CN104195223B - 一种用于鉴定耐缺铁苹果砧木的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于鉴定耐缺铁苹果砧木的方法。该方法包括如下步骤：1)对待测苹果砧木和标准耐缺铁苹果砧木分别进行缺铁处理，提取总RNA；2)采用针对耐缺铁基因探针对总RNA进行斑点杂交；3)用ImageScannner扫描，并用ImageMaster分析，得到所述待测苹果砧木和所述标准耐缺铁苹果砧木中所述耐缺铁基因的表达量；4)若所述待测苹果砧木中所述耐缺铁基因的表达量不低于所述标准耐缺铁苹果砧木，则所述待测苹果砧木为或候选为耐缺铁苹果砧木。实验证明，本发明方法具有成本低廉和高效的优点，并且克服了耐缺铁苹果砧木常规选育的局限性，在基因水平上进行选育，为基因表达标记辅助选择育种奠定良好基础。

Description

一种用于鉴定耐缺铁苹果砧木的方法
技术领域
本发明涉及一种用于鉴定耐缺铁苹果砧木的方法。
背景技术
铁是植物生长发育的必需营养元素，在植物体的光合作用、呼吸作用、氮的固定、蛋白质和核酸的合成等诸多生理代谢过程中发挥着极为重要的作用。全世界约有40％以上的土壤缺铁，缺铁失绿症已成为植物营养失调的关键问题之一。为了适应缺铁胁迫，从土壤中吸收更多的铁来满足自身生长发育的需求，高等植物在长期进化过程中逐渐形成了不同的适应性机理。Romheld和Marschner在总结以前研究工一些作以及对120种来源不同的植物缺铁反应机理的研究基础上，首先提出高等植物在适应缺铁胁迫过程中逐渐形成的两种适应性机理，机理Ⅰ和机理Ⅱ。对这些机制的深入研究将为解决石灰性土壤上植物缺铁问题提供重要的理论依据。机理I植物在缺铁胁迫的时候根系会发生一系列的形态变化和生理生化反应。一些植物根毛密度增加，还有一些植物根表面会形成转移细胞。其主要吸收机制是在缺铁时通过激活H+-ATPase，向根外释放更多的H+，使根际酸化，从而增加铁的溶解性。同时会分泌一些有机酸与土壤中的三价铁螯合，以Fe3+-螯合物的形式存在，此时三价铁螯合还原酶催化电子从胞质中还原态的吡啶核苷酸(NADH)跨膜传递给胞外的螯合物，将Fe3+还原成Fe2+，然后Fe2+在质膜上二价铁转运蛋白的作用下由根表皮转运到细胞内，这些因素共同作用，相互协调，使植物根系还原Fe3+的能力增强，显著提高了植物的吸铁效率。
小金海棠(MalusxiaojinensisChengetJiang)是中国农业大学园艺植物研究所经过多年努力从40多个苹果属植物的种或生态型中筛选出的第一个苹果铁高效基因型(HanZH,ShenT,KorcakRF,BaligarVC(1994)Screeningforiron-efficientspeciesinthegenusmalus.JournalofPlantnutrition17(4):579-592)。研究结果表明，在缺铁胁迫时，小金海棠表现出典型的机制I型植物的缺铁适应性反应(韩振海，沈隽.果树的缺铁失绿症—文献述评.园艺学报，1991，18(4)：323-328)。
我国苹果产地土壤多偏碱性，土壤的钙化导致可溶性铁含量降低，因而苹果是发生缺铁黄化病普遍而严重的树种之一。缺铁黄化病对果树的产量、品质、树势及农业经济效益均造成极大的损失，如何解决苹果的缺铁黄叶病就显得极为重要。在现行经济条件下还难以通过大面积的土壤改良或施肥进行缺铁矫正。而选育耐缺铁的砧木成为解决铁营养失调问题的根本途径。苹果多为多年生木本植物，基因高度杂合，遗传背景复杂，所以传统的育种方法在果树上还很难应用。随着分子生物学技术的发展，从分子水平研究育种方法，筛选耐缺铁植株，将会成为解决苹果缺铁失绿症的根本途径，可为今后的果树优良种质定向改良、更快更稳定地获得我国果树需要的新品种、新种质打下良好基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于鉴定耐缺铁苹果砧木的方法。
