CN101851283B - 小金海棠MxCS蛋白及编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能提高植物耐缺铁性的由1)衍生的蛋白质。实验证明，转入MxCS的拟南芥和烟草植株耐缺铁性明显提高，为进一步研究植物体内铁元素运输利用机制提供理论依据。

Description

小金海棠MxCS蛋白及编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因与应用，特别涉及小金海棠MxCS蛋白及编码基因与应用。

背景技术

铁元素是作物生长必需的营养元素之一。作物缺铁会引起叶片黄化、早衰等现象，严重者造成作物产量与品质下降。农业生产缺铁是一个世界性的问题，世界各国都有大量有关植物缺铁的报道。

Robinson，N.J.等在1999年就发现从拟南芥里克隆的FRO2基因可以恢复拟南芥frdl-1突变体的Fe3+-螯合还原酶的活性，并且拟南芥植株的抗缺铁能力增强(Robinson，N.J.，et al.，A ferric-chelate reductase for iron uptake from soils.Nature1999.397：694-697)。肖海华等2008年发现从山定子里克隆的MbNRAMP1基因可以提高酵母菌抗缺铁能力(Hai-hua Xiao et al.，The Iron-regulated Transporter，MbNRAMP1，Isolated from Malus baccatais Involved in Fe，Mn and Cd Trafficking)。而西红柿的LeFRO1基因和豌豆的PsFRO1基因主要在叶中表达，转基因后也可以提高植株对缺铁的抵抗能力。凌宏清等发现转入NAS基因可以恢复西红柿NA突变体chloronerva的抗缺铁能力。

因此，通过转基因技术提高或者恢复植物的抗缺铁能力为研究的热点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物耐缺铁相关的蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的植物耐缺铁相关的蛋白，名称为MxCS，来源于苹果属小金海棠(Malus xiaojinensis)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐缺铁相关的由1)衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列1由473个氨基酸残基组成。

为了使1)中的MxCS便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的MxCS可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的MxCS的编码基因可通过将序列表中序列2的自5′末端第86-1504位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加可为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述与植物耐缺铁相关蛋白的cDNA基因也属于本发明的保护范围。

与植物耐缺铁相关蛋白的cDNA基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)序列表中的序列2所示的DNA分子；

2)序列表中的序列2自5′末端第86位-1504位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

3)在严格条件下可与1)或2)的DNA序列杂交且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)所示DNA序列具有90％以上的同一性且编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。

所述步骤4)中的基因，与1)或2)的基因最好有95％以上的同一性。

上述序列表中的序列2由1882个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第86-1504位脱氧核苷酸，编码的氨基酸序列是序列表中的序列1。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

扩增上述MxCS基因全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述与植物耐缺铁相关蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有MxCS基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明与植物耐缺铁相关蛋白编码基因MxCS的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的宿主植物可以是拟南芥或者烟草等双子叶植物。

使用MxCS基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体为可在pBI 121的多克隆位点间(如插入XbaI和BamHI位点)插入序列表中序列2的自5′末端第86-1504位脱氧核苷酸得到的重组表达载体pBI121-35sMxCS。

本发明的另一个目的是提供一种利用MxCS编码基因培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将MxCS编码基因转入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物的耐缺铁能力高于所述目的植物；所述转基因植物根系中铁含量高于所述目的植物。

其中，MxCS编码基因可通过上述重组表达载体导入目的植物中。

上述目的植物可为双子叶植物，如拟南芥或烟草；当所述双子叶植物为烟草时，所述转基因植物的叶片中铁含量高于所述目的植物。

本发明构建了MxCS的表达载体，并将其转入野生型拟南芥和烟草植株中，结果表明，转入MxCS的拟南芥植株和转入MxCS的烟草植株耐缺铁性均明显提高，说明MxCS是与植物耐缺铁相关的蛋白，MxCS蛋白及其编码基因可用于提高植物的耐缺铁性，为进一步研究植物体内铁元素运输利用机制提供理论依据。

附图说明

图1为MxCS基因的PCR扩增产物结果

图2为不同铁处理水平下MxCS基因在小金海棠不同器官中的半定量RT-PCR结果

图3为MxCS基因瞬时表达载体pEZS-MxCS的酶切鉴定结果

图4为MxCS基因的亚细胞定位检测结果

图5为表达载体pBI121-35sMxCS的酶切鉴定结果

图6为转基因根癌农杆菌GV3101的菌落PCR检测结果

图7为转基因拟南芥的PCR鉴定结果

图8为不同基因型的拟南芥在正常供铁和低铁处理两周时的表型

图9为转基因烟草的PCR鉴定结果

图10为不同基因型的烟草植株低铁处理5天、10天的表型

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物合成及测序工作均由上海生工生物技术服务有限公司完成。

限制性内切酶BamHI、XholI、XbaI等内切酶均购自大连宝生物工程有限公司，pEASY-T1-Vector Kit购自全式金生物公司，3’5’-RACE cDNA Amplification Kit购自Invitrogen公司。

