CN102051333A - 根癌农杆菌介导的甘油氧化酶高产菌株的转化及筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种日本曲霉菌株(Aspergillus japonicus)。该日本曲霉菌株甘油氧化酶产量比原始菌株提高50％。该菌株利用根癌农杆菌介导的转化方法获得。包括将适合丝状真菌转化的载体质粒通过三亲杂交的方法导入根癌农杆菌，将含有载体的根癌农杆菌和日本曲霉分生孢子混合培养，以潮霉素B作为选择压力筛选出日本曲霉的转化子。本方法操作简单，重复性好，转化率高，10⁶个孢子可以得到超过80个转化子。本方法为日本曲霉功能基因的研究，以及日本曲霉工程菌的分子育种奠定了基础。

Description

根癌农杆菌介导的甘油氧化酶高产菌株的转化及筛选方法

【技术领域】：本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高产甘油氧化酶的日本曲霉菌株以及根癌农杆菌介导的日本曲霉转化方法。

【背景技术】：曲霉属包括灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)群、白曲霉(Aspergillus candidus)群、黄曲霉(Aspergillus flavus)群、杂色曲霉(Aspergillus versicolor)群、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)群、棕曲霉(Aspergillus ochraceus)群、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)群、黑曲霉(Aspergillus niger)群等等。其中黑曲霉群中的很多种，如黑曲霉(Aspergillus niger)，臭曲霉(Aspergillus foetidus)，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)等都具有强大的酶系统，目前已经广泛应用于工业大规模生产各种生物酶制剂，包括淀粉酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、果胶酶、蛋白酶、单宁酶等。黑曲霉群的发酵工艺已经十分成熟。

实际人们对于这些酶还没有充分利用，所受到的主要限制之一就是，产生的某些酶酶活太低而没有实用价值。目前，很多研究者已经分别采取物理、化学诱变、原生质体融合以及分子生物学手段来对菌种进行改良，以期得到具有优良产量性状的菌株。

日本曲霉(Aspergillus japonicus)属于半知菌纲，从梗孢目，从梗孢科，曲霉属的黑曲霉群，分布十分广泛，可以在棕桐油、空气、土壤中分离得到。其菌落生长较快，10天直径就可达5-6厘米，绒状，紫褐色，反面幼时无色，后变为淡紫褐色。分生孢子头球形，老后散列成几个松柱状结构，分生孢子梗光滑，顶囊球形或稍长，小梗单层，分生孢子球形或近球形，有明显的小刺。有些菌系产生白色或奶油色的球形菌核，是黑曲霉群中单层小梗的代表类型。

目前发现日本曲霉可以产生甘油氧化酶GLOX，并且日本曲霉产生甘油氧化酶的活力最高，虽然青霉中也可以产生GLOX，但是产生的GLOX结合在菌丝体细胞的表面，难于分离，且很不稳定，不适合生产的需要。所以日本曲霉有作为工程菌株生产甘油氧化酶的潜力，但日本曲霉的基因组序列尚未测通，其中与甘油氧化酶代谢相关的基因目前也还未知，并且甘油氧化酶的产量也相对较低，所以需要建立一套有效的遗传转化体系，这样不仅可以为日本曲霉功能基因的分子生物学研究提供前提，也可以为日本曲霉优良性状菌株的育种提供手段，同时也为曲霉属其他的种提供分子生物学研究方法。

根癌农杆菌介导法首先应用于植物的遗传转化，并由Bundock首先应用于酿酒酵母的遗传转化，之后在丝状真菌中得到了广泛的应用，为丝状真菌的研究奠定了基础。但目前对于日本曲霉还没有根癌农杆菌介导的遗传转化体系的报道。

【发明内容】：本发明目的在于提供一种高产甘油氧化酶的日本曲霉菌株。本发明的另一目的是克服现有技术存在的上述不足，提供一种根癌农杆菌介导的日本曲霉的转化方法及甘油氧化酶高产菌株的筛选。

本发明提供的日本曲霉菌株(Aspergillus japonicus)Ajyz0079，属于真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，半知菌纲(Sphaeropsidales)，从梗孢目(Moniliales)，从梗孢科(Moniliaceae)，曲霉属(Aspergillus)。其菌落生长较快，10天直径就可以达到5-6厘米，绒状，紫褐色，反面幼时无色后变为淡紫褐色。分生孢子头球形，老后散列成几个松柱状结构，分生孢子梗光滑，顶囊球形活稍长，小梗单层，分生孢子球形或近球形，有明显的小刺。

本发明提供的根癌农杆菌介导的甘油氧化酶高产菌株的转化及筛选方法，包括以下步骤：

第一、将载体质粒通过三亲杂交的方法导入根癌农杆菌，其中所述的载体质粒为pBI-hphII，含有构巢曲霉启动子PtrpC和相应的终止子TtrpC，在启动子的下游含有潮霉素B抗性基因；

第二、将上步得到的含有载体质粒的根癌农杆菌和日本曲霉混合培养于含有诱导剂乙酰丁香酮的IM固体培养基上的微孔滤膜上，培养3天后，转移到含有潮霉素B和头孢霉素的察氏培养基中30℃培养得到潜在的转化子；

