CN110004175A

CN110004175A - 颠茄鸟氨酸脱羧酶在培育高产莨菪碱及山莨菪碱颠茄品种中的应用

Info

Publication number: CN110004175A
Application number: CN201910287701.0A
Authority: CN
Inventors: 廖志华; 陈敏; 杨春贤; 曾令江; 赵腾飞
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-04-11
Filing date: 2019-04-11
Publication date: 2019-07-12

Abstract

本发明公开了颠茄鸟氨酸脱羧酶在培育高产莨菪碱及山莨菪碱颠茄品种中的应用，颠茄鸟氨酸脱羧酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，通过在颠茄中过表达鸟氨酸脱羧酶能够提高颠茄发根和植株中腐胺、N‑甲基腐胺和TAs的含量；通过对AbODC的研究明确了，AbODC在多胺及托品烷生物碱生物合成中的功能，有利于加深对托品烷生物碱生物合成途径的认识，具有重要的理论价值；本研究相关结果也表明AbODC在采用代谢工程技术改造TAs生物合成途径和提高TAs含量方面具有重要应用价值。

Description

颠茄鸟氨酸脱羧酶在培育高产莨菪碱及山莨菪碱颠茄品种中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及颠茄鸟氨酸脱羧酶在培育高产莨菪碱及山莨菪碱颠茄品种中的应用。

背景技术

托品烷类生物碱是一类来源少数茄科植物的具有显著生理活性的天然碱性有机物，在临床上被作为抗胆碱药物广泛用于麻醉、镇痛、止咳、催眠、抗晕动病和治疗帕金森等。临床上常用的是莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱。这些TAs主要依赖于从少数茄科TAs药源植物中提取，但是野生产托品烷植物中的植株中TAs的含量普遍较低，莨菪碱和东莨菪碱含量极低，导致TAs商业生产成本较高。因此，培育TAs高产植物材料是业内一致追求的目标。随着分子生物学等学科的快速发展，通过基因工程手段对相关药源植物进行遗传改造成为一种理想且简便的手段，而这一切的前提就是筛选获得理想的分子工具。因此，对托品烷生物碱合成途径进行深入解析，分离相关途径基因并鉴定其生物学功能就显得非常必要。

随着代谢组学和转录基因组学的快速发展，TAs生物合成途径基因大部分已经被分离和鉴定出来，使得采用代谢工程技术培育TAs高产的药源植物呈现出良好前景。但是，关于托品烷生物碱代谢途径仍有一些步骤尚未被清楚解析。在茄科产TAs植物中，鸟氨酸和精氨酸通过脱羧生成腐胺从而进入到TAs生物合成中，而腐胺的生物合成来源于两个途径即ODC途径和ADC途径。鸟氨酸脱羧酶作为腐胺合成的限速酶，在动物及微生物中已经得到了广泛的研究，但是关于植物ODC的研究报道较少，且主要关注其在植物生长发育及胁迫条件下的功能研究。目前，只有烟草ODC及古柯ODC被成功克隆并利用纯化蛋白做了酶动力学分析。在茄科产托品烷生物碱植物中，只有曼陀罗的鸟氨酸脱羧酶基因(DsODC)得到了克隆，虽然Michael等人在1996年在大肠杆菌中表达了DsODC的重组蛋白，但是并未开展相关酶动力学实验。所以目前关于植物ODC的研究，特别是茄科产托品烷生物碱植物的ODC基因的研究有待深入。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种颠茄鸟氨酸脱羧酶在培育高产莨菪碱及山莨菪碱颠茄品种中的应用；本发明的目的之二在于提供一种获得高产莨菪碱和山莨菪碱颠茄品种的方法；本发明的目的之三在于提供颠茄鸟氨酸脱羧酶或重组颠茄鸟氨酸脱羧酶作为鸟氨酸合成腐胺的催化剂中的应用；本发明的目的之四在于提供颠茄鸟氨酸脱羧酶或重组颠茄鸟氨酸脱羧酶作为赖氨酸合成尸胺的催化剂中的应用；本发明的目的之五在于提供重组颠茄鸟氨酸脱羧酶的制备方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、颠茄鸟氨酸脱羧酶在培育高产莨菪碱及山莨菪碱颠茄品种中的应用，所述颠茄鸟氨酸脱羧酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且具鸟氨酸脱羧酶活性的氨基酸序列。

优选的，所述颠茄鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或SEQ IDNO.3所示核苷酸序列取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且具有鸟氨酸脱羧酶活性的核苷酸序列。

2、一种获得高产莨菪碱和山莨菪碱颠茄品种的方法，包括如下步骤：在颠茄中超量表达颠茄鸟氨酸脱羧酶，获得转基因颠茄品种，即获得高产莨菪碱和山莨菪碱颠茄品种；

所述颠茄鸟氨酸脱羧酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且具鸟氨酸脱羧酶活性的氨基酸序列。

优选的，在颠茄中超量表达颠茄鸟氨酸脱羧酶的方法如下：构建含编码颠茄鸟氨酸脱羧酶基因的植物重组表达载体，构建转化子，转化颠茄，诱导再生，筛选转基因植株，即获得超量表达颠茄鸟氨酸脱羧酶的颠茄。