Amp抗生素、Tris饱和酚、水饱和酚、DEPC、2000bpDNA Marker、琼脂糖、酵母提取物、胰蛋白胨均购自北京鼎国生物技术有限公司。

下述实施例中扩增MxCS基因全长或任一片段所用引物如表2所示，其中下划线部分表示酶切位点：

表2扩增MxCS基因引物序列

引物名称	序列	序列名称
			F1中	CTTGGTGGRATGAGAGGRATGAC	序列3
R1中	ATCCAHARCAAMACTTCCTGAT	序列4
			Adp	CTGATCTAGAAGGTACCGGATCC	序列5
F1	AGAATGCCAGAAAGTATTACCTGCT	序列6
			F2	TTGCACAAGTGCCAGTAGTAGCTGC	序列7
AAP	GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG	序列8
			AUAP	GGCCACGCGTCGACTAGTAC	序列9
R1	GCAGGTAATACTTTCTGGCATTCTG	序列10
			F5全	TTCACATTTAAAACGTAATTGAGTT	序列11
R5全	TTTGTTAAAATAAAGTCCAAGCACT	序列12
			RT-5F	GTATTCTTCAGGAGCGTCACCGCGC	序列13
RT-5R	AGTGTTACGATGGAATCGCTTGAGA	序列14
			S5	CCGCTCGAGATGGTATTCTTCAGGA	序列15
R5	CGCGGATCCAGACGAAGCTGCTTTCT	序列16
			CS-5	GCGTCTAGAATGGTATTCTTCAGGAG	序列17
CS-3	CGCGGATCCAGACGAAGCTGCTTTCT	序列18

实施例一、与植物耐缺铁相关蛋白MxCS及其编码基因的获得

一、MxCS基因中间片段的获得

以小金海棠(Malus xiaojinensis)(辽宁兴城市国家苹果种质资源圃，编号为DGB0458；成明昊，李晓林，张云贵，苹果优良砧木资源-小金海棠，西南农业大学学报，2000年10月，22(5)：383-386；公众可从中国农业大学获得。)为实验材料，提取其叶片总RNA，将其反转录为cDNA。以此cDNA为模板，以F1中(序列3)和R1中(序列4)为引物，PCR扩增MxCS基因的中间片段，即为序列2的自5′末端第312-1040位核苷酸。反应混合物如下：

ddH2O	17.0μl
		10×PCR缓冲液	2.5μl
dNTP Mixture(2.5mM)	2.0μl
		Taq酶(5U/μl)	0.5μl
F(10mM)	1.0μl
		R(10mM)	1.0μl
模板(反转录的cDNA)	1.0μl
		Total	25μl

PCR反应条件：先94℃预变性3min；然后94℃变性40S，62℃退火40S，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1A所示，其中，M为2000bp的DNA分子量标准，1和2为MxCS基因中间片段的PCR产物。结果表明得到727bp的目的片段。切下目的条带，纯化回收后按照pEASY-T1-Vector Kit载体试剂盒(购自全式金生物公司)说明书将PCR产物连接到pEASY-T1上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的727bp片段即是MxCS因的中间片段。

其中：上述引物的序列如下：

F1中：5′-CTTGGTGGRATGAGAGGRATGAC-3′(序列3)；

R1中：5′-ATCCAHARCAAMACTTCCTGAT-3′(序列4)。

二、MxCS基因3’端序列的获得

以步骤一获得的cDNA序列为模板，在其3′端设计引物，进行PCR反应，扩增MxCS基因的3’端序列。Master Mix预混物体系如下：

总体积36μl，将上述Master Mix预混物平均分成4管，每管9μl，按照下表加入引物和cDNA模板：

PCR反应条件：先94℃预变性3min；然后94℃变性30S，62℃退火30S，72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

以引物F1(序列6)和Adp(序列5)进行第一轮PCR，再取1μL作为模板，以F1和Adp为引物再进行PCR反应，PCR反应条件与第一轮相同，获得的产物为样品1。同样的方法以引物F2(序列7)和Adp为引物进行两次PCR获得的产物为样品2。分别取10μL样品1和样品2进行琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图1B所示：其中，M为2000bp的DNA分子量标准，1为样品1(引物Adp和F1的PCR产物)，2为样品2(引物Adp和F2的PCR产物)。结果表明，两个单引物对照组都没有扩增出特异条带，样品2和样品1分别为约1000bp和1400bp的片段。

切下1000bp和1400bp条带，纯化回收后按照pEASY-T1-Vector Kit载体试剂盒(全式金生物公司)说明书将PCR产物分别连接到pEASY-T1载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得约1400bp片段即是MxCS基因的3’端序列，也即为序列2的自5′末端第403-1803位核苷酸。

