CN114015801A - 一种甘蓝根肿病抗性鉴定的InDel分子标记引物及应用 - Google Patents

一种甘蓝根肿病抗性鉴定的InDel分子标记引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘蓝根肿病抗性鉴定的InDel分子标记引物及应用，所述的分子标记的引物为BOCR‑InDel‑F：GTTACCATTTTCCTTTGCTTTTGTGT和BOCR‑InDel‑R：ATCTTGAATGGATAGTTTTCAAGATCA。本发明开发的分子标记是基于282份不同遗传背景的甘蓝基因组重测序信息，在抗病连锁区间内进行特异性InDel鉴定后得到的，在分离群体进行验证时，其检测结果与单株抗性完全吻合，在96份甘蓝类蔬菜(结球甘蓝、青花菜、花椰菜)的不同品种中测试时显示了良好的适用性，可用于甘蓝抗根肿病鉴定或者育种中的筛选工作。

Description

一种甘蓝根肿病抗性鉴定的InDel分子标记引物及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘蓝根肿病抗性鉴定的InDel分子标记引物及应用。
背景技术
由芸薹根肿菌(Plasmodiophora brassicae)侵染引起的根肿病是十字花科作物上最严重的土传病害之一，该病害可引起根部变形肿大，使根系逐渐丧失水分和养分运输功能，最终导致植株生长迟缓直至枯死。甘蓝是十字花科中重要的一类蔬菜作物，常见的蔬菜如结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)、花椰菜(B.oleracea var.botrytis)、青花菜(B.oleracea var.italica)均是甘蓝变种。由于抗根肿病基因仅在白菜亚种芜菁(B.rapa ssp.rapa)中发现，早期的甘蓝抗根肿病育种需要通过远源杂交方式从白菜中导入抗病基因，与白菜抗根肿病育种相比，目前报道的抗根肿病甘蓝品种较少(张小丽等2020)。
少数抗根肿病甘蓝类蔬菜品种的育成，意味着抗根肿病基因已成功导入到甘蓝类蔬菜品种中，甘蓝育种家以后可直接将这些品种作为抗源在育种中使用。在抗根肿病基因由白菜转移到甘蓝的过程中，与基因紧密连锁的白菜染色体片段也会导入到甘蓝基因组中，理论上位于这段连锁区段上已发表的分子标记也同样可以用于甘蓝中，然而育种中使用的材料遗传背景十分复杂，并非与抗病基因位于相同连锁区段的分子标记就能适用，一些与抗源具有较近亲缘关系的感病材料，在抗病基因连锁区间内的DNA变异特征与抗源也高度相似，基于这些DNA变异开发的分子标记常常在这类感病品种中检测出假阳性(Ren etal 2019)，因此分子标记是否具有普适性，需要经过大量不同遗传背景的品种进行检验。
芸薹属物种进化的研究表明白菜与甘蓝是属内亲缘关系最近的两个基本种(栗茂腾等2005)，目前已报道的用于甘蓝育种的抗根肿病分子标记较少，白菜中的抗根肿病分子标记在甘蓝育种中适用性较差，如袁天成测试了已发表的28个抗根肿病分子标记，这些标记均未在抗病与感病甘蓝材料中表现出条带差异；沈舒从已发表的文章及专利中选取了43个标记进行测试，仅筛选到一个标记在其选择的白菜抗源与3份感病结球甘蓝有条带差异，在BC1分离世代中，该标记的检测结果与株系抗性吻合；何海艳对一份抗根肿病甘蓝商品种“GZ87”进行遗传分析，将其抗性基因定位在C07染色体末端，同时筛选到两个与甘蓝根肿病抗性存在关联的RAPD分子标记，并将其转化为SCAR标记OA与YA，其中OA位于抗病基因连锁区间内，在CP分离群体中，两个SCAR标记检测结果与单株抗性一致，在8份以结球甘蓝为主的感病对照品种对SCAR标记进行测试，未检测到假阳性，认为其在甘蓝育种中具有适用性(何海艳2018)。