优选的，所述含编码颠茄鸟氨酸脱羧酶基因的植物重组表达载体由以下方法构建：将SEQ ID NO.3所示序列通过BglII和BstEII连入1305⁺植物过表达载体；所述1305⁺植物过表达载体为pCAMBIA1305载体上的hygR基因替换为gus基因，获得中间载体，然后再将pBI121的GUS表达框通过BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的中间载体而得。

3、颠茄鸟氨酸脱羧酶或重组颠茄鸟氨酸脱羧酶作为鸟氨酸合成腐胺的催化剂中的应用，所述颠茄鸟氨酸脱羧酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

优选的，所述重组颠茄鸟氨酸脱羧酶由以下方法制备：以SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示序列为引物，颠茄cDNA为模板经PCR扩增AbODC编码区，然后经扩增获得的序列经BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的原核表达载体pET28a⁽⁺⁾中，获得重组质粒pET28a⁽⁺⁾-AbODC，然后将转化大肠杆菌Rosetta，获得含pET28a⁽⁺⁾-AbODC质粒的工程菌，使用终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达，纯化，获得重组颠茄鸟氨酸脱羧酶。

优选的，所述纯化为使用Proteinlso Ni-NTA Resin填料装柱，填充后静置30-60min后，ddH₂O冲洗洗去原装填料液体中的酒精，后用5倍体积的平衡缓冲液冲洗柱子后，再加入5倍的平衡缓冲液平衡树脂，静置1h；待柱子平衡结束后，加入重组蛋白上清液，流速调低至20滴/min，使目的蛋白与镍柱充分结合，待上样结束后，用平衡缓冲液冲洗镍柱，去除柱子上残留的不能与柱子结合的蛋白；再用100mM的咪唑洗脱，调节流速至60滴/min，收集洗脱液，即获得重组颠茄鸟氨酸脱羧酶。

4、颠茄鸟氨酸脱羧酶或重组颠茄鸟氨酸脱羧酶作为赖氨酸合成尸胺的催化剂中的应用，所述颠茄鸟氨酸脱羧酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

5、重组颠茄鸟氨酸脱羧酶的制备方法，包括如下步骤：以SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示序列为引物，颠茄cDNA为模板经PCR扩增AbODC编码区，然后经扩增获得的序列经BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的原核表达载体pET28a⁽⁺⁾中，获得重组质粒pET28a⁽⁺⁾-AbODC，然后将转化大肠杆菌Rosetta，获得含pET28a⁽⁺⁾-AbODC质粒的工程菌，使用终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达，纯化，获得重组颠茄鸟氨酸脱羧酶。

本发明的有益效果在于：本发明研究了AbODC基因功能，在颠茄中过表达AbODC能够提高颠茄发根和植株中腐胺、N-甲基腐胺和TAs的含量。在颠茄发根中开展了TAs代谢工程的相关研究，表明AbODC在采用代谢工程技术提高TAs生物合成中具有重要应用价值。本研究较为深入的研究了AbODC在多胺及托品烷生物碱生物合成中的功能，有利于加深对托品烷生物碱生物合成途径的认识，具有重要的理论价值；本研究相关结果也表明AbODC在采用代谢工程技术改造TAs生物合成途径和提高TAs含量方面具有重要应用价值。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为AbODC重组蛋白的纯化SDS-PAGE结果。

图2为AbODC重组蛋白催化鸟氨酸脱羧的活性鉴定(A：AbODC酶促产物的HPLC指纹图谱；B：AbODC酶促反应产物的质谱鉴定)。

图3为AbODC重组蛋白的赖氨酸脱羧酶催化活性鉴定(A：AbODC酶促产物的HPLC指纹图谱；B：AbODC酶促产物的质谱鉴定)。

图4为过表达AbODC颠茄发根的分子检测(A：PCR检测NPTII；B：PCR检测35S::AbODC片段；C：AbODC的表达量分析)。

图5为过表达AbODC发根中多胺及N-甲基腐胺的含量分析(A：发根中腐胺的含量；B：发根中亚精胺的含量；C：发根中精胺的含量；D：发根中N-甲基腐胺的含量)。

图6为过表达AbODC发根中TAs的含量分析(A：发根中莨菪碱的含量；B：发根中山莨菪碱的含量；C：发根中东莨菪碱的含量)。

图7为AbODC过表达转基因植株的分子检测(A：PCR检测NPTII；B：PCR检测35S::AbODC片段；C：AbODC在叶中的表达量分析；D：AbODC在根中的表达量分析)。

图8为过表达AbODC植株中多胺和N-甲基腐胺的的含量分析(A：叶中腐胺的含量；B：叶中亚精胺的含量；C：叶中精胺的含量；D：叶中N-甲基腐胺的含量；E：根中腐胺的含量；F：根中亚精胺的含量；G：根中精胺的含量；H:根中N-甲基腐胺的含量)。

图9为过表达AbODC植株中TAs的含量分析(A：叶中莨菪碱的含量；B：叶中山莨菪碱的含量；C：叶中东莨菪碱的含量；D：根中莨菪碱的含量；E：根中山莨菪碱的含量；F：根中东莨菪碱的含量)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、颠茄AbODC基因克隆