本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定耐缺铁苹果砧木的方法，命名为Dot-blot-macroarray法，具体可包括如下步骤：
(1)对待测苹果砧木植株和标准耐缺铁苹果砧木植株分别进行缺铁处理后，提取总RNA；
(2)采用针对耐缺铁基因的探针对步骤(1)所得的总RNA进行斑点杂交；
(3)采用软件ImageScannner对步骤(2)获得的杂交结果进行扫描，并用软件ImageMaster进行分析，分别得到所述待测苹果砧木植株和所述标准耐缺铁苹果砧木植株中所述耐缺铁基因的表达量；
(4)根据步骤(3)的结果，按照如下方法确定所述待测苹果砧木是否为耐缺铁苹果砧木：若所述待测苹果砧木植株中所述耐缺铁基因的表达量在统计学上不低于(最好为显著高于)所述标准耐缺铁苹果砧木植株中相应所述耐缺铁基因的表达量，则所述待测苹果砧木为或候选为耐缺铁苹果砧木；反之，则所述待测苹果砧木不为或候选不为耐缺铁苹果砧木。
在所述方法的步骤(1)中，所述缺铁处理可为用4μmol·L-1的铁离子进行处理(正常供铁浓度为40μmol·L-1)。
在本发明的一个实施例中，所述缺铁处理具体为：将所述待测苹果砧木植株或所述标准耐缺铁苹果砧木植株种植于经过如下处理的河沙基质中：向不含铁离子的河沙基质中通过滴灌提供含有铁离子浓度为4μmol·L-1的改良Hoagland’s营养液。
进一步，所述缺铁处理的时间可为1天。
在所述方法的步骤(1)中，所述提取总RNA可为采用CTAB法提取总RNA。
在所述方法的步骤(2)中，所述耐缺铁基因可为如下5个基因中的至少1个：MxIrt1基因、MxCS1基因、MxHA7基因、MxFIT1基因和MxRD3基因；
所述MxIrt1基因的核苷酸序列为序列表中序列3；所述MxCS1基因的核苷酸序列为序列表中序列4；所述MxHA7基因的核苷酸序列为序列表中序列1；所述MxFIT1基因的核苷酸序列为序列表中序列2；所述MxRD3基因的核苷酸序列为序列表中序列5。
在实际的生产中，所述5个基因只需检测一个即可，但为了提高所得候选耐缺铁苹果砧木的准确率，可以检测所述5个基因中任何2个基因或更多个基因的表达量，若所述待测苹果砧木植株中所述任何2个基因或更多个基因的表达量均在统计学上不低于(最好为显著高于)所述标准耐缺铁苹果砧木植株中相应所述耐缺铁基因的表达量，则所述待测苹果砧木为或候选为耐缺铁苹果砧木。
进一步，针对所述5个基因的探针具体如下：
针对所述MxHA7基因的探针为序列表中序列1的第1205-1780位所示的单链DNA分子；
针对所述MxFIT1基因的探针为序列表中序列2的第112-616位所示的单链DNA分子；
针对所述MxIrt1基因的探针为序列表中序列3的第53-561位所示的单链DNA分子；
针对所述MxCS1基因的探针为序列表中序列4的第596-1443位所示的单链DNA分子；
针对所述和MxRD3基因的探针为序列表中序列5的第43-765位所示的单链DNA分子。
在所述方法的步骤(2)中，所述“对步骤(1)所得的总RNA进行斑点杂交”，可为现有的斑点杂交方法。在本发明中，具体按照如下步骤进行：
(a1)用地高辛标记所述探针；
(a2)将所述总RNA变性后用转到尼龙膜上，于120℃烘烤干燥30min；
(a3)将步骤(a2)处理后的尼龙膜在杂交仪中于50℃、8-15转/分钟预杂交1-2小时；
