CN108103071B - 芍药HpLEA基因及其应用 - Google Patents

芍药HpLEA基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108103071B
CN108103071B CN201611055218.2A CN201611055218A CN108103071B CN 108103071 B CN108103071 B CN 108103071B CN 201611055218 A CN201611055218 A CN 201611055218A CN 108103071 B CN108103071 B CN 108103071B
Authority
CN
China
Prior art keywords
peony
hplea
gene
primer
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611055218.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108103071A (zh
Inventor
蒋昌华
叶康
张婷
高燕
宋垚
赵广琦
奉树成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI BOTANICAL GARDEN
Original Assignee
SHANGHAI BOTANICAL GARDEN
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI BOTANICAL GARDEN filed Critical SHANGHAI BOTANICAL GARDEN
Priority to CN201611055218.2A priority Critical patent/CN108103071B/zh
Publication of CN108103071A publication Critical patent/CN108103071A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108103071B publication Critical patent/CN108103071B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种芍药HpLEA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明进一步提供了将该基因转入拟南芥后提高转基因植株对高盐胁迫耐性的技术，应用该技术可以提高转基因植株的高盐抗性。

Description

芍药HpLEA基因及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学、生理学以及基因工程等领域，具体涉及一种芍药HpLEA基因及其应用，特别是涉及一种在芍药中表达的HpLEA(芍药真核生物翻译起始因子：Herbaceous peony late-embryogenesis-abundant protein，HpLEA)的克隆、转基因载体的构建、拟南芥的转化，以及所述基因在提高转基因植株的高盐胁迫抗性中的应用。
背景技术
胚胎发育后期丰富蛋白(LEA)是生物体中广泛存在的一类与渗透调节有关的家族蛋白。研究发现在植物胚胎发育晚期，LEA蛋白表达量十分丰富，而且在环境胁迫如干旱、低温、盐胁迫、ABA、紫外辐射和NaHCO3等条件下LEA蛋白mRNA也会大量累积，被认为是在胁迫过程中对植物起保护作用的物质之一。LEA蛋白在细胞中分布广泛，具有很高的亲水性和热稳定性，即使在煮沸条件下也能保持水溶状态，起稳定细胞膜、分子屏障、离子结合和防止氧化等作用。
在没有胁迫或激素处理的条件下，拟南芥中的一些LEA基因表现出组成型表达特性；在干旱、冷和盐胁迫条件下，部分LEA基因可被胁迫强烈诱导表达，这和前人的研究结果相一致。芍药HpLEA基因为胁迫诱导表达，但在高盐胁迫条件下，HpLEA只在耐盐芍药品种中强表达，而在不耐热品种中弱表达甚至不表达，该基因的表达与否和芍药品种的田间耐盐性差异观察结果相吻合。
大豆LEA蛋白Em的表达可提高拟南芥和转基因烟草的耐盐性，自1981年Dure等在棉花子叶中报告LEA蛋白以来，在许多植物的种子、花粉粒和受干旱胁迫的幼苗营养组织中，发现LEA蛋白可高水平表达，且表达水平与植物细胞的抗逆性有着密切的关系。目前关于LEA蛋白的抗胁迫研究已经积累了一些的资料，如Cheng等将小麦PMA1959(LEA1)基因转化水稻，使转基因水稻的脱水耐盐能力得到增强。利用酵母细胞与植物细胞在一些耐盐反应的相似性，Swire-Clark将小麦Em基因(LEA1)转化酵母，证明了单一LEA蛋白在提高重组酵母对高浓度NaCl、KCl和低温胁迫的耐受性中起着直接作用。蔡丹等(2006)将大豆Em基因(LEA1)转化拟南芥和烟草，证明了大豆Em蛋白的过量表达不仅对提高重组菌耐盐性有着直接的贡献，也可提高转基因烟草对高盐胁迫的耐受性。这一结果与前人在水稻和酵母中得到的结果一致，为前人提出的假说，即“LEA蛋白在原核生物和真核细胞中可能采取相似的抗逆保护机制”提供了实验证据，也表明拟南芥异源表达体系是研究LEA蛋白耐盐机制的简单、快捷、有效的体系。