根据NCBI上报道的颠茄AbODC的cDNA全长序列设计克隆AbODC编码区的引物，具体引物序列如下：

AbODC-F1：5’-atggccggccaaacagtcatcg-3’(SEQ ID NO.1)；

AbODC-R1：5’-tcagcttggataagcataagcaagg-3’(SEQ ID NO.2)；

然后以颠茄cDNA为模版，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物，利用高保真酶KOD plus DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR反应条件为：94℃预变性3min；30个循环(94℃变性30s→56℃退火30s→68℃延伸1.5min)，68℃延伸8min；后将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳及胶回收纯化后，连接pJET载体并进行测序，扩增获得如SEQ ID NO.3所示序列，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

实施例2、AbODC原核表达载体的构建及诱导表达

根据测序的AbODC编码区序列，分析其序列包含的酶切位点，结合原核表达载体pET28a(+)多克隆位点携带的酶切位点，设计原核表达构建的相关引物，具体引物如下：

pAbODC-F1：5’-gcggatccatggccggccaaacagtcatcg-3’(SEQ ID NO.4)；

pAbODC-R1：5’-cgcgtcgacgcttggataagcataagcaagg-3’(SEQ ID NO.5)。

利用上述引物通过PCR扩增AbODC编码区，由于上游引物引入BamH I酶切位点，下游引物引入Sac I酶切位点，通过BamH I和Sac I酶切位点将AbODC编码区连入原核表达载体pET28a⁽⁺⁾(Geng C,Zhao T,Yang C,et al.Metabolic characterization ofHyoscyamus niger root-specific putrescine N-methyltransferase[J].PlantPhysiology and Biochemistry,2018,127:47–54.)，获得pET28a⁽⁺⁾-AbODC质粒，经验证成功后转化大肠杆菌Rosetta，获得含pET28a⁽⁺⁾-AbODC质粒的工程菌，进行异源表达重组蛋白。

重组蛋白表达的方法如下：

(1)取出保存于-80℃的工程菌置于冰上融化，待菌融化后，吸取菌液100μL接种到相应抗性的50mL LB+50mg/L Kan+34mg/L Cm的液体培养基中，37℃180rpm过夜振荡培养。

(2)吸取第一次活化的菌液8mL，按1:50比例接种量接种到400mLLB++50mg/L Kan+34mg/L Cm的液体培养基中，37℃，180rpm培养至OD₆₀₀＝0.6(2.5-3.0h)，加入IPTG至终浓度0.5mM，将菌液置于低温摇床上25℃，180rpm培养7h后终止培养，将菌液转移至离心管中4℃，4000rpm离心10min。

(3)用pH 8.0的lysis buffer重悬诱导的菌体，加入溶菌酶(7mg/20mL菌液)，冰上放置0.5h以上，用超声破碎仪超声破碎(功率200w，超声3s停7s，约25min，冰上操作)；

(4)超声结束后，将菌液转移至离心管中，4℃，10000rpm离心10min，上清用0.45μm尼龙膜过滤上清中残留的菌体。

重组蛋白的纯化：

重组蛋白的纯化使用北京全式金生物技术有限公司Proteinlso Ni-NTA Resin进行蛋白纯化。具体操作方法参照Proteinlso Ni-NTA Resin说明书进行。

(1)用Proteinlso Ni-NTA Resin填料装柱2mL左右，填充后静置30-60min后，用10倍体积的ddH₂O冲洗，洗去原装填料液体中的酒精，后用5倍体积的平衡缓冲液冲洗柱子后，再加入5倍的平衡缓冲液平衡树脂，静置1h；

(2)待柱子平衡结束后，用移液枪沿壁加入重组蛋白上清液，此时流速调低至20滴/min，使目的蛋白与镍柱充分结合，流速过高将会导致重组蛋白柱子的结合效率降低；

(3)待上样结束后，用20mL平衡缓冲液冲洗镍柱，以去除柱子上残留的不能与柱子结合的蛋白；

(4)洗脱用平衡缓冲液配制不同浓度的咪唑：50mM(10mL)、150mM(10mL)、400mM(20mL，母液)。将400mM作为母液，稀释获得其他浓度的咪唑，调节流速至60滴/min，用1.5mLEP管收集，置于冰上保存用以后续实验；

(5)洗脱结束后，加入10mL平衡缓冲液冲洗镍柱，待即将流完时关闭阀门；

(6)取每个洗脱浓度得到的样品40μL，加入10μL 5×蛋白loading buffer，混匀后在沸水中煮10min，取出样品与Marker一起进行上样、SDS-PAGE，鉴定纯化后的结果，结果如图1所示。结果显示，在咪唑浓度为50mM的浓度时，重组蛋白开始被部分洗脱下来；但AbODC重组蛋白大量存在100mM的咪唑洗脱液里，在200mM咪唑洗脱液里仅剩少量的蛋白存在，从电泳结果还可以看出，AbODC重组蛋白与预测的蛋白的分子量大小相一致，纯度较高，无明显杂蛋白条带，可以用于下面酶动力学相关实验。

