CN103740814A - 一种pbr1基因标记筛选防治根肿病潜在菌株的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种PBR1基因标记筛选防治根肿病潜在菌株的方法。该方法从待测菌株组织中提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，用PBR1引物进行PCR扩增，获得PCR产物，用1％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，选择电泳单条带约753bp的PCR产物进行测序得待测菌株的核苷酸序列与PBR1基因标记的核苷酸序列的同源性在98%以上，并且包含一个开放阅读框，则将待测菌株的核苷酸序列翻译得到氨基酸序列与抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列进行比对，如果待测菌株的氨基酸序列与所述抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列的同源性为100%，则该待测菌株为防治根肿病潜在菌株。该方法准确性高，操作简便、快速。

Description

一种PBR1基因标记筛选防治根肿病潜在菌株的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学以及基因工程技术领域，具体地说是利用一种抗菌蛋白PBR1的编码基因标记筛选具有生防潜力菌株的方法。
背景技术
十字花科蔬菜根肿病又称根瘤病，是世界性危害较严重的土传病害之一，极难防治。该病近年来在世界范围内发生日趋严重，尤其在欧洲、北美、日本、韩国等地区，已成为一种毁灭性病害，给十字花科蔬菜生产造成严重威胁。我国早在1936年，即在台湾种植的大白菜上发生；1955年国内开始报道。现今，北至黑龙江，南至广东、广西、云南均有分布。
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357是一株具有广谱抑菌作用、能有效控制根肿病、白粉病，并能高效抑制由镰刀菌引起的枯萎病、由立枯丝核菌等引起的立枯病和根腐病、由疫霉引起的疫病等根部病害。其对十字花科作物根肿病的防治效果高达70%以上，是具有广泛开发应用价值的生物菌株。
目前开发微生物制剂来控制有害生物已经成为了替代化学农药的新型环保措施，而利用拮抗微生物来防止植物病害成为了一个主要内容。在植物根际存在着大量的微生物，其中尤以细菌的种类最多，数量也最大。这些根际细菌有的对植物生长是有益的，有的是有害的，也有的是中性的。其中的芽孢杆菌属中的大多数都具有抑制土传病害的作用，因此可作为控制土传病害的一种途径即生物防治来从土壤中进行筛选、鉴定。生物防治在其他作物病害上已部分地发挥作用，但用于根肿病这类特殊病害的生物防治一直停滞不前。
发明内容
本发明提供一种PBR1基因标记筛选防治根肿病潜在菌株的方法，该方法可用于根肿病这类特殊病害生防菌的有效筛选。
本发明提供的一种PBR1基因标记筛选防治根肿病潜在菌株的方法，包括以下步骤：
（1）从待测菌株组织中提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，用PBR1引物进行PCR扩增，获得PCR产物，用1％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，选择电泳单条带约753bp的PCR产物进行测序得待测菌株的核苷酸序列；所述的PBR1引物由上游引物PBR101和下游引物PBR102组成，所述的上游引物PBR101的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述的下游引物PBR102的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；
（2）如果步骤（1）获得的待测菌株的核苷酸序列与PBR1基因标记的核苷酸序列的同源性在98%以上，并且包含一个开放阅读框，则将待测菌株的核苷酸序列在NCBI网站进行翻译得到氨基酸序列，将所得的氨基酸序列与抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列进行比对，如果待测菌株的氨基酸序列与所述抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列的同源性为100%，则该待测菌株为防治根肿病潜在菌株；所述PBR1基因标记的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
所述的PBR1基因标记筛选防治根肿病潜在菌株的方法，其步骤（1）所述的PCR扩增的反应体系为：50μl反应体系中，模板 DNA 1.0μl，5U/μlTaq DNA 聚合酶0.5μl，10mM/μl dNTP 4μl，10×TaqBuffer 5μl，10mM/μl上游引物PBR101 1.0μl，10mM/μl下游引物PBR102 1.0μl，D.D.W37.5μl； PCR扩增的条件为：94℃变5min，94℃变性1min ， 54℃退火40s ，72℃延伸1min，共30个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。
本发明的优点是采用分子标记的方法，可直接对根肿病具有抑制作用的生防菌株进行筛选，该方法准确性高，操作简便、快速。
序列表中SEQ ID NO：1所示的是PBR1基因标记的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：2所示的是PBR1引物的上游引物PBR101的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：3所示的是PBR1引物的下游引物PBR102的碱基序列。