芍药(Paeonia lactiflora Pall.)为芍药科(Paeoniaceae)芍药属(Paeonia)的多年生宿根草本花卉，被誉为“花中之相”，与牡丹尊称“花中二绝”，素有“绰约之花”的美名，象征着繁荣富强和美满幸福，多年来作为我国的传统名花被广为栽培。中国是世界芍药野生种的原产中心和分布中心，也是世界芍药园艺品种的栽培中心。我国原产芍药组植物有8种，6个变种，主要分布在四川东部、贵州、湖南西部、江西、浙江、安徽、湖北、河南西北部、陕西南部、山西、河北、东北。芍药也是非常有名的药用植物，从南北朝时期开始，依药用功能被分为白芍和赤芍两种。上海地区自然环境特殊，存在地下水位高、土壤含盐量高、高温高湿的特点。尽管芍药的适应性较强，在上海的园林绿化中也有应用，但品种较少，尤其在崇明、金山等沿海区县几乎没有应用，尚未见芍药的相关耐盐方面研究报道。因此，耐盐芍药品种在上海具有很大的开发应用潜力。
随着生活水平的提高，园林观赏植物越来越受到人们关注，研究观赏植物对高盐逆境抗性的遗传机制有广泛的应用前景。
发明内容
本发明研究了一种从芍药中克隆胚胎发育后期丰富蛋白基因，并转入拟南芥后提高转基因植株对高盐胁迫耐性的技术，应用该技术预期可以提高转基因植株的高盐抗性。
本发明首先提供了一种芍药HpLEA基因，将该芍药HpLEA基因转化拟南芥，可以提高转基因植株的高盐胁迫抗性。
所述芍药HpLEA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，长度为981bp。
所述的芍药HpLEA基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2，由326个氨基酸残基组成，分子量为36020.94道尔顿，pI为4.526。
进一步，本发明提供了所述芍药HpLEA基因提高转基因拟南芥的高盐胁迫抗性中的应用。将所述芍药HpLEA基因的开放阅读框连接于载体pCAMBIA1300中，获得重组表达载体pCAMBIA1300-HpLEA，并转化农杆菌GV3101，以农杆菌浸染法(叶盘法)转化拟南芥叶片，结果显示转基因拟南芥(pCAMBIA1300-HpLEA)比野生型拟南芥(CK)具有更强的高盐胁迫抗性。
在本发明中，术语“芍药HpLEA基因的开放阅读框”指编码完整的芍药HpLEA蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-978位的核苷酸序列所示。
在本发明中，可选用本领域已知的各种重组表达载体和宿主细胞，如市售的载体，包括质粒等。
进一步，本发明还提供了一种所述芍药HpLEA基因克隆的方法，包括以下步骤：
1)用NaCl溶液浇灌处理耐盐芍药12-48小时；
2)提取耐盐芍药嫩叶的总RNA；
3)将总RNA反转录成cDNA；
4)以cDNA为模板进行RT-PCR；
5)将PCR产物进行割胶回收，并连接到pGEM T-Vector上，构建重组质粒pGEM T重组载体；
6)转化大肠杆菌DH5α。
优选地，步骤1)中耐盐芍药品种为‘东方金’二年生嫁接苗，NaCl溶液的浓度为800mM，浇灌处理时间为24小时。
在本发明的一种实施方式中，步骤4)中RT-PCR扩增引物的设计是根据草莓LEA基因(登录号：XM_011468123.1)与葡萄LEA基因(登录号：XM_010652458.1)的同源序列设计一对兼并引物：5’端兼并引物：5’-ATGKCRTCMTMTGATRAS-3’，3’端兼并引物：5’-CTAGTCCTCATCMTCGTC-3’，以及中间一对同源引种：5’端同源引物：5’-GAATGACTTTGACTTGGG-3’，3’端同源引物：5’-CCCAAGTCAAAGTCATTC-3’，以5’端兼并引物配对3’端同源引物，以3’端兼并引物配对5’端同源引物，分别进行RT-PCR克隆芍药HpLEA基因的5’端、3’端序列。
在本发明的另一种实施方式中，步骤4)中正向引物序列为：5’-ATGGTATCCTCTGATGAC-3’，反向引物序列：5’-TTAAAATCCAGTGTAGAG-3’。
附图说明
图1为本发明的芍药HpLEA基因在拟南芥中异源表达提高转基因拟南芥的高盐胁迫(400mM NaCl溶液胁迫处理8天)耐性实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验手册(New York：Cold Spring Harbor LabortaryPress，1989)中所叙述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1芍药HpLEA基因的克隆
1)将耐盐芍药品种‘东方金’二年生嫁接苗于正常条件下及800mM NaCl溶液浇灌24小时处理，分别提取它们嫩叶的总RNA(“Plant RNAout”试剂盒，TianDZ，中国)。
2)将获得的总RNA反转录成cDNA(逆转录的试剂盒为PrimeScriptTM RT ReagentKit(TaKaRa，中国大连)，然后根据草莓LEA基因(登录号：XM_011468123.1)与葡萄LEA基因(登录号：XM_010652458.1)的同源序列设计一对兼并引物：5’端兼并引物：5’-ATGKCRTCMTMTGATRAS-3’，3’端兼并引物：5’-CTAGTCCTCATCMTCGTC-3’，以及中间一对同源引物：5’端同源引物：5’-GAATGACTTTGACTTGGG-3’，3’端同源引物：5’-CCCAAGTCAAAGTCATTC-3’，以5’端兼并引物配对3’端同源引物，以3’端兼并引物配对5’端同源引物，分别进行RT-PCR克隆芍药HpLEA基因的5’端、3’端序列。小量胶回收法将PCR产物进行割胶回收，连接到pGEM T-Vector上，构建重组质粒pGEM T重组载体。转化大肠杆菌DH5α，测序，将测序结果提交至NCBI非冗余数据库进行BLAST检索，分别获得芍药HpLEA基因的5’端、3’端序列，并通过拼接获得芍药HpLEA基因全长序列。
