CN109336956A

CN109336956A - 功能蛋白pox01907及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN109336956A
Application number: CN201811219702.3A
Authority: CN
Inventors: 冯家勋; 赵帅; 张美远
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2038-10-19
Also published as: CN109336956B

Abstract

本发明公开了功能蛋白POX01907及其编码基因与应用。本发明公开的功能蛋白POX01907为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明POX01907在调控淀粉酶基因和或生淀粉酶基因的表达调控中起关键作用，在提高生淀粉酶产量中具有应用潜力。

Description

功能蛋白POX01907及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，功能蛋白POX01907及其编码基因与应用。

背景技术

自然界中，植物可通过光合作用大量产生淀粉，淀粉是一种仅次于纤维素的重要碳水化合物。淀粉由葡萄糖残基通过α-1,4-糖苷键或α-1,6-糖苷键聚合成的大分子聚合物，分为支链淀粉和直链淀粉。收获物富含淀粉的作物很多，例如水稻、玉米和木薯等。淀粉工业是重要的农产品加工产业，对扩大就业、改善民生和服务三农等方面发挥了重要作用。淀粉工业中，需要使用大量淀粉酶，主要包括α-淀粉酶(α-amylase,EC 3.2.1.1)、糖化酶(glucoamylase,EC 3.2.1.3)和α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,EC 3.2.1.20)。淀粉酶用途广，需求量大，占全球酶制剂交易市场的25-33％。

生淀粉酶(raw starch-digesting amylase，RSDA)能在淀粉糊化温度以下的温度直接水解生淀粉，生淀粉是指直接来源于植物，未经过任何处理的淀粉。生淀粉酶主要包括α-生淀粉酶(raw starch-digestingα-amylase)、β-生淀粉酶(raw starch-digestingβ-amylase)和生淀粉糖化酶(raw starch-digesting glucoamylase，RSDG)，具有巨大的应用前景。其中，RSDG可直接降解生淀粉产生葡萄糖。目前RSDG主要来源于丝状真菌，例如黑曲霉(Aspergillus niger)、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、根霉(Rhizopus)等。但是，天然丝状真菌产生的RSDA包括RSDG的量很低，远远不能满足工业需求。基于真菌RSDA基因表达调控网络构建遗传工程菌以提高生淀粉酶产量是有效的途径。

在丝状真菌中，淀粉酶基因包括RSDA基因的表达在转录水平上受到严格的控制。但是，真菌中对RSDA基因，尤其是RSDG基因的表达调控机制的报道很少。因此，鉴定丝状真菌中更多新的调控RSDA基因表达的转录因子是必要的，具有潜在的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控微生物产生淀粉酶或生淀粉酶的量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种来源于草酸青霉(Penicilliumoxalicum)菌株HP7-1的蛋白质，其名称为POX01907，POX01907为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A2)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的POX01907蛋白质，为与序列1所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的POX01907蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的POX01907蛋白质的编码基因可通过将序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示标签的编码序列得到。其中，序列2所示的DNA分子编码序列1所示的POX01907蛋白质。

本发明还提供了与POX01907相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码POX01907的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因细胞系；

B6)降低权利要求1中所述蛋白质表达量的核酸分子；

B7)含有B6)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b13)序列表中序列3的DNA分子；

b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码POX01907的cDNA分子或DNA分子；

b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码POX01907的cDNA分子或DNA分子；

B6)所述核酸分子可为如下b61)或b62)或b63)或b64)：

B61)含有序列表中序列4的第1-2179位和/或第4608-6180位的DNA分子；

B62)序列表中序列4所示的DNA分子；

B63)与b61)或b62)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的DNA分子；

B64)在严格条件下与b61)或b62)或b63)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码POX01907蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的POX01907蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码POX01907蛋白质且具有POX01907蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相同性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸编码序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述生物材料中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述生物材料中，B2)所述的含有编码POX01907蛋白质的核酸分子的表达盒(POX01907基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达POX01907蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动POX01907基因转录的启动子，还可包括终止POX01907基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。

可用现有的表达载体构建含有所述POX01907基因表达盒的重组载体。

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为真菌、酵母、细菌或藻。所述真菌可为丝状真菌。所述丝状真菌可为青霉。所述青霉可为草酸青霉(Penicillium oxalicum)。所述草酸青霉具体可为草酸青霉菌株HP7-1或敲除草酸青霉菌株HP7-1中Ku70基因得到的重组菌株ΔPoxKu70。

上述生物材料中，所述转基因细胞系不包括繁殖材料。

本发明还提供了POX01907蛋白质或所述生物材料的应用，所述应用为如下(b1)-(b6)中的至少一种：(b1)调控微生物淀粉酶产量；(b2)调控微生物生淀粉酶产量；(b3)调控微生物淀粉酶相关基因的表达量；(b4)调控微生物α-淀粉酶基因的表达量；(b5)调控微生物糖化酶基因的表达量；(b6)调控微生物生淀粉糖化酶基因的表达量。

上述应用中，所述调控可为正向调控。

所述淀粉酶相关基因具体可为POX01356基因,POX02412基因和/或POX09352基因。所述α-淀粉酶基因具体可为POX09352基因。所述糖化酶基因具体可为POX01356基因和/或POX02412基因。所述生淀粉糖化酶基因具体可为POX01356基因。

上述应用中，所述微生物可为真菌、酵母、细菌或藻。所述真菌可为丝状真菌。所述丝状真菌可为青霉。所述青霉可为草酸青霉(Penicillium oxalicum)。所述草酸青霉具体可为草酸青霉菌株HP7-1或敲除草酸青霉菌株HP7-1中Ku70基因得到的重组菌株ΔPoxKu70。

本发明还提供了一种抑制微生物生产淀粉酶能力的方法，所述方法包括：抑制出发微生物中POX01907蛋白质的编码基因的表达，或降低所述出发微生物中POX01907蛋白质的含量，或抑制所述出发微生物中POX01907蛋白质的活性，得到目的微生物，与所述出发微生物相比，所述目的微生物的生产淀粉酶的能力下降。

本发明还提供了一种制备重组微生物的方法，所述方法包括：抑制出发微生物中POX01907蛋白质的编码基因的表达，或降低所述出发微生物中POX01907蛋白质的含量，或抑制所述出发微生物中POX01907蛋白质的活性，得到重组微生物。

上文中，所述淀粉酶可为生淀粉酶。

所述淀粉酶具体可为分泌到细胞外的淀粉酶。

所述抑制出发微生物中POX01907的编码基因的表达可通过向所述出发微生物中导入降低POX01907蛋白质表达量的核酸分子实现。

所述微生物可为真菌、酵母、细菌或藻。所述真菌可为丝状真菌。所述丝状真菌可为青霉。所述青霉可为草酸青霉(Penicillium oxalicum)。所述草酸青霉具体可为草酸青霉菌株HP7-1或敲除草酸青霉菌株HP7-1中Ku70基因得到的重组菌株ΔPoxKu70。

所述编码基因可为上文B1)所述核酸分子。

降低POX01907蛋白质表达量的核酸分子可为上文B6)所述核酸分子。

采用所述制备重组微生物的方法制备得到的重组微生物，也属于本发明的保护范围。

在本发明的一个实施例中，所述重组微生物为敲除ΔPoxKu70中POX01907蛋白质的编码基因得到的突变株ΔPOX01907。突变株ΔPOX01907具有如下特点：

(1)在可溶性淀粉诱导培养条件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX01907前期生长稍慢，后期变快。

(2)在可溶性淀粉诱导培养条件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX01907的生淀粉酶活力显著降低。

(3)在可溶性淀粉诱导培养条件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX01907中关键淀粉酶基因的转录水平显著下降或升高。

(4)在可溶性淀粉诱导培养条件下，和背景菌株ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX01907中关键生淀粉酶基因的转录水平显著下降或升高。

本发明提供了一种草酸青霉的功能蛋白POX01907，通过实验证明POX01907在调控淀粉酶基因和/或生淀粉酶基因的表达调控中起关键作用，敲除POX01907基因后，微生物细胞的淀粉酶或生淀粉酶产量显著下降，所得到的微生物可以作为模型用于筛选提高淀粉酶产量的物质，在提高生淀粉酶产量中具有应用潜力。

附图说明

图1为构建草酸青霉POX01907基因敲除盒的PCR产物电泳图。M为1kb DNA分子量标准。

图2为草酸青霉POX01907基因敲除盒的元件示意图。

图3为草酸青霉突变株ΔPOX01907的PCR验证电泳图。

图4为草酸青霉突变株ΔPOX01907的Southern杂交图。

图5为草酸青霉ΔPoxKu70和ΔPOX01907-7在葡萄糖液体培养基中的生物量。

图6为草酸青霉ΔPoxKu70和突变株ΔPOX01907-7在可溶性淀粉液体培养基中的生物量。

图7为草酸青霉ΔPoxKu70和突变株ΔPOX01907-7、ΔPOX01907-9和ΔPOX01907-15的生淀粉酶产量检测结果。

图8为草酸青霉突变株ΔPOX01907-7和菌株ΔPoxKu70在淀粉诱导条件下淀粉酶基因POX01356、POX02412和POX09352的RT-qPCR检测比较结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

下述实施例中的草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株HP7-1为文献(Zhao S,Yan YS,He QP,et al.Comparative genomic,transcriptomic and secretomicprofiling of Penicillium oxalicum HP7-1 and its cellulase and xylanase hyper-producing mutant EU2106,and identification of two novel regulatory genes ofcellulase and xylanase gene expression[J].Biotechnology for Biofuels,2016,9(1):203)中的“Penicillium oxalicum strain HP7-1”，草酸青霉菌株HP7-1在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为：CGMCC 10781，公众也可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

质粒pCPXG418：参考文献：Chen M,Jiang M,Shang J,et al.CYP1,a hypovirus-regulated cyclophilin,is required for virulence in the chestnut blight fungus[J].Molecular Plant Pathology 2011,12(3):239–246.；质粒pCPXG418在文献中的名称为“transformation vector pCPXG418”，公众可以从广西大学获得。

