분 동안 반응시켰다. 배양액의 인산 함량은 KH₂PO₄ 용액을 인산 표준 용액으로 이용하여 A₈₂₀에서 흡광도를 측정하여 확인했으며, 인산 함량 분석 결과를 통해 식물체 내 인산 함량이 높은 형질전환체를 최종 선발하였다 (도 5C).

실시예 5. OsMYB4P 유전자 과발현 형질전환 식물체의 생육 특성

최종 선발한 OsMYB4P 유전자 과발현 형질전환 식물체에서 수확한 종자 및 야생형 종자 (대조구)를 발아시켜 증류수에서 2주 동안 수경재배한 후, 인산 결핍 조건 (0.02 mM KH₂PO₄) 및 인산 충분 조건 (2 mM KH₂PO₄)의 호글랜드 용액 [Ca(NO₃)₂·4H₂O, K₂SO₄, MgSO₄·7H₂O, KH₂PO₄, KCl, MnSO₄, H₃BO₃, ZnSO₄, CuSO₄, Na₂MoO₄, Fe-Sequestrate, K₂SO₄; pH 5.5]에서 3주 동안 배양하면서, 형질전환체의 생육 상태를 야생형과 비교 조사하였다.

그 결과, 인산 결핍 및 충분 조건에서 야생형 식물체에 비해 OsMYB4P 유전자 과발현 형질전환체의 생육이 더 좋은 것을 확인할 수 있었다 (도 6A). 초장 및 근장을 측정한 정량적인 조사에서도 육안으로 관찰한 결과와 마찬가지로 야생형 식물체에 비해 형질전환체의 줄기 및 뿌리 생장이 더 좋은 것으로 나타났다. 특히, 뿌리의 경우에는 형질전환체에서 곁뿌리와 뿌리털의 수가 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 6B, C). 또한, 인산 결핍 조건에서 형질전환 식물체의 인산 함량이 야생형보다 유의하게 높은 것으로 나타났으며, 특히, 뿌리의 경우에는 인산 함량이 40% 이상 증가하는 것으로 확인되었다 (도 6D, E). 이와 같은 결과는 OsMYB4P 유전자의 과발현이 벼의 인산 흡수율과 식물체내 인산 함량을 증가시키는데 효과적이라는 것을 나타낸다. 또한, R2R3-MYB 전사조절 단백질에 의해 전사가 조절되는 모든 식물체에서 OsMYB4P 유전자의 과발현에 의한 인산 흡수 효율의 개선이 가능하다는 것을 제시한다.