AbODC重组蛋白催化鸟氨酸脱羧的活性鉴定：

利用纯化得到的AbODC重组蛋白，进行底物饲喂，将热失活的蛋白在同样条件下进行底物饲喂，反应产物作为实验的空白对照。具体是：将酶反应产物、空白对照样品以及腐胺标品用苯甲酰氯衍化后，用以HPLC检测，结果如图2中A所示。检测结果表明，与空白对照组相比，在AbODC重组鸟氨酸脱羧酶的催化实验样品的指纹图谱上，在保留时间10.2min处，有一个新的光吸收峰出现，与苯甲酰化腐胺标准品的出峰时间一致，而相对应的在空白对照的指纹图谱上在10.2min处未检测到有相应的光吸收峰。经质朴鉴定，结果如图2中B所示。结果显示，AbODC重组蛋白催化的反应产物苯甲酰化后的质荷比(m/z)与苯甲酰化的腐胺标准品的加氢质荷比(297.15)和加钠质荷比(319.20)一致，由此证明，纯化得到的上述重组蛋白均具有鸟氨酸脱羧酶的功能，即具有催化鸟氨酸脱羧生产腐胺的能力。而对照组的检测结果则表明，对照组所使用的失活蛋白，已经完全失活，无催化合成腐胺的能力。上述结果表明，颠茄的鸟氨酸脱羧酶的重组蛋白，具有鸟氨酸脱羧酶活性。

AbODC重组蛋白催化赖氨酸脱羧的活性鉴定：

目前关于动物及微生物的鸟氨酸脱羧酶的研究较多，研究表明，哺乳动物的ODC具有鸟氨酸催化活性的同时，还具有赖氨酸催化活性。目前关于植物界鸟氨酸脱羧酶进行系统测试的只有两个物种的脱羧酶有过相关报道，即产可卡因植物可可树的EcODC和产尼古丁的粘毛烟草的NgODC被测试过赖氨酸催化活性。EcODC只具有鸟氨酸催化活性而不具有赖氨酸催化活性，NgODC则具有赖氨酸催化活性。而产托品烷生物碱植物的鸟氨酸是否具有赖氨酸催化活性，一直未曾报道。本实验利用上述纯化得到的AbODC、重组蛋白，进行了(赖氨酸)底物饲喂实验。结果如图3中A。实验结果表明，AbODC重组蛋白催化产物的指纹图谱上，在保留时间28.6min处均有一个新的光吸收峰出现，与尸胺标准品衍化物出峰时间一致；而对照组在相同的保留时间位置则没有新物质的生成。经质朴鉴定，结果如图3中B。结果显示，AbODC、酶催化的反应产物苯甲酰化后的加氢加钠的质荷比(m/z)与苯甲酰化的尸胺的标准品的加氢(311.2)和加钠的质荷比(333.15)一致，由此证明，纯化得到的上述重组蛋白除了具有鸟氨酸脱羧酶的功能之外，还具有催化赖氨酸脱羧酶活性，即催化赖氨酸生产尸胺的能力。以上实验结果表明，AbODC具有赖氨酸脱羧酶活性。

实施例3、AbODC植物过表达载体的构建及其转化

根据实施例1克隆的AbODC的编码区序列，分析其序列包含的酶切位点，结合过表达载体1305⁺载体的克隆位点携带的酶切位点，设计过表达构建的的相关引物，具体引物如下：

oeAbODC-F1：5’-gcagatctgatggccggccaaacagtcatcg-3’(SEQ ID NO.6)；

oeAbODC-R：5’-gcggtcacctcagcttggataagcataagcaagg-3’(SEQ ID NO.7)；

利用SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列为引物通过PCR扩增在的编码区的上下游引入相应的酶切位点。正向片段上下游引入的酶切位点为：上游引入BglII酶切位点和下游引入BstEII酶切位点；将正确的AbODC基因编码框全长通过限制性内切酶BglII和BstEII酶切，然后通过T4连接酶分别连接到1305⁺植物表达载体的CaMV 35S启动子驱动子Nos终止子之间，从而获得最终表达载体1305⁺-AbODC。

其中1305⁺植物表达载体由pCAMBIA1305载体上的hygR基因替换为NPTII基因获得中间载体，之后将pBI121的GUS表达框通过BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的中间载体，即获得1305⁺。其中NPTII基因使用如下引物：NPTIIF:5’-gcctcgagatggggattgaacaagatggattg-3’；NPTIIR:gcctcgagtcagaagaactcgtcaagaaggcg-3’，以pBI121为模板扩增获得NPTII基因，然后通过引物两端的Xho I酶切位点替换pCAMBIA1305载体上的hygR基因。

将获得表达载体1305⁺-AbODC分别转化农杆菌EHA105和C58C1，获得工程菌EHA105-1305⁺-AbODC，C58C1-1305⁺-AbODC用于后续的遗传转化。

(1)C58C1-1305⁺-AbODC转化颠茄诱导发根：

将获得的工程菌C58C1-1305⁺-AbODC接种到不同的10mL YEP+Rif 40mg/L+Kan50mg/L的液体培养基中200rpm，28℃恒温摇床上振荡培养过夜；吸取1mL上述培养的菌液到含有上述抗性的50mLYEP培养基中进行扩大培养，当菌液OD₆₀₀为0.4-0.6左右时，终止培养，将菌液转移至100mL无菌的离心管中，室温下5000rpm离心5min，弃上清液，菌体沉淀用50mL未加抗生素的MS液体培养基悬浮，加入AS至终浓度为100μM/L重悬30min后可用于转化。