(a4)采用步骤(a1)经地高辛标记过的探针对步骤(a3)预杂交过的尼龙膜在杂交仪中于55℃、8-15转/分钟杂交16h以上；
(a5)洗涤步骤(a4)处理后的尼龙膜，加入封闭剂，于20-25℃封闭30min。
(a6)加入地高辛抗体抗体，常温下反应30min；
(a7)洗膜后，加入检测缓冲液，平衡3-5min；
(a8)将尼龙膜转移到显色液中，避光静置显色；
(a9)显色后，用水(如双蒸水)洗膜5分钟以终止反应。
在上述方法中，用于检测的所述标准耐缺铁苹果砧木植株和所述待测苹果砧木植株均可为苗期植株。进一步，提取所述总RNA时的取样标本可为苗期植株的根部(具体如根部幼嫩部分)。
在上述方法中，所述标准耐缺铁苹果砧木具体可为小金海棠。
在上述方法中，所述待测苹果砧木可为任何可作为苹果砧木的植物品种。
在本发明的一个实施例中，所述待测苹果砧木具体为小金海棠和山定子的杂交F1代群体。
本发明的另一个目的是提供一种定量检测基因表达的方法。
本发明所提供的定量检测基因表达的方法，具体可包括如下步骤：
(a)采用针对待测基因的探针对生物样品进行斑点杂交；
(b)采用软件ImageScannner对步骤(a)获得的杂交结果进行扫描，并用软件ImageMaster进行定量分析。
其中，(a)中所述生物样品为用于测定所述待测基因表达量的生物样品。
在本发明中，以上所有的所述软件ImageMaster均具体可为软件ImageMaster2DPlatinum。
另外，用于鉴定或辅助鉴定耐缺铁苹果砧木的探针也属于本发明的保护范围。
所述用于鉴定或辅助鉴定耐缺铁苹果砧木的探针，具体可为如下中的全部或部分：
(a1)序列表中序列1的第1205-1780位所示的单链DNA分子；
(a2)序列表中序列2的第112-616位所示的单链DNA分子；
(a3)序列表中序列3的第53-561位所示的单链DNA分子；
(a4)序列表中序列4的第596-1443位所示的单链DNA分子；
(a5)序列表中序列5的第43-765位所示的单链DNA分子。
在本发明中，以上所有的所述耐缺铁均为可耐受4μmol·L-1以下(如4μmol·L-1)的铁离子。
在本发明中，以上所有的所述耐缺铁苹果砧木均指经4μmol·L-1的铁离子处理1天后黄化指数不高于(在统计学上等于或显著低于)经过相同处理的小金海棠的苹果砧木。所述黄化指数分级标准参照“GonzaloMJ,DirlewangerE,MorenoM,GogorcenaY(2012)GeneticanalysisofironchlorosistoleranceinPrunusrootstocks.TreeGenetics&Genomes8(5):943-955”一文。
本发明在斑点杂交的基础上对结果进行定量化，创建了一种用于定量检测基因表达的新方法，并将其应用于鉴定耐缺铁苹果砧木。实验证明，本发明方法与传统的RT-QPCR相比，具有如下优点：成本低廉，探针可以反复利用；高效，可以一次检查上千个样品。另外，本发明可以在苗期进行早期选择，大大缩短育种周期，提高育种效率，在辅助育种中可行性非常高。本发明克服了耐缺铁苹果砧木常规选育的局限性，在基因水平上进行选育，为基因表达标记辅助选择育种奠定良好的基础。
附图说明
图1为缺铁黄化分级图。A黄化0级；B黄化1级；C黄化2级；D黄化3级；E黄化4级。
图2为5个基因探针的PCR检测图。泳道1、3、5、7、9分别为地高辛标记的MxFIT1、MxHA7、MxCS1、MxRD3和MxIrt1探针；泳道2、4、6、8、10为相应的未经地高辛标记的对照。
图3为部分样品的Dot-blot-macroarray法检测5个基因表达量图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