序列表中SEQ ID NO：4所示的是抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列。
序列表中SEQ ID NO：5所示的是Z-1菌株的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：6所示的是41-1菌株的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：7所示的是6-11菌株的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：8所示的是36菌株的核苷酸序列。
序列表中SEQ ID NO：9所示的是Z-1菌株的氨基酸序列。
序列表中SEQ ID NO：10所示的是41-1菌株的氨基酸序列。
序列表中SEQ ID NO：11所示的是6-11菌株的氨基酸序列。
序列表中SEQ ID NO：12所示的是36菌株的氨基酸序列。
解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357的保藏号：CGMCC NO.2357，保藏日：2008年1月24日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）。地址：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101。该菌株获取时间：2006 年3 月，采集地：中国云南省昆明市大板桥镇大白菜根际土（原始来源）。
所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357也是在中国专利200810058919.0（授权公告号CN 101416641 B，授权公告日2011年8月17日）授权的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF-1。
附图说明
图1是Sephendex-G75凝胶层析柱分离XF1的粗蛋白的层析图；图中横坐标表示时间，纵坐标表示蛋白浓度。（XF1为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357的简称）。
图2 是图1中前、后峰蛋白液对三七根腐病菌的抑制作用。
图3是几丁质亲和层析图谱，图中横坐标表示时间，纵坐标表示蛋白浓度；第1、2个为穿透峰，第3个为吸收峰。
图4是SDS-PAGE电泳图，图中M为标准分子量蛋白 Marker；1，2表示粗蛋白样品。
图5是蛋白酶K、胰蛋白酶和RNA酶处理后的抗菌蛋白PBR1对康乃馨枯萎病菌抑菌作用，Ⅰ代表蛋白酶K处理、Ⅱ代表胰蛋白酶处理、Ⅲ代表RNA酶处理。
图6是抗菌蛋白PBR1对根肿菌孢子的裂解作用，图中A为未处理，B为处理后立即制片观察，C为处理6h，D为处理24h。
图7 是水对根肿菌孢子的抑制作用，图中A为未处理，B为处理后立即制片观察，C为处理6h，D为处理24h。
图8是抗菌蛋白PBR1的编码基因片断的PCR扩增产物，图中M为2k plus marker， 1-3道为 XF1菌株（解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357简称XF1菌株）
图9是重组原核表达载体pQE81L-PBR1图谱。
图10是诱导表达抗菌蛋白PBR1的编码基因的SDS-PAGE电泳图，泳道 1和 2 为空白载体，泳道3为Marker；泳道 4、5、6、7、8、9、10 分别为加入 IPTG 诱导 2、4、6、8、10、12、24h 后的菌体。
图11是重组原核表达载体pQE81L-PBR1表达的融合蛋白对三七根腐病菌的抑制作用，A为融合蛋白，B为CK。
图12 是融合蛋白对根肿菌孢子的抑制作用，A为未处理，B为处理24h后。
图13是重组原核表达载体pQE30-PBR1图谱。
图14是诱导表达抗菌蛋白PBR1的编码基因的SDS-PAGE 电泳图，泳道 1和 2 为空白载体，M为Marker，泳道 3、4、5、6、7、8、9分别为加入 IPTG 诱导 2、4、6、8、10、12、24h 后的菌体。
图15是融合蛋白对根肿菌孢子的抑制作用，A为未处理，B为处理24h后。
图16是重组原核表达载体pHT43-PBR1图谱。
图17是重组原核表达载体pHT43-PBR1的融合蛋白对根肿菌孢子的抑制作用，A为未处理，B为处理 24h 后。
图18是Z-1菌株处理的芸薹根肿菌厚垣孢子，图中A为空白，B为处理24h，C为处理48h。
图19是 36菌株处理的芸薹根肿菌厚垣孢子，图中A为空白，B为处理24h，C为处理48h。
图20是 41-1菌株处理的芸薹根肿菌厚垣孢子，图中A为空白，B为处理24h，C为处理48h。
图21是6-11菌株处理的芸薹根肿菌厚垣孢子，图中A为空白，B为处理24h，C为处理48h。
下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂、各菌株等，均可从商业途径得到。各种菌株可通过如中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心等微生物保藏机构购买到。
实施例1：抗菌蛋白PBR1的制备及其性质
1、抗菌蛋白PBR1的制备
（1）取解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357接种于LB液体培养基中，于30℃，170rpm振荡培养48h后，得到发酵液。
（2）将步骤（1）得到的发酵液分离纯化，即得到目的蛋白；所述分离纯化方法为：
①硫酸铵沉淀：取步骤（1）得到的发酵液，于4℃，8000rpm 离心10min 后，收集上清液，采用盐析法，向发酵液中加入80% 饱和度的固体硫酸铵，4℃沉淀 24h左右，于12000 rpm冷冻高速离心30min，收集沉淀。