从以上研究进展来看，目前筛选或开发的甘蓝抗根肿病分子标记在其使用的遗传分离群体中具有较高的准确性，但在育种中，常需要利用分子标记在不同品种中进行抗病材料筛选，在回交转育抗根肿病基因时，不同育种家选用的轮回亲本遗传背景也不尽相同，而以上标记在适用性测试时，使用的感病品种数量较少且以结球甘蓝品种为主，缺乏代表性，并不能证明其在甘蓝类蔬菜育种中具有普适性。因此，现阶段仍然缺乏经过了广泛验证，具有普适性的甘蓝抗根肿病分子标记。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种用于甘蓝根肿病抗性鉴定的InDel分子标记引物，所述的分子标记BOCR-InDel的引物为：BOCR-InDel-F：GTTACCATTTTCCTTTGCTTTTGTGT和BOCR-InDel-R：ATCTTGAATGGATAGTTTTCAAGATCA。
本发明的另一个目的在于提供了一种甘蓝根肿病抗性鉴定的InDel分子标记引物的应用，利用该引物可用于甘蓝不同变种的抗根肿病品种育种，或者抗根肿病品种的鉴定。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
十字花科植物根肿病鉴定的分子标记引物的获得：
1.对三份抗根肿病商品种进行全基因组重测序，同时从NCBI数据库中分别获取282份包含了各类甘蓝变种如结球甘蓝，青花菜，花椰菜等材料的全基因组重测序数据。
2.利用GATK算法(通过sentieon软件实现)，以青花菜HDEM的三代基因组组装序列的V1版本Brassica oleracea cv.HDEM V1(NCBI登录号:GCA_900416815.2)作为参考基因组(Belser et al 2018)，对1中获取的所有测序数据进行分析获取InDel与SNP的基因型结果(VCF文件)。
3.以2中获得的SNP基因型结果为基础，将282份甘蓝变种材料与3份抗根肿病甘蓝商品种以1Mb为单位，0.5Mb为滑动距离在全基因组内逐个区间进行聚类分析，成功地鉴定到三个抗病品种在7号染色体两个连续的染色体区间C07:51.5-52.5Mb及C07:52-53Mb上聚为了一个类群(图2)，因此，我们以C07:51.5-53Mb为抗病基因所在的连锁区间进行分子标记开发。
4，在3中确定的连锁区间内，从2中的InDel基因型结果里寻找只存在于抗病品种中的InDel突变，最终在C07:52560844处鉴定到一个4bp的InDel突变(参考基因组碱基为ATACT，突变碱基为A)，在C07:52561054处鉴定到一个28bp的InDel突变(参考基因组碱基为ATTCAATTGACACCAGAGGTGTCTGGTGG，突变碱基为T)，两个InDel突变均符合如下特征：在3份抗根肿病品种基因型均为杂合突变型；在其它282份不同甘蓝变种材料中均不存在杂合或纯合突变型。
5.针对4中鉴定到的InDel突变设计了分子标记BOCR-InDel，具体如下：标记的正向引物设计在C07:52560844上游，反向引物在C07:52561054下游，使得引物扩增条带差异为32bp，正向引物BOCR-InDel-F：GTTACCATTTTCCTTTGCTTTTGTGT、反向BOCR-InDel-R：ATCTTGAATGGATAGTTTTCAAGATCA，抗病条带302bp；感病条带334bp。
十字花科植物根肿病抗性鉴定的分子标记引物在甘蓝根肿病抗性鉴定中的应用；包括利用本领域的常规方式，对待测甘蓝品种进行PCR，即可获得该甘蓝品种对于根肿病的抗性判定。
以上所述的应用中，所述的甘蓝包括具体实施方式中表1中的品种、NCBI登录号：PRJNA312457中的119份品种、NCBI登录号:PRJNA700684中的163份品种。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明开发的甘蓝抗根肿病分子标记BOCR-InDel是在充分考量了甘蓝种内282份资源的多态性信息，最大限度避开了亲缘关系干扰的基础上开发的，与现有技术相比，本发明公布的分子标记，是最具普适性的鉴定根肿病抗性的分子标记。
附图说明
图1为本发明抗根肿病分子标记的开发流程图。
图2为3份抗根肿病品种与282份甘蓝变种资源的聚类结果，灰色字体标示的ruixue、yacui91与weibaF1分别为抗根肿病品种瑞雪、雅翠91与威霸F1；