取颠茄无菌苗真叶，用手术剪将叶片切成1cm²左右大小，用灭菌的镊子在叶片上扎一些伤口提高农杆菌的侵染效率；将叶片转移至重悬好的菌液中，浸泡约8-10min；然后取出浸泡的叶片，用灭过菌的吸水纸将叶片表面的吸干多余菌液吸干，将叶片转移至铺有滤纸的MS+AS(100μmol/L)固体培养基上，25±1.0℃恒温暗光条件下培养，共培养48-72h；共培养结束后，用无菌滤纸将外植体表面液体吸干，然后转移至MS+Cef 400mg/L+Kan20mg/L的固体除菌筛选培养基上，约10-15d左右，从叶片伤口边缘长出发根，待发根长约3cm左右时剪下，接种到MS+Cef 200mg/L固体除菌培养基上培养；挑选生长迅速，分支多的发根，每15d左右继代一次，继代3次后，转到不含抗生素的MS固体培养基上继续培养；发根在无抗生素的MS固体培养基上后培养一周左右，无农杆菌滋生，可认为发根上携带的农杆菌已经完全除去，可用于后续的阳性克隆鉴定和后续的液体培养。

为了鉴定过表达AbODC转基因颠茄发根的阳性克隆，以获得的发根的基因组DNA为模板，检测了植物筛选标记基因(NPTII)的同时并在相应的转化的颠茄发根中检测了35S::AbODC融合片段，使用引物如下：

35S-F：5’-cgcaagacccttcctctatataag-3’(SEQ ID NO.8)；

oeAbODC-R：5’-gcggtcacctcagcttggataagcataagcaagg-3’(SEQ ID NO.9)；

NPTII-F：5’-gatggattgcacgcaggttctcc-3’(SEQ ID NO.10)；

NPTII-R：5’-ctggcgaacagttcggctggcgc-3’(SEQ ID NO.11)；

结果显示，阳性对照的NPTII的PCR产物在500bp左右有特异性条带出现与预测条带大小一致，而阴性对照泳道在相应位置，无特异性条带，说明PCR扩增成功进行(图4，A)。颠茄转基因发根的筛选标记基因(NPTII)的PCR检测结果显示，在过表达AbODC的颠茄发根的发根克隆(L3、L6、L8、L13和L15)的基因组DNA中均能检测到NPTII基因的存在(图4，A)，表明NPTII基因被成功的整合到颠茄发根的基因组上。在这些检测到NPTII的颠茄发根的基因组DNA中，以引物35S和扩增AbODC的下游引物为本次PCR检测的上下游引物，进行跨载体检测。结果显示，在相应的发根中能够检测到目的片段35S::AbODC(图4，B)。以上检测结果表明，携带过表达区段的T-DNA通过农杆菌介导，成功的整合到了颠茄发根的基因组中。但是T-DNA与植物基因组的整合是一个随机插入的过程，而且在基因组上插入的拷贝数也是不等的，实践证明，并不是所有的转基因植物中插入的外源基因都会被有效的启动表达。本研究中，采用荧光定量PCR技术，对AbODC在基因组PCR检测为阳性的发根中的基因表达量进行了检测(图4，C)。荧光定量PCR检测结果显示，在AbODC的过表达发根中，AbODC的基因表达量均得到了极大幅度的提高。AbODC的表达量在L13的发根系中提高幅度最大，达到68.7倍。

过表达AbODC颠茄发根的多胺及N-甲基腐胺含量分析：

上述检测发现携带35S::AbODC片段的T-DNA被成功整合到颠茄发根的基因组上，且AbODC在转基因发根L3、L6、L8、L13和L15中实现了超量表达。针对以上发根的多胺及N-甲基腐胺的检测，结果如图5所示。结果显示，在转基因发根中腐胺(图5，A)和N-甲基腐胺(图5，D)的含量无一列外的都得到了显著的提高。与对照中腐胺和N-甲基腐胺的含量相比，转基因发根中，腐胺的含量最大增幅为64.6％，N-甲基腐胺的最大增幅为87.7％，而亚精胺(图5，B)和精胺(图5，D)的含量并没有随着腐胺含量的增加而显著增加。以上结果表明，在颠茄的发根中过表达AbODC能够显著促进颠茄发根中TAs生物合成前体物质-腐胺及N-甲基腐胺的积累，而对精胺和亚精胺的含量无显著性影响。

过表达AbODC颠茄发根的TAs含量检测：

为验证相关转基因发根可以提高托品烷生物碱的理想研究材料，检测过表达AbODC颠茄发根的生物碱含量，结果如图6所示。生物碱检测结果表明，过表达AbODC基因之后，在检测的5个发根系中莨菪碱含量均实现了大幅度的提高，其中在L8发根系中，莨菪碱的含量提高了接近1倍(图6、A)。山莨菪碱的含量在检测的所有发根中也实现了显著性的的提高(图6，B)。而在过表达AbODC的颠茄发根中，东莨菪碱并未实现一致性的变化，在发根L3、L13和15中，东莨菪碱显著提高，而在发根系L6和L8中，东莨菪碱的含量，与对照相比并为实现显著性提高(图6，C)。以上结果表明，过表达ODC基因能够显著提高颠茄发根中TAs的含量，特别是莨菪碱及山莨菪碱的含量，与上述两种生物碱相比，过表达AbODC对于东莨菪生物合成的推动作用并不明显。