小金海棠(MalusxiaojinensisChengetJiang)：为铁高效基因型，记载于“HanZH,ShenT,KorcakRF,BaligarVC(1994)Screeningforiron-efficientspeciesinthegenusmalus.JournalofPlantnutrition17(4):579-592”一文，公众可从中国农业大学获得。
山定子(MalusbaccataBokh.)：为铁低效基因型，记载于“张柳霞,王忆,朱斌.苹果属山定子柠檬酸合成酶基因(MbCS1)的克隆及表达分析.农业生物技术学报,2012年09期”一文，公众可从中国农业大学获得。
实施例1、采用Dot-blot-macroarray法鉴定耐缺铁苹果砧木
一、待测苹果砧木的获得及缺铁处理
以铁高效基因型的20年生小金海棠(MalusxiaojinensisChengetJiang)为母本树，铁低效基因型山定子(MalusbaccataBokh.)为父本树，2009年花蕾期去雄授粉套袋，2010年播种，共得到145个F1群体，2012扦插扩繁，每个株系选取生长一致的三棵扦插苗，移栽于河沙基质栽培槽中。正常供铁时铁离子浓度为40μmol·L-1，缺铁处理时铁离子浓度为4μmol·L-1。具体而言，向经过去离子水完全冲洗，经检测不含铁离子的河沙基质中通过滴灌提供改良Hoagland’s营养液，其中正常供铁时铁离子浓度为40μmol·L-1，缺铁处理时铁离子浓度为4μmol·L-1。
其中，改良Hoagland’s营养液的配方为：四水硝酸钙945mg/L；硝酸钾506mg/L；硝酸铵80mg/L；磷酸二氢钾136mg/L；硫酸镁493mg/L；铁盐溶液2.5ml/L；微量元素液5ml/L；pH＝6.0。微量元素液：碘化钾0.83mg/L；硼酸6.2mg/L；硫酸锰22.3mg/L；硫酸锌8.6mg/L；钼酸钠0.25mg/L；硫酸铜0.025mg/L；氯化钴0.025mg/L。铁盐溶液：七水硫酸亚铁(正常供铁时：2.78g；缺铁处理时：0.278g)；乙二胺四乙酸二钠(EDTA.Na)0.373g；蒸馏水500ml；pH＝5.5。
对145个F1群体的扦插苗(每个株系3棵苗)进行正常供铁两周后后，进行缺铁处理。同时以同期的小金海棠(MalusxiaojinensisChengetJiang)扦插苗和山定子作为亲本对照。
二、待测苹果砧木的缺铁黄化指数调查和黄化分级
在步骤一中对145个F1群体的扦插苗、小金海棠和山定子进行缺铁处理后，观察各株系的缺铁黄化情况，进而进行缺铁黄化指数调查和黄化分级。
缺铁黄化情况参考本领域公认的Gonzalo等(参考文献：GonzaloMJ,DirlewangerE,MorenoMá,GogorcenaY(2012)GeneticanalysisofironchlorosistoleranceinPrunusrootstocks.TreeGenetics&Genomes8(5):943-955)的分级标准。将黄化程度最低定0级，最高定为4级：黄化0级，完全没有黄化；黄化1级，轻微黄化，叶尖黄化，黄化不超过1/2；黄化2级，中度黄化，全叶片黄化，但不呈典型的缺铁黄化；黄化3级，重度黄化，全叶黄化，典型的缺铁黄化，即脉间失绿；黄化4级，全叶失绿，呈黄化或白化症状(见图1)。每个株系从生长点往下取10个叶片，按以下公式计算黄化指数：黄化指数＝[(黄化级值×相应黄化级值叶片数)/(总叶片数×4)×100％]。其中，各株系的黄化指数均为3棵扦插苗的平均值。黄化指数越低说明植株的耐缺铁能力越强，以小金海棠作为标准对照，黄化指数不高于(在统计学上等于或显著低于)小金海棠的株系判定为耐缺铁株系。