DNA纯化试剂盒：天根生化科技有限公司，货号：DP214。

总RNA提取试剂盒(离心柱型)：天根生化科技有限公司，货号：DP419。

溶菌酶：索莱宝公司，货号：L8120。蜗牛酶：索莱宝公司，货号：S8280。裂解酶：Sigma公司，货号：L1412-5G。高保真酶：诺唯赞公司，货号：P515-AA。验证酶：GenStar公司，货号：A012-101。潮霉素：Amresco公司，货号：1796C205。定量酶：TaKaRa公司，货号：RR820。

PDA培养基：(BD公司，货号：5056836)：称取7.8g PDA溶解于200mL蒸馏水中，摇匀，121℃，高压蒸汽灭菌25min。

0.1％吐温80溶液：量取1mL吐温80混匀于1L去离子水中，121℃，高压蒸汽灭菌25min。

用于提取真菌总DNA的葡萄糖培养基(g/L)：Yeast extract 0.5g，Tryptone 3g，Glucose 10g，(NH₄)₂SO₄ 2g，K₂HPO₄ 4g，CaCl₂·2H₂O 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.3g，pH 5.0，115℃，低压蒸汽灭菌20min。

基本培养基：KH₂PO₄ 4g、(NH₄)₂SO₄ 4g、MgSO₄·7H₂O 0.6g、CaCl₂ 0.6g、微量元素溶液0.1mL，Tween 80加2mL，蒸馏水定容至1L，pH 5.5；115℃，低压蒸汽灭菌20min。

葡萄糖液体培养基：在基本培养基中加入葡萄糖，葡萄糖在葡萄糖液体培养基中的浓度为10g/L。

可溶性淀粉液体培养基：在基本培养基中加入玉米可溶性淀粉，玉米可溶性淀粉在可溶性淀粉液体培养基中的浓度为10g/L。

CM培养基(g/L)：Tryptone 2g、Yeast extract 1g、Glucose 10g、酶水解酪蛋白1g、20×硝酸盐50mL、微量元素溶液1mL，pH 6.5，115℃，低压蒸汽灭菌20min。

微量元素溶液(g/L)：FeSO₄·7H₂O 2.5g、MnSO₄ 0.8g、ZnSO₄·7H₂O 0.7g、CoCl₂1.0g，去离子水定容至1L。

20×硝酸盐(g/L)：NaNO₃ 120g、KCl 10.4g、MgSO₄·7H₂O 10.4g、KH₂PO₄ 30.4g，去离子水定容至1L。

50×TAE缓冲液：242g Tris碱,57.1mL冰乙酸,100mL 0.5M EDTA(pH 8.0)加入去离子水至1L，121℃，高压蒸汽灭菌25min。

0.5M EDTA(pH 8.0)：称取186.1g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂·2H₂O)，加入到800mL去离子水中，边搅拌边调pH至8.0，定容至1L。

0.6M MgSO₄·7H₂O：称取147.88g MgSO₄·7H₂O于1L去离子水中，混匀，高压蒸汽灭菌25min，4℃冰箱待用。

1M山梨醇水溶液：称取182.1g山梨醇于1L去离子水中，混匀，高压蒸汽灭菌，4℃冰箱待用。

OM buffer：称取295.76g MgSO₄·7H₂O、1.56g NaH₂PO₄，溶解于800mL去离子水，然后用1M Na₂HPO₄溶液调节pH至5.8，定容至1L，高压蒸汽灭菌，4℃冰箱待用。

Trapping buffer：称取72.872g山梨醇、12.1g Tris，溶解于800mL去离子水，用稀HCl溶液调节pH至7.0，定容至1L，高压蒸汽灭菌，4℃冰箱待用。

PTC溶液：称取400g PEG3350、12.1g Tris、11.1g CaCl₂，溶解于800mL去离子水，然后用稀HCl溶液调节pH至8.0，定容至1L，高压灭菌后置4℃冰箱待用。

STC溶液：称取182.2g山梨醇、12.1g Tris、11.1g CaCl₂，溶解于800mL去离子水，用稀HCl溶液调节pH至8.0，定容至1L，高压蒸汽灭菌，4℃冰箱待用。

OM酶解液：称取溶菌酶0.2g、溶壁酶0.3g、蜗牛酶0.3g，加入到50mL的OM buffer中溶解(现配现用)。

再生培养基(OCM)：酶水解酪蛋白0.05g、酵母提取物0.05g、蔗糖17.1g，琼脂1g，加入50mL蒸馏水，pH自然，121℃，高压蒸汽灭菌25min。

pH 5.0柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液：将0.1M柠檬酸溶液和0.2M Na₂HPO₄溶液分别按照48.5％和51.5％的比例混匀，微调pH值至5.0。

1.0％的生木薯淀粉：1g生木薯淀粉于100mL的pH 5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，混匀备用。

1.0％的可溶性淀粉：1g可溶性淀粉于100mL的pH 5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，混匀备用。

DNS溶液：200g四水合酒石酸钾钠、0.5g无水亚硫酸钠和3,5-二硝基水杨酸10g，用少于1L去离子水溶解，然后分别加入溶解好的20g氢氧化钠和2g重蒸酚，定容至1L待充分溶解后，过滤避光静置一周后，方可使用。

0.4M Na₂CO₃：43.4g碳酸钠于1L去离子水溶解。

蛋白提取液：PMSF 0.871g，EDTA 1.861g，NaCl 8.5g，Na₂HPO₄ 2.2g，NaH₂PO₄0.2g，定容至1L，调pH为7.4。

实施例1、草酸青霉中功能蛋白POX01907及其编码基因的发现

本发明提供了一个来源于草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株HP7-1的蛋白质，其名称为POX01907，由1794个氨基酸残基组成，氨基酸序列为序列表中序列1。将编码POX01907的基因命名为POX01907基因，草酸青霉菌株HP7-1的POX01907基因cDNA上的开放阅读框(ORF)如序列表的序列2所示。POX01907基因的基因组DNA如序列表的序列3所示。

一、POX01907基因敲除盒的构建

1、提取草酸青霉菌株HP7-1的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物POX01907-L-F和引物POX01907-L-R组成的引物对进行PCR扩增，得到POX01907基因上游的2921 bp DNA片段(电泳结果见图1的泳道1)，称为POX01907左臂。

POX01907-L-F:5’-CGAGCCGCCCAGTAAAGG-3’；

POX01907-L-R：5’-GGTAATCCTTCTTTCTAGACCGGGCCACCCGATGA-3’。

3、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物POX01907-R-F和引物POX01907-R-R组成的引物对进行PCR扩增，得到POX01907基因下游的2537bp DNA片段(电泳结果见图1的泳道3)，称为POX01907右臂。

POX01907-R-F:5’-CAATATCATCTTCTGTCGACGTTGGACGTGCGACATGAG-3’；

POX01907-R-R：5’-GCGTCTGCGTCATTCACA-3’。

4、以质粒pCPXG418为模板，采用引物G418-F和G418-R组成的引物对进行PCR扩增，得到抗生素G418抗性基因的编码序列(1888bp)(电泳结果见图1的泳道2)。

G418-F：5’-TCTAGAAAGAAGGATTACC-3’；

G418-R：5’-CGACAGAAGATGATATT-3’。

5、将步骤2、步骤3和步骤4得到的三个PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化，然后按照摩尔比1:1:1混合后，进行融合PCR扩增，得到PCR混合产物。

融合PCR反应条件：预变性95℃3min；95℃15s，58℃15s，72℃3min，一共进行30个循环反应；72℃5min。

6、以步骤5得到的PCR混合产物为模板，采用引物POX01907-N-F和引物POX01907-N-R组成的引物对进行PCR扩增，得到6180 bp PCR产物(电泳结果见图1的泳道4)。

POX01907-N-F：5’-CCAGCAAGTTTCCGATTC-3’；

POX01907-N-R：5’-GGACGCCTCATAACCTCTAT-3’。

经测序，得到的PCR产物如序列表的序列4所示。将序列表的序列4所示的DNA分子命名为POX01907基因敲除盒。序列4中，自5’端第1-2719位核苷酸为POX01907左臂序列，第2720-4607位核苷酸为G418抗性基因序列，第4608-6180位核苷酸为POX01907右臂序列。

POX01907基因敲除盒的元件示意图见图2。

实际应用中，也可以直接人工合成序列4所示DNA分子。

二、草酸青霉POX01907基因缺失突变株ΔPOX01907的构建与验证

1、以草酸青霉菌株HP7-1为出发菌，敲除其Ku70基因，得到草酸青霉突变体ΔPoxKu70。

记载草酸青霉突变体ΔPoxKu70，以及敲除Ku70基因的具体步骤的文献如下：ZhaoS,Yan YS,He QP,et al.Comparative genomic,transcriptomic and secretomicprofiling of Penicillium oxalicum HP7-1 and its cellulase and xylanase hyper-producing mutant EU2106,and identification of two novel regulatory genes ofcellulase and xylanase gene expression[J].Biotechnology for Biofuels,2016,9(1):203.草酸青霉突变体ΔPoxKu70在文献中的名称为“Penicillium oxalicum mutantΔPoxKu70”。草酸青霉突变体ΔPoxKu70在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号为：CGMCC 3.15650，公众也可从广西大学获得。

2、制备草酸青霉突变体ΔPoxKu70的原生质体

(1)将步骤1得到的草酸青霉突变体ΔPoxKu70接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×10⁸个孢子/mL)。

(2)取步骤(1)中2mL的孢子悬浮液，接种至200mL CM培养基中，28℃、180rpm振荡培养11小时。

(3)完成步骤(2)后，4℃、3500rpm离心10min，弃上清，收集菌丝体沉淀，用0.6MMgSO₄·7H₂O水溶液洗涤2次，然后4℃、3500rpm离心15min，弃上清，收集菌丝体沉淀。

(4)取步骤(3)得到的菌丝体，用50mL OM酶解液重悬，28℃、180rpm振荡反应2小时以进行酶解；用显微镜观察到大部分菌丝形成原生质体后，按每管12.5mL分装到50mL离心管中,加入2倍体积的Trapping buffer溶液，4℃、3500rpm离心30分钟，观察到明显的分层现象。