(2)EHA105-1305⁺-AbODC诱导颠茄再生

颠茄植株的再生方法如下：

取工程菌EHA105-1305⁺-AbODC接种于10mL YEP(Rif+Str+Kan)液体培养基中，28℃，200r/min振荡培养24-48h；待OD₆₀₀达到0.5后，终止培养；然后于5000rpm离心6min收集菌体，用共培液体培养基悬浮菌体，剪取颠茄子叶和下胚轴，在活化好的农杆菌菌液中浸泡8-10min；用灭过菌的吸水纸除去颠茄外植体表面液体后，将外植体移至铺有滤纸的共培固体培养基上，25℃，暗培养4d；暗培结束后，将外植体转入除菌和再生培养基，25℃，16h/8h(light/dark)光照条件下进行培养，10d左右转接一次培养基；培养3周后，外植体上有芽点出现；继续培养15天左右，将带芽点的愈伤(芽点附近的愈伤，其它部分的去除掉)移至不含筛选压的生根培养基中继续培养；待芽点长出茎约2-3厘米时，用无菌的手术剪或解剖刀，从茎基部剪短，将再生幼苗从愈伤上剥离。然后将再生幼苗转移至新的生根培养基上继续培养，直至完整的再生植株形成。将生根的AbODC转基因植株和对照植株移栽至预先准备好的营养土中(蛭石：草炭土：珍珠岩6:3:1)。

为了获得过表达AbODC转基因颠茄植株的阳性克隆，提取的转基因植株的基因组DNA为模板，按发跟检测方法检测植物筛选标记基因(NPTII)和35S::AbODC融合片段。琼脂糖凝胶电泳显示，在颠茄植株L12、L13、L14、L18和L20的基因组DNA中均能检测到NPTII基因(图7，A)和35S::AbODC(图7，B)融合片段，表明携带有NPTII基因和AbODC基因的T-DNA被成功的整合到颠茄发根的基因组上。为了验证AbODC基因在转基因植株中是否被有效的启动表达，本研究中采用荧光定量PCR技术，对PCR检测为阳性的植株中的AbODC表达量进行了检测。荧光定量PCR检测结果显示，在过表达AbODC的颠茄植株的叶(图7，C)和根(图7，D)中，AbODC的基因表达量均得到了极大幅度的提高，该研究表达AbODC在转基因颠茄植株中，AbODC实现了超量表达。以上研究结果表明，获得了AbODC过表达的阳性植株，并在阳性植株中实现了AbODC的超量表达。

过表达AbODC颠茄植株中多胺及N-甲基腐胺含量测定：

为了探究过表达AbODC对于颠茄植株中多胺代谢的影响，测定了转基因颠茄植株的叶和根中多胺的含量。叶片的多胺含量测定显示，过表达AbODC显著提高了转基因颠茄叶片中腐胺(图8，A)及亚精胺(图8，B)含量，与对照叶片中的腐胺(58.1nmol/g FW)和亚精胺(57.3nmol/g FW)含量相比，转基因颠茄叶片中腐胺(192.3nmol/g FW)和亚精胺(151.5nmol/g FW)的含量最大幅度分别达到了2.3倍和1.6倍，而精胺的含量与对照相比无显著行变化(图8，C)。无论在对照的叶片中还是转基因颠茄的叶片中，我们均检测不到N-甲基腐胺的存在(图8，D)。而根的多胺含量检测结果与叶片的含量检测结果有所不同，与对照相比，虽然转基因颠茄根中腐胺的含量也有显著的提高，但腐胺的最大增幅度只有1.10倍(图8，E)，增幅远小于转基因颠茄叶片中腐胺的增加幅度。而亚精胺的含量只在L12和L20的根中有显著性提高，但是在L13、L14和L18中均无显著性变化(图8，F)。根中精胺的检测结果与叶片中的精胺检测结果较为类似，与对照相比，无显性变化(图8，G)。虽然在叶片中检测不到N-甲基腐胺的存在，但是N-甲基腐胺却存在于根中，N-甲基腐胺在根中的检测结果显示，与对照相比，转基因颠茄根中N-甲基腐胺的含量无一例外的得到了提高，增幅最大可达1.7倍(图8，H)。以上结果表明过表达AbODC能够显著提高转基因植株叶中腐胺及亚精胺的含量，同时对于根中腐胺和N-甲基腐胺的积累也有明显的促进作用。

过表达AbODC颠茄植株中TAs的含量分析：

在颠茄发根中过表达AbODC的实验表明，过表达AbODC能够促进颠茄发根中TAs的生物合成。相比于发根，颠茄植株具有更高的生产实用价值。本实验通过遗传转化获得了过表达AbODC的转基因颠茄植株。TAs含量检测结果显示(图9)，在5个转基因植株的根中，莨菪碱(图9，D)及山莨菪碱(图9，E)的含量无一例外的都得到了提高，其中在L3中的根中，莨菪碱(2.12mg/g DW)和山莨菪碱(2.69mg/gDW)的含量与对照相比分别提高了3.42倍和1.69倍；东莨菪碱的含量只在L14和L20中含量得到了提高(图9，F)，在L2、L13和L18根中的东莨菪碱的含量与对照相比均无显著性变化。在转基因植株的片中，TAs的含量检测结果显示叶片中的莨菪碱(图9，A)及山莨菪碱(图9，B)的含量均实现了大幅度的提高，在所有转基因植株的叶片中，只有L14的叶片中的东莨菪碱的含量与对照相比有所提高(图9，C)。以上结果表明，过表达AbODC能够显著促进颠茄植株中莨菪碱及山莨菪碱的积累，而对东莨菪碱的生物合成，无明显促进作用。