其中：上述引物的序列如下：

Adp：5′-CTGATCTAGAAGGTACCGGATCC-3′(序列5)；

F1：5′-AGAATGCCAGAAAGTATTACCTGCT-3′(序列6)。

F2：5′-TTGCACAAGTGCCAGTAGTAGCTGC-3′(序列7)。

三、MxCS因5’端序列的获得

以步骤一获得的cDNA序列为模板，在其5′端设计引物，进行PCR反应，扩增MxCS基因的5’端序列。Master Mix预混物体系如下：

总体积40μl，将上述Master Mix预混物平均分成4管，每管10μl，按照下表加入引物和模板：

PCR反应条件：先95℃预变性3min；然后95℃变性30S，60℃退火30S，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

将第一轮PCR(以AAP(序列8)和R1(序列10)为引物)产物稀释10倍，取1μL作为模板，以R1(序列10)和AUAP(序列9)为引物，进行巢式PCR反应，PCR反应条件与第一轮相同。

取10μL第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1C所示，其中，M为2000bp的DNA分子量标准，1为样品组(R1和AUAP)的PCR扩增结果，2为单引物R1对照组的PCR扩增结果，3为单引物AUAP对照组的PCR扩增结果。结果表明，两个单引物对照组都没有扩增出特异条带，只有样品组扩增得到约670bp的片段。

切下目的条带，纯化回收后将PCR产物连接到pEASY-T1载体上，进行测序。经同源性比较分析后确定获得的约670bp片段即是MxCS基因的5’端序列，也即序列2的自5′末端第1-670位核苷酸。

其中：上述引物的序列如下：

AAP：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′(序列8)；

AUAP：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′(序列9)。

R1：5′-GCAGGTAATACTTTCTGGCATTCTG-3′(序列10)。

四、MxCS基因全长cDNA序列的获得

将上述PCR扩增获得的MxCS基因5’端序列、中间序列以及3’端序列进行同源性比较，利用DNAMAN等生物软件进行拼接校正，拼接出MxCS基因全长cDNA序列。根据拼接的MxCS基因全长cDNA序列设计引物F5全(序列11)和R5全(序列12)，以步骤一中反转录的cDNA为模板，利用RT-PCR方法扩增全长MxCS基因，用高保真Pfu酶替换Taq酶，PCR反应混合物如下：

10×PCR缓冲液	2.5μl
		dNTP Mixture(2.5mM)	2.0μl
引物F5全(10mM)	0.5μl
		引物R5全(10mM)	0.5μl
模板(反转录的cDNA)	1.5μl
		Pfu酶(5U/ul)	0.3μl
ddH2O	17.7μl
		Total	25μl

PCR反应条件：先94℃预变性3min；然后94℃50S，56℃1min，72℃3min，共35个循环；再72℃延伸10min，4℃保存。

PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1D所示，其中，M为2000bp的DNA分子量标准，1为MxCS基因全长cDNA序列的PCR产物。结果表明获得1870bp的条带。切下该目的条带，纯化回收后按照pEASY-T1-Vector Kit载体试剂盒说明书将PCR产物连接到pEASY-T1载体上，进行测序，测序结果表明，该1870bp的核苷酸片段即为MxCS，其核苷酸序列如序列表中序列2的自5′末端第1-1869位核苷酸所示，其编码的氨基酸序列如序列表中序列1所示。将获得含有该1870bp的核苷酸片段的重组表达载体命名为pEASYT1-MxCS。

其中：上述引物的序列如下：

F5全：5′-TTCACATTTAAAACGTAATTGAGTT-3′(序列11)；

R5全：5′-TTTGTTAAAATAAAGTCCAAGCACT-3′(序列12)。

五、小金海棠不同器官中MxCS基因的表达分析

分别提取过量供铁(Hoagland营养液+320μM Fe-EDTA)、正常供铁(Hoagland营养液+40μM Fe-EDTA)及低铁处理(Hoagland营养液+4μM Fe-EDTA)0、2、4、6和8天的小金海棠幼根、茎、新叶(未展开叶)和成熟叶的总RNA，紫外分光光度计分别测定不同器官、不同处理的RNA的含量，取等质量的上述RNA，反转录成单链cDNA。以该单链cDNA为模板，先以肌动蛋白(ACTIN)基因作为内参，使用ACTIN引物Ats：5′-CTACAAAGTCATCGTCCAGACAT-3′和Atr：5′-TGGGATGACATGGAGAAGATT-3′进行PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳结果，调整不同处理模板的用量，使各个处理ACTIN的PCR扩增产物亮度一致。不同处理模板用量确定后，进行ACTIN与MxCS基因的扩增。MxCS基因扩增的引物为：RT-5F和RT-5R。每个处理的RT-PCR分析重复3次。

结果表明，MxCS基因在根、茎、成熟叶和新叶中都有表达。低铁处理时，随着处理天数的增加，MxCS基因在茎和成熟叶中表达增强，在新叶中的表达也增强。具体结果如图2A-B所示。其中，A为低铁处理0、2、4、6和8天时，MxCS基因在根的表达情况，B为低铁处理0、2、4、6和8天时，MxCS基因在新叶中的表达情况。且MxCS基因在各检测部位的表达量相当。