3)以获得的芍药cDNA为模板进行RT-PCR，正向引物序列为：5’-ATGGTATCCTCTGATGAC-3’，反向引物序列：5’-TTAAAATCCAGTGTAGAG-3’，获得芍药HpLEA基因，全长981bp BLAST结果表明该序列和其他物种中相应的LEA的序列高度保守。
实施例2芍药HpLEA基因的序列信息与同源性分析
对上述获得的981bp条带进行测定，其序列如SEQ ID NO.1所示，即为本发明的芍药HpLEA基因的核苷酸序列。该芍药HpLEA基因编码蛋白质的氨基酸序列由326个氨基酸残基组成，分子量为36020.94道尔顿，pI为4.526，序列如SEQ ID NO.2所示。
将上述芍药HpLEA基因的核苷酸序列及其编码的蛋白质的氨基酸序列用BLAST程序在Non-redundant GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GeneBank CDStranslations+PDB+SwissPort+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检测，结果发现它与柽柳Tamarix hispida isolate ThLEA7 late embryogenesis abundantprotein(LEA)gene存在一定的同源性。在核苷酸水平上，它与柽柳Tamarix hispidaisolate ThLEA7 late embryogenesis abundant protein(LEA)基因的mRNA编码序列(GeneBank AccessionNo.KF801666.1)有78％的同源性(参看下述表1)，在氨基酸水平上，它与柽柳Tamarix hispida isolate ThLEA7 late embryogenesis abundant protein(LEA)蛋白质的氨基酸残基(GeneBank AccessionNo.AHF21584.1)也有78％的相似性(参看下述表2)。因此，该芍药HpLEA基因与柽柳Tamarix hispida isolate ThLEA7 lateembryogenesis abundant protein(LEA)基因存在较高的同源性。
表1本发明的芍药HpLEA基因与柽柳Tamarix hispida isolate ThLEA7 lateembryogenesis abundant protein(LEA)基因的核苷酸序列的同源性比较表
Tamarix hispida isolate ThLEA7 late embryogenesis abundant protein(LEA)gene,complete cds Sequence ID:KF801666.1Length:957Number of Matches:1Related Information
Range 1:73 to 953GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match
Alignment statistics for match#1
Figure BDA0001161709200000051
Figure BDA0001161709200000061
其中，Query为芍药HpLEA基因核苷酸序列，Sbjct为柽柳Tamarix hispidaisolate ThLEA7 late embryogenesis abundant protein(LEA)基因核苷酸序列(GenBankAccession No.KF801666.1)。
表2本发明的芍药HpLEA蛋白与柽柳Tamarix hispida isolate ThLEA7 lateembryogenesis abundant protein(LEA)蛋白的氨基酸序列的同源性比较表
|ate embrogenesis abundant protein[Tamarix hispida]
Sequence ID：AHF21584.1 Length：318 Number or Matches：1
Figure BDA0001161709200000062
其中，Query为本发明的芍药HpLEA氨基酸序列，Sbjct为柽柳Tamarix hispidaisolate ThLEA7 late embryogenesis abundant protein(LEA)蛋白质的氨基酸残基(GeneBank AccessionNo.AHF21584.1)。相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。
实施例3芍药HpLEA基因在拟南芥中异源表达提高转基因拟南芥的高盐胁迫耐性实验重组表达载体pCAMBIA1300-HpLEA的构建及拟南芥转化
以芍药HpLEA基因的ORF设计引物序列，正向引物序列为：5’-ATGGTATCCTCTGATGAC-3’，反向引物序列：5’-TTAAAATCCAGTGTAGAG-3’。正向引物引入EcoRI酶切位点，反向引物引入Xba I酶切位点。以实施例1中获得的耐盐芍药品种‘东方金’cDNA为模板，进行PCR扩增；割胶回收PCR产物，连接到pGEM T-Vector构建成重组质粒pGEM T-HpLEA；转化大肠杆菌DH5α，PCR检测阳性克隆，提取质粒pGEM T-HpLEA；EcoR I、Sac I双酶切质粒pGEM T-HpLEA，电泳分离，割胶回收酶切产物的小片段，与同样经EcoR I、Xba I双酶切的植物表达载体pCAMBIA1300连接，构建pCAMBIA1300-HpLEA重组质粒；转化大肠杆菌DH5α，PCR检测阳性克隆，并测序证明插入片段HpLEA序列正确，无移码发生；提取质粒pCAMBIA1300-HpLEA。