②透析：将步骤收集的沉淀经灭菌水溶解后装入透析袋，截留分子量为3000 Da，在冰上用灭菌水进行透析，透析时间30h，期间换灭菌水3次，透析袋内液即为粗蛋白，将获得的粗蛋白转移到已灭菌的适当的培养皿或烧杯中，用干净的薄膜封口后用针头在薄膜上均匀扎出一定量的孔洞。将培养皿放入-80℃冰箱，开启冷冻浓缩干燥仪，进行24h浓缩处理，即得浓缩的粗蛋白。
③LP 层析仪层析
用pH7.0浓度为0.02M/L的磷酸缓冲液溶胀胶体48h，待胶体充分溶胀好后，再用pH7.0浓度为0.02M/L的磷酸缓冲液平衡凝胶柱过夜；取浓缩的粗蛋白2mL轻轻加到凝胶柱上，然后用pH7.0浓度为0.02M/L的缓冲液进行洗脱（即用相同的缓冲液进行洗脱），流速为 1mL/min，利用LP层析仪中紫外分光光度计检测流出蛋白的OD值并调零，当 OD值上升时开始收集蛋白，每3min一管分步收集洗脱液，以三七根腐病菌为指示菌，进行抑菌活性的检测，收集具有抑菌活性的粗蛋白。
④Sephadex-G75 凝胶柱层析
将Sephendex-G75超纯水溶胀72小时装柱，将收集的具有抑菌活性的粗蛋白上样，纯水溶洗脱，流速为0.5mL /min，280nm下检测，每5 min收集一管，根据洗脱曲线，分别取各收集峰液体，以三七根腐病菌为指示菌，检测抑菌活性，分别收集活性峰的洗脱液，冷冻干燥备用。
具有抑菌活性的粗蛋白上Sephendex-G75 凝胶柱层析，其检测结果如图 1 所示，得到明显的2个吸收峰。将收集得到的 2 个峰的试管中的蛋白进行抑菌活性检测。前峰流出的组分与后峰流出的组分均具有抑菌作用（见图2）。后峰的抑菌圈为1.8cm，前峰的抑菌圈为1.5cm。
⑤几丁质亲和层析
将步骤（2）④收集到的后峰洗脱液，进行几丁质亲和层析。将制备好的胶体几丁质装柱（1.5×50cm）后，用pH4.0浓度0.02mol/L的乙酸钠缓冲液冲洗平衡亲和柱。调节流速1.0mol/ min，流出液体达4倍时上样，由柱的上端加入40mL的后峰洗脱液样品，同时收集流出液，当样品液靠近几丁质顶端时，立即加pH4.0浓度0.02mol/L的乙酸钠缓冲液洗涤，后再加入pH7.4 浓度0.02mol/L 的磷酸缓冲液冲洗样品，使非亲和蛋白质洗脱下来。待缓冲液面靠近几丁质柱时加入 0.2mol/L甘氨酸-氢氧化钠，同时用梯度浓度为0-1.0mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，根据层析曲线如图3所示，亲和层析后出现3个峰，第1、2个为穿透峰，第3个为吸收峰，收集吸收峰液即为收集液冷冻备用。
2、SDS-PAGE分析
经过乙酸钠缓冲液以及磷酸缓冲液洗脱掉经步骤（2）⑤几丁质亲和层析的吸收峰杂蛋白后，最后用NaOH-甘氨酸缓冲液洗脱出的蛋白经过SDS-PAGE检测，可见一条单一的蛋白条带，分子量约25KD左右，初步判断纯化后的蛋白组分为单一蛋白，如图4所示。将该清晰条带小心挖出，放入干净的离心管中，编号送往上海生工作氨基酸序列测定，既是SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。将该序列同XF-1基因组比对后与其中的一个蛋白的序列同源性为40%，初步确定该蛋白的碱基与氨基酸序列，并将该蛋白暂时命名为PBR1（Plasmodiophora brassicae resistance 1）。因此，步骤（2）④收集液（吸收峰液）即为本发明所述的抗菌蛋白PBR1。
3、抗菌蛋白PBR1的理化性质
（1）热稳定性的测定
将上述分离纯化得到的抗菌蛋白PBR1液分别置于30℃、50℃、70℃、100℃下保温10min，用三七根腐菌做抑菌实验，在30℃、50℃、70℃三个温度下其抑菌圈半径没有区别，约为1.2cm。而在100℃处理下，抑菌活性有所减弱，抑菌圈半径约为0.8cm。说明该蛋白具有一定的热稳定性。
（2）对蛋白酶的稳定性
将上述分离纯化得到的抗菌蛋白PBR1液分别用蛋白酶K、胰蛋白酶和RNase I处理，每种酶使用浓度500μg/mL，37℃水浴中处理1h。以康乃馨枯萎病菌（Fusarium oxysporum）为指示菌，以未经处理的上述分离纯化得到的抗菌蛋白PBR1液为对照，进行抑菌活性测定。
当用蛋白酶K、胰蛋白酶和RNA酶处理上述分离纯化得到的抗菌蛋白PBR1液后，该抗菌蛋白PBR1液对康乃馨枯萎病菌的抑菌活性基本不变（图5）。围绕着牛津杯周围有两个不同的圆圈，内圈为抑菌圈，外圈为促进生长的垫状菌丝圈。表明上述分离纯化得到的抗菌蛋白PBR1及扩散到外圈的物质对这3种酶都不敏感。
（3）对紫外线的稳定性
将上述分离纯化得到的抗菌蛋白PBR1分别经紫外照射（20W，距离40cm）10min、30min和60min后，以康乃馨枯萎病菌为指示菌，进行抑菌活性测定，以不经紫外照射处理的为对照。
随着紫外线光照时间的增长，该抗菌蛋白PBR1对康乃馨枯萎病菌的抑菌活性没有明显降低，扩散较远的成份促进菌株生长的作用也未改变，表明抗菌蛋白PBR1对紫外照射不敏感。
实施例2：抗菌蛋白PBR1对根肿菌孢子的抑制作用
抗菌蛋白PBR1对根肿菌孢子具有很强的裂解作用，加入抗菌蛋白PBR1后，可见孢子聚集成链状或团状（图6B）。6h后可见根肿菌孢子的细胞壁明显变薄且孢子的形态开始变为畸形（图6C），24h后已经可见孢子裂解，细胞内涵物外渗（图6D）。而对照中（水、缓冲液）孢子均未发生变化（图7）。
实施例3：抗菌蛋白PBR1抑菌谱的测定
通过对11个真菌菌株的抑制作用来看，分离的抗菌蛋白PBR1对病原菌具有广谱的抑制作用（见表1），它不仅对重大气传病害水稻稻瘟病菌有很好的抑制作用，而且对番茄灰霉病菌、小麦全蚀病、石榴枯萎病也有很好的抑制作用。这些病原菌包括半知菌亚门的镰刀菌属（Fusarium）、子囊菌亚门的长喙壳属（Ceratocystis）、以及半知菌亚门的葡萄孢属（Botrytis）。
Figure 48579DEST_PATH_IMAGE001
 