其中：A为C07:51.5-52.5Mb区间内的聚类结果；
B为C07:52-53Mb区间内的聚类结果；
图3为由杂合抗根肿病的青花菜品种“雅翠91”与感病青花菜自交系BL-83杂交后得到的分离群体中，抗病与感病分离单株接种鉴定的效果；
其中CP-R表示分离群体中的抗病单株，CP-S表示分离群体中的感病单株，BL-83为感病对照。
图4为BOCR-InDel在分离群体中的检测结果。
其中：A中各泳道信息为：M，DNA标尺；1，雅翠91(阳性对照)；2，BL-83(阴性对照)；3-20为分离群体中接种后表现为抗病的单株。
B中各泳道信息为：M，DNA标尺；1，雅翠91(阳性对照)；2，BL-83(阴性对照)；3-19为分离群体中接种后表现为感病的单株。
图5为BOCR-InDel在结球甘蓝、青花菜及花椰菜品种中的检测效果图；
每排的前两个泳道分别为DNA marker及阳性对照，其中第一排阳性对照为雅翠91，第二排阳性对照为瑞雪，第三排阳性对照为威霸F1，第35、36泳道分别为北京农林科学院蔬菜研究中心提供的抗根肿病结球甘蓝品种210717与20205，其它泳道为2021年武汉种博会提供的94份感病品种，具体信息见附表1。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
一个用于鉴定甘蓝根肿病抗性的InDel分子标记的获得：
1.将三份抗根肿病商品种：结球甘蓝“威霸F1”(来源于寿光格顿农业科技有限公司)、花椰菜“瑞雪”(来源于寿光格顿农业科技有限公司)及青花菜“雅翠91”(来源于寿光先正达种子有限公司)利用二代测序技术获取全基因组重测序数据。从NCBI数据库中分别获取119份(NCBI登录号：PRJNA312457)及163份(NCBI登录号:PRJNA700684)包含了各类甘蓝变种如结球甘蓝，青花菜，花椰菜等共计282份材料的全基因组重测序数据。
2.利用GATK算法(通过sentieon软件实现)，以青花菜HDEM的三代基因组组装序列的V1版Brassica oleracea cv.HDEM V1(NCBI登录号:GCA_900416815.2)作为参考基因组(Belser et al 2018)，对1中获取的所有测序数据进行分析获取InDel与SNP的基因型结果(VCF文件)。
3.以2中获得的SNP基因型结果为基础，将282份甘蓝变种材料与3份抗根肿病甘蓝商品种以1Mb为单位，0.5Mb为滑动距离在全基因组内逐个区间进行聚类分析，成功地鉴定到三个抗病品种在7号染色体两个连续的染色体区间C07:51.5-52.5Mb及C07:52-53Mb上聚为了一个类群(图2)，因此，我们以C07:51.5-53Mb为抗病基因所在的连锁区间进行分子标记开发。
4，在3中确定的连锁区间内，从2中的InDel基因型结果里寻找只存在于抗病品种中的InDel突变，最终在C07:52560844处鉴定到一个4bp的InDel突变(参考基因组碱基为ATACT，突变碱基为A)，在C07:52561054处鉴定到一个28bp的InDel突变(参考基因组碱基为ATTCAATTGACACCAGAGGTGTCTGGTGG，突变碱基为T)，两个InDel突变均符合如下特征：在3份抗根肿病品种基因型均为杂合突变型；在其它282份不同甘蓝变种材料中均不存在杂合或纯合突变型。
5.针对4中鉴定到的InDel突变设计了分子标记BOCR-InDel，具体如下：标记的正向引物设计在C07:52560844上游，反向引物在C07:52561054下游，使得引物扩增条带差异为32bp，正向引物BOCR-InDel-F：GTTACCATTTTCCTTTGCTTTTGTGT、反向BOCR-InDel-R：ATCTTGAATGGATAGTTTTCAAGATCA，抗病条带302bp；感病条带334bp。
实施例2：
BOCR-InDel分子标记与根肿病抗性相关性：
收集到的抗根肿病品种均为细胞质雄性不育的商业F1类型品种，采用杂合抗根肿病商业F1为母本(“雅翠91”)与感病材料(感病青花菜自交系BL-83)进行杂交，因母本为杂合抗性，因此其与感病材料的杂交后代即会出现抗性分离。以十字花科蔬菜的流行根肿病菌4号优势生理小种对杂交得到的分离群体进行鉴定：