(5)用巴氏吸管小心地吸出步骤(4)中间层的原生质体至新50mL离心管中，加入2倍体积1M山梨醇水溶液漂洗1次，4℃、3500rpm离心15分钟，再使用20mL STC溶液漂洗2次后离心，弃上清，得到原生质体。

3、草酸青霉突变株ΔPOX01907的构建及验证

(1)将4体积份的STC溶液和1体积份的PTC溶液混合，得到混合液，用混合液重悬步骤2得到的原生质体，得到原生质体溶液(调整浓度为1×10⁷个/mL)。

(2)用实施例2得到的POX01907基因敲除盒DNA转化ΔPoxKu70原生质体(方法参照文献：Churchill ACL,Ciuffetti LM,Hansen DR,et al.Transformation of the fungalpathogen Cryphonectria parasitica with a variety of heterologous plasmids[J].Current Genetics 1990,17:25-31)，具体步骤如下：

①将5μg POX01907敲除盒DNA和3μL 100mM亚精胺溶液混合后加入到100μL步骤(1)制备的原生质体溶液中，混合均匀，冰上反应30分钟；

②反应结束后向溶液中加入1mL PTC溶液，混合均匀，室温放置25分钟；

③向混合液中加入1mL STC溶液混合均匀，将混合液加入到20mL预热的再生培养基中，混合均匀，将上述混合液倒入到无菌培养皿中(按每个培养皿分别倒入2-5mL)，室温放置1h，加入40mL含有G418(800μg/mL)与潮霉素(300μg/mL)的PDA培养基，覆盖在再生培养基的表面，完全凝固后28℃倒置培养5天。

④将步骤③的转化双层板的孢子用0.1％吐温80溶液冲洗，放入到新离心管中，用无菌水梯度稀释孢子悬浮液，将每个稀释梯度的孢子悬浮液涂在两个含有G418(800μg/mL)与潮霉素(300μg/mL)的PDA平板上，28℃培养4天，挑选单菌落，随机选取三个候选突变株(Δ7、Δ9和Δ15)，提取各候选突变株基因组DNA，采用引物POX01907-L-F和左交叉验证引物G418-V-R、右交叉验证引物G418-V-F和引物POX01907-R-R、引物POX01907-V-F和引物POX01907-V-R进行PCR验证。

左交叉验证引物G418-V-R：5’-GTGAATGCTCCGTAACACCCAAT-3’；

右交叉验证引物G418-V-F：5’-CGCTACTGCTTACAAGTGGGCTGAT-3’。

POX01907-V-F：5’-GTTCCTGCCTTCGGTTCA-3’(识别序列位于从ATG开始第726-743位核苷酸)；

POX01907-V-R：5’-TCGCATCACTCGGGTCAA-3’(识别序列位于从ATG开始第2533-2550位核苷酸)。

结果如图3所示。图3中，泳道M为1kb DNA Marker，泳道1为以突变体ΔPoxKu70作为模板的对照，泳道2为以ddH₂O作为模板的阴性对照，泳道3为Δ7的鉴定结果，泳道4为Δ9的鉴定结果，泳道5为Δ15的鉴定结果。图3中A为用引物POX01907-L-F和引物G418-V-R扩增得到的扩增产物；图3中B为用引物G418-V-F和POX01907-R-R扩增得到的扩增产物；图3中C为用引物POX01907-V-F和POX01907-V-R扩增得到的扩增产物。结果表明，Δ7、Δ9和Δ15可以扩增出3035bp的左臂DNA片段(图3中A)和2711bp的右臂DNA片段(图3中B),而突变体ΔPoxKu70没有G418抗性基因的存在，不能扩增出左臂和右臂基因片段(图3中A、图3中B)。同时，突变体ΔPoxKu70可扩增出1825bp的目的DNA片段，Δ7、Δ9和Δ15无扩增产物(图3中C)。上述结果表明菌株Δ7、Δ9和Δ15中POX01907基因已被敲除。

⑤提取三个候选突变株(Δ7、Δ9和Δ15)和突变体ΔPoxKu70的基因组DNA，将基因组DNA采用PstⅠ酶切后进行Southern杂交分析，结果如图4所示。图4中，泳道M为1kb DNAMarker，泳道1为突变体ΔPoxKu70对照，泳道2为Δ7的鉴定结果，泳道3为Δ9的鉴定结果，泳道4为Δ15的鉴定结果。结果表明，Δ7、Δ9和Δ15均得到大小为2.7kb的杂交带，突变体ΔPoxKu70得到6.9kb的杂交带，与预计结果一致。

以上结果表明，将POX01907基因敲除盒导入草酸青霉菌株ΔPoxKu70原生质体得到的三个转化子(Δ7、Δ9和Δ15)均为POX01907基因被敲除的突变菌株，分别命名为ΔPOX01907-7、ΔPOX01907-9和ΔPOX01907-15。将敲除POX01907基因的该3个突变菌株均命名为突变株ΔPOX01907。

三、草酸青霉突变株ΔPOX01907在葡萄糖液体培养基中生物量的测定

待测菌株为：ΔPOX01907-7和ΔPoxKu70。

1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。

2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将PDA平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×10⁸个孢子/mL)。

3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养72小时。

分别于培养的第12小时、第24小时、第36小时、第48小时、第60小时、第72小时收集培养体系中的所有菌丝体，50℃烘干至恒重,测定生物量(菌丝体干重)。

结果如图5所示。结果表明，ΔPOX01907-7在葡萄糖液体培养基中的生物量与ΔPoxKu70菌株的生物量无显著差异，表明菌株ΔPoxKu70中POX01907基因的敲除不影响草酸青霉菌株在葡萄糖培养基中正常生长。

四、草酸青霉突变株ΔPOX01907在可溶性淀粉液体培养基中生物量的测定

待测菌株为：ΔPOX01907-7和ΔPoxKu70。

1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。

3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL可溶性淀粉液体导培养基中，28℃、180rpm振荡培养72小时。

结果见图6。菌株ΔPOX01907-7在可溶性淀粉培养基中的生物量与菌株ΔPoxKu70的生物量相比表明，前36小时，菌株ΔPOX01907-7的生长比菌株ΔPoxKu70略慢，36小时后，菌株ΔPOX01907-7的生长比菌株ΔPoxKu70稍快，说明菌株ΔPoxKu70中POX01907基因的敲除影响草酸青霉菌在可溶性淀粉培养基中正常生长。

五、草酸青霉菌突变株ΔPOX01907生淀粉酶产量的测定

待测菌株为：ΔPoxKu70、ΔPOX01907-7、ΔPOX01907-9和ΔPOX01907-15。

1、将待测菌株接种于PDA培养基平板上，28℃静置培养6天。

2、完成步骤1后，用0.1％吐温80溶液将平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液(1×10⁸个孢子/mL)。

3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养24小时，离心收集菌丝体，用无菌水洗涤2-3次。

4、取步骤3得到的菌丝体(湿重为1g)，转接到100mL可溶性淀粉液体培养基中，28℃、180rpm振荡培养4天。

分别于培养的第2天、第3天和第4天取样，8000rpm离心10min，收集上清液，即为粗酶液。

5、检测步骤4得到的粗酶液的生淀粉酶活力。所用底物为生木薯粉。一个生淀粉酶活力单位(U)的定义:每分钟产生1μmoL还原糖所需要的酶量。

检测方法参考文献：Xu QS,Yan YS,Feng JX.Efficient hydrolysis of rawstarch and ethanol fermentation:a novel raw starch-digesting glucoamylasefrom Penicillium oxalicum[J].Biotechnology for Biofuels.2016,9:216.。

6.提取步骤4可溶性淀粉液体培养基中菌丝体的胞内蛋白。方法参照以下步骤：

①将步骤4得到菌丝体放入预冷的研钵中，加入适量液氮迅速研磨成粉末。

②将步骤①得到的粉末转移到50mL离心管中，加入15mL蛋白提取液，再加入5g直径为0.25mm以及1g直径为3mm的玻璃珠。

③将步骤②的混合液在旋涡振荡器上振荡1min，再放置冰上30s。重复8-10次。

④将步骤③得到的混合液在7000rpm，4℃，离心20min，收集上清液，即为菌体胞内蛋白。胞内蛋白浓度检测方法参照文献：Zor T,Selinger Z.Linearization of theBradford protein assay increase its sensitivity:theoretical and experimentalstudies[J].Anal Biochem 1996,236:302-308。

草酸青霉菌株生淀粉酶产量(U/g胞内蛋白)＝生淀粉酶活力(U)/胞内蛋白(g)。

结果如图7所示。与菌株ΔPoxKu70相比，3株突变株(ΔPOX01907-7、ΔPOX01907-9和ΔPOX01907-15)的生淀粉酶产量均显著降低，说明基因POX01907正调控草酸青霉生淀粉酶的产生。

六、POX01907基因的缺失对草酸青霉淀粉酶基因转录水平的影响

待测菌株为：ΔPOX01907-7和ΔPoxKu70。

1、将待测菌株接种于无菌PDA培养基上，28℃恒温培养6天。

2、用0.1％吐温80溶液将PDA平板表面的孢子洗脱，得到孢子悬浮液并将浓度调整到1×10⁸个/mL。

3、将1mL步骤2得到的孢子悬浮液接种至100mL葡萄糖液体培养基中，28℃、180rpm培养24小时，收集菌丝体；将1g菌丝体转接至100mL可溶性淀粉液体培养基，28℃、180rpm培养。分别收集、提取诱导培养第4小时、第12小时、第24小时和第48小时的待测菌株总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行定量PCR检测，检测3个淀粉酶相关基因(1个α-淀粉酶基因：POX09352基因；2个糖化酶基因：POX01356基因、POX02412基因，其中POX01356为生淀粉糖化酶基因)在转接后第4小时、12小时、24小时、48小时的表达情况，采用actin基因作为内参基因。