实施例4：抗菌蛋白PBR1的编码基因即PBR1基因标记的克隆
1、 PBR1基因标记的扩增引物的设计
根据获得的抗菌蛋白PBR1的测序得到的氨基酸序列推导出其核苷酸的序列而设计出扩增该抗菌蛋白PBR1的编码基因的PBR1引物，PBR1引物由上游引物PBR101和下游引物PBR102组成，所述的上游引物PBR101的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述的下游引物PBR102的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。
2、 PBR1基因标记的克隆
按CTAB法提取XF1菌株的基因组DNA，以XF1菌株基因组DNA为模板，扩增XF1菌株的抗菌蛋白的基因片段，预计扩增片断大小为751bp。PCR反应体系为：50μL，内含10×Buffer 5μL、TaqDNA聚合酶(5U/μL，Takara) 0.5μL、10mM/μL dNTP 4μL、10mM/μL上游引物PBR101引物1.0μL、10mM/μL下游引物PBR102 1.0μL、ddH2O 37.5μL；PCR的反应程序为：94℃ 5min，94℃ 1min，54℃ 40sec，72℃ 1min，共30个循环，最后72℃下延伸10min。所得到PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分离检测（见图8），将得到的纯化PCR产物克隆到pMD18-T载体中，转入大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆送上海生物工程有限公司测序。对测得的序列进行比对析，得到PBR1基因标记的全长序列，既是SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，为一个753bp长片段的完整ORF框，编码239个氨基酸。
利用 NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）网站上提供的核酸比对软件 Blastn 对测得的序列进行比较表明：从XF1 菌株克隆的PBR1基因标记的序列全长 753bp, 为一个完整的 ORF框，与已发表的对根肿菌孢子没有抑制作用的Bacillus subtilis 168（AL009126.3）相比，核苷酸序列有15个碱基差异，碱基突变位点为第 34、108、114、148、176、216、217、240、273、286、399、520、576、638、656 位，同源性为 98%（738/753）。
实施例5：PBR1基因标记的在大肠杆菌中的诱导表达及功能验证
1、一种重组原核表达载体pQE81L-PBR1的构建及其功能验证
（1）构建重组原核表达载体pQE81L-PBR1
提取阳性克隆质粒pMD18-T/ PBR1经BamHI和KpnI双酶后电泳回收目的片段，与原核表达载体pQE81L质粒经BamHI和KpnI双酶切后电泳回收片段用试剂盒进行连接，构建重组原核表达载体pQE81L-PBR1（图9）。将含有目的基因(抗菌PBR1的编码基因)的重组原核表达载体pQE81L-PBR1转化入大肠杆菌BL21，挑取阳性菌落，摇菌提取质粒进行PCR验证，将证实为阳性克隆的菌落接种于装有10mL的LB液体培养基（加AMP100μl/mL）试管中进行扩大培养，在37℃摇床上170 rpm震荡培养6h，并加入20 μl 100mM IPTG进行诱导培养。同时也将XF1菌株和大肠杆菌BL21分别活化后接种到10mL的LB液体培养基试管中，作为阳性和阴性对照。离心后的菌体加入2mL缓冲液（100mM Tris-Hcl pH8.0，300mM NaCl，1mM PMSF），充分悬浮后用液氮冷冻，立即放入42℃水浴锅中溶解，将得到的裂解物12,000rpm离心1min后，取上清，加入1×SDS-PAGE上样buffer，混匀，95℃水浴5min后进行SDS-PAGE电泳。
表达产物经 SDS-PAGE 电泳检测后，在 25kD 位置处有表达条带，与预期蛋白大小一致。蛋白在 IPTG 诱导 2h 开始表达，6h 达到最大值。而未经诱导的蛋白没有表达的条带（图10）。
（2）表达的融合蛋白的抑制作用
表达后的融合蛋白用超声波破碎仪破壁后，以三七根腐病菌为指示菌，将破壁后的融合蛋白加入牛津杯内，可知表达的融合蛋白对病原菌具有抑制作用（图11A），菌丝生长稀疏，抑菌圈直径为0.5cm，而对照（图11B）中，菌丝生长茂盛。
将融合蛋白与根肿菌孢子悬浮液混合后，24h 后制片在显微镜下观察，可知孢子膨胀，且细胞壁出现裂口，继而消融，内容物外泄（箭头所示处）。可见重组原核表达载体pQE81L-PBR1融合蛋白对根肿菌孢子具有抑制作用（图12）。
2、重组原核表达载体pQE30-PBR1的构建及功能验证
（1）构建重组原核表达载体pQE30-PBR1
提取阳性克隆质粒pMD18-T/ PBR1经BamHI和KpnI双酶后电泳回收目的片段，与原核表达载体pQE30质粒经BamHI和KpnI双酶切后电泳回收片段用试剂盒进行连接，构建重组原核表达载体pQE30-PBR1（图13）。将含有目的基因(抗菌PBR1的编码基因)的重组原核表达载体pQE30-PBR1转化入大肠杆菌BL21，挑取阳性菌落，摇菌提取质粒进行PCR验证，将证实为阳性克隆的菌落接种于装有10mL的LB液体培养基（加AMP100μl/mL）试管中进行扩大培养，在37 ℃ 摇床上170 rpm震荡培养6h，并加入20 μl 100mM IPTG进行诱导培养。同时也将XF1菌株和大肠杆菌BL21分别活化后接种到10mL的LB液体培养基试管中，作为阳性和阴性对照。离心后的菌体加入2mL缓冲液（100mM Tris-Hcl pH8.0，300mM NaCl，1mM PMSF），充分悬浮后用液氮冷冻，立即放入42℃水浴锅中溶解，将得到的裂解物12,000rpm离心1min后，取上清，加入1×SDS-PAGE上样buffer，混匀，95℃水浴5min后进行SDS-PAGE电泳。
表达产物经 SDS-PAGE 电泳检测后，在 25kD 位置处有表达条带，与预期蛋白大小一致。蛋白在 IPTG 诱导 2h 开始表达，6h 达到最大值。而未经诱导的蛋白没有表达的条带（图 14）。
（2）表达的融合蛋白的抑制作用
将融合蛋白与根肿菌孢子悬浮液混合后，24h后制片在显微镜下观察，可知孢子膨胀，且细胞壁出现裂口，继而消融，内容物外泄（箭头所示处）。可见重组原核表达载体pQE30-PBR1表达的融合蛋白对根肿菌孢子具有抑制作用（图15）。
实施例6  PBR1基因标记的在枯草芽孢杆菌 168中的诱导表达及功能验证
1、重组原核表达载体pHT43-PBR1的构建
重组原核表达载体pHT43-PBR1是枯草芽孢杆菌表达的携带有外泌信号肽的表达载体，能够将诱导的目的蛋白分泌到细胞膜外；受体细胞是枯草芽孢杆菌 168，它对根肿菌孢子没有抑制作用。
提取阳性克隆质粒pMD18-T/ PBR1经BamHI和Aat II双酶后电泳回收目的片段，与原核表达载体pHT43质粒经BamHI和Aat II双酶切后电泳回收片段用试剂盒进行连接，构建重组原核表达载体pHT43-PBR1（图16）。将含有目的基因(抗菌PBR1的编码基因)的重组原核表达载体pHT43-PBR1转化入枯草芽孢杆菌 168 ，挑取阳性菌落，摇菌提取质粒进行PCR验证，将证实为阳性克隆的菌落接种于装有10mL的LB液体培养基（加AMP100μl/mL）试管中进行扩大培养，在37 ℃ 摇床上170 rpm震荡培养6h，并加入20 μl 100mM IPTG进行诱导培养。
2、表达的融合蛋白的抑制作用
将诱导去菌体后的上清液与根肿菌孢子悬浮液混合后，24h 后制片在显微镜下观察，可知孢子膨胀，且细胞壁出现裂口，继而消融，内容物外泄（箭头所示处）。可见重组原核表达载体pHT43-PBR1在枯草芽孢杆菌 168中表达的融合蛋白对根肿菌孢子具有抑制作用（图 17）。
