CN101914521A

CN101914521A - 一种转化发根农杆菌的三亲杂交方法

Info

Publication number: CN101914521A
Application number: CN201010257935XA
Authority: CN
Inventors: 孔卫青; 杨金宏
Original assignee: Ankang University
Current assignee: Ankang University
Priority date: 2010-08-20
Filing date: 2010-08-20
Publication date: 2010-12-15
Anticipated expiration: 2030-08-20
Also published as: CN101914521B

Abstract

本发明公开了一种转化发根农杆菌的三亲杂交方法。其技术要点在于：供体菌、受体菌和辅助菌三类菌株中，供体菌和辅助菌菌株为营养缺陷型并带有抗性标记，受体菌为野生型发根农杆菌，以缺陷型培养基加相应抗生素作筛选标记进行三亲杂交，完成基因向野生型发根农杆菌的遗传转化。本方法操作简单，转化效率高，突破了野生型发根农杆菌没有染色体抗性标记不能应用三亲杂交转化的局限，改变了野生型发根农杆菌只能使用电转化或化学方法制备感受态细胞进行转化、操作复杂、转化效率低的局面，将大大加快发根农杆菌在植物转基因工程的应用。

Description

一种转化发根农杆菌的三亲杂交方法

技术领域

本发明涉及没有染色体抗性标记的野生型发根农杆菌的遗传转化，属于生物技术领域。

背景技术

随着基因工程技术的发展，农杆菌介导法在外源基因的遗传转化、作物品质的改良，以及培育抗病、抗虫、抗逆性较强的工程植物具有越来越广泛的应用。目前应用的有根癌农杆菌和发根农杆菌2种。根癌农杆菌因介导外源基因插入的完整性好，但Ti质粒的T-DNA上具有致病基因，外源基因表达易失活，基因的表达和植株再生不相容，且操作复杂，取材限制大，转化效率低，且必须要有成熟的再生系统，限制了它的广泛应用；而发根农杆菌对植物的侵染是自然界中天然的遗传转化模式。

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)侵染植物伤口进入细胞后，Ri质粒的TL-DNA上的rolA-D基因群和TR-DNA的tms基因能诱发被感染植物的受伤部位产生大量的毛状根，发根农杆菌也可以同时转化双元Ti质粒，将Ti质粒上的DNA整合进植物基因组，稳定地遗传给后代，实现植物的转基因。同时野生型发根农杆菌Ri质粒的T-DNA不影响植株的再生，而且转化效率高，因此在植物遗传转化中的应用越来越多，并已在甘草（Glycyrrhiza uralensis F.）、烟草（Nicotiana tabacum L.）、蓝猪耳（Torenia fournieri L.）、钝莨菪（Hyoscyamus muticus L.）等中获得成功。

将携带外源基因的双元载体质粒导入农杆菌是农杆菌介导法进行植物遗传转化的一项关键技术。化学法、电击转化法、三亲杂交法是根癌农杆菌研究中将双元质粒导入细菌中常用的方法。化学法操作简单，但重复性差，需要用到液氮等危险药品和冷冻离心机等贵重仪器，而且由于发根农杆菌菌体生长慢、植物基因工程所用双元表达载体较大，利用该方法制备的发根农杆菌感受态细胞往往不能取得满意的转化效率。电击转化法是利用外加电场造成菌的跨膜电势并形成细胞表面孔洞，从而摄取外源DNA。该方法转化效率高于化学法，但操作复杂，需要重复用超纯水洗涤，对菌液需求量大，而且要用到电转化仪、冷冻离心机等贵重仪器。三亲杂交法只需要在辅助菌的参与下就可以完成导入，是三种方法中效率最高的，但需要受体菌具有相对于供体菌和辅助菌特殊的筛选标记，由于野生型发根农杆菌没有染色体抗性标记而不能应用，因此很大程度上制约了发根农杆菌在植物转基因中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合于没有染色体抗性标记的野生型发根农杆菌的三亲杂交转化方法，加快野生型发根农杆菌在植物转基因工程中的应用。

首先对三亲杂交所需的供体菌、受体菌和辅助菌三类菌株进行分析，改变之前三亲杂交方法应用受体菌携带的不同于供体菌和辅助菌的染色体的抗性标记进行的正向选择的方法，根据供体菌和辅助菌菌株自身的基因和营养缺陷，以缺陷型培养基做筛选标记，进行三亲杂交完成基因向野生型发根农杆菌的遗传转化，并对菌株不同生长状态以及不同共培养时间下的转化效率和转化的假阳性率进行了调查。