结果显示，在缺铁处理的第18天后开始出现黄化，第30天黄化分级明显，且不同株系黄化指数存在显著差异。具体如表1所示。
表1各株系在缺铁处理30天后的黄化指数统计以及5个基因第二天在根部的
Dot-blot-macroarray法测定表达量
注：**表示与小金海棠相比差异极显著(P<0.01)，*表示与小金海棠相比差异显著(P<0.05)。
三、Dot-blot-macroarray法鉴定耐缺铁苹果砧木
在步骤一中对145个F1群体的扦插苗、小金海棠和山定子进行缺铁处理1天后，各株系分别取根部幼嫩部分1g左右，采用CTAB法提取总RNA。
一方面，采用本发明提供的Dot-blot-macroarray法定量检测与苹果砧木耐缺铁性状紧密苦相关的MxHA7基因(序列1)、MxFIT1基因(序列2)、MxIrt1基因(序列3)、MxCS1基因(序列4)和MxRD3基因(序列5)的表达情况；另一方面，为了验证Dot-blot-macroarray检测基因表达的准确性，本发明的发明人采用高度灵敏的实时荧光定量PCR对相同的材料验证上述五个基因表达量。
1、Dot-blot-macroarray法
下述方法中涉及的Washingbuffer，Blockingsolution，Detectionbuffer为一个试剂盒里面的药品，Roche,Cat.No.11585762001。
(1)cDNA探针的制备，探针的合成采用PCR方法合成，用地高辛标记，琼脂糖凝胶电泳检测，由于标记探针中有地高辛的渗入，泳动速度将慢于非标记的PCR产物。五个基因探针的引物见表2。
表2铁高效相关基因探针合成引物序列
五个基因探针的PCR检测图如图2所示。图2所示的结果与理论上“由于标记探针中有地高辛的渗入，泳动速度将慢于非标记的PCR产物”相符。进一步，对所得五个PCR产物进行序列测定，得到针对所述MxHA7基因的探针的核苷酸序列为序列表中序列1；针对所述MxFIT1基因的探针的核苷酸序列为序列表中序列2；针对所述MxIrt1基因的探针的核苷酸序列为序列表中序列3；针对所述MxCS1基因的探针的核苷酸序列为序列表中序列4；针对所述和MxRD3基因的核苷酸序列探针为序列表中序列5。
(2)取提取的总RNA(0.5μg)68℃变性10min，冰浴5min。
(3)将变性后的RNA用Minifold-I型96孔真空转膜仪(德国Scheicher&Schuell公司)负压转印到尼龙膜上。将膜放入烘箱中，120℃烘烤干燥30min进行固定。
(4)将膜放入杂交管中，加入杂交液(每100cm2膜需12.5ml杂交液)，在杂交仪中50℃、8-15转/分钟预杂交1-2小时。其中，杂交液为Roche公司产品,Cat.No.11603558001。
(5)弃预杂交液，加入新的杂交液，并加入步骤(1)制备好的经地高辛标记的探针(20-100ng/ml杂交液)，在杂交仪中55℃、8-15转/分钟杂交过夜。实验共5个平行，每个平行中加入针对一种基因的探针。
(6)弃杂交液，加入足量的2×SSC、0.1％SDS溶液(1-5ml/cm2膜)，常温(20-25℃)下洗膜2次，每次5min。其中，2×SSC、0.1％SDS溶液分别由20×SSC和20％SDS母液配制所得。20％SDS配方：称取20gSDS，用双蒸水溶解，定容至100ml，用HCl调pH至7.2，无需灭菌，室温保存。20×SSC配方：氯化钠17.53g，柠檬酸钠8.82g溶解于双蒸水，定容至100ml，用HCl调pH至7.0，高压灭菌。
(7)加入0.1×SSC、0.1％SDS溶液(1-5ml/cm2膜)，68℃下洗膜2次，每次15min。其中，0.1×SSC、0.1％SDS溶液分别由20×SSC和20％SDS母液(母液配方同上)配制所得。