实施例7  本发明方法
本发明一种PBR1基因标记筛选防治根肿病潜在菌株的方法，包括以下步骤：
（1）从待测菌株组织中提取基因组DNA（常规细菌DNA提取方法），以提取的基因组
DNA为模板，用PBR1引物进行PCR扩增，获得PCR产物，用1％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，选择电泳单条带约753bp的PCR产物进行测序得待测菌株的核苷酸序列；所述的PBR1引物由上游引物PBR101和下游引物PBR102组成，所述的上游引物PBR101的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述的下游引物PBR102的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；
（2）如果步骤（1）获得的待测菌株的核苷酸序列与PBR1基因标记的核苷酸序列的同源性在98%以上，并且包含一个开放阅读框，则将待测菌株的核苷酸序列在NCBI网站进行翻译得到氨基酸序列，将所得的氨基酸序列与抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列进行比对，如果待测菌株的氨基酸序列与所述抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列的同源性为100%，则该待测菌株为防治根肿病潜在菌株；所述PBR1基因标记的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
步骤（1）所述的PCR扩增的反应体系为：50μl反应体系中，模板 DNA 1.0μl，5U/μlTaq DNA 聚合酶0.5μl，10mM/μl dNTP 4μl，10×TaqBuffer 5μl，10mM/μl上游引物PBR101 1.0μl，10mM/μl下游引物PBR102 1.0μl，D.D.W37.5μl； PCR扩增的条件为：94℃变5min，94℃变性1min ， 54℃退火40s ，72℃延伸1min，共30个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。
 实施例8  筛选防治根肿病潜在菌株
按照上述实施的方法，对55株芽孢杆菌进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。有14个菌株可以获得扩增产物，大小约750bp，与预期的PBR1基因片段大小相符，初步表明扩增产物为PBR1基因片段。
实施例9
上述14个待测菌株扩增的PBR1基因片段序列与 PBR1基因标记序列的同源性比较
将14个待测菌株的PBR1基因测序，其中有4个菌株（Z-1菌株、41-1菌株、6-11菌株、36菌株）全长为753bp，包含一个开放阅读框（ORF），起始密码子和终止密码子，编码250个氨基酸、约为25kD的蛋白质，另10个菌株基因全长为752bp，无完整的阅读框。
   （1）Z-1菌株的PBR1基因序列全长753bp，与PBR1基因标记序列相比，有7个碱基差异，碱基突变位点为第21、214、398、488、530、547、596位，同源性为99% (746/753)。
  （2）41-1菌株的PBR1基因序列全长753bp, 与PBR1基因标记序列相比，核苷酸序列同源性为100% (753/753)。
   （3）6-11菌株的PBR1基因序列全长753bp, 与PBR1基因标记序列相比，有1个碱基差异，碱基突变位点为第21，同源性为99.87% (752/753)。
   （4）36菌株的PBR1基因序列全长753bp，与PBR1基因标记序列相比，核苷酸序列有4个碱基差异，碱基突变位点为第21、88、523、605，同源性为99.47% (749/753)。
实施例10  
上述4个待测菌株扩增PBR1基因片段翻译的氨基酸序列与PBR1基因标记编码的抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列的同源性比较
通过翻译后的氨基酸序列比对结果，可知：
1）Z-1菌株的氨基酸序列同抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列在第72、133、165、177、183、199位上的氨基酸发生了变化，分别由苯丙蛋氨酸代替了异亮氨酸、缬氨酸代替了天冬氨酸、组氨酸代替了亮氨酸、精氨酸代替了苏氨酸、组氨酸代替了天冬酰胺、色氨酸代替了丝氨酸。同源性为97.60%
2）41-1菌株的氨基酸序列同抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列同源性为100%。氨基酸序列没有任何的变化。
3）6-11菌株的氨基酸序列同抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列同源性为100%。氨基酸序列没有任何的变化。
4）36菌株的氨基酸序列同抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列在第30、175、202位上的氨基酸发生了变化，分别由苯丙氨酸代替了亮氨酸，亮氨酸代替了异亮氨酸，天冬酰胺代替了丝氨酸。同源性为98.80%。
实施例11  菌株对根肿菌孢子的抑制作用
将上述4个待测菌株：Z-1菌株、41-1菌株、6-11菌株、36菌株在LB培养基上活化后，接种到液体LB培养基中发酵培养24h后在冷冻离心机中离心，收集上清液。按1:1的比例与根肿菌孢子悬浮液混合，以加水的为对照于24和48h后用伊文斯兰染色剂染色后制片于显微镜下观察。
如图18可见：死亡的孢子染色后显蓝色（黑白图中为深色），而未死亡的孢子不着色。空白对照中的根肿病菌孢子不着色（图18A），而用Z-1菌株发酵上清液处理过的孢子死亡率与对照相比变化不大，处理24h后，孢子死亡率达10%（图18B）。随着处理时间的延长，在48h后，孢子死亡数量也未有所变化。因此，可以断定，Z-1菌株发酵上清液对芸薹根肿菌的孢子不具有抑制作用。
如图19可见：死亡的孢子染色后显蓝色（黑白图中为深色），而未死亡的孢子不着色。空白对照中的根肿病菌孢子不着色（图19A），而用36菌株发酵上清液处理过的孢子死亡率与对照相比变化不大，处理24h后，孢子死亡率达10%（图19B）。随着处理时间的延长，在48h后，孢子死亡数量有一点增加，约为15%。因此，可以断定，36菌株发酵上清液对芸薹根肿菌的孢子基本上也不具有抑制作用。
如图20可见：死亡的孢子染色后显蓝色（黑白图中为深色），而未死亡的孢子不着色。空白对照中的根肿病菌孢子不着色（图20A），而用41-1菌株发酵上清液处理过的孢子死亡率有所增加，处理24h后，孢子死亡率达50%（图20B）。随着处理时间的延长，在48h后，孢子死亡数量增加，死亡率达80%以上，而空白对照孢子未见变化。因此，可以断定，41-1菌株发酵上清液对芸薹根肿菌的孢子具有抑制作用。
如图21可见：死亡的孢子染色后显蓝色（黑白图中为深色），而未死亡的孢子不着色。空白对照中的根肿病菌孢子不着色（图21A），而用6-11菌株发酵上清液处理过的孢子死亡率有所增加，处理24h后，孢子死亡率达90%（图21B）。随着处理时间的延长，在48h后，孢子死亡数量增加，死亡率为100%，视野下的孢子基本上全部死亡。而空白对照孢子未见变化。因此，可以断定，6-11菌株发酵上清液对芸薹根肿菌的孢子具有抑制作用，且作用效果显著，速度快。
以上实验表明本发明方法可直接对根肿病具有抑制作用的潜在菌株进行筛选，该方法准确性高，操作简便快速。 
                      