本发明具体实现过程如下：

一种转化发根农杆菌的三亲杂交方法，其特征在于：供体菌、受体菌和辅助菌三类菌株中，供体菌和辅助菌菌株为营养缺陷型并带有抗性标记，受体菌为野生型发根农杆菌，以缺陷型培养基加相应抗生素作筛选标记进行三亲杂交，完成基因向野生型发根农杆菌的遗传转化。

所述供体菌为大肠杆菌DH5a(pCAMBIA2300-attacin)，辅助菌为大肠杆菌HB101(PRK2013)， DH5a和HB101的基因型为thi-1基因缺陷，即维生素B1的营养缺陷，其中所含质粒均带有Kan抗性。

所述缺陷型培养基为MM培养基。

所述受体菌为野生型发根农杆菌A4。

转化发根农杆菌的三亲杂交方法具体实施步骤如下：

（1）分别挑取供体菌DH5a(pCAMBIA2300-attacin)、辅助菌HB101(PRK2013)单菌落于含Kan抗生素的LB液体培养基中震荡培养，挑取野生型发根农杆菌A4于YEB液体培养基中震荡培养；

（2）取等量的三种菌液离心，收集菌体，YEB培养基重悬并混合，再次离心，重复洗涤，最后所得菌体用YEB培养基混匀；

（3）吸取混合液涂布在YEB平板上的无菌的微孔滤膜上，正置平板培养；

（4）取出滤膜，置入MM液体培养基中震荡混匀1 h，取50 μL菌液于含Kan抗生素的MM固体平板培养基上，培养获得单菌落；

（5）挑取单菌落MM液体培养基振荡培养，碱裂解法提取质粒；

（6）以提取的质粒DNA为模板，以rolB、rolC和attacin基因的引物进行PCR扩增，获得相应的扩增产物，证明 pCAMBIA2300-attacin成功转化至发根农杆菌A4；随机挑取的30个单菌落（约总数的1/6），均为阳性克隆。

上述步骤（2）和（3）中，三种菌分别培养至OD600≈0.6时取菌液，洗涤后共培养2~3 h获得最大的转化效率。

本发明的优点是：利用三亲杂交对无染色体抗性标记的野生型发根农杆菌进行遗传转化，解决了其他转化方法效率不高的缺陷，且对于化学、物理转化方法不明确菌株进行三亲杂交转化具有重要的参考价值。

附图说明

图1为转化获得单菌落提取质粒的PCR；

图2为单菌落假阳性率的rolB、rolC和attacin基因的PCR扩增。

具体实施方式

图1为转化获得单菌落提取质粒的PCR；其中M代表分子量标准，每条带的大小（bp）标于左侧，泳道1、3、5分别为rol B基因、 rol C基因和attacin基因以A4(pCAMBIA2300-attacin)菌株提取的质粒做模板进行的PCR；泳道2、4分别为rol B基因和rol C基因的以大肠杆菌菌株质粒提取的模板进行的PCR；泳道6分别为分别为attacin基因的A4(pCAMBIA2300-attacin)菌株的质粒模板和大肠杆菌菌株质粒模板的PCR检测；

图2为单菌落假阳性率的rolB、rolC和attacin基因的PCR扩增；其中A图为rol B基因PCR扩增；B图为rol C基因的PCR扩增；C图为attacin基因的PCR扩增；M代表分子量标准，每条带的大小（bp）标于左侧。

本发明转化发根农杆菌的三亲杂交方法具体实施步骤如下：

（1）分析各菌株的最小培养基和基因型：野生型发根农杆菌A4菌株的最小营养培养基为MM培养基，该培养基不含有维生素B1；大肠杆菌DH5a和HB101的基因型为thi-1基因缺陷，即维生素B1的营养缺陷，在不含有维生素B1的培养基上不能生长，分别以此菌株做供体菌和辅助菌；

（2）分别挑取含重组双元载体pCAMBIA2300-attacin的供体菌DH5a和含游动质粒PRK2013的辅助菌HB101的单菌落于10ml含50 mg/L Kan抗生素的LB液体培养基，同时挑取野生型发根农杆菌A4单菌落于10ml YEB培养基，26℃，160 r/min震荡培养至OD600≈0.6时进行三亲杂交，具体步骤为：取三种菌各2 mL，5000 r/min离心3 min，YEB培养基重悬并混合，再次5000 r/min离心3 min，收集菌体，并重复2次，所得菌体用150 μL YEB液体培养基混匀；