RT-qPCR检测引物如下所示(5’→3’)：

actin-F：CTCCATCCAGGCCGTTCTG

actin-R：CATGAGGTAGTCGGTCAAGTCAC

POX01356-F：CCTCGGTGAGCCCAAGTT

POX01356-R：CCAAAGTCAATCAAGGCAA

POX02412-F：TATGTGGATTCCTTCCGCTCTA

POX02412-R：ATGGATTGCCTCCTTGGT

POX09352-F：CTGACGGCTGCCCAATG

POX09352-R：CCAAATCGCAGTAAATCCC

结果如图8所示，其中，相对表达量是指突变株ΔPOX01907-7中淀粉酶相关基因的转录水平减去ΔPoxKu70中同样基因的转录水平。图8表明，在淀粉诱导第4小时，与ΔPoxKu70相比，突变株ΔPOX01907-7中除了POX09352基因外，其他两个糖化酶基因POX01356基因、POX02412基因的转录水平显著升高，其中POX01356基因的转录水平升高幅度最大。在淀粉诱导第12小时，POX09352、POX01356、POX02412三个基因的转录水平都比淀粉诱导第4小时的显著降低，但与ΔPoxKu70相比，POX01356基因的转录水平还是显著上调，上调212.2％。在淀粉诱导第24小时，与ΔPoxKu70相比，POX09352基因下调幅度超过了90％，为96.7％，而POX01356基因下调45.3％，POX02412基因下调71.3％。在淀粉诱导第48小时，三个淀粉酶基因转录水平都非常低，与ΔPoxKu70相比，下调幅度都超过了80％，其中POX01356基因下调91.7％、POX02412基因下调82.7％，POX09352基因下调98.8％。

以上结果表明，POX01907在可溶性淀粉液体诱导培养条件下，对草酸青霉3个关键淀粉酶相关基因的表达起关键调控作用。

<110> 广西大学

<120> 功能蛋白POX01907及其编码基因与应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1794

<212> PRT

<213> 草酸青霉(Penicillium oxalicum)

<400> 1

Met Asp Pro Leu Arg Val Glu Gly Met Phe Thr Asp Gln Val Pro Cys

1 5 10 15

Ala Val Val Gly Gly Glu Thr Gly Lys Glu Val Val Asp Glu Gly Ala

20 25 30

Ser Phe Ser Ala Val Glu Ala Asp Pro Val Lys Leu Ala Gln Ile Gly

35 40 45

His Ala Ala Val Arg Leu Ser Trp Thr Ala Thr Ala Asn Glu Ile Tyr

50 55 60

Trp Ile Ala Thr Val His Leu Asn Ala Ile Ala Ser Gly Ser Trp Thr

65 70 75 80

Ala Asn Ala Asn Val Ile Glu Thr Glu Ile Glu Ile Gly Thr Glu Thr

85 90 95

Glu Thr Glu Thr Glu Thr Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr Ala Ile

100 105 110

Glu Thr Gly Thr Trp Thr Asp Val Ile Arg Asp Leu Leu Pro Asn Arg

115 120 125

Val Asp Asn Arg Asn Ser Ile Ala Ser Val Ser Ala Ser Ser Ala Asn

130 135 140

Ala Ile Pro Leu Pro Val Pro Thr Ala Pro Glu Arg Leu Ser Glu Pro

145 150 155 160

Glu Asn Val Asp Ser Ser His Arg Lys Ser Ser Ile Ile Ser Gly Pro

165 170 175

Pro Ala Ala Glu Pro Pro Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Glu Pro Ala

180 185 190

Pro Val Arg Leu Glu Pro Pro Lys Asp Ala Ala Val Ser Val Gln Gln

195 200 205

Ser Pro Pro Pro Ser Ala Pro Gln Val Pro Ala Phe Gly Ser Val Ser

210 215 220

Thr Pro Val Pro Ser Ala Gly Pro Ala Lys Val Ser Ser Pro Glu Gly

225 230 235 240

Arg Pro Ser Ile Asp Ala Thr Thr Pro Ser Asp Lys Asp Arg Pro Pro

245 250 255

Phe His Pro Pro Thr Gly Pro Lys Ala Glu Arg Ser Gln Ser Leu His

260 265 270

Ser Val Glu Ser Arg Ser His Gly Ser Glu Ser Asn His Arg Gln Asp

275 280 285

Asp Ser Ser Arg Ser Val Arg Thr Ser Val His Val Pro Asp Arg Ser

290 295 300

Pro Pro Thr Ala Pro Ala Ala Met Val Lys Arg Asp Ser Val Ser Gly

305 310 315 320

Asn Val Glu His Ala Ser Leu Gly Arg Ser Ser Val His Ala Thr Ser

325 330 335

Pro Thr Phe Thr Arg Leu Pro Pro Pro Ala Pro Arg Ala Leu Ser Arg

340 345 350

Asp Pro Ser Ile Ser Pro Arg Met Gln Thr Ser Asn Ile Pro Thr Gly

355 360 365

Pro Arg Ala Tyr Gln Arg Arg Pro Ser Leu Ser Pro Arg Gly Gly Gly

370 375 380

Lys Gly Met Lys Ala Trp Gly Arg Ala Thr Phe Gly Arg Ala Pro Ser

385 390 395 400

Ala Thr Gly Met Gln Leu Lys Lys Asp His Asp Asp Ser Asp Glu Arg

405 410 415

Pro Pro Val Val Glu Ala Ile Gln Gln Asp Ser Pro Leu Pro Ala Gln

420 425 430

Arg Thr Thr Gln Glu Ser Val Val Ala Asn Glu Ser Val Gln Ser Thr

435 440 445

Pro Pro Arg Ser Gly Ser Val Asp Leu Pro Ile Arg Val Ser Pro Pro

450 455 460

Pro Ala Thr Lys Pro Gln Thr Gln Gln His Thr His Thr Glu Ala Glu

465 470 475 480

Ile Ser Ser Ala Ala Asn Asn Gln Val Pro Gly Gln Leu Glu Gly Ile

485 490 495

His Glu Glu Arg Arg Glu Met Asn Ala Gln Ala Ala Pro Gln Val Glu

500 505 510

Thr Val Glu Lys Thr Glu Thr Thr Glu Leu Asp Ala Gln Glu Glu Glu

515 520 525

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asn Val Val Phe Thr Lys Glu Tyr

530 535 540

Leu Glu Glu Arg Lys Gln Lys Phe Glu Lys Asp Met Gln Ser Leu Arg

545 550 555 560

Ala Glu Met Pro Met Pro Pro Leu Glu Asp Pro Thr Ile Val Ser Leu

565 570 575

Leu Leu Lys Ile Gln Met Leu Gly Lys Val Ala His Asp Gln Arg His

580 585 590

Gly Gln Ser Ile Gly Pro Val Leu Ser Glu Glu Glu Lys Glu Ile Pro

595 600 605

Ser Thr Ala Pro Val Asp Asp Glu Val Pro Ser Val Val Pro Pro Gly

610 615 620

Pro Glu Asp Lys Ile Asp Ser Thr Ser Val Thr Ile Pro Pro Lys Thr

625 630 635 640

Pro Met Gln Glu Glu Arg Val Val Asp Ser Leu Pro Phe Leu His Ser

645 650 655

Gly Pro Pro Thr Pro Ile Ser Asp Met Asp Thr Ser Leu Thr Asp Lys

660 665 670

Val Thr Lys Gln His Leu Asn Glu Phe Ile Arg Thr Glu Leu Ile Arg

675 680 685

Arg Gln Lys Glu Val Ala Glu Lys Asn Ala Ala Leu Arg Asp Glu Tyr

690 695 700

Met Ser His Tyr Lys Arg Trp Arg Leu Glu Val Trp Glu Leu Asp Arg

705 710 715 720

Leu Lys Glu Lys Lys Pro Met Thr Pro Gly Pro Val Ser Pro Pro Ala

725 730 735

Pro Pro Val Pro Thr Pro Pro Ala Ala Val Ser Glu Ser Arg Glu Gly

740 745 750

Arg Arg Tyr Lys Gly Asn Ser Glu Leu Asp Phe Leu Asn Ala Leu Lys

755 760 765

Ala Ser Glu Ile Ser Ala Gln Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Thr Arg

770 775 780

Met Ala Thr Ala Arg Pro Asp Leu Ala Arg Glu Ala Ile Ile Pro Asp

785 790 795 800

Met Leu Glu Pro Arg Gln Val Lys Ala Gly Ile Phe Lys Asp Val Asn

805 810 815

Asn Thr Val Asp Pro Ser Asp Ala Met Glu Val Phe Gly Phe Leu Pro

820 825 830

Pro Pro Asn Asp Phe Thr Pro Glu Glu His Gln Leu Phe Thr Asp Ala

835 840 845

Phe Met Ala Tyr Pro Lys Lys Trp Gly Lys Ile Ala Glu Ser Leu Pro

850 855 860

Gly Arg Asp Phe Arg Gln Cys Ile Ile His Tyr Tyr Leu Thr Lys Glu

865 870 875 880

Glu Ile Lys Tyr Lys Ala Lys Leu Asn Lys Arg Trp Ser Arg Arg Gly

885 890 895

Arg Gly Lys Ala Arg Ser Ser Arg Pro Lys Ser Asn Ala Leu Ile Ala

900 905 910

Asp Leu Gly Val Val Lys Pro Asp Phe Asp Gly Glu Glu Glu Gln Pro

915 920 925

Pro Pro Val Thr Asp Thr Gly Arg Pro Arg Arg Ala Ala Ala Pro Thr

930 935 940

Phe Gly Asp Ser Asn Asp Ser Glu Gly Ala Val Ala Gly Ser Arg Arg

945 950 955 960

Gly Gln Ser Val Lys Asp Gly Glu Leu Thr Glu Lys Pro Ala Val Arg

965 970 975

Arg Gly Gly Arg Ala Thr Gly Thr Arg Thr Gln Arg Arg Gly Ala Lys

980 985 990

Val Val Gln Gln Asp Pro Lys Ser Gln Pro Ser Thr Pro Gln Gly Ser

995 1000 1005

Asn Thr Pro Val Pro Pro Ala Pro Lys Ile Glu Ser Gly Ile Asp

1010 1015 1020

Ala Leu Val Glu Val Ala Leu Pro Pro Glu Lys Glu Leu Val Glu

1025 1030 1035

Lys Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser Arg Pro Lys Ala Gly Arg Gly