<110>  云南农业大学
 
<120>  一种PBR1基因标记筛选防治根肿病潜在菌株的方法
 
<130>  /
 
<160>  12   
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
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<212>  DNA
<213>  解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357 
 
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<213>  解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357
 
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<212>  PRT
<213>  解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）XF1菌株CGMCC NO.2357
 
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Met Lys Lys Val Leu Ile Ala Gly Ala Val Gly Thr Ala Val Leu Phe
1               5                   10                  15       
Gly Thr Leu Ser Ser Gly Val Leu Gly Leu Pro Ala Ala Asp Thr Gln
            20                  25                  30            
Val Ala Lys Ala Ala Ser Gln Leu Pro Lys Gly Ile Gly Gly Arg Ala
        35                  40                  45               
Tyr Leu Asn Ser Thr Gly Ala Val Phe Thr Ala Lys Ile Lys Leu Pro
    50                  55                  60                   
Asp Thr Val Lys Asn Asp Asp Ser Val Ser Thr Pro Tyr Ile Tyr Ser
65                  70                  75                  80 
Gly Phe Arg Ala Thr Ser Gly Thr Glu Ala Asp Ile Gly Leu Gln Tyr
                85                  90                  95     
Ser Lys Gln Tyr Asn Val Trp Lys Pro Leu Met Lys Val Gly Ala Lys
            100                 105                 110        
 