过量供铁时，随着处理天数的增加，MxCS基因在茎和成熟叶中表达增强，在新叶中的表达先增强再减弱。结果如图2C-D所示。其中，C为过量供铁0、2、4、6和8天时，MxCS基因在根的表达情况，D为过量供铁0、2、4、6和8天时，MxCS基因在新叶中的表达情况。

其中：上述引物的序列如下：

RT-5F：5′-GTATTCTTCAGGAGCGTCACCGCGC-3′(序列13)；

RT-5R：5′-AGTGTTACGATGGAATCGCTTGAGA-3′(序列14)

六、MxCS5基因的亚细胞定位

(1)、MxCS基因与GFP融合的瞬时表达载体的构建

使用引物S5(序列15)和R5(序列16)进行PCR扩增MxCS基因全长序列(去除了终止密码子的MxCS开放阅读框)，并将其克隆进pEASY-T1载体中，经XhoI和BamHI酶切后再克隆进pEZS-NL载体(购自全式金生物技术有限公司)中构建瞬时表达载体pEZS-MxCS。pEZS-MxCS转化大肠杆菌DH5α菌株，挑取阳性斑进行菌落PCR、酶切鉴定和测序验证，酶切鉴定结果如图3所示，其中，M为1000bp的DNA分子量标准，1为瞬时表达载体pEZS-MxCS的酶切鉴定效果图。对鉴定结果为阳性的菌斑摇菌，提取质粒。

其中：上述引物的序列如下：

S5：5′-CCGCTCGAGATGGTATTCTTCAGGA-3′(序列15)

R5：5′-CGCGGATCCAGACGAAGCTGCTTTCT-3′(序列16)

(2)、采用基因枪法进行表达载体向洋葱表皮细胞的转化

1、待转化洋葱表皮的制备

在无菌条件下，撕下洋葱的内表皮，平铺于含有MS培养基的培养皿中，然后将培养皿用锡箔纸包好备用。

2、金粉悬浮液的制备

称取60mg金粉，放入1.5ml灭菌的离心管中，加入1ml无水乙醇，震荡1min，10000rpm离心10s，弃上清，再加入1ml无水乙醇，震荡1min，10000rpm离10s；弃上清，将金粉悬于1ml无菌水中，获得金粉悬浮液，-20℃保存备用。

3、金粉-质粒DNA复合体的制备

吸取8.5μl上述步骤2制备的金粉悬浮液、3.5μl 0.1M亚硝胺、8.5μl  2.5MCaCl₂·2H₂O和5μl上述步骤(1)获得的pEZS-MxCS，将混合物在震荡器上振荡3min；10000rpm离心20s；弃上清，用无水乙醇漂洗3次；加入30μl无水乙醇悬浮，获得金粉-质粒DNA复合体备用。

4、轰击受体材料选用一定压力的压力膜，与轰击膜一起在70％的无水乙醇中浸泡1-2小时，取出晒干；金属档板用70％的无水乙醇浸泡后在酒精灯上灭菌；取10μl上述步骤3制备好的金粉-质粒DNA复合体，均匀涂布于轰击膜的中间位置上，不要涂于整个膜上，涂布的面积与载体固体圈上的孔径范围一致；将膜晒干后，安装到发射装置上；将压力膜安装到气体加速器的下端；洋葱表皮细胞置于培养皿的中部，放入真空室内，取下培养皿盖；抽真空指针到26；放气于气体加速器上，直到管中压力达到可裂膜所能承受的压力时，可裂膜破开，气体冲到轰击膜上，载体向下运动，被金属档板挡住，而下面的金属颗粒却透过金属档板的网孔，射向靶细胞。

5、荧光观察

将培养皿用Parafilm封好，28℃培养24h，在荧光显微镜下观察绿色荧光的表达，采用同样的方法处理对照质粒pEZS-NL。具体结果如图4所示。其中，A1为对照质粒pEZS-NL明视场照片，A2为对照质粒pEZS-NL暗视场照片，B1为质粒pEZS-MxCS明视场照片，B2为质粒pEZS-MxCS暗视场照片。结果表明，MxCS主要定位于细胞膜上。

实施例二、MxCS基因转化拟南芥及其功能验证

一、MxCS重组表达载体(pBI121-35sMxCS)的构建

以实施例一中用F5全和R5全扩增的MxCS基因全长的PCR产物作模板，以5’端添XbaI酶切位点的引物CS-5(序列17)和3’端添加BamHI酶切位点的引物CS-3(序列18)为引物，进行PCR，回收PCR产物。用XbaI和BamHI分别酶切该PCR产物与pBI121(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)，分别胶回收，将经酶切的PCR产物连接到酶切后的pBI121的大片段上，得到重组表达载体pBI121-35sMxCS。

将重组表达载体pBI121-35sMxCS转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，用XbaI和BamHI酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，得到1400bp左右的MxCS基因片段。结果如图5所示，其中M为1000bp的DNA分子量标准，1为PBI121-35sMxCS的酶切结果。结果表明pBI121-35sMxCS为含有MxCS基因表达载体。