在发根和植株中的TAs检测结果表明，AbODC的超量表达能够显著提高发根及植株中莨菪碱和山莨菪碱的含量，但是对于东莨菪碱的生物合成无明显推动作用。这可能与H6H为TAs生物合成途径中的限速酶有关。因此过表达AbODC可以获得高产莨菪碱及山莨菪碱的颠茄品种。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 颠茄鸟氨酸脱羧酶在培育高产莨菪碱及山莨菪碱颠茄品种中的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggccggcc aaacagtcat cg 22

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actgcttgga taagcataag caagg 25

<210> 3

<211> 1293

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggccggcc aaacagtcat cgtttccggg ttgaacccgg cggccattct tcagtccaca 60

atcggcggag ctcctccatc cacggcggaa aacggccata ccagaaaagt tgttcctatg 120

tcaaaagatg ccctccaaga tttcatggtt tcaattataa cccaaaaatt acaagacgaa 180

aaacaacctt tttacgtgtt agatttgggt gaagttgttt cccttatgga ccaatggaat 240

aacgctttac caaatatccg tccattttat gctgttaagt gtaaccctga accttctttc 300

ttgtccatgt tgtctgcttt gggctcaaac tttgattgtg ctagccgtgc cgaaattgag 360

tacgttttat ctctcggtat ttccccagac cggatcgttt tcgctaaccc gtgtaaaccc 420

gaatccgaca tcatttatgc agcgaaagtt ggagttaatc tcacaacgta tgactccgaa 480

gaagaggttt acaagatccg aaaacatcac ccgaaatccg agcttttgct ccgtatcaag 540

cccatggacg acgctaacgc caggtgtcca atgggcccga aatacggagc attgcccgaa 600

gaagtcgaac cgttgctccg ggccgcccat acagcccgga ttactgtctc tggcgtctcc 660

tttcacattg gaagcggaga cgccgattca aacgcctatt taggcgctat agctgcagct 720

aaggaagttt tccaaaccgc ggctaggttt ggtatgtcta aaatgacgat tttagacatt 780

ggcggcggtt ttacatctgg tcaccaattc acaaccgccg caaccgcggt taaatcagct 840

ttatctcaac acttccatga tgaaccggag ttaacaatca tagctgaacc gggccggttt 900

tttgcggaaa cggcttttac tttagggacg acaattatag ggaaaagagt gaggggagaa 960

ttaagagaat attggattaa cgacgggtta tacggttcaa tgaactgtgt actttacgac 1020

cacgcaacgg taacggcgac ggcgttagcg tgtgtgtcga atcgtagtaa cgttaactgt 1080

ggcgggtcga aaacgtttcc gtcaactgtg tttgggccca catgtgatgc acttgatact 1140

gtgttgaggg attaccagtt accggagctg caggttaatg attggttggt ttttcctaat 1200

atgggtgctt atactaaggc tgctgggtct aatttcaatg gatttaatac atctgccatt 1260

gttactcacc ttgcttatgc ttatccaagc tga 1293

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcggatccat ggccggccaa acagtcatcg 30

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcgtcgacg cttggataag cataagcaag g 31

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcagatctga tggccggcca aacagtcatc g 31

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcggtcacct cagcttggat aagcataagc aagg 34

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcaagaccc ttcctctata taag 24

<210> 9

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcggtcacct cagcttggat aagcataagc aagg 34

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gatggattgc acgcaggttc tcc 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctggcgaaca gttcggctgg cgc 23

<210> 12

<211> 430

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Ala Gly Gln Thr Val Ile Val Ser Gly Leu Asn Pro Ala Ala Ile

1 5 10 15

Leu Gln Ser Thr Ile Gly Gly Ala Pro Pro Ser Thr Ala Glu Asn Gly

20 25 30

His Thr Arg Lys Val Val Pro Met Ser Lys Asp Ala Leu Gln Asp Phe

35 40 45

Met Val Ser Ile Ile Thr Gln Lys Leu Gln Asp Glu Lys Gln Pro Phe

50 55 60

Tyr Val Leu Asp Leu Gly Glu Val Val Ser Leu Met Asp Gln Trp Asn

65 70 75 80

Asn Ala Leu Pro Asn Ile Arg Pro Phe Tyr Ala Val Lys Cys Asn Pro

85 90 95

Glu Pro Ser Phe Leu Ser Met Leu Ser Ala Leu Gly Ser Asn Phe Asp

100 105 110

Cys Ala Ser Arg Ala Glu Ile Glu Tyr Val Leu Ser Leu Gly Ile Ser

115 120 125

Pro Asp Arg Ile Val Phe Ala Asn Pro Cys Lys Pro Glu Ser Asp Ile

130 135 140

Ile Tyr Ala Ala Lys Val Gly Val Asn Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Glu