取出-20℃保存的根肿菌根瘤解冻打碎，与干燥的草炭基质按1:20混合，25℃黑暗环境下放置48小时后，用其播种。幼苗在环境温度25℃/20℃(昼/夜)，光周期为14/10小时(光照/黑暗)的绿化间内生长，期间保持基质湿润，4周后，清洗幼苗根部观察发病情况。
结果显示，子代出现典型的抗感单株分离(图3)，CP-R表示分离群体中的抗病单株，CP-S表示分离群体中的感病单株，BL-83为感病对照。
利用实施例1中的分子标记引物对子代进行检测，PCR反应体系：总体积10μL，其中：10X Easy Taq buffer 1.0μL，dNTP(10mM)0.2μL，正反引物(10μM)各0.2μL，DNA模板(50-200ng/μL)1μL，Easy Taq酶(5U/μL)0.1μL，ddH2O 7.3μL；
BOCR-InDel-F：GTTACCATTTTCCTTTGCTTTTGTGT、
BOCR-InDel-R：ATCTTGAATGGATAGTTTTCAAGATCA；
PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环，72℃延伸5min，4℃保存10min；
凝胶电泳检测：PCR产物用3％琼脂糖凝胶在130V电压条件下电泳50min，结果在凝胶成像系统上显示。
结果如图4所示，在抗病子代中，检测均为条带为302bp和334bp的杂合子；在感病子代中，均为条带为334bp的纯合子。
以上结果表明本发明开发的标记在分离群体中与根肿病抗性连锁。
实施例3：
BOCR-InDel分子标记的普适性：
待测品种为表1所示，甘蓝类蔬菜品种由结球甘蓝、青花菜与花椰菜共96份商品种构成，其中抗病品种2份，感病品种94份。
结果如图5所示，利用本发明设计的分子标记引物，对96份甘蓝类蔬菜(结球甘蓝、青花菜、花椰菜)品种进行检测，高抗根肿病结球甘蓝品种210717检测为纯抗(图5中泳道35，302bp)，中抗根肿病结球甘蓝品种20205检测为杂抗(图5中泳道36，302bp和334bp)，94份感病品种均未检测到抗病条带。
验证结果显示了新开发的抗根肿病分子标记在甘蓝类蔬菜育种中具有广泛的适用性。
表1
Figure BDA0003386721860000061
Figure BDA0003386721860000071
Figure BDA0003386721860000081
序列表
<110> 湖北省农业科学院经济作物研究所
<120> 一种甘蓝根肿病抗性鉴定的InDel分子标记引物及应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttaccattt tcctttgctt ttgtgt 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atcttgaatg gatagttttc aagatca 27

Claims (4)

1.一个用于甘蓝根肿病抗性鉴定的InDel分子标记引物，所述的分子标记的引物为：BOCR-InDel-F：GTTACCATTTTCCTTTGCTTTTGTGT和BOCR-InDel-R：ATCTTGAATGGATAGTTTTCAAGATCA。
2.权利要求1所述的引物在甘蓝类蔬菜在根肿病敏感或抗性鉴定中的应用。
3.权利要求1所述的引物在甘蓝类蔬菜抗根肿病育种中的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，所述的甘蓝类蔬菜为：NCBI登录号：PRJNA312457中的119份品种、NCBI登录号:PRJNA700684中的163份品种和下述品种：
Figure FDA0003386721850000011
Figure FDA0003386721850000021
Figure FDA0003386721850000031
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