利用冻融法将含有MxCS重组表达载体pBI121-35sMxCS导入根癌农杆菌GV3101(赵军胜，支大英，薛哲勇，夏光敏.根癌农杆菌介导的高羊茅遗传转化研究.遗传学报.2005.6 Vol 32，No.6：579-585；公众可从中国农业大学获得。)中获得重组菌GV3101/pBI121-35sMxCS，挑取阳性克隆，用引物S5(序列15)和R5(序列16)进行菌落PCR鉴定。阴性对照为采用同样的方法将空载体pBI121导入根癌农杆菌GV3101获得重组菌GV3101/pBI121用引物S5和R5进行菌落PCR，阳性对照为将MxCS基因全长的PCR产物用引物S5和R5进行PCR。结果如图6所示：其中，M为2000bp Plus的DNA分子量标准，1为假阳性克隆，2为重组菌GV3101/pBI121-35sMxCS，3为阴性对照重组菌GV3101/pBI121，4为阳性对照MxCS的PCR产物。结果表明，植物表达载体pBI121-35sMxCS已成功转入根癌农杆菌GV3101中。

其中：上述引物的序列如下：

CS-5：GCGTCTAGAATGGTATTCTTCAGGAG(序列17，其中下划线部分为XbaI位点)

CS-3：CGCGGATCCAGACGAAGCTGCTTTCT(序列18，其中下划线部分为BamHI位点)

二、重组菌GV3101/pBI121-35sMxCS转化拟南芥

当野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana cv.Columbia；购自美国俄亥俄州立大学拟南芥生物资源中心，网址：http://www.arabidopsis.org/index.jsp)植株长至茎高3cm时，去除其顶生花序，以刺激叶生花序的生长。打顶5-7d后进行转化，此时叶生花序已长出，其下部的花已经有花粉的出现。转化前一天要浇透水，剪掉角果和已开的花。

将上述获得的重组菌GV3101/pBI121-35sMxCS接种于5mlYEB(含卡那霉素和利福平)液体培养基中，28℃培养24-36h，以1∶50的比例转接到200mlYEB培养基中，当OD₆₀₀值为1.2-1.6时4500rpm离心10min收集菌体，沉淀用适量渗透培养基(1/2MS+5％的蔗糖+0.02％SilwetL-77)充分悬浮至OD₆₀₀值为0.6-0.8。

将上述悬浮液倒在小烧杯中，将拟南芥的花浸入悬浮液中3-5min，保证莲座叶以上部分浸于悬浮液中，浸泡5min，可见植株上有一层薄膜。将浸泡好的拟南芥植株取出，避光横放16-24h，然后将其放正，绑住松散花芽培育获得T₀代转MxCS拟南芥。将T₀代转MxCS拟南芥培育至结实，收获成熟种子即为T₁代转MxCS拟南芥种子。

采用同样的方法将空载体pBI121转入野生型拟南芥，获得T₀代转pBI121拟南芥，再收获种子获得T₁代转pBI121拟南芥。

三、转基因纯合体的筛选及PCR检测和测序

将收获的T₁代转MxCS拟南芥种子播种于含50mg/L卡纳霉素的1/2MS培养基上，4℃春化2-3天，然后转至22℃培养，获得20株(请补充)T₁代转MxCS拟南芥植株。筛选20株(请核实)真叶健康且根伸长至培养基中的T₁代转MxCS拟南芥植株，提取它们的基因组DNA并以其为模板，以F5全和R5全为引物，进行PCR扩增，其中6株的扩增结果如图7所示。其中，M为2000bp Plus的DNA分子量标准，S1-S6为T₁代转MxCS拟南芥的PCR结果，CK为T₁代转pBI121拟南芥的PCR结果，WT为野生型拟南芥的PCR结果，把亮带切胶回收，连接到pEASY-T1载体上测序，结果表明S1-S6为T₁代转MxCS拟南芥阳性植株，MxCS基因成功转入拟南芥中。采用同样的方法鉴定出共获得20株阳性T₁代转MxCS拟南芥。

将PCR检测结果为阳性的T₁代转MxCS拟南芥单株收种，得到T₂代转MxCS拟南芥种子，将T₂代转MxCS拟南芥种子再经过相同的筛选，经卡方检验符合3∶1分离比的T₂代转基因植株单株收种得到T₃代转MxCS拟南芥种子，在筛选培养基(MS+50uM卡纳硫酸霉素)上不发生分离的为T₃代转MxCS拟南芥的纯合株系。结果共获得T₃代转MxCS拟南芥纯合株系12株。