将重组表达载体质粒pCAMBIA1300-HpLEA转化农杆菌GV3101，以农杆菌浸染法(叶盘法)转化拟南芥叶片；潮霉素(15mg/L)筛选阳性植株，获得T3代转基因(pCAMBIA1300-HpLEA)拟南芥植株。选取5叶期的转基因(pCAMBIA1300-HpLEA)拟南芥植株土培盆苗，进行400mM NaCI溶液高盐胁迫处理8天后，转基因拟南芥植株(pCAMBIA1300-HpLEA)未发生明显的形态变化而野生型拟南芥(CK)出现严重萎蔫(参看图1)，结果显示转基因拟南芥(pCAMBIA1300-HpLEA)比野生型拟南芥(CK)具有更强的耐高盐性。表明芍药HpLEA基因在拟南芥中异源过表达能提高转基因拟南芥对高盐胁迫的耐性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海植物园
<120> 芍药HpLEA基因及其应用
<130> 2016
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> 芍药
<400> 1
atggtatcct ctgatgactc agcaagatca gatcgcggca ttaaggagga ggagaaaaaa 60
cacaatgggg aggaagagga gggtgacagc ttcatagata aggtcaagga tttcattcat 120
gacattggcg agaagatcga gggagctatc ggatttggta agcccactgc agatgtggct 180
gcaattcaca tcccctgcat aaatctggag aaggcagaga ttgcggttga tgtgcttatt 240
aagaacccaa atcctgtgcc catcccgctc attgacataa actacttgat tgaaagtgat 300
ggtaggaaac tggtgtctgg attgatcccg gacgctggaa caatccaggc tcatggagaa 360
gagactgtca aagttccact tcacttgatt tacgatgaca tcaagagcac ctacaatgat 420
atcgagcctg gaagcatcat tccctacagg atcaaggttg atctcattgt ggatgtccct 480
gttcttggca ggctcactct cccacttgag aaaactggag agatccccat cccctacaaa 540
cctgatgttg atgttgacaa aatcaagttt cagaaattct cctttgaaga aactgttgca 600
gtgctccatt tgaagctcga gaacatgaat gactttgact tgggcctcaa tgttttagac 660
tacgagattt ggctctgtga ggtcagcatt ggaggcgctg agctctccaa atctgccaac 720
cttgaaaaga aaggtatcac ttttgttgac gttcctatta ccttcaggcc aaaggatttt 780
ggctctgcac tctgggatat gatccgcggt aggggtactg gttatacctt caaaggccat 840
atcgatgttg atactccctt tggggccatg aagttaccca ttgtcaagga gggtggtact 900
acacgcctca agaagagcaa ggaagatggt ggcgacgatg atgacgatga tgaggtaagt 960
aatctctaca ctggatttta a 981
<210> 2
<211> 326
<212> PRT
<213> 芍药
<400> 2
Met Val Ser Ser Asp Asp Ser Ala Arg Ser Asp Arg Gly Ile Lys Glu
1 5 10 15
Glu Glu Lys Lys His Asn Gly Glu Glu Glu Glu Gly Asp Ser Phe Ile
20 25 30
Asp Lys Val Lys Asp Phe Ile His Asp Ile Gly Glu Lys Ile Glu Gly
35 40 45
Ala Ile Gly Phe Gly Lys Pro Thr Ala Asp Val Ala Ala Ile His Ile
50 55 60
Pro Cys Ile Asn Leu Glu Lys Ala Glu Ile Ala Val Asp Val Leu Ile
65 70 75 80
Lys Asn Pro Asn Pro Val Pro Ile Pro Leu Ile Asp Ile Asn Tyr Leu
85 90 95
Ile Glu Ser Asp Gly Arg Lys Leu Val Ser Gly Leu Ile Pro Asp Ala
100 105 110
Gly Thr Ile Gln Ala His Gly Glu Glu Thr Val Lys Val Pro Leu His
115 120 125