1040 1045 1050

Arg Ala Lys Asp Gly Ile Tyr Val Phe Glu Ser Thr Glu Thr Asp

1055 1060 1065

Pro Thr Thr Ala Thr Pro Lys Pro Ser Glu Ser Gly Tyr Gly Ser

1070 1075 1080

Leu Gln Pro Thr Ser Tyr Trp Ser Val Pro Glu Gln Arg Asp Phe

1085 1090 1095

Pro Arg Leu Leu Ala His Phe Gly Arg Asp Phe Glu Gly Ile Ser

1100 1105 1110

Ser Phe Met Lys Thr Lys Thr Thr Val Met Val Lys Asn Tyr Tyr

1115 1120 1125

Gln Arg Arg Leu Asp Ser Gly Gln Lys Asp Phe Glu Glu Ile Val

1130 1135 1140

Leu Val Ala Glu Glu Lys Lys Ala Arg Gly Glu Pro Thr Gly Pro

1145 1150 1155

Leu Pro Val Pro Ser Val Ala Pro Lys Arg Arg Tyr Glu Ala Thr

1160 1165 1170

Pro Ser Ala Ile Ile Pro Arg Pro Leu Ala Pro His Gly Glu Ser

1175 1180 1185

Val Ser Glu Ser Glu Asp Ala Arg Phe Ala Pro Lys Ser Lys Pro

1190 1195 1200

Ala Val Thr Ser Pro Gln Thr Val Pro Val His Ser Arg Pro Val

1205 1210 1215

Val Glu Gly Asp Arg Thr Ser Ser Arg Tyr Ala Pro Leu Ala Gln

1220 1225 1230

Ala Ser Thr Pro Gly Ala Asn Ser Pro Met Ala Ala Thr Tyr Gly

1235 1240 1245

Asp Asp Ala Ala Arg Gly Ser Arg Thr Gln Pro Pro Pro Ser Arg

1250 1255 1260

Met Ser Gly Pro Arg Ile Gly Phe Phe Thr Glu Asp Arg Arg Asp

1265 1270 1275

Ser Pro Ile Leu Gln Ser Gly Ala Gln Arg Ala Ser Asp Met Pro

1280 1285 1290

Ile Ser Ala Arg His Val Ala Thr Gly Ala Met Pro Gln Glu Met

1295 1300 1305

Thr Gly Met Glu Pro Ile Ala Leu Gln Thr Tyr Met Pro Gly Gln

1310 1315 1320

Pro Ser Ser Ser Leu Met Gln Thr Ser His Ser Arg His Asn Ser

1325 1330 1335

Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ser Pro Ala Ala Arg Pro Arg Thr Glu

1340 1345 1350

Leu Glu His Pro Ser Tyr His Arg Asp Pro Phe Ala Pro Arg Ala

1355 1360 1365

Tyr Tyr Ser Leu Pro Gly Gln Pro Thr Gly Leu Val Asn Ser Pro

1370 1375 1380

Arg Leu Gly Met Ser Pro Val Lys Asp Gly Pro Arg Pro Gly Ala

1385 1390 1395

Thr Pro Val Ser Glu Pro Thr Pro Arg Gln Val Pro Ala Lys Arg

1400 1405 1410

Ser Asn Ile Met Ser Ile Leu Asn Asp Glu Pro Glu Asp Pro Gln

1415 1420 1425

Pro Arg Lys Arg Phe Ala Ser Glu Val Ser Ser Asn Ser Gly Gln

1430 1435 1440

Gly Pro Ala Ser Gly Pro Val Ser Arg Ser Val Tyr Gln Pro Gly

1445 1450 1455

Glu Lys Ala Arg Ile Asp Glu Ala Ala Gln Lys Pro Thr Ser Tyr

1460 1465 1470

Gly Gln Pro Ser Pro Tyr Gln Ala Ser Ser Arg Gly Tyr Pro Asp

1475 1480 1485

Tyr Asn Met Ser Asn Tyr Gly Pro Pro Ala Asn Gly Pro Gly Asn

1490 1495 1500

Ala Val Asn Asn Asp Trp Met Ala Arg Phe Asp Pro Arg Ala Gln

1505 1510 1515

Gln Gly Gly Pro Pro Thr Gln Ser Gln Pro Pro Pro Pro Ala Pro

1520 1525 1530

Ser Ser Gln Val Gly Arg Pro Val Ser Ser Met Ala Thr Gln Gly

1535 1540 1545

Ser Tyr Thr Gln Tyr Ala Gly Gly Gln Ser Gln His Ala Ala Pro

1550 1555 1560

Pro Leu Ser Ser Leu Pro Ala Pro Ser Pro Ala Pro Thr Pro Pro

1565 1570 1575

Pro Ala Ser Ser Gln Arg Gln Ser Tyr Ser Ser Val Phe Ser Gln

1580 1585 1590

His Gly Val Pro Ser Gly Ala Arg Asp Leu Gly Pro Gln Pro Ser

1595 1600 1605

Pro Tyr Arg Pro Ala Ser Pro Thr Pro Arg Ala Gly Ser Ala Ala

1610 1615 1620

Tyr Gly Ser Arg Thr Glu Pro Ser Thr Ala Ala Gln Ser Ala Asn

1625 1630 1635

Ser Pro Phe Ala Leu Ala Pro Arg Gln Leu Ala Gln Gln His Ser

1640 1645 1650

Tyr Thr Ser Ala Ala Ser Pro Thr Pro Val Gly Thr Pro Gln His

1655 1660 1665

Ser Gln Ser Tyr Gln Gln His Val Gln Thr Leu Val Asn Gly Ser

1670 1675 1680

His Gln Ser His Arg Ser Thr Pro Val Ala Leu Gly Ser Gly Pro

1685 1690 1695

Gln Gln Tyr Gly His Asn Thr Leu Thr Pro Gln Ala Pro Gly Arg

1700 1705 1710

Ser Met Pro Ser Leu Ala Ser Leu Gly Arg Ser Tyr Thr Pro Pro

1715 1720 1725

Ser Ala Leu His Pro Gly Ser Met Gly Phe Gly Pro Pro Pro Pro

1730 1735 1740

Pro Gly Pro Ser Gly Met Ser Ser Met His His Arg Ala Ser Gly

1745 1750 1755

Pro Gly Asp His Ile Val His Pro Gly Gly His His Arg Val Tyr

1760 1765 1770

Ser Gln Gly Ser Thr Pro Gly Gly Leu Pro Ser Ser Met Arg Pro

1775 1780 1785

Gly Ser Gln Pro Pro Arg

1790

<210> 2

<211> 5385

<212> DNA

<213> 草酸青霉(Penicillium oxalicum)