采用同样的方法获得转入空载体pBI121的T₃代转pBI121拟南芥。

四、T₃代转MxCS拟南芥在低铁培养基(4Um Fe-EDTA)和正常供铁培养基(100uMFe-EDTA)上生长的表型观察

选取上述获得的T₃代转MxCS拟南芥的纯合株系1#和14#的种子，在1/2MS培养基上生长一周后，分别移入低铁培养基(含有4μM Fe-EDTA的1/2MS培养基)、正常供铁培养基(含有100μM Fe-EDTA的1/2MS培养基)中进行培养并观察表型。以野生型拟南芥和T₃代转pBI121拟南芥的种子为对照。其中，1#T₃代转MxCS拟南芥测定10株，14#T₃代转MxCS拟南芥测定10株，野生型拟南芥测定8株，T₃代转pBI121拟南芥测定10株。2周后可以明显看到，在正常供铁培养基中，T₃代转MxCS拟南芥、T₃代转pBI121拟南芥和野生型拟南芥都能生长正常，且没有出现明显的表型上的差别；而在低铁培养基中，1#和14#T₃代转MxCS拟南芥两个株系的中分别有7株和8株均表现出比T₃代转pBI121拟南芥和野生型拟南芥更耐缺铁的特征，具体表现如图8所示：低铁培养基培养一周后，所有的野生型拟南芥(WV)和T₃代转pBI121拟南芥(V)开始出现明显的叶片黄化现象，而1#T₃代转MxCS拟南芥(1#)和14#T₃代转MxCS拟南芥(14#)叶片生长正常。

五、转MxCS拟南芥中铁元素含量的测定

选取上述获得的1#和14#T₃代转MxCS拟南芥种子在1/2MS培养基上生长一周后，分别移入低铁培养基和正常供铁培养基中培养2周后，截取上述拟南芥的根和地上部分，经过灰化处理后用原子吸收法测定其中的Fe元素的含量。以经同样处理获得的野生型拟南芥种子和T₃代转pBI121拟南芥种子为对照，其中，1#T₃代转MxCS拟南芥测定3株，14#T₃代转MxCS拟南芥测定3株，野生型拟南芥测定3株，T₃代转pBI121拟南芥种子测定3株。测定结果如表3所示：

表3.各株系的铁元素含量

结果表明，任何处理情况下，根中铁元素的含量总是明显高于地上部分，1#和14#T₃代转MxCS拟南芥植株根部和地上部铁金属元素的含量均高于野生型和T₃代转pBI121拟南芥的对照植株，是以上对照株的1.2-1.8倍。野生型拟南芥植株和T₃代转pBI121拟南芥植株铁金属元素的含量没有显著差异。

实施例三、MxCS基因转化烟草及其功能验证

一、烟草叶片的消毒

选取长势良好无病毒感染的珊系烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthi)叶片(Qing-Lin Liu，Ke-Dong Xu，Nan Ma，Li Zeng，Liang-Jun Zhao.Isolation and functionalcharacterization of DgZFP：a gene encoding a Cys2/His2-type zinc finger protein inchrysanthemum.Mol Biol Rep(2010)37：1137-1142；公众可从中国农业大学获得。)，放入2L烧杯中，添加洗涤液5-10滴，小水冲洗2-3小时。先用75％乙醇消毒1分钟，再用1‰的升汞消毒6-8分钟，加入几滴吐温-20后无菌水洗2遍。

二、转MxCS烟草的获得

将实施例二中获得的重组菌GV3101/pBI121-35sMxCS 28℃，180rpm摇菌过夜，测OD600大于0.6即可。取过夜菌液2mL转入50mL的YEB培养基中28℃，180rpm摇菌约6小时。测OD600为0.6-0.7之间，4℃，5000rpm离心10分钟，弃上清，加入约80mL的1/2MS+5％蔗糖(pH＝5.8)重悬。上述获得的烟草叶片放入8-10分钟，再用滤纸吸干后转入共培养基(MS+40mg/L乙酰丁香酮)上3天(黑暗28℃)。转入筛选培养基上(MS+500mg/L的羧苄青霉素+100mg/L的卡纳+3.0mg/L的6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L的萘乙酸)进行培养。

等苗子在培养皿中长出后，转入瓶中MS培养基(MS++500mg/L的羧苄青霉素+100mg/L的卡纳霉素)生根，待苗子长到约6-10厘米后转出瓶子，洗净上面的培养基，转入营养土中生长，然后记录生长状况及拍照片，得到6株T₀代转MxCS烟草。

采用同样方法将含有空载体pBI121的农杆菌GV3101转化烟草，得到T₀代转pBI121烟草。

三、转MxCS烟草鉴定

提取上述6株T₀代转MxCS烟草的基因组DNA并以其为模板，以F5全和R5全为引物，进行PCR扩增，扩增结果如图9所示。其中，M为2000bpPlus的DNA分子量标准，1-6为T₀代转MxCS烟草的PCR结果，WT为野生型烟草的PCR结果，从图9中可以看出，2、5、6为阳性T₀代转MxCS烟草植株，将这三株的PCR产物胶回收连接到pEASY-T1载体上测序，结果表明为序列表中序列2的自5′末端第86-1504位核苷酸，即MxCS基因成功转入烟草中，共获得3株阳性T₀代转MxCS烟草。