(8)加入100ml洗涤液(Washingbuffer)，室温(20-25℃)漂洗5min。
(9)弃洗涤液，加入20ml封闭剂(Blockingsolution)，室温(20-25℃)封闭30min。
(10)加入20ml抗地高辛的抗体溶液(Antibodysolution，Roche,Cat.No.11093174910)，常温(20-25℃)下反应30min。
(11)弃抗体溶液，加入100ml洗涤液((Washingbuffer)，洗膜2次，每次15min。
(12)加入20ml检测缓冲液(Detectionbuffer)平衡3-5min。
(13)将杂交膜转移到10mL新鲜制备的BCIP-NBT显色液(Roche,Cat.No.11681451001)中，避光静置显色(勿摇)。
(14)显色到6小时后，用50mL超纯水将杂交膜漂洗5分钟以终止反应。
(15)用软件ImageScannner对杂交斑点进行扫描，并用软件ImageMaster2DPlatinum进行定量分析，最终得到一张宏列阵的基因表达芯片。从而获得待测苹果砧木中5个基因的表达量。
Dot-blot-macroarray法检测138个F1群体的5个基因的表达量定量结果如表1所示，部分样品的直观图如图3所示，斑点颜色越深表示相应基因的表达量越高。
2、RT-QPCR验证
反应采用20μl体系：cDNA2μl，上下游引物各0.3μl，SYBRGreenfuorescenceMix10μl(Takara)，ROX(Takara)0.4μl，H2O7μl。其中，用于检测MxHA、MxFIT1、MxIrt1、MxCS1和MxRD3这5个基因的RT-QPCR引物序列如表3所示。以β-Actin为内参基因。
将反应体系均匀混合，置于AB7500荧光定量PCR仪上进行自动化扩增反应。
反应程序：95℃30s；95℃5s，60℃34s，40个循环。
RT-QPCR结果：将内参基因的表达量设为1，得到待测基因的相对表达量。
表3RT-QPCR引物序列
表4为从145个F1群体中随机选取的30个株系的RT-QPCR法对5个基因的表达量的定量检测结果。
表4RT-QPCR法对5个基因的表达量的定量检测结果比较
注：其中Dot即表示Dot-blot-macroarray法。
四、数据分析
本发明的发明人基于以上步骤一至三的实验结果，对Dot-blot-macroarray法与RT-QPCR法检测的5个基因的表达量之间的相关性(参见表4和表1中共同涉及的30个F1群体的相关数据)，以及Dot-blot-macroarray法检测的5个基因的表达量与黄化指数之间的相关性(参见表1中138个F1群体的相关数据，用EXCEL作相关性，求相关系数)，进行了统计分析。
结果如表5所示。由RT-QPCR法与Dot-blot-macroarray法相关系数可知，本发明Dot-blot-macroarray发检测基因表达量准确性非常高。由Dot-blot-macroarray法基因表达与黄化指数相关系数可知，5个基因表达量与黄化指数呈负相关，耐缺铁能力越强，这5个基因的表达量越高，5个基因在杂交后代中表达量表现具有一致性。
表55个基因的表达量与杂交后代黄化指数关联系数
注：*表示相关性极显著。