<400> 2

atggaccccc ttcgagtgga gggcatgttc acggaccagg tcccatgcgc ggtcgtgggc 60

ggggagactg ggaaggaggt cgtggacgag ggcgcgagct tttccgccgt cgaagccgat 120

cccgtgaagc tcgcccaaat tggccacgcg gccgtccgtc tatcctggac cgcgaccgcg 180

aacgagatct actggatcgc gaccgtccac ttgaacgcga tcgcgagcgg atcatggacc 240

gcgaacgcga acgtgatcga gaccgagatc gagatcggga ccgagaccga gaccgagacc 300

gagaccgtga ccgtgaccgt gaccgtgacc gcgatcgaga ccgggacttg gaccgacgtg 360

atccgggacc tcctaccaaa ccgagtggac aatcgtaatt caattgcctc agtcagcgcc 420

tcttcagcca atgcgatccc tttgcccgtt cccactgcac ccgagcgatt gtcggaaccg 480

gagaacgtcg attcttcaca tagaaaatcg tctatcatct caggtcctcc agcagcggaa 540

ccaccccgac gggagagtgt ccgcccagag ccggcgcctg tccgactcga acctccgaag 600

gatgcagccg tgtctgttca gcagtctccc cctccgtccg ccccgcaggt tcctgccttc 660

ggttcagtgt caacaccagt cccgtctgca gggccagcca aggtcagctc gccggaaggc 720

cgtccatcga ttgatgctac gacaccatct gacaaagatc gaccaccttt ccacccgcca 780

acgggcccca aagccgagcg gagtcaatct ctgcactcag tcgaatcccg aagtcatggc 840

tctgaaagca atcatcgaca ggatgattcc tcacgctcag taaggacctc tgtgcatgtc 900

cccgacaggt ctccgccgac tgcacctgct gcaatggtga agagagattc tgtctcaggt 960

aacgttgagc acgcctcgct tggaagatcc agtgtccacg cgacgtctcc gacctttact 1020

cgacttccac cgccagctcc acgagcgctg tccagagatc cgtccatttc ccctcgaatg 1080

caaacttcga atattccaac agggcctcgc gcctaccaaa gacgaccaag tttgtctccg 1140

cgaggaggtg gcaagggcat gaaagcttgg ggacgtgcaa cttttggtcg cgccccgtct 1200

gccactggga tgcagctcaa gaaggaccat gatgattcgg atgagagacc gcctgtcgtt 1260

gaagcaattc aacaagactc acctcttccc gctcagcgta caacccaaga atctgttgtc 1320

gcaaatgagt ctgttcagtc tacacctccc cgctctggct cagtggatct gcccataaga 1380

gtcagtcctc cgcctgcgac aaagccccag actcagcaac atacccacac ggaagccgag 1440

atatcttccg ccgccaacaa tcaagttcca ggccaacttg aagggataca tgaagagcgt 1500

cgtgagatga atgctcaagc ggccccacaa gtagagactg tggagaaaac agagacgaca 1560

gaactagatg cgcaggagga ggaggaagaa gaagaggagg aagaagaaaa tgttgtcttc 1620

acaaaagaat atttggagga gcgaaagcag aagttcgaaa aagatatgca gtctcttcgt 1680

gctgaaatgc caatgccacc cttggaagat cccactattg tctcacttct tctcaaaatt 1740

caaatgctgg gcaaggttgc ccatgatcaa agacacggac aatctatcgg acctgtgctc 1800

tctgaagaag aaaaggagat tccatccact gccccagtcg acgacgaggt cccatcggtc 1860

gttccaccgg gacctgaaga taagatcgat tcgacatccg ttactattcc ccccaagact 1920

cccatgcagg aggagagagt cgtcgacagc ctgccattcc tgcattcagg ccctcctact 1980

ccaatctcag acatggacac ctcccttaca gacaaggtga ccaagcagca tctgaacgag 2040

ttcatccgca cagagctcat tcggcgacaa aaggaggtcg cggaaaagaa cgctgcattg 2100

cgcgatgagt acatgtccca ttacaagcga tggcgcttag aagtatggga actcgatcga 2160

ctcaaggaga agaagcctat gacacctggt ccagtctcgc ctccagcgcc acctgtaccg 2220

acccccccag cggcggtttc ggaaagccgg gaagggcgcc ggtacaaagg caacagcgaa 2280

cttgacttct tgaacgcatt gaaggcatcg gaaatttctg ctcaggagga actcgagcgt 2340

cgacgaacaa gaatggcgac tgcgcgacct gacctcgctc gcgaagccat catccccgat 2400

atgcttgagc cgcgccaagt gaaggctgga atctttaagg atgtcaacaa taccgttgac 2460

ccgagtgatg cgatggaagt gtttggattt ctgccaccgc caaatgattt cacccccgag 2520

gagcatcaat tgttcacaga cgctttcatg gcgtatccga agaaatgggg caagattgca 2580

gaatctctgc ctggtcgtga tttcagacag tgcatcattc actattacct gacaaaggaa 2640

gagatcaagt acaaggctaa actgaacaaa cgttggagtc gccgtggacg gggcaaagcc 2700

cgctcttcgc gaccaaagtc taacgctttg attgctgact tgggagtcgt caaaccggat 2760

tttgatggcg aggaggagca acctccgccc gtcactgata ctggtcgacc tcggcgcgcg 2820

gctgccccta cgtttggtga ttccaatgat tctgaaggcg ctgttgctgg cagccggcgt 2880

ggccagtccg tcaaagatgg cgaactcaca gagaagcctg ctgtgcgaag aggcgggcga 2940

gccactggca cacgcacgca aagacgcggt gcgaaagtcg ttcagcagga tcctaagagc 3000

cagccttcga ctcctcaagg gagcaacact cccgtccctc cggcccccaa gatagaatcg 3060

ggtattgatg cgctggttga ggttgcattg ccaccagaga aggagctcgt tgaaaaggaa 3120

cctttgccgt ccgcttcgcg tccgaaagca gggcgaggtc gggcaaagga cgggatctat 3180

gtctttgaat ccacagagac ggacccgaca acagcaacac ccaagccttc tgaaagtggg 3240

tatggatcac tgcaaccgac tagctactgg tctgtccccg agcagcgcga ttttcctcgc 3300

ttgcttgctc actttggacg tgactttgag ggcatttcca gctttatgaa gacgaagaca 3360

actgtgatgg tgaaaaacta ctaccagcga cgccttgact ctggacaaaa agatttcgag 3420

gagatcgtcc tagtcgcaga agagaagaaa gctcgcggtg agccgactgg tcctctcccg 3480

gtgccgagtg ttgctccaaa acgtcgttat gaagctaccc catcggccat catccctcgc 3540

ccgctcgcac cgcatggaga atcagtctca gaaagcgagg acgcccggtt tgcccccaag 3600

agcaaaccgg ctgtcacatc accccaaacg gttccagtgc acagtcggcc tgtggtggaa 3660

ggtgatcgga cgtcgagtcg ttatgctccc cttgcgcaag catccacgcc tggcgctaac 3720

tcaccaatgg ccgccacgta cggagatgat gctgcccgag gctcgcggac acaacctcca 3780

ccttctcgaa tgtctggacc tcgtattgga ttctttaccg aggatcgtcg cgactcgcca 3840

attctccaat caggcgctca gcgagcgtca gacatgccga tttccgcccg gcatgttgcg 3900

acgggagcca tgccacaaga gatgacggga atggagccca ttgcgctgca aacatacatg 3960

cctggtcaac catcttcgtc gctgatgcag acatctcatt cccgccacaa cagtcttact 4020

cagccgccca gctcgccagc ggcgcgcccg cggacggagc ttgagcatcc ctcttaccat 4080

cgtgatcctt tcgcaccgag ggcgtactat tctctcccgg gtcagcccac tggtctcgtt 4140

aactcccctc gtcttggaat gtcaccggtg aaggatggtc cccgtccagg tgctacgcct 4200

gtctccgaac caaccccacg ccaggtgcct gctaagcgct caaacatcat gagcattttg 4260

aacgatgagc ccgaggaccc acagcccagg aaaagatttg ctagtgaagt ttcatccaac 4320

tctggccaag gccctgcttc tggtcccgtg tcacgatcag tttaccagcc tggcgaaaag 4380

gctcgaattg atgaggctgc gcagaagccg accagctacg gtcaaccaag cccttatcaa 4440

gcgtcctccc gaggatatcc tgattacaat atgagcaatt atgggccgcc tgccaatggc 4500

ccgggaaatg ctgtcaacaa tgattggatg gctcgcttcg atccgagagc tcaacaggga 4560

ggtccgccta cccagtccca gccacctcct ccagctccat cgtctcaagt gggtcgaccg 4620

gtctcgtcaa tggccaccca aggctcctac acgcagtacg cgggtggcca atctcagcat 4680

gctgcgccgc ccttgagctc gttaccagcc ccttcccctg cgcctacacc acccccagcc 4740

agttcacagc ggcaaagtta ttccagcgtg ttttctcagc atggagttcc ctcgggcgcc 4800

cgggacctag ggccacaacc ttctccctat cgacctgcct cgcccactcc tcgagccggc 4860

agtgctgcgt atggctcacg cacagagcca tcgacagccg ctcaatcggc caatagtccg 4920

tttgctctag ccccgcgtca gctggcccag cagcactcct acacctcagc tgcctctccc 4980

acgcccgtgg gtactccaca acacagccag agctatcagc agcacgtaca aactctggtg 5040

aatggttccc atcagtcgca tcgatcgacg cccgtggcac tggggagcgg tccccaacaa 5100

tacggccaca acacgctcac accgcaagca ccgggccgct caatgccgtc acttgccagc 5160

cttggtcgat catacactcc cccttcagcc ttgcaccctg gcagtatggg ctttggtccg 5220

ccaccgccgc caggtccaag tgggatgtcg tcaatgcatc acagagcatc tgggcctggg 5280

gatcatattg ttcacccggg cggccatcat cgtgtttaca gccaggggtc caccccagga 5340

ggtcttccga gctcgatgcg ccctgggtcc cagccaccac gctaa 5385

<210> 3

<211> 5525

<212> DNA

<213> 草酸青霉(Penicillium oxalicum)