四、转MxCS烟草在低铁培养液(4uM-Fe)和正常供铁培养液(40uM-Fe)中生长的表型观察

选取上述获得的3株阳性T₀代转MxCS烟草，同时以5株野生型烟草植株为对照，在Hoagland营养液中生长一周后，移入低铁营养液(含有4μM Fe-EDTA的Hoagland营养液)，以正常供铁营养液(含有40μM Fe-EDTA的Hoagland营养液)为对照，进行培养并观察表型。一周后可以明显看到，在正常供铁营养液中，T₀代转MxCS烟草和野生型烟草都能生长正常，且没有出现明显的表型上的差别；而在低铁营养液中，T₀代转MxCS烟草均表现出比野生型烟草更耐缺铁的特征，具体如图10所示，低铁培养基培养5天后，所有的野生型烟草开始出现明显的叶片黄化现象，而3株T₀代转MxCS烟草均叶片生长正常，其中MxCS1表示转pBI121-35sMxCS的烟草株系，WT为野生型烟草株系。即使是在低铁培养基中培养10天后，3株T₀代转MxCS烟草也仅2株新叶出现了轻微的黄化。说明该基因在烟草体内有功能，可以有助于提高植株对缺铁的抵抗能力。

五、转MxCS烟草中铁元素含量的测定

选取上述获得的3株T₀代转MxCS烟草采用实施例二中的方法测定了三株烟草叶片中的铁元素含量，以野生型烟草为对照，结果如表4所示：

表4.各株系的铁元素含量

结果表明，任何处理情况下，三株T₀代转MxCS烟草植株叶片中铁金属元素的含量均高于野生型的对照植株，是以上对照株的1.3-1.5倍。

序列表

<110>中国农业大学

<120>小金海棠MxCS蛋白及编码基因与应用

<130>CGGNARB102270

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>473

<212>PRT

<213>小金海棠(Malus xiaojinensis)