Leu Ile Tyr Asp Asp Ile Lys Ser Thr Tyr Asn Asp Ile Glu Pro Gly
130 135 140
Ser Ile Ile Pro Tyr Arg Ile Lys Val Asp Leu Ile Val Asp Val Pro
145 150 155 160
Val Leu Gly Arg Leu Thr Leu Pro Leu Glu Lys Thr Gly Glu Ile Pro
165 170 175
Ile Pro Tyr Lys Pro Asp Val Asp Val Asp Lys Ile Lys Phe Gln Lys
180 185 190
Phe Ser Phe Glu Glu Thr Val Ala Val Leu His Leu Lys Leu Glu Asn
195 200 205
Met Asn Asp Phe Asp Leu Gly Leu Asn Val Leu Asp Tyr Glu Ile Trp
210 215 220
Leu Cys Glu Val Ser Ile Gly Gly Ala Glu Leu Ser Lys Ser Ala Asn
225 230 235 240
Leu Glu Lys Lys Gly Ile Thr Phe Val Asp Val Pro Ile Thr Phe Arg
245 250 255
Pro Lys Asp Phe Gly Ser Ala Leu Trp Asp Met Ile Arg Gly Arg Gly
260 265 270
Thr Gly Tyr Thr Phe Lys Gly His Ile Asp Val Asp Thr Pro Phe Gly
275 280 285
Ala Met Lys Leu Pro Ile Val Lys Glu Gly Gly Thr Thr Arg Leu Lys
290 295 300
Lys Ser Lys Glu Asp Gly Gly Asp Asp Asp Asp Asp Asp Glu Val Ser
305 310 315 320
Asn Leu Tyr Thr Gly Phe
325

Claims (7)

1.芍药HpLEA基因在拟南芥中异源表达提高转基因拟南芥的高盐胁迫耐性中的应用，其特征在于：
所述芍药HpLEA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.芍药HpLEA基因编码的蛋白质在拟南芥中异源表达提高转基因拟南芥的高盐胁迫耐性中的应用，其特征在于：
所述芍药HpLEA基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.重组表达载体在提高转基因拟南芥的高盐胁迫耐性中的应用，其特征在于：
所述重组表达载体包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的多核苷酸链。
4.宿主细胞在提高转基因拟南芥的高盐胁迫耐性中的应用，其特征在于：
所述宿主细胞包含重组表达载体，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的多核苷酸链。
5.一种芍药HpLEA基因克隆的方法，其特征在于包括步骤：
1)用NaCl溶液浇灌处理耐盐芍药12-48小时；
2)提取耐盐芍药嫩叶的总RNA；
3)将总RNA反转录成cDNA；
4)以cDNA为模板进行RT-PCR；
5)将PCR产物进行割胶回收，并连接到pGEM T-Vector上，构建重组质粒pGEM T重组载体；
6)转化大肠杆菌DH5α；
其中，所述芍药HpLEA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；并且
其中，所述耐盐芍药的品种为东方金。
6.如权利要求5所述的芍药HpLEA基因克隆的方法，其特征在于步骤4)中使用引物，包括一对兼并引物：5’端兼并引物：5’-ATGKCRTCMTMTGATRAS-3’，3’端兼并引物：5’-CTAGTCCTCATCMTCGTC-3’，以及中间一对同源引物：5’端同源引物：5’-GAATGACTTTGACTTGGG-3’，3’端同源引物：5’-CCCAAGTCAAAGTCATTC-3’，以5’端兼并引物配对3’端同源引物，以3’端兼并引物配对5’端同源引物分别进行RT-PCR克隆芍药HpLEA基因的5’端、3’端序列。
7.如权利要求5所述的芍药HpLEA基因克隆的方法，其特征在于步骤4)中使用正向引物和反向引物，正向引物序列为：5’-ATGGTATCCTCTGATGAC-3’，反向引物序列为：5’-TTAAAATCCAGTGTAGAG-3’。
CN201611055218.2A 2016-11-25 2016-11-25 芍药HpLEA基因及其应用 Active CN108103071B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611055218.2A CN108103071B (zh) 2016-11-25 2016-11-25 芍药HpLEA基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611055218.2A CN108103071B (zh) 2016-11-25 2016-11-25 芍药HpLEA基因及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108103071A CN108103071A (zh) 2018-06-01