（3）吸取50 μL混合液涂布于无菌的0.45 mm微孔滤膜（直径2.5 cm）上，而后放置在不含抗生素的YEB平板上，26℃正置平板培养3 h。取出滤膜，置入3 mL MM液体培养基中，震荡混匀1 h后取50 μL涂布于含Kan抗生素的MM固体平板培养基上，28℃培养2~3 d，获得单菌落；

（4）挑取MM固体平板培养基上生长的单菌落于含Kan抗生素的MM液体培养基振荡培养2~3 d，碱裂解法提取质粒，并以提取的质粒DNA为模板，以野生型发根农杆菌A4自身的rolB、rolC基因和重组双元载体携带的attacin基因的引物进行PCR扩增，同时以DH5a(pCAMBIA2300-attacin)和HB101(PRK2013)的混合菌液、以及A4菌以同样方法提取的质粒为模板，三个基因的引物进行PCR扩增做阴性对照，鉴定遗传转化结果。

所用引物序列分别为：

rolBF: 5’-GCTCTTGCAGTGCTAGATTT-3’;

rolBR: 5’- GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3’;

rolCF: 5’-CTCCTGACATCAAACTCGTC-3’;

rolCR: 5’- TGCTTCGAGTTATGGGTACA-3’；

attacinF: 5’-TTAGAAGAATTTCGAGAAGGAG-3’;

attacinR: 5’-ATGTCCAAGAGTGTAGCGTTG-3’, 分别扩增423 bp、626 bp和655 bp的目的产物，PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳分析（见图1、图2）；

（5）在三种菌的OD₆₀₀约0.2、0.4、0.6、0.7、0.9、1.0时分别取样进行共培养，分别培养1 h、2 h、3h、4 h、5 h和12 h，在各种菌分别培养至对数生长期时进行共培养，共培养2~3 h具有获得203个转化子，转化效率最大；

（6）随机挑取MM固体平板培养基上单菌落30个（约总数的1/6），rolB、rolC和attacin基因的引物进行菌落PCR和1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，所有菌落均为阳性克隆。

综上所述，分析受体菌野生型发根农杆菌A4的最小营养培养基，为不含有维生素B1的MM培养基，分析大肠杆菌DH5a和HB101为thi-1基因缺陷，即维生素B1的营养缺陷，在不含有维生素B1的培养基上不能生长，分别使用含有重组双元载体pCAMBIA2300-attacin的DH5a和游动质粒PRK2013的HB101做野生型发根农杆菌三亲转化的供体菌和辅助菌；三种菌的单菌落分别在含相应抗生素的培养基中于26℃ 160 r/min进行震荡培养，培养至OD600≈0.6时按常规三亲杂交转化方法进行遗传转化，转化后混合液均匀涂布于含重组双元载体pCAMBIA2300-attacin的Kan抗生素的培养基平板进行筛选，获得转化有attacin基因的野生型发根农杆菌A4；该方法在各种菌分别培养至对数生长期时进行共培养，共培养2~3 h具有最大的转化效率，使用该方法获得的单菌落全为阳性菌落。

Claims

1.一种转化发根农杆菌的三亲杂交方法，其特征在于：供体菌、受体菌和辅助菌三类菌株中，供体菌和辅助菌菌株为营养缺陷型并带有抗性标记，受体菌为野生型发根农杆菌，以缺陷型培养基加相应抗生素作筛选标记进行三亲杂交，完成基因向野生型发根农杆菌的遗传转化。

2.根据权利要求1所述的转化发根农杆菌的三亲杂交方法，其特征在于：供体菌为大肠杆菌DH5a(pCAMBIA2300-attacin)，辅助菌为大肠杆菌HB101(PRK2013)， DH5a和HB101的基因型为thi-1基因缺陷，即维生素B1的营养缺陷，其中所含质粒均带有Kan抗性。

3.根据权利要求2所述的转化发根农杆菌的三亲杂交方法，其特征在于：缺陷型培养基为MM培养基。

4.根据权利要求2所述的转化发根农杆菌的三亲杂交方法，其特征在于：受体菌为野生型发根农杆菌A4。

5.根据权利要求1所述的转化发根农杆菌的三亲杂交方法，其特征在于包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的转化发根农杆菌的三亲杂交方法，其特征在于：步骤（2）和（3）中，三种菌分别培养至OD600≈0.6时取菌液，洗涤后共培养2~3 h获得最大的转化效率。