<110> Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> OsMYB4P gene improving phosphate uptake efficiency in plant and uses thereof <130> PN13285 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 993 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggggagac ctccatgctg cgacaatggc gtcggcgtca agaaagggcc atggacgcca 60 gaggaggaca tcatcctcgt ctcctacatc cagcagcatg gccccgggaa ctggcgctcc 120 gtgcccgaga acaccggatt gatgaggtgc agcaagagct gcaggctgcg gtggacgaac 180 tacttgagac cggggatcaa gcgtggcaac ttcacccctc atgaggaggg gatcatcatc 240 cacctccagg cattgcttgg caacaagtgg gcagcaatag cctcctacct cccccaaaga 300 acagacaacg acatcaagaa ctactggaac acacacctca agaagaaggt gaagaggctg 360 caacaacaac aacaatcaca ccctgatcat catcaccacc attccttcca aaccacccct 420 tcttcctcca atgcagcagc agtagcaaca accagcccaa actactacaa ccctaacaac 480 agcaacagca acagcagcaa ttacctccat aacaacaacc acaatcttga atccatgcaa 540 tccatggcca ctgcacctag caatgaggcc accaccatcc ccaagctctt ccagttccag 600 acatggatga agccatcacc agcaacaaca tcatcagcag caacagctgc tgcaggtagc 660 tgctacaagc aggccatggc catgcaggag ctccaagagg agcaagaggg ctctgctgct 720 gctgctgcaa tggcttcttc cattgatggc gtctccaagg accaggatta tcacatgtgt 780 gctgtgatca gtggtgatga caagtcgtcg tcgtcggaga tgatgacggc tgcggcaatg 840 gccggccatg gcgaggcggc cacgacgacc ttctcgctgc tcgagaactg gctgctcgac 900 gacatgccgg ggcaggcggc catgagcgcc gccatggatg ggttcttgga gatctctgct 960 ggatactgct gtgcagaccc tatcatgttc tga 993 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Gly Arg Pro Pro Cys Cys Asp Asn Gly Val Gly Val Lys Lys Gly 1 5 10 15 Pro Trp Thr Pro Glu Glu Asp Ile Ile Leu Val Ser Tyr Ile Gln Gln 20 25 30 His Gly Pro Gly Asn Trp Arg Ser Val Pro Glu Asn Thr Gly Leu Met 35 40 45 Arg Cys Ser Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro 50 55 60 Gly Ile Lys Arg Gly Asn Phe Thr Pro His Glu Glu Gly Ile Ile Ile 65 70 75 80 His Leu Gln Ala Leu Leu Gly Asn Lys Trp Ala Ala Ile Ala Ser Tyr 85 90 95 Leu Pro Gln Arg Thr Asp Asn Asp Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His 100 105 110 Leu Lys Lys Lys Val Lys Arg Leu Gln Gln Gln Gln Gln Ser His Pro 115 120 125 Asp His His His His His Ser Phe Gln Thr Thr Pro Ser Ser Ser Asn 130 135 140 Ala Ala Ala Val Ala Thr Thr Ser Pro Asn Tyr Tyr Asn Pro Asn Asn 145 150 155 160 Ser Asn Ser Asn Ser Ser Asn Tyr Leu His Asn Asn Asn His Asn Leu 165 170 175 Glu Ser Met Gln Ser Met Ala Thr Ala Pro Ser Asn Glu Ala Thr Thr 180 185 190 Ile Pro Lys Leu Phe Gln Phe Gln Thr Trp Met Lys Pro Ser Pro Ala 195 200 205 Thr Thr Ser Ser Ala Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ser Cys Tyr Lys Gln 210 215 220 Ala Met Ala Met Gln Glu Leu Gln Glu Glu Gln Glu Gly Ser Ala Ala 225 230 235 240 Ala Ala Ala Met Ala Ser Ser Ile Asp Gly Val Ser Lys Asp Gln Asp 245 250 255 Tyr His Met Cys Ala Val Ile Ser Gly Asp Asp Lys Ser Ser Ser Ser 260 265 270 Glu Met Met Thr Ala Ala Ala Met Ala Gly His Gly Glu Ala Ala Thr 275 280 285 Thr Thr Phe Ser Leu Leu Glu Asn Trp Leu Leu Asp Asp Met Pro Gly 290 295 300 Gln Ala Ala Met Ser Ala Ala Met Asp Gly Phe Leu Glu Ile Ser Ala 305 310 315 320 Gly Tyr Cys Cys Ala Asp Pro Ile Met Phe 325 330 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 caccatgggg agacctccat gctg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 tcagaacatg atagggtctg cact 24 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 tgaagccatc accagcaaca 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ggtctgcaca gcagtatcca 20

Claims (13)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P).
2. 제1항의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 코딩하는 유전자.
3. 제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
5. 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
6. 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환시켜 OsMYB4P 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 식물체의 인산 흡수 효율을 증가시키는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 OsMYB4P 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물체의 인산 흡수 효율을 증가시키는 방법.
8. 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 야생형에 비해 인산 흡수 효율이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 OsMYB4P 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 인산 흡수 효율이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
10. 제8항의 방법에 의해 제조된 인산 흡수 효율이 증가된 형질전환 식물체.
11. 제10항에 있어서, 상기 식물체는 벼과 (Poaceae) 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
12. 제10항에 따른 형질전환 식물체의 종자.
13. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 벼 유래의 전사조절 단백질 OsMYB4P (Oryza sativa MYB4P)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 함유하는 식물체의 인산 흡수 효율 증가용 조성물.

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