另外，分析表1中的数据，F1群体中MxHA7基因的表达量不显著低于小金海棠的21个株系中有18个株系按照缺铁黄化指数进行判定被归为耐缺铁株系(即缺铁黄化指数不显著高于作为标准对照的小金海棠)，显著低于小金海棠的117个株系中有114个株系按照缺铁黄化指数进行判定被归为非耐缺铁株系(即缺铁黄化指数显著高于作为标准对照的小金海棠)；F1群体中MxFIT1基因的表达量不显著低于小金海棠的15个株系中有14个株系按照缺铁黄化指数进行判定被归为耐缺铁株系，显著低于小金海棠的123个株系中有116个株系按照缺铁黄化指数进行判定被归为非耐缺铁株系；F1群体中MxIrt1基因的表达量不显著低于小金海棠的20个株系中有16个株系按照缺铁黄化指数进行判定被归为耐缺铁株系，显著低于小金海棠的118个株系中，有113个株系按照缺铁黄化指数进行判定被归为非耐缺铁株系；F1群体中MxCs1基因的表达量不显著低于小金海棠的25个株系中有19个株系按照缺铁黄化指数进行判定被归为耐缺铁株系，显著低于小金海棠的113个株系中有111个株系按照缺铁黄化指数进行判定被归为非耐缺铁株系；F1群体中MxFRD3基因的表达量不显著低于小金海棠的19个株系中有16个株系按照缺铁黄化指数进行判定被归为耐缺铁株系，显著低于小金海棠的119个株系中有114个株系按照缺铁黄化指数进行判定被归为非耐缺铁株系。如上数据，再次表明“采用通过比较待测苹果砧木与作为标准对照的小金海棠的如上5个基因的表达量之间的差异性判定待测苹果砧木是否耐缺铁”这一方法的准确性很高。

Claims (4)

1.一种用于鉴定或辅助鉴定耐缺铁苹果砧木的方法，包括如下步骤：
(1)对待测苹果砧木植株和标准耐缺铁苹果砧木植株分别进行缺铁处理后，提取总RNA；
(2)采用针对耐缺铁基因的探针对步骤(1)所得的总RNA进行斑点杂交；
(3)采用软件ImageScannner对步骤(2)获得的杂交结果进行扫描，并用软件ImageMaster进行分析，分别得到所述待测苹果砧木植株和所述标准耐缺铁苹果砧木植株中所述耐缺铁基因的表达量；
(4)根据步骤(3)的结果，按照如下方法确定所述待测苹果砧木是否为耐缺铁苹果砧木：若所述待测苹果砧木植株中所述耐缺铁基因的表达量不低于所述标准耐缺铁苹果砧木植株中所述耐缺铁基因的表达量，则所述待测苹果砧木为或候选为耐缺铁苹果砧木；反之，则所述待测苹果砧木不为或候选不为耐缺铁苹果砧木；
所述耐缺铁基因为如下5个基因中的至少1个：MxIrt1基因、MxCS1基因、MxHA7基因、MxFIT1基因和MxRD3基因；
所述标准耐缺铁苹果砧木为小金海棠。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述缺铁处理为用4μmol·L-1的铁离子进行处理。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，针对所述MxHA7基因的探针为序列表中序列1的第1205-1780位所示的单链DNA分子；
针对所述MxFIT1基因的探针为序列表中序列2的第112-616位所示的单链DNA分子；
针对所述MxIrt1基因的探针为序列表中序列3的第53-561位所示的单链DNA分子；
针对所述MxCS1基因的探针为序列表中序列4的第596-1443位所示的单链DNA分子；
针对所述和MxRD3基因的探针为序列表中序列5的第43-765位所示的单链DNA分子。
4.用于鉴定或辅助鉴定耐缺铁苹果砧木的探针，为如下中的全部或部分：
(a1)序列表中序列1的第1205-1780位所示的单链DNA分子；
(a2)序列表中序列2的第112-616位所示的单链DNA分子；
(a3)序列表中序列3的第53-561位所示的单链DNA分子；
(a4)序列表中序列4的第596-1443位所示的单链DNA分子；
(a5)序列表中序列5的第43-765位所示的单链DNA分子。
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