<400>1

Met Val Phe Phe Arg Ser Val Thr Ala Leu Ser Lys Leu Arg Ser Arg

1               5                   10                  15

Leu Gly Gln Leu Ser Ser Leu Arg Asp Ser Val Arg Trp Ile Gln Thr

            20                  25                  30

Gln Thr Ser Thr Asp Leu Asp Leu Arg Ser Gln Leu Ala Glu Leu Ile

        35                  40                  45

Pro Glu Gln Gln Glu Arg Leu Lys Lys Leu Lys Ala Asp Tyr Gly Lys

    50                  55                  60

Val Gln Leu Gly Asn Ile Thr Val Asp Met Val Ile Gly Gly Met Arg

65                  70                  75                  80

Gly Met Thr Gly Leu Leu Trp Glu Thr Ser Leu Leu Asp Pro Asp Glu

                85                  90                  95

Gly Ile Arg Phe Arg Gly Leu Ser Ile Pro Glu Cys Gln Lys Val Leu

            100                 105                 110

Pro Ala Ala Lys Pro Gly Gly Glu Pro Leu Pro Glu Gly Leu Leu Trp

        115                 120                 125

Leu Leu Leu Thr Gly Lys Val Pro Ser Lys Glu Gln Val Asp Ala Leu

    130                 135                 140

Ser Lys Glu Leu Arg Thr Arg Ala Val Val Pro Ala Tyr Val Tyr Lys

145                 150                 155                 160

Ala Ile Asp Ala Leu Pro Ile Thr Ala His Pro Met Thr Gln Phe Thr

                165                 170                 175

Thr Gly Val Met Ala Leu Gln Val Asp Ser Glu Phe Gln Lys Ala Tyr

            180                 185                 190

Glu Lys Gly Ile His Lys Ser Lys Tyr Trp Glu Pro Thr Phe Glu Asp

        195                 200                 205

Ser Leu Ser Leu Ile Ala Gln Val Pro Val Val Ala Ala Tyr Ile Tyr

    210                 215                 220

Arg Arg Ile Phe Lys Asp Gly Lys Val Arg Pro Val Asn Asp Ser Leu

225                 230                 235                 240

Asp Tyr Gly Ala Asn Phe Ser His Met Leu Gly Phe Asp Asp Pro Ile

                245                 250                 255

Val His Glu Leu Met Arg Leu Tyr Val Thr Ile His Ser Asp His Glu

            260                 265                 270

Gly Gly Asn Val Ser Ala His Thr Gly His Leu Val Ala Ser Ala Leu

        275                 280                 285

Ser Asp Pro Tyr Leu Ser Phe Ala Ala Ala Leu Asn Gly Leu Ala Gly

    290                 295                 300

Pro Leu His Gly Leu Ala Asn Gln Glu Val Leu Leu Trp Ile Lys Ser

305                 310                 315                 320

Val Val Asp Glu Val Gly Glu Asn Val Thr Thr Lys Gln Leu Lys Asp

                325                 330                 335

Tyr Val Trp Lys Thr Leu Lys Ser Gly Lys Val Val Pro Gly Phe Gly

            340                 345                 350

His Gly Val Leu Arg Lys Thr Asp Pro Arg Tyr Thr Cys Gln Arg Glu

        355                 360                 365

Phe Ala Leu Lys His Met Pro Asp Asp Pro Leu Phe Gln Leu Val Ser

    370                 375                 380

Lys Leu Tyr Glu Val Val Pro Pro Val Leu Thr Glu Leu Gly Lys Val

385                 390                 395                 400

Lys Asn Pro Trp Pro Asn Val Asp Ala His Ser Gly Val Leu Leu Asn

                405                 410                 415

His Phe Gly Leu Thr Glu Ala Arg Tyr Phe Thr Val Leu Phe Gly Val

            420                 425                 430

Ser Arg Ser Ile Gly Ile Gly Ser Gln Leu Ile Trp Asp Arg Ala Leu

        435                 440                 445

Gly Leu Pro Leu Glu Arg Pro Lys Ser Val  Thr Met  Glu Ser Leu Glu

    450                 455                 460

Asn Phe Cys Lys Lys Ala Ala Ser Ser

465                 470

<210>2

<211>1882

<212>DNA

<213>小金海棠(Malus xiaojinensis)

<400>2

ttcacattta aaacgtaatt gagttggttc ggtgcagagt acagcgagag agagaaagag    60

aggtgatcaa tcgctgcagt catcgatggt attcttcagg agcgtcaccg cgctttccaa    120

gctccgttct cgtctcgggc aactgtcgag tctcagggat tccgtcagat ggattcaaac    180

gcagacctcc acagatctcg accttcgttc tcagttggcg gaattgattc cagaacaaca    240

ggaacgtctg aaaaaactga aggcagatta tggaaaagtt caactgggca atatcacggt    300

tgatatggtg attggtggaa tgagaggaat gacagggttg ctgtgggaaa cctccttact    360

tgatccagat gagggaattc gcttcagggg tttgtcaatt ccagaatgcc agaaagtatt    420

acctgctgca aagccaggtg gagaaccttt gcctgagggt cttctgtggc tgcttttgac    480

aggaaaggta cctagcaaag agcaagtaga tgcattatcc aaggaattga ggactcgtgc    540

tgtagttcca gcttatgtgt ataaggccat tgatgctctg cctataacag cacatccaat    600

gacccagttc accactggtg tcatggccct ccaggtagac agtgaattcc agaaggcata    660

tgaaaagggg atacataaat caaagtactg ggagccaact tttgaggatt cacttagctt    720

gattgcacaa gtgccagtag tagctgccta tatttatcga agaattttca aggatggaaa    780

agtaagacct gttaatgatt ctctggatta tggtgcaaat ttttcacaca tgctgggttt    840

tgacgatccc atagtgcatg agctcatgag gctttatgtc accatccata gtgatcatga    900

aggtgggaat gtcagtgctc acaccggcca cttagttgct agtgcacttt cagatccgta    960

tctttcattt gcagctgctt taaacggctt ggctggccca ctccatggtt tggctaatca    1020

ggaagtattg ctttggataa agtctgtggt agatgaagtt ggagagaatg taactacaaa    1080

gcagttgaaa gattatgtct ggaaaacatt aaaaagtggg aaggttgttc ctggttttgg    1140

acacggagtc ttgcgtaaaa cagacccacg atacacatgt caaagggagt ttgcattgaa    1200

gcacatgcct gatgatccgc tgtttcagct ggtctcgaag ctttatgaag ttgtgcctcc    1260

cgtacttact gaactaggca aggttaaaaa cccatggccc aatgtagatg cacacagtgg    1320

agttctgttg aaccattttg gtttgactga ggcaaggtat tttactgttc ttttcggtgt    1380

atcgaggagt atagggattg gttcccagtt gatatgggac cgagctcttg gtttgcctct    1440

tgaaaggcca aaaagtgtta cgatggaatc gcttgagaat ttctgcaaga aagcagcttc    1500

gtcttgagaa attgagtgct gtatcactct gagtaataat tgctcccgaa tgatggcttt    1560

gtgaaagatg caacggttgt gtaaaaattt cagtttctgt tggttttagt tgagaaattg    1620

ttacagggaa acctcaacac tcacacatca cacttgagca ttttcaggta ctttaaagaa    1680

attttgaagt gagataggcg ttggggcttt tgctgctcgg ttaataaacg gattggagct    1740

atttagatta aaacgtgtac tttaaagatt tccacaagta gtaagcgttt tacgcgtatt    1800

ctgctatgag ggcggcacat ttattattga gaactttaat gagaagtgct tggactttat    1860

t t taacaaaa aaaaaaaaaa aa                                           1882

Claims (10)

1.一种蛋白，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的cDNA基因为如下1)或2)所述的基因：

1)序列表中的序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列2的自5′末端第86位-1504位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体为在pBI121的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。

6.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物的耐缺铁能力高于所述目的植物。

7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物中铁含量高于所述目的植物。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入所述目的植物中。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述目的植物为双子叶植物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为拟南芥或烟草；当所述双子叶植物为烟草时，所述转基因植物的叶片中铁含量高于所述目的植物。 

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