第三、将第二步得到的潜在的转化子在不含抗生素的培养基上传代后，再于含有潮霉素B和头孢霉素的培养基中培养，得到抗性遗传稳定的转化子。

第四、提取第三步得到的转化子的基因组，以潮霉素B抗性基因的特异性引物检测转化子的阳性，并以该抗性基因作为探针检测抗性基因的插入拷贝数。

其中，第二步所述的日本曲霉为分生孢子；分生孢子的浓度为10⁴、10⁵、10⁶、10⁷或10⁸个/mL。

第二步和第三步中所述的潮霉素B的浓度为10μg/mL～60μg/mL，头孢霉素浓度为200μg/mL。

采用本发明方法转化得到甘油氧化酶产量提高的转化子，并从中得到了一株甘油氧化酶产量比原始菌株提高50％的菌株，命名为Ajyz0079。

本发明方法的优点和积极效果：

(1)本发明建立了日本曲霉的一种遗传转化方法；

(2)这种转化方法操作简单，重复性好。

(3)所用的材料简单，只需要日本曲霉的分生孢子即可。

(4)方便的得到日本曲霉转化子，为日本曲霉功能基因的分子生物学研究和优良性状菌株的育种奠定了基础。

【具体实施方式】：

实施例1：

本发明实施例中涉及的培养基及试剂等分别为：

培养基：

土豆培养基：20％土豆，2％葡萄糖，0.3％KH₂PO₄，0.15％MgSO₄·7H₂O，PH自然。

LB培养基：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％NaCL，PH＝7.2-7.4。

YEB培养基：0.5％蛋白胨，0.1％酵母粉，0.05％MgSO₄·7H₂O，0.5％蔗糖，PH＝7.2。

察氏培养基：0.3％NaNO₃，0.05％KCL，0.1％K₂HPO₄，0.001％FeSO₄，0.05％MgSO₄·7H₂O，3％蔗糖，PH＝7.2-7.4。

20×AB Buffer：6％K₂HPO₄，2％NaH₂PO₄，PH＝7.0。

20×AB Salt：2％NH₄CL，0.6％MgSO₄·7H₂O，0.3％KCL，0.02％CaCL₂，0.002FeSO₄，PH＝7.0。

MM培养基：5％20×AB Buffer，5％20×AB Salt，0.5％葡萄糖。

IM培养基：2mmol/LNa₃PO₄，50mmol/L MES，5％20×AB Salt，0.5％葡萄糖，PH＝5.8。

发酵培养基：甘油4％，蛋白胨1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，KH₂PO₄ 1g/L，玉米浆2g/L，酵母膏3g/L。

试剂：

硼砂碳酸钠缓冲液：硼砂10.36g/L，Na₂CO₃ 4.38g/L，EDTA 1.46g/L。

甘油氧化酶检测体系：0.1mol/L甘油167μL，0.3mol/L PBS缓冲液(pH7.0)167μL，2.4mol/L 4-氨基安替比林167μL，42mmol/L苯酚167μL，过氧化物酶(比活大于250)33μL，去离子水267μL。

步骤1：日本曲霉野生型菌株对潮霉素B的敏感性测定：

挑取日本曲霉野生型菌株的孢子，接种于含有不同浓度潮霉素B(0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100μg/mL)的察氏培养基中，于30℃培养2天，测定日本曲霉对于潮霉素B的敏感度。当浓度达到60μg/mL时，菌体生长被完全抑制，说明未转化的日本曲霉不会在筛选平板上生长。

步骤2：三亲杂交法构建侵染性农杆菌：

将含有质粒pBI-hphII的大肠杆菌DH5α和helper接种到LB(含有卡那霉素50μg/mL)培养基中，180rpm37℃过夜培养，将农杆菌接种到YEB(含有利福平50μg/mL)培养基中，180rpm、30℃过夜培养；各取100μL的过夜培养物混合均匀后，涂布于固体YEB培养基中，培养24h；用YEB培养液冲洗平板，接种于YEB(含有利福平50μg/mL，含有卡那霉素50μg/mL)固体培养基中培养24h；用接种针划取薄的地方接入液体YEB(含有利福平50μg/mL，含有卡那霉素50μg/mL)中培养24h；用接种针蘸取培养物在YEB(含有利福平50μg/mL，含有卡那霉素50μg/mL)固体培养中，得到含有质粒pBI-hphII的农杆菌。

步骤3：日本曲霉的遗传转化：

将步骤2得到的含有质粒pBI-hphII的农杆菌接种到MM(含有利福平50μg/mL，含有卡那霉素50μg/mL)培养基中，180rpm、30℃培养48h；将培养物按1∶10的比例接种到IM(含有乙酰丁香酮200μmol/L)培养基中，180rpm、30℃培养24h-36h，使得培养物达到不同的OD₆₀₀值0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2。