Asn Glu Glu Thr Tyr Thr Glu Gly Lys Asp Lys Phe Thr Tyr Lys Lys
        115                 120                 125               
Gly Phe Arg Pro Gly Ser Thr Val Gln Met Thr Ile Tyr Lys Asn Leu
    130                 135                 140                  
Asn Gly Asn Thr Arg Met Thr Leu Trp Gly Thr Asn Asn Asp Gly Tyr
145                 150                 155                 160   
Thr Gly Arg Ile Ile Thr Glu Ile Gln Gly Thr Asn Ile Gly Thr Ile
                165                 170                 175       
Ser Lys Trp Lys Thr Leu Ala Thr Ala Ala Val Ser Tyr Glu Ser Gln
            180                 185                 190          
Arg Asn Ser Ile Lys Ala Thr Phe Ser Thr Ala Phe Asn Asn Ile Thr
        195                 200                 205               
Ile Asp Asn Lys Ala Val Thr Pro Val Val Asp Thr Gln Asp Phe Ala
    210                 215                 220                   
Lys Val Ser Val Ser Gly Asn Asn Val Thr Ile Ser Val Asn Lys
225                 230                 235                
 
  
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<213>  芽孢杆菌( Bacillus )
 
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Ile Ala Gly Ala Val Gly Thr Ala Val Leu Phe Gly Thr Leu Ser Ser
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Ser Thr Val Gln Met Thr Ile Tyr Lys Asn Leu Ser Gly Asn Thr Arg
145                 150                 155                 160   
Met Thr Leu Trp Gly Thr Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Gly Arg Ile Ile
                165                 170                 175      
Thr Glu Ile Gln Gly Thr Asn Ile Gly Thr Ile Ser Lys Trp Lys Thr
            180                 185                 190          
Leu Ala Thr Ala Ala Val Ser Tyr Glu Ser Gln Arg Asp Ala Ile Lys
        195                 200                 205              
Ala Thr Phe Ser Thr Ser Phe Asn Asn Ile Thr Ile Asp Asn Lys Ala
    210                 215                 220                
 
 
Val Thr Pro Val Val Asp Thr Gln Asp Phe Ala Lys Val Ser Val Ala
225                 230                 235                 240   
Gly Asn Asn Val Thr Ile Ser Val Asn Lys
                245                 250
  
<210>  10
<211>  249
<212>  PRT
<213>  芽孢杆菌( Bacillus )
 
<400>  10
 
Met Ala Lys Pro Leu Ser Lys Gly Gly Ile Leu Met Lys Lys Val Leu
1               5                   10                  15        
Ile Ala Gly Ala Val Gly Thr Ala Val Leu Phe Gly Thr Leu Ser Ser
            20                  25                  30           
Gly Ile Pro Gly Leu Pro Ala Ala Asp Ala Gln Val Ala Lys Ala Ala
        35                  40                  45               
Ser Gln Leu Pro Asn Gly Ile Gly Gly Arg Ala Tyr Leu Asn Ser Thr
    50                  55                  60                   
Gly Ala Val Phe Thr Ala Lys Ile Thr Leu Pro Glu Thr Val Lys Asn
65                  70                  75                  80    
Asn Asp Ser Val Ser Thr Pro Tyr Ile Tyr Ser Gly Phe Arg Ala Ser
                85                  90                  95        
Ser Gly Thr Glu Ala Asp Ile Gly Leu Gln Tyr Ser Lys Gln Tyr Asn
            100                 105                 110           
Val Trp Lys Pro Leu Met Lys Val Gly Ser Lys Asn Glu Glu Thr Tyr
        115                 120                 125               
Ile Glu Gly Lys Asp Lys Phe Thr Tyr Asn Lys Gly Phe Arg Pro Gly
    130                 135                 140                   
Ser Thr Val Gln Met Thr Ile Tyr Lys Asn Leu Ser Gly Asn Thr Arg
145                 150                 155                 160
  
Met Thr Leu Trp Gly Thr Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Gly Arg Ile Ile
                165                 170                 175       
Thr Glu Ile Gln Gly Thr Asn Ile Gly Thr Ile Ser Lys Trp Lys Thr
            180                 185                 190          
Leu Ala Thr Ala Ala Val Ser Tyr Glu Ser Gln Arg Asp Ala Ile Lys
        195                 200                 205               
Ala Thr Phe Ser Thr Ser Phe Asn Asn Ile Thr Ile Asp Asn Lys Ala
    210                 215                 220                   
Val Thr Pro Val Val Asp Thr Gln Asp Phe Ala Lys Val Ser Val Ala
225                 230                 235                 240   
Gly Asn Asn Val Thr Ile Ser Val Asn
                245                
 
 
<210>  11
<211>  249
<212>  PRT
<213>  芽孢杆菌( Bacillus )
 
<400>  11
 
Met Ala Lys Pro Leu Ser Lys Gly Gly Ile Leu Met Lys Lys Val Leu
1               5                   10                  15        
Ile Ala Gly Ala Val Gly Thr Ala Val Leu Phe Gly Thr Leu Ser Ser
            20                  25                  30            
Gly Ile Pro Gly Leu Pro Ala Ala Asp Ala Gln Val Ala Lys Ala Ala
        35                  40                  45                
Ser Gln Leu Pro Asn Gly Ile Gly Gly Arg Ala Tyr Leu Asn Ser Thr
    50                  55                  60                    
Gly Ala Val Phe Thr Ala Lys Ile Thr Leu Pro Glu Thr Val Lys Asn
65                  70                  75                  80    
Asn Asp Ser Val Ser Thr Pro Tyr Ile Tyr Ser Gly Phe Arg Ala Ser
                85                  90                  95     
 