<400> 3

atggaccccc ttcgagtgga gggcatgttc acggaccagg tcccatgcgc ggtcgtgggc 60

ggggagactg ggaaggaggt cgtggacgag ggcgcgagct tttccgccgt cgaagccgat 120

cccgtgaagc tcgcccaaat tggccacgcg gccgtccgtc tatcctggac cgcgaccgcg 180

aacgagatct actggatcgc gaccgtccac ttgaacgcga tcgcgagcgg atcatggacc 240

gcgaacgcga acgtgatcga gaccgagatc gagatcggga ccgagaccga gaccgagacc 300

gagaccgtga ccgtgaccgt gaccgtgacc gcgatcgaga ccgggacttg gaccgacgtg 360

atcgttttga acggagagac gaatgggaga accgccgtcc agatcgtgag gatcgagatc 420

gacctaatga gccttggaag cgggacctcc taccaaaccg agtggacaat cgtaattcaa 480

ttgcctcagt cagcgcctct tcagccaatg cgatcccttt gcccgttccc actgcacccg 540

agcgattgtc ggaaccggag aacgtcgatt cttcacatag aaaatcgtct atcatctcag 600

gtcctccagc agcggaacca ccccgacggg agagtgtccg cccagagccg gcgcctgtcc 660

gactcgaacc tccgaaggat gcagccgtgt ctgttcagca gtctccccct ccgtccgccc 720

cgcaggttcc tgccttcggt tcagtgtcaa caccagtccc gtctgcaggg ccagccaagg 780

tcagctcgcc ggaaggccgt ccatcgattg atgctacgac accatctgac aaagatcgac 840

cacctttcca cccgccaacg ggccccaaag ccgagcggag tcaatctctg cactcagtcg 900

aatcccgaag tcatggctct gaaagcaatc atcgacagga tgattcctca cgctcagtaa 960

ggacctctgt gcatgtcccc gacaggtctc cgccgactgc acctgctgca atggtgaaga 1020

gagattctgt ctcaggtaac gttgagcacg cctcgcttgg aagatccagt gtccacgcga 1080

cgtctccgac ctttactcga cttccaccgc cagctccacg agcgctgtcc agagatccgt 1140

ccatttcccc tcgaatgcaa acttcgaata ttccaacagg gcctcgcgcc taccaaagac 1200

gaccaagttt gtctccgcga ggaggtggca agggcatgaa agcttgggga cgtgcaactt 1260

ttggtcgcgc cccgtctgcc actgggatgc agctcaagaa ggaccatgat gattcggatg 1320

agagaccgcc tgtcgttgaa gcaattcaac aagactcacc tcttcccgct cagcgtacaa 1380

cccaagaatc tgttgtcgca aatgagtctg ttcagtctac acctccccgc tctggctcag 1440

tggatctgcc cataagagtc agtcctccgc ctgcgacaaa gccccagact cagcaacata 1500

cccacacgga agccgagata tcttccgccg ccaacaatca agttccaggc caacttgaag 1560

ggatacatga agagcgtcgt gagatgaatg ctcaagcggc cccacaagta gagactgtgg 1620

agaaaacaga gacgacagaa ctagatgcgc aggaggagga ggaagaagaa gaggaggaag 1680

aagaaaatgt tgtcttcaca aaagaatatt tggaggagcg aaagcagaag ttcgaaaaag 1740

atatgcagtc tcttcgtgct gaaatgccaa tgccaccctt ggaagatccc actattgtct 1800

cacttcttct caaaattcaa atgctgggca aggttgccca tgatcaaaga cacggacaat 1860

ctatcggacc tgtgctctct gaagaagaaa aggagattcc atccactgcc ccagtcgacg 1920

acgaggtccc atcggtcgtt ccaccgggac ctgaagataa gatcgattcg acatccgtta 1980

ctattccccc caagactccc atgcaggagg agagagtcgt cgacagcctg ccattcctgc 2040

attcaggccc tcctactcca atctcagaca tggacacctc ccttacagac aaggtgacca 2100

agcagcatct gaacgagttc atccgcacag agctcattcg gcgacaaaag gaggtcgcgg 2160

aaaagaacgc tgcattgcgc gatgagtaca tgtcccatta caagcgatgg cgcttagaag 2220

tatgggaact cgatcgactc aaggagaaga agcctatgac acctggtcca gtctcgcctc 2280

cagcgccacc tgtaccgacc cccccagcgg cggtttcgga aagccgggaa gggcgccggt 2340

acaaaggcaa cagcgaactt gacttcttga acgcattgaa ggcatcggaa atttctgctc 2400

aggaggaact cgagcgtcga cgaacaagaa tggcgactgc gcgacctgac ctcgctcgcg 2460

aagccatcat ccccgatatg cttgagccgc gccaagtgaa ggctggaatc tttaaggatg 2520

tcaacaatac cgttgacccg agtgatgcga tggaagtgtt tggatttctg ccaccgccaa 2580

atgatttcac ccccgaggag catcaattgt tcacagacgc tttcatggcg tatccgaaga 2640

aatggggcaa gattgcagaa tctctgcctg gtcgtgattt cagacagtgc atcattcact 2700

attacctgac aaaggaagag atcaagtaca aggctaaact gaacaaacgt tggagtcgcc 2760

gtggacgggg caaagcccgc tcttcgcgac caaagtctaa cgctttgatt gctgacttgg 2820

gagtcgtcaa accggatttt gatggcgagg aggagcaacc tccgcccgtc actgatactg 2880

gtcgacctcg gcgcgcggct gcccctacgt ttggtgattc caatgattct gaaggcgctg 2940

ttgctggcag ccggcgtggc cagtccgtca aagatggcga actcacagag aagcctgctg 3000

tgcgaagagg cgggcgagcc actggcacac gcacgcaaag acgcggtgcg aaagtcgttc 3060

agcaggatcc taagagccag ccttcgactc ctcaagggag caacactccc gtccctccgg 3120

cccccaagat agaatcgggt attgatgcgc tggttgaggt tgcattgcca ccagagaagg 3180

agctcgttga aaaggaacct ttgccgtccg cttcgcgtcc gaaagcaggg cgaggtcggg 3240

caaaggacgg gatctatgtc tttgaatcca cagagacgga cccgacaaca gcaacaccca 3300

agccttctga aagtgggtat ggatcactgc aaccgactag ctactggtct gtccccgagc 3360

agcgcgattt tcctcgcttg cttgctcact ttggacgtga ctttgagggc atttccagct 3420

ttatgaagac gaagacaact gtgatggtaa gacctttccc actttcccct taacatcttc 3480

tgcctttcgc taaacattaa tcatcacagg tgaaaaacta ctaccagcga cgccttgact 3540

ctggacaaaa agatttcgag gagatcgtcc tagtcgcaga agagaagaaa gctcgcggtg 3600

agccgactgg tcctctcccg gtgccgagtg ttgctccaaa acgtcgttat gaagctaccc 3660

catcggccat catccctcgc ccgctcgcac cgcatggaga atcagtctca gaaagcgagg 3720

acgcccggtt tgcccccaag agcaaaccgg ctgtcacatc accccaaacg gttccagtgc 3780

acagtcggcc tgtggtggaa ggtgatcgga cgtcgagtcg ttatgctccc cttgcgcaag 3840

catccacgcc tggcgctaac tcaccaatgg ccgccacgta cggagatgat gctgcccgag 3900

gctcgcggac acaacctcca ccttctcgaa tgtctggacc tcgtattgga ttctttaccg 3960

aggatcgtcg cgactcgcca attctccaat caggcgctca gcgagcgtca gacatgccga 4020

tttccgcccg gcatgttgcg acgggagcca tgccacaaga gatgacggga atggagccca 4080

ttgcgctgca aacatacatg cctggtcaac catcttcgtc gctgatgcag acatctcatt 4140

cccgccacaa cagtcttact cagccgccca gctcgccagc ggcgcgcccg cggacggagc 4200

ttgagcatcc ctcttaccat cgtgatcctt tcgcaccgag ggcgtactat tctctcccgg 4260

gtcagcccac tggtctcgtt aactcccctc gtcttggaat gtcaccggtg aaggatggtc 4320

cccgtccagg tgctacgcct gtctccgaac caaccccacg ccaggtgcct gctaagcgct 4380

caaacatcat gagcattttg aacgatgagc ccgaggaccc acagcccagg aaaagatttg 4440

ctagtgaagt ttcatccaac tctggccaag gccctgcttc tggtcccgtg tcacgatcag 4500

tttaccagcc tggcgaaaag gctcgaattg atgaggctgc gcagaagccg accagctacg 4560

gtcaaccaag cccttatcaa gcgtcctccc gaggatatcc tgattacaat atgagcaatt 4620

atgggccgcc tgccaatggc ccgggaaatg ctgtcaacaa tgattggatg gctcgcttcg 4680

atccgagagc tcaacaggga ggtccgccta cccagtccca gccacctcct ccagctccat 4740

cgtctcaagt gggtcgaccg gtctcgtcaa tggccaccca aggctcctac acgcagtacg 4800

cgggtggcca atctcagcat gctgcgccgc ccttgagctc gttaccagcc ccttcccctg 4860

cgcctacacc acccccagcc agttcacagc ggcaaagtta ttccagcgtg ttttctcagc 4920

atggagttcc ctcgggcgcc cgggacctag ggccacaacc ttctccctat cgacctgcct 4980

cgcccactcc tcgagccggc agtgctgcgt atggctcacg cacagagcca tcgacagccg 5040

ctcaatcggc caatagtccg tttgctctag ccccgcgtca gctggcccag cagcactcct 5100

acacctcagc tgcctctccc acgcccgtgg gtactccaca acacagccag agctatcagc 5160

agcacgtaca aactctggtg aatggttccc atcagtcgca tcgatcgacg cccgtggcac 5220

tggggagcgg tccccaacaa tacggccaca acacgctcac accgcaagca ccgggccgct 5280

caatgccgtc acttgccagc cttggtcgat catacactcc cccttcagcc ttgcaccctg 5340

gcagtatggg ctttggtccg ccaccgccgc caggtccaag tgggatgtcg tcaatgcatc 5400

acagagcatc tgggcctggg gatcatattg ttcacccggg cggccatcat cgtgtttaca 5460

gccaggggtc caccccagga ggtcttccga gctcgatgcg ccctgggtcc cagccaccac 5520

gctaa 5525

<210> 4

<211> 6180

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccagcaagtt tccgattcgg ttcaagccct tggcacgcaa gccggctccc ggcgtgctga 60