将日本曲霉分生孢子配制成1×10⁵，1×10⁶，1×10⁷，1×10⁸个/mL四种浓度的悬浮液，取孢子悬浮液和步骤2构建的侵染性农杆菌各100μL混合涂布于铺在IM(含有乙酰丁香酮200μmol/L)固体培养基上的微孔滤膜上，于不同的温度20，24，28℃共培养不同的时间1，2，3，4，5，6天。

将微孔滤膜转移到察氏(含有头孢霉素200μg/mL，潮霉素B60μg/mL)固体培养基上，30℃培养，直到培养基上长出转化子，挑取单菌落到察氏(含有头孢霉素200μg/mL，潮霉素B60μg/mL)固体培养基上进行复筛，继续生长的菌落保存为菌种。

步骤4：转化子的阳性检测：

根据质粒当中的潮霉素抗性基因序列设计引物hph1(5’-ATGCCTGAACTCACCGCGAC-3’)和hph2(5’-CTATTCCTTTGCCCTCGGAC-3’)，随机挑取8个转化子提取基因组作为模板进行PCR检测，PCR体系为：基因组DNA溶解液1μL，10×PCR缓冲液(含20mmol/L MgCl₂)2.5μL，dNTP(10mmol/L)2μL，hph1(10μmol/L)1μL，hph2(10μmol/L)1μL，Taqase(2U/μL)1μL，H₂O16.5μL。PCR反应程序为：94℃5min后，进入PCR循环，每个循环94℃1min，53℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃10min。PCR产物进行电泳检测，结果发现阳性率为100％。

步骤5：潮霉素抗性基因插入拷贝数的检测：

以pBI-hphII为模板，以引物hph1和hph2进行PCR扩增，利用所得PCR产物合成地高辛探针。随机挑取8个转化子，提取基因组之后取15μg总DNA，以HindIII单酶切，以潮霉素B抗性基因PCR产物为阳性对照，以未转基因菌株的总DNA的单酶切产物为阴性对照，进行1％琼脂糖凝胶电泳，转移到尼龙膜上进行southern杂交，结果发现9株转化株中，单拷贝插入率为33.3％，双拷贝插入率为55.6％，三拷贝插入率为11.1％。

步骤6：转化子抗性稳定性的检测：

随机挑取9个转化子，在不含有任何抗生素的土豆培养基中传代培养10次之后，挑取单菌落重新接种到察氏(含有头孢霉素200μg/mL，潮霉素B60μg/mL)固体培养基上，检测抗性的遗传稳定性。遗传稳定性％＝抗性稳定的菌株数/待测菌株数。结果发现抗性稳定率为100％。

步骤7：转化子的甘油氧化酶产量性状的检测：

将得到的遗传稳定的转化子，按孢子浓度10⁴个/mL接种到100mL发酵培养中，30℃、180rpm培养2天，收获的菌体液氮研磨之后溶解于20mL硼砂碳酸钠缓冲液，5000rpm离心5分钟取上清液得到甘油氧化酶提取液，取33μL提取液加入甘油氧化酶检测体系中，于37℃反应一分钟，测得OD₅₀₀值，根据公式：酶产量＝227.2×OD₅₀₀计算得到酶产量。利用同样的方法检测原始菌株的酶产量，通过比较，得到一株比原始菌株甘油氧化酶酶产量提高50％的菌株，命名为Ajyz0079。

表1日本曲霉转化子中部分甘油氧化酶产量正突变株的酶产量指标

Claims (7)

1.一种日本曲霉菌株(Aspergillus japonicus)Ajyz0079，属于真菌界(Fungi)，子囊菌门(Ascomycota)，半知菌纲(Sphaeropsidales)，从梗孢目(Moniliales)，从梗孢科(Moniliaceae)，曲霉属(Aspergillus)；其菌落生长较快，10天直径就能够达到5-6厘米，绒状，紫褐色，反面幼时无色后变为淡紫褐色；分生孢子头球形，老后散列成几个松柱状结构，分生孢子梗光滑，顶囊球形或稍长，小梗单层，分生孢子球形或近球形，有明显的小刺。

2.一种根癌农杆菌介导的甘油氧化酶高产菌株的转化及筛选方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

第一、将载体质粒通过三亲杂交的方法导入根癌农杆菌，其中所述的载体质粒含有构巢曲霉启动子PtrpC和相应的终止子TtrpC，在启动子的下游含有潮霉素B抗性基因；

第二、将上步得到的含有载体质粒的根癌农杆菌和日本曲霉混合培养后，转移到含有潮霉素B的培养基中，30℃培养得到潜在的转化子；

第三、将第二步得到的潜在的转化子在不含抗生素的培养基上传代后，再于含有潮霉素B的培养基中培养，得到潮霉素抗性遗传稳定的转化子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于第二步所述的日本曲霉为分生孢子。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述的分生孢子的浓度为10⁴、10⁵、10⁶、10⁷或10⁸个/mL。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的潮霉素B的浓度为10μg/mL～60μg/mL。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于通过该转化方法得到甘油氧化酶产量提高的转化子。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于从获得的转化子中得到了一株甘油氧化酶产量比原始菌株提高50％的菌株，命名为Ajyz0079。