Ser Gly Thr Glu Ala Asp Ile Gly Leu Gln Tyr Ser Lys Gln Tyr Asn
            100                 105                 110           
Val Trp Lys Pro Leu Met Lys Val Gly Ser Lys Asn Glu Glu Thr Tyr
        115                 120                 125               
Ile Glu Gly Lys Asp Lys Phe Thr Tyr Asn Lys Gly Phe Arg Pro Gly
    130                 135                 140                   
Ser Thr Val Gln Met Thr Ile Tyr Lys Asn Leu Ser Gly Asn Thr Arg
145                 150                 155                 160  
Met Thr Leu Trp Gly Thr Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Gly Arg Ile Ile
                165                 170                 175       
Thr Glu Ile Gln Gly Thr Asn Ile Gly Thr Ile Ser Lys Trp Lys Thr
            180                 185                 190           
Leu Ala Thr Ala Ala Val Ser Tyr Glu Ser Gln Arg Asp Ala Ile Lys
        195                 200                 205               
Ala Thr Phe Ser Thr Ser Phe Asn Asn Ile Thr Ile Asp Asn Lys Ala
    210                 215                 220                   
Val Thr Pro Val Val Asp Thr Gln Asp Phe Ala Lys Val Ser Val Ala
225                 230                 235                 240   
Gly Asn Asn Val Thr Ile Ser Val Asn
                245                
 
 
<210>  12
<211>  250
<212>  PRT
<213>  芽孢杆菌( Bacillus )
 
<400>  12
 
Met Ala Lys Pro Leu Ser Lys Gly Gly Ile Leu Met Lys Lys Val Leu
1               5                   10                  15        
Ile Ala Gly Ala Val Gly Thr Ala Val Leu Phe Gly Thr Phe Ser Ser
            20                  25                  30         
  
Gly Ile Pro Gly Leu Pro Ala Ala Asp Ala Gln Val Ala Lys Ala Ala
        35                  40                  45                
Ser Gln Leu Pro Asn Gly Ile Gly Gly Arg Ala Tyr Leu Asn Ser Thr
    50                  55                  60                    
Gly Ala Val Phe Thr Ala Lys Ile Thr Leu Pro Glu Thr Val Lys Asn
65                  70                  75                  80    
Asn Asp Ser Val Ser Thr Pro Tyr Ile Tyr Ser Gly Phe Arg Ala Ser
                85                  90                  95        
Ser Gly Thr Glu Ala Asp Ile Gly Leu Gln Tyr Ser Lys Gln Tyr Asn
            100                 105                 110           
Val Trp Lys Pro Leu Met Lys Val Gly Ser Lys Asn Glu Glu Thr Tyr
        115                 120                 125               
Ile Glu Gly Lys Asp Lys Phe Thr Tyr Asn Lys Gly Phe Arg Pro Gly
    130                 135                 140                   
Ser Thr Val Gln Met Thr Ile Tyr Lys Asn Leu Ser Gly Asn Thr Arg
145                 150                 155                 160   
Met Thr Leu Trp Gly Thr Asn Asn Asp Gly Tyr Thr Gly Arg Leu Ile
                165                 170                 175       
Thr Glu Ile Gln Gly Thr Asn Ile Gly Thr Ile Ser Lys Trp Lys Thr
            180                 185                 190           
Leu Ala Thr Ala Ala Val Ser Tyr Glu Asn Gln Arg Asp Ala Ile Lys
        195                 200                 205              
Ala Thr Phe Ser Thr Ser Phe Asn Asn Ile Thr Ile Asp Asn Lys Ala
    210                 215                 220                
Val Thr Pro Val Val Asp Thr Gln Asp Phe Ala Lys Val Ser Val Ala
225                 230                 235                 240   
Gly Asn Asn Val Thr Ile Ser Val Asn Lys
                245                 250
 
 

Claims (2)

1.一种PBR1基因标记筛选防治根肿病潜在菌株的方法，包括以下步骤：
（1）从待测菌株组织中提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，用PBR1引物进行PCR扩增，获得PCR产物，用1％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳检测，选择电泳单条带约753bp的PCR产物进行测序得待测菌株的核苷酸序列；所述的PBR1引物由上游引物PBR101和下游引物PBR102组成，所述的上游引物PBR101的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示，所述的下游引物PBR102的碱基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示；
（2）如果步骤（1）获得的待测菌株的核苷酸序列与PBR1基因标记的核苷酸序列的同源性在98%以上，并且包含一个开放阅读框，则将待测菌株的核苷酸序列翻译得到氨基酸序列与抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列进行比对，如果待测菌株的氨基酸序列与所述抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列的同源性为100%，则该待测菌株为防治根肿病潜在菌株；所述PBR1基因标记的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，所述抗菌蛋白PBR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.根据权利要求1所述的PBR1基因标记筛选防治根肿病潜在菌株的方法，步骤（1）所述的PCR扩增的反应体系为：50μl反应体系中，模板 DNA 1.0μl，5U/μlTaq DNA 聚合酶0.5μl，10mM/μl dNTP 4μl，10×TaqBuffer 5μl，10mM/μl上游引物PBR101 1.0μl，10mM/μl下游引物PBR102 1.0μl，D.D.W37.5μl； PCR扩增的条件为：94℃变5min，94℃变性1min ， 54℃退火40s ，72℃延伸1min，共30个循环，再72℃延伸10min，4℃保温。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117511989A (zh) * 2023-11-08 2024-02-06 安徽农业大学 一种筛选根肿菌功能基因方法

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