aagagcccat gtaggtagga gccaggcact tgatcaagtc ctcctccacg ccgcccgccg 120

tggtcacgat cgctgagaca tgtttatgtt tcacaagata acgcagagtg tcccggaggc 180

cggatgagat gagattggag gtgtacccga ggaagattgt cgccctttcc ccggtttcgg 240

gatgacgaaa ggctcgctgt ccagaaaaag tcagaaccga ggcagaacaa gtcccctgcc 300

caggcattcc tgtcccccat cagcggactt cgcgtcaggc ctagtcttac ataccatctc 360

attgataatt cgggcagctt cagcgacggc gctgccttga aaccccatat gggtcatatt 420

ctcaaccatc tcagcaaccg tgatatcgcg accctggaac tggtcaaagt ccacaccacg 480

aacgatttgt gtaccctcag gaaccggctg tgaggagacg aggactgagt cggtcgccga 540

cgtggggggc gcagatgtgg tcatcgtggc gagctgggag gtgatatgaa taggactttt 600

ggacgagctc tggacactcg gtcgaatcga agctggctgg atcgagaatc cacgcacacc 660

agaccagaaa tggtatcaat tgagagatca aggctgcaca agccaggaag accacgtgga 720

tgtaatacga aaggctgagg tccagatgcg agattgggga gaggacgagg ttacactgat 780

gttcttctgt agcccttgac aatttttttt gcccctccgg ccttcaatcg tgagaatcat 840

cagcggggct ccaggccgcc ttaaggcact agtattgaca cctcaggcct cagatctact 900

cgcggagagt caagttgaca tgatgatcgg tacgaccatt accgtacatt tgccatatgc 960

gcttcatcaa agtgaaagca ctcttcgttg atccctggac tcaatggaaa tcttgagcat 1020

ccttgccacc taaaatggtg ggcttctcac catgataatg catcgaaatg attttttttg 1080

tcatgatgtt ccccagcccg agctttctcc cgtccgattt gaacgtgcga ttgtgccaag 1140

cctttctcgg ctcttgagag ccgggttgac actgccgtca cgaggccccc aggaaccaaa 1200

gaccctttcg cacgaattgc tccgttcaca gcctcactgg gattcaccga tcgtctgtgg 1260

ttgcgcgtca cgtttcatca atgccgttga ctcgacatgc acacagtaac gtgaacacag 1320

ggctcaggtt caatgggtcc tgcttctccc ggctcgcaac ctagtcatcc caccgaggaa 1380

tgccgagccc ttctcccact gaataaatgg ttaaatcgag cccgggcgcg tgccggctgt 1440

cgagggagaa ttggatgagt ccacaccgta gaattcatca tatgtggtcg cccggttgca 1500

gggccaggcg tgcgggcgtg tcggtggcgt gcacggacca ggcttcccct tttgcgacct 1560

ctgcagtttt ggcgaatcca tgtatccgtt cttgaattta gactatccat ggcccagtcg 1620

aacaagttgt ctccattttc ctggcctgcc aacccaacac cagtaggagg tttccaaccc 1680

tcaatcaggg attcaaaact cacgttttcc ccttcagata cccacagaga ggctgtatat 1740

gccagtatcc aagtttgcgc gagctgtcaa cactggaaat cattccaatc gccggtcggc 1800

ccatctcgaa ttggcagccc aattaggtcc ttcttcatgt ggtccgtgca gaagatcacg 1860

tggtaactat cttctcgttg gctcggttct ccagaggctg caactggaag gaaagtgcaa 1920

gatcccatcc tcaagactca gtggcctgtc tgtgcattcc tgcgatctcg cgacgcagga 1980

ggagactcga acgtctcatc tttgttctca gccttttcga ccttttccct tccaacccaa 2040

catctctgtc cgcaccacag acgttccttg agtgtccgga tcaccacata gcatgatctg 2100

gtaatgtctt ctcgatttcc cccttcgtcc gggtttaact cccgtgaccg ctcccctcaa 2160

cgctttgggg atcgccgaca gcatgggggg ccccgaagtg tagatgatgg gagtccttct 2220

tttggccgag aaccaccgcg tggcccgcgc gcgctcgtgg attcccctgg tcgaggtggc 2280

actttctcca gcaatgatcg tttcagtgga ggaggaggag gtggtggtgg tggaggtgga 2340

agtggaggcg gaggaggact ccctggagga gggggaggtg gcggcgctgg acgtggtcgc 2400

ggttatggcc ggggaagcga ctttcgagat cgagaccgag atcgagaccg tgacatacga 2460

gatccacgag atcgcgactt cagagactct cgagacggcc cacctccatt ccggcgcgac 2520

gtggatcgcg actacggtgg ccgtcgggac agagaattcg actcgcgccc agatcgcatt 2580

ggatttggtc gaggacgctc tcgatcaccc actcgcgact ttcgagatgc acgcgatctt 2640

ccagcccgtg atttcgatct agtgcgcatg cgacgaaatt cacgggacag tatattatcc 2700

gcttcatcgg gtggcccggt ctagaaagaa ggattacctc taaacaagtg tacctgtgca 2760

ttctgggtaa acgactcata ggagagttgt aaaaaagttt cggccggcgt attgggtgtt 2820

acggagcatt cactaggcaa ccatggttac tattgtatac catcttagta ggaatgattt 2880

cgaggtttat acctacgatg aatgtgtgtc ctgtaggctt gagagttcaa ggaagaaaca 2940

tgcaattatc tttgcgaacc cagggctggt gacggaattt tcatagtcaa gctatcagag 3000

taaagaagag gagcatgtca aagtacaatt agagacaaat atatagtcgc gtggagccaa 3060

gagcggattc ctcagtctcg taggtctctt gacgaccgtt gatctgcttg atctcgtctc 3120

ccgaaaatga aaatagctct gctaagctat tcttctcttc gccggagcct gaaggcgtta 3180

ctaggttgca gtcaatgcat taatgcattg cagatgagct gtatctggaa gaggtaaacc 3240

cgaaaacgcg ttttattctt gttgacatgg agctattaaa tcactagaag gcactctttg 3300

ctgcttggac aaatgaacgt atcttatcga gatcctgaac accatttgtc tcaactccgg 3360

agctgacatc gacaccaacg atcttatatc cagattcgtc aagctgtttg atgatttcag 3420

taacgttaag tggatggatc catctactct agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg 3480

cgatgcgctg cgaatcggga gcggcgatac cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt 3540

cgccgccaag ctcttcagca atatcacggg tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg 3600

ccacacccag ccggccacag tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat 3660

tcggcaagca ggcatcgcca tgggtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atgcgcgcct 3720

tgagcctggc gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct 3780

gatcgacaag accggcttcc atccgagtac gtgctcgctc gatgcgatgt ttcgcttggt 3840

ggtcgaatgg gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga 3900

tggatacttt ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc 3960

ccaatagcag ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa 4020

cgcccgtcgt ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc ctgcagttca ttcagggcac 4080

cggacaggtc ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg 4140

cggcatcaga gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc 4200

aagcggccgg agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat catatcgatg cttcggtaga 4260

ataggtaagt cagattgaat ctgaaataaa gggaggaagg gcgaacttaa gaaggtatga 4320

ccgggtcgtt cacttacctt gcttgacaaa cgcacaagtt atcgtgcacc aagcagcaga 4380

tgataataat gtcctcgttc ctgtctgcta ataagagtca cacttcgagc gccgccgcta 4440

ctgcttacaa gtgggctgat ctgaccagtt gcctaaatga accatcttgt caaacgacac 4500

aaattttgtg atccgcctgg acgactaaac caaaatagca ttgatgtgtt gacctccact 4560

agctccagcc aagcccaaaa atgctccttc aatatcatct tctgtcgacg ttggacgtgc 4620

gacatgagct ggtctctgac ggtgatgata acgaaggccg accttggctt gaaccgagct 4680

cactgtacat acatgaacgg aagatgagtc ttctcggctt tcatgattcc tacctgtgat 4740

tttaatttgt gccactattt ttgatgagtc gattttgttt ccctttgtgc tactaattgt 4800

atgcgttaat gttgcgccat tgacgttgaa atatgaattc agcgatttat gtctccaatt 4860

gaaagataac gtctcactca atcaatctct gaatgcagac gaaccagtct ctagttttat 4920

tacatgatag gttgtcacca ccatctgggc cgccttggca gatcgacgac catcatcatt 4980

ccatcgtaat taggcccgat cggcctgggc ttggttcatt tggctcaacg ctccagctgg 5040

ttcatgtgac tgggtagatt ccacgggtca tagtcgagat gcacaaaggc tctatccacg 5100

gttggtacac tttccaggat gtattgcaga ctttctccca cgtcgtgagc atctcgaaga 5160

cttgtctgct catcgacgac caggtcgacc tcgacattca acttgtcgcc ggcgtagtag 5220

gctttgaggt cctggatctt ttgaatcaca cgggagaaac gcatcgtcat gtataagaga 5280

atgctgtggt cgatcgggga cgcagccgca ccggtgagtc gtcgaatgta ttcactcgcg 5340

gtttgacccc aattccacat gacgtacaga gacaggagaa gaccacctag ggggtcaagg 5400

aaccacaggc gcgcaaaagc accaactaga cgggagtgat tgattagcat atctccgttc 5460

ggctacggtg actcgtatga tctaaacgtc ttgggagggg gcctggaaaa gaaagcacag 5520

ggcaaaagga gggatgaagg cactcactca aggggaaaat aatactaaac gtgttgaata 5580

tgacatcggt catcgcatcc tgagcgagga cttgaacgct gggactcggg attagccgac 5640

accagatcca gcagagtaat ttgatgatca cggtgccggc catcagagca attgaaggca 5700

ttgatagcgc cacgatggag tgatcatctc caatcaactg gttcgccgat gagagtgcaa 5760

cctgaaggaa cgatgttacc atgatcacag agaaaaccag cacggtcaag ggttccaagc 5820

gacggcgact gatgggatac cgtcggcggt cttgtcggcg gatcagggtg gtggtagtcc 5880

aaataatcac tgtactgagg aaatcgagga tcccatccac gaggcctgcc agtacggaca 5940

tggagctcgt cagggccatg atggcgatct tggcaacgag aaggatgacg ttggcggcaa 6000

agttgatgcg aatagccagg ttaaccaagc gctcttccgc ctccggggag aggcgctgct 6060

ggacatccga gtcggagtca tcaaggtcag atctaccaga ctctctcgag cgctctggat 6120

cctcatctgg gagcaaaggg accgtctcat cggggacacg atagaggtta tgaggcgtcc 6180

Claims

1.蛋白质，为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列1的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B6)降低权利要求1中所述蛋白质表达量的核酸分子；

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)或b15)：

b11)编码序列是序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列2的cDNA分子或DNA分子；

b13)序列表中序列3的DNA分子；

b14)与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

b15)在严格条件下与b11)或b12)或b13)或b14)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

B6)所述核酸分子为如下b61)或b62)或b63)或b64)：

B62)序列表中序列4所示的DNA分子；

4.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述生物材料的应用，为如下(b1)-(b6)中的至少一种：

(b1)调控微生物淀粉酶产量；

(b2)调控微生物生淀粉酶产量；

(b3)调控微生物淀粉酶相关基因的表达量；

(b4)调控微生物α-淀粉酶基因的表达量；

(b5)调控微生物糖化酶基因的表达量；

(b6)调控微生物生淀粉糖化酶基因的表达量。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述调控为正向调控。

6.一种抑制微生物生产淀粉酶能力的方法，包括：抑制出发微生物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达，或降低所述出发微生物中权利要求1所述蛋白质的含量，或抑制所述出发微生物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到目的微生物，与所述出发微生物相比，所述目的微生物的生产淀粉酶的能力下降。

7.一种制备重组微生物的方法，包括：抑制出发微生物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达，或降低所述出发微生物中权利要求1所述蛋白质的含量，或抑制所述出发微生物中权利要求1所述蛋白质的活性，得到重组微生物。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述淀粉酶为生淀粉酶。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：抑制出发微生物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达通过向所述出发微生物中导入降低权利要求1中所述蛋白质表达量的核酸分子实现。

10.采用权利要求7-9中任一所述的方法制备得到的重组微生物。