145 150 155 160

Glu Glu Val Tyr Lys Ile Arg Lys His His Pro Lys Ser Glu Leu Leu

165 170 175

Leu Arg Ile Lys Pro Met Asp Asp Ala Asn Ala Arg Cys Pro Met Gly

180 185 190

Pro Lys Tyr Gly Ala Leu Pro Glu Glu Val Glu Pro Leu Leu Arg Ala

195 200 205

Ala His Thr Ala Arg Ile Thr Val Ser Gly Val Ser Phe His Ile Gly

210 215 220

Ser Gly Asp Ala Asp Ser Asn Ala Tyr Leu Gly Ala Ile Ala Ala Ala

225 230 235 240

Lys Glu Val Phe Gln Thr Ala Ala Arg Phe Gly Met Ser Lys Met Thr

245 250 255

Ile Leu Asp Ile Gly Gly Gly Phe Thr Ser Gly His Gln Phe Thr Thr

260 265 270

Ala Ala Thr Ala Val Lys Ser Ala Leu Ser Gln His Phe His Asp Glu

275 280 285

Pro Glu Leu Thr Ile Ile Ala Glu Pro Gly Arg Phe Phe Ala Glu Thr

290 295 300

Ala Phe Thr Leu Gly Thr Thr Ile Ile Gly Lys Arg Val Arg Gly Glu

305 310 315 320

Leu Arg Glu Tyr Trp Ile Asn Asp Gly Leu Tyr Gly Ser Met Asn Cys

325 330 335

Val Leu Tyr Asp His Ala Thr Val Thr Ala Thr Ala Leu Ala Cys Val

340 345 350

Ser Asn Arg Ser Asn Val Asn Cys Gly Gly Ser Lys Thr Phe Pro Ser

355 360 365

Thr Val Phe Gly Pro Thr Cys Asp Ala Leu Asp Thr Val Leu Arg Asp

370 375 380

Tyr Gln Leu Pro Glu Leu Gln Val Asn Asp Trp Leu Val Phe Pro Asn

385 390 395 400

Met Gly Ala Tyr Thr Lys Ala Ala Gly Ser Asn Phe Asn Gly Phe Asn

405 410 415

Thr Ser Ala Ile Val Thr His Leu Ala Tyr Ala Tyr Pro Ser

420 425 430

Claims

1.颠茄鸟氨酸脱羧酶在培育高产莨菪碱及山莨菪碱颠茄品种中的应用，其特征在于：所述颠茄鸟氨酸脱羧酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，或SEQ ID NO.12所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一个氨基酸，且具鸟氨酸脱羧酶活性的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述颠茄鸟氨酸脱羧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，或SEQ ID NO.3所示核苷酸序列取代、缺失或添加至少一个核苷酸，且具有鸟氨酸脱羧酶活性的核苷酸序列。

3.一种获得高产莨菪碱和山莨菪碱颠茄品种的方法，其特征在于，包括如下步骤：在颠茄中超量表达颠茄鸟氨酸脱羧酶，获得转基因颠茄品种，即获得高产莨菪碱和山莨菪碱颠茄品种；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：在颠茄中超量表达颠茄鸟氨酸脱羧酶的方法如下：构建含编码颠茄鸟氨酸脱羧酶基因的植物重组表达载体，构建转化子，转化颠茄，诱导再生，筛选转基因植株，即获得超量表达颠茄鸟氨酸脱羧酶的颠茄。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述含编码颠茄鸟氨酸脱羧酶基因的植物重组表达载体由以下方法构建：将SEQ ID NO.3所示序列通过BglII和BstEII连入1305⁺植物过表达载体；所述1305⁺植物过表达载体为pCAMBIA1305载体上的hygR基因替换为gus基因，获得中间载体，然后再将pBI121的GUS表达框通过BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的中间载体而得。

6.颠茄鸟氨酸脱羧酶或重组颠茄鸟氨酸脱羧酶作为鸟氨酸合成腐胺的催化剂中的应用，其特征在于：所述颠茄鸟氨酸脱羧酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组颠茄鸟氨酸脱羧酶由以下方法制备：以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列为引物，颠茄cDNA为模板经PCR扩增AbODC编码区，然后经扩增获得的序列经BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的原核表达载体pET28a⁽⁺⁾中，获得重组质粒pET28a⁽⁺⁾-AbODC，然后将转化大肠杆菌Rosetta，获得含pET28a⁽⁺⁾-AbODC质粒的工程菌，使用终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达，纯化，获得重组颠茄鸟氨酸脱羧酶。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述纯化为使用Proteinlso Ni-NTAResin填料装柱，填充后静置30-60min后，ddH₂O冲洗洗去原装填料液体中的酒精，后用5倍体积的平衡缓冲液冲洗柱子后，再加入5倍的平衡缓冲液平衡树脂，静置1h；待柱子平衡结束后，加入重组蛋白上清液，流速调低至20滴/min，使目的蛋白与镍柱充分结合，待上样结束后，用平衡缓冲液冲洗镍柱，去除柱子上残留的不能与柱子结合的蛋白；再用100mM的咪唑洗脱，调节流速至60滴/min，收集洗脱液，即获得重组颠茄鸟氨酸脱羧酶。

9.颠茄鸟氨酸脱羧酶或重组颠茄鸟氨酸脱羧酶作为赖氨酸合成尸胺的催化剂中的应用，其特征在于：所述颠茄鸟氨酸脱羧酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

10.重组颠茄鸟氨酸脱羧酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示序列为引物，颠茄cDNA为模板经PCR扩增AbODC编码区，然后经扩增获得的序列经BamH I和Sac I酶切后连入经同样酶切的原核表达载体pET28a⁽⁺⁾中，获得重组质粒pET28a⁽⁺⁾-AbODC，然后将转化大肠杆菌Rosetta，获得含pET28a⁽⁺⁾-AbODC质粒的工程菌，使用终浓度为0.5mM的IPTG诱导表达，纯化，获得重组颠茄鸟氨酸脱羧酶。