CN108103071B true CN108103071B (zh) 2021-05-18

Family

ID=62205291

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611055218.2A Active CN108103071B (zh) 2016-11-25 2016-11-25 芍药HpLEA基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108103071B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110317815B (zh) * 2019-07-11 2020-11-13 东北林业大学 一种调控大青杨不定根发生的基因、检测引物、表达载体及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102094028A (zh) * 2010-12-16 2011-06-15 上海植物园 月季RcLEA编码序列及其应用
CN105801679A (zh) * 2016-04-15 2016-07-27 首都师范大学 蛋白质PpLEA3-2在调控植物抗逆性中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102094028A (zh) * 2010-12-16 2011-06-15 上海植物园 月季RcLEA编码序列及其应用
CN105801679A (zh) * 2016-04-15 2016-07-27 首都师范大学 蛋白质PpLEA3-2在调控植物抗逆性中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Heterologous expression of two Physcomitrella patens group 3 late embryogenesis abundant protein (LEA3) genes confers salinity tolerance in arabidopsis;Du, J等;《JOURNAL OF PLANT BIOLOGY》;20160415;第59卷(第2期);第182-190页 *
水稻OsLEA19a基因在大肠杆菌中的表达和抗逆性分析;胡廷章等;《华北农学报》;20121228;第27卷(第6期);第1-4页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108103071A (zh) 2018-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104946665B (zh) GmMYB62在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用
CN113430212B (zh) 苹果砧木抗盐胁迫相关基因MdLysMe3及其编码蛋白与应用
CN113429465B (zh) 一种桑黄MADS-box类转录因子PbMADS1及其编码基因与应用
CN111662914A (zh) 水稻耐盐胁迫基因OsBAG4、编码蛋白及其应用
CN108251432A (zh) 三七类病程相关蛋白基因PnPRlike及应用
CN102094028A (zh) 月季RcLEA编码序列及其应用
CN101985465B (zh) 大豆GmPHR1基因及其编码的蛋白和应用
CN108103071B (zh) 芍药HpLEA基因及其应用
CN112961229A (zh) 橡胶树转录因子HbICE4及其编码基因与应用
CN101302523B (zh) 生理时钟调控蛋白lhy在培育耐逆植物中的应用
CN110713994A (zh) 一种植物耐逆性相关蛋白TaMAPK3及其编码基因和应用
CN104480120A (zh) 植物耐盐相关基因PpSIG2及其编码蛋白和应用
CN112322600A (zh) 紫花苜蓿耐盐基因MsSnRK2.3及其编码蛋白与应用
CN106589086A (zh) 三七抗病相关蛋白PnPR10‑2及其编码基因与应用
CN114292856B (zh) 一种调控胡杨耐盐性的基因PeCLH2及其应用
CN1919866B (zh) 一种大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用
CN102399270A (zh) 毛白杨中的MYB类转录因子PtrMYB01及其cDNA的克隆方法及应用
CN112778408B (zh) 橡胶树转录因子HbICE2及其编码基因与应用
CN101402679A (zh) 抗寒蛋白及其编码基因与应用
CN104561036A (zh) 植物耐盐相关基因PpSIG1及其编码蛋白和应用
CN101942468B (zh) 提高转基因生物耐盐性的基因LcGST及其制备以及利用其编码的蛋白
CN114525298B (zh) 大豆蛋白GmFVE在植物耐盐性调控中的应用
CN114836437A (zh) 牡丹PsMYB4基因在改变植物花瓣色斑颜色和大小方面的应用
CN1919867B (zh) 大豆Trihelix转录因子及其编码基因与应用
CN107176983B (zh) 蛋白质PpLEA3-3在调控植物抗逆性中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant