CN114097614A - 一种栽培草莓离体叶片高频再生方法及其在遗传转化中的应用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种栽培草莓离体叶片高频再生方法及其在遗传转化中的应用方法，具体步骤如下：S1：材料预处理，在无菌环境下，以生长于1/2MS培养基中生长状态良好的栽培草莓无菌苗为材料，转移至预培养培养基中进行预培养；S2：材料切割取材，在无菌环境下，取出S1中生长于预培养培养基的草莓材料，将其叶片剪下后放置于湿润的培养皿中，并切割分离叶片基部组织成为约0.5cm×0.5cm大小的叶圆盘片；S3：分化培养，将S2中获得的叶圆盘平铺于离体叶片再生培养基表面以使得叶盘周围与培养基充分接触。通过对比，结果表明经过预处理后的无菌草莓叶片数量增加增加3倍，并可作为良好的外殖体作为后期分化的原材料应用于草莓遗传转化操作中。

Description

一种栽培草莓离体叶片高频再生方法及其在遗传转化中的应 用方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，尤其涉及一种栽培草莓离体叶片高频再生方法及其在遗传转化中的应用方法。
背景技术
草莓属于蔷薇科草莓属植物。因其果实鲜美且富含维生素等多种营养物质而受到消费者的青睐。因此，草莓也作为一种优良的园艺作物而得以广泛栽培。随着草莓栽培技术的不断推广以及草莓栽培面积的不断扩大，对于草莓优良品种的需求也在不断增加。因此，选育更好的草莓品种是草莓产业发展的内在需求，同时也是从事草莓科学研究工作的主要任务之一。现有的草莓育种研究主要以野生草莓(Fragaria vesca)为材料。而栽培草莓(Fragaria ananassa)则是在农业生产中最广泛栽培的草莓物种。但野生草莓为二倍体草莓物种，而栽培草莓为八倍体草莓物种，其中两者之间的遗传背景的差异造成了野生草莓的基因功能研究结果无法直接应用于栽培草莓的品种选育工作中。另一方面，随着分子生物学以及生物信息学的发展，栽培草莓基因组研究也取得重要突破。栽培草莓基因组信息的公布将草莓的研究推向了后基因组时代，使得直接研究栽培草莓基因功能研究成为可能。通过研究验证具体一个或者多个草莓基因的生物学功能可以进一步为草莓品种选育提供理论依据。草莓遗传转化则是进行草莓基因功能研究的基础，草莓遗传转化作为一种重要的生物技术结合分子生物学技术(如基因编辑技术)可以特异性地改变草莓基因组，从而对特定基因的生物学功能及其对草莓农艺性状的影响进行系统研究。因此，开发建立以栽培草莓为受体系统的遗传转化体系对于研究栽培草莓基因功能并直接用于新品种栽培草莓选育具有重要作用。
农杆菌介导的遗传转化是获得转基因草莓植株的主要方法。栽培草莓遗传转化体系已经在近年的研究中逐步趋于完善。此类体系主要以栽培草莓离体叶片为外殖体作为转化受体，借助农杆菌侵染转化外殖体愈伤组织的过程将待验证的核酸片段转移到植物细胞中，并依赖植物细胞全能性分化形成遗传转化植株。但是此类体系仍然存在许多问题，如培养基多样且繁琐、转化后的愈伤组织再生困难以及获得遗传转化植株较少等问题。其中，栽培草莓叶片的再生效率直接影响转基因效率，是决定草莓遗传转化成功与否的关键因素。因此迫切需要建立可运用在栽培草莓遗传转化的栽培草莓离体叶片高频再生体系。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种栽培草莓离体叶片高频再生方法及其在遗传转化中的应用方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种栽培草莓离体叶片高频再生方法，该栽培草莓离体叶片高频再生方法的具体步骤如下：
S1：材料预处理，在无菌环境下，以生长于1/2MS培养基中生长状态良好的栽培草莓无菌苗为材料，用无菌手术刀将无菌苗的丛生芽切割分离，最后保留丛生芽芽点及其周围3-5片叶片，并将其转移到草莓材料预培养基中，培养室环境中培养18-24天备用；
S2：材料切割取材，在无菌环境下，取出S1中生长于草莓材料预培养基的草莓无菌苗，将其叶片剪下后放置于湿润的培养皿中，用锋利的手术刀或者专用打孔器将草莓叶片的小叶基部进行切割处理成为0.5cm×0.5cm的叶圆盘片；
S3：分化培养，将S2中获得的叶圆盘片平铺于离体叶片再生培养基表面以使得叶圆盘片周围与培养基充分接触，将铺好的培养基于培养室环境中培养天21天即可观察到分化得到的不定芽，继续培养21天，可以获得大量的不定芽。
本发明还提供了一种栽培草莓离体叶片高频再生方法在遗传转化中的应用方法，该栽培草莓离体叶片高频再生方法在遗传转化中的应用方法具体步骤如下：
步骤1：材料预处理:在无菌环境下，以生长于1/2MS培养基中生长状态良好的栽培草莓无菌苗为材料，用无菌手术刀将无菌苗的丛生芽切割分离，最后保留丛生芽芽点及其周围3-5片叶片，并将其转移到草莓材料预培养基中，在培养室环境中培养18-24天后取出生长于草莓材料预培养基的草莓材料，将其叶片剪下后放置于湿润的培养皿中，用锋利的手术刀或者专用打孔器将草莓叶片小叶切割处理为0.5cm×0.5cm的叶圆盘片，将叶圆盘片平铺于离体叶片再生培养基表面以使得叶圆盘片周围与培养基充分接触，将铺好的培养基于培养室环境中预培养天3天；
步骤2：准备菌株:用热激法质粒载体转化进入GV3101农杆菌工程菌中，并通过固体培养基筛选和PCR手段获得含有正确质粒载体的GV3101单克隆农杆菌，把单克隆农杆菌接种到含有抗生素的1mlYEP培养基中，在27-30摄氏度环境中，200rpm震荡培养2天直到培养基可见混浊，将混浊的菌液在无菌环境下吸取到25mlYEP培养基中进行震荡培养，培养环境为27摄氏度，震荡速度为200rpm，将菌液培养到OD600＝0.1-0.15时加入乙酰丁香酮溶液(100mM)20ul，将菌液继续培养3h后取出，在2000g的加速度下旋转离心5分钟，弃掉上清液并加入含有乙酰丁香酮100uM的MS液体培养基25ml，轻轻震荡悬浮菌体备用；
步骤3：材料侵染:取出步骤1中的叶圆盘片放置于湿润的培养皿中，将2步骤中制备得到的菌液倒入装叶圆盘片的培养皿中，并轻轻摇晃使菌液和叶圆盘片充分接触混合侵染，侵染时间为30-40分钟，侵染期间每隔5分钟晃动培养皿一次直到侵染结束，将叶片转移到含有乙酰丁香酮的离体叶片再生培养基中黑暗培养3天作为共培养；
步骤4：材料分化再生与抗性筛选:将步骤3中共培养基中的叶圆盘片转移到含有抗菌抗生素的离体叶片再生培养基中培养7天作为延迟筛选培养，最后将延迟筛选培养基中的叶圆盘片转移到含有抗菌抗生素和筛选抗生素的离体叶片再生培养基中进行筛选培养56天即可获得健壮的转基因抗性芽。
优选的，步骤2中的质粒载体选择Cambia1301载体，此载体具有表达出可以被GUS染色的蛋白和抵抗潮霉素筛选的抗性蛋白，可以用于遗传转化后期组织染色鉴定和抗性筛选。
优选的，步骤4中的抗菌抗生素种类与浓度分别为:特美汀(Timentin):250mg/L和羧苄青霉素:250mg/L。
优选的，在步骤2中使用Cambia1301载体，则在步骤4中的筛选抗生素的种类和浓度为:潮霉素B(Hygromycin B)5mg/L，并且在步骤4中，筛选培养每隔14天需将外殖体转移到新的筛选培养基中，同时逐渐增加潮霉素B的浓度到7mg/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明中采用了预处理的无菌草莓叶片作为外殖体,经过预处理后的无菌草莓叶片增加3倍从而提供了大量的叶片外殖体作为后期分化的原材料。
2、相比于单一使用分化培养基,本发明对材料进行了预处理培养可以提高叶片外殖体的再生效率。并且可以达到90％以上的的不定芽再生效率,远高于现有其他方案。
3、由于本发明中所提出的分化培养基可以使栽培草莓离体叶片高频分化，因此可以应用于栽培草莓遗传转化中，可以获得良好的再生分化效果并获得转基因草莓株系。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
一种栽培草莓离体叶片高频再生方法，该栽培草莓离体叶片高频再生方法的具体步骤如下：
S1：材料预处理，在无菌环境下，以生长于1/2MS培养基中生长状态良好的栽培草莓无菌苗为材料，用无菌手术刀将无菌苗的丛生芽切割分离，最后保留丛生芽芽点及其周围3片叶片，并将其转移到草莓材料预培养基中，培养室环境中培养18天备用；
S2：材料切割取材，在无菌环境下，取出S1中生长于草莓材料预培养基的草莓材料，将其叶片剪下后放置于湿润的培养皿中，用锋利的手术刀或者专用打孔器将草莓叶片小叶切割处理为0.5cm×0.5cm的叶圆盘片；
S3：分化培养，将S2中获得的叶圆盘片平铺于离体叶片再生培养基表面以使得叶圆盘片周围与培养基充分接触，将铺好的培养基于培养室环境中培养天21天即可观察到分化出来的不定芽，继续培养21天，可以获得大量的不定芽。
栽培草莓离体叶片高频再生过程中所涉及的两种培养基，其特征在于
用于预培养的培养基：MS培养基(pH＝5.6-6.0)+6-BA(0.5mg/L)+IBA(0.1mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(7g/L)
用于叶圆盘片分化的分化培养基：MS培养基(pH＝5.6-6.0)+TDZ(4mg/L)+IBA(0.5mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(7g/L)
其中缩略词以及CAS号：
6-BA：6-BENZYLAMINOPURINE(CAS：1214-39-7)
IBA：INDOLE-3-BUTYRIC ACID(CAS：133-32-4)
TDZ：THIDIAZURON(CAS：51707-55-2)。
本发明还提供了一种栽培草莓离体叶片高频再生方法在遗传转化中的应用方法，该栽培草莓离体叶片高频再生方法在遗传转化中的应用方法具体步骤如下：
步骤1：材料预处理:在无菌环境下，以生长于1/2MS培养基中生长状态良好的栽培草莓无菌苗为材料，用无菌手术刀将无菌苗的丛生芽切割分离，最后保留丛生芽芽点及其周围3片叶片，并将其转移到草莓材料预培养基中，在培养室环境中培养18天后取出生长于草莓材料预培养基的草莓材料，将其叶片剪下后放置于湿润的培养皿中，用锋利的手术刀或者专用打孔器将草莓叶片小叶切割处理为0.5cm×0.5cm的叶圆盘片，将叶圆盘片平铺于离体叶片再生培养基表面以使得叶圆盘片周围与培养基充分接触，将铺好的培养基于培养室环境中预培养天3天；
步骤2：准备菌株:用热激法质粒载体转化进入GV3101农杆菌工程菌中，并通过固体培养基筛选和PCR手段获得含有正确质粒载体的GV3101单克隆农杆菌，把单克隆农杆菌接种到含有抗生素的1mlYEP培养基中，在27摄氏度环境中，200rpm震荡培养2天直到培养基可见混浊，将混浊的菌液在无菌环境下吸取到25mlYEP培养基中进行震荡培养，培养环境为27摄氏度，震荡速度为200rpm，将菌液培养到OD600＝0.1-0.15时加入乙酰丁香酮溶液(100mM)20ul，将菌液继续培养3h后取出，在2000g的加速度下旋转离心5分钟，弃掉上清液并加入含有乙酰丁香酮100uM的MS液体培养基25ml，轻轻震荡悬浮菌体备用；
步骤3：材料侵染:取出步骤1中的叶圆盘片放置于湿润的培养皿中，将2步骤中制备得到的菌液倒入装叶圆盘片的培养皿中，并轻轻摇晃使菌液和叶圆盘片充分接触混合侵染，侵染时间为30分钟，侵染期间每隔5分钟晃动培养皿一次直到侵染结束，将叶片转移到含有乙酰丁香酮的离体叶片再生培养基中黑暗培养3天作为共培养；
步骤4：材料分化再生与抗性筛选:将步骤3中共培养基中的叶圆盘片转移到含有抗菌抗生素的离体叶片再生培养基中培养7天作为延迟筛选培养，最后将延迟筛选培养基中的叶圆盘片转移到含有抗菌抗生素和筛选抗生素的离体叶片再生培养基中进行筛选培养56天即可获得健壮的转基因抗性芽。
步骤2中的质粒载体选择Cambia1301载体，此载体具有表达出可以被GUS染色的蛋白和抵抗潮霉素筛选的抗性蛋白，可以用于遗传转化后期组织染色鉴定和抗性筛选。步骤4中的抗菌抗生素种类与浓度分别为:特美汀(Timentin):250mg/L和羧苄青霉素:250mg/L。在步骤2中使用Cambia1301载体，则在步骤4中的筛选抗生素的种类和浓度为:潮霉素B(Hygromycin B)5mg/L，并且在步骤4中，筛选培养每隔14天需将外殖体转移到新的筛选培养基中，同时逐渐增加潮霉素B的浓度到7mg/L。
实施例2
一种栽培草莓离体叶片高频再生方法，该栽培草莓离体叶片高频再生方法的具体步骤如下：
S1：材料预处理，在无菌环境下，以生长于1/2MS培养基中生长状态良好的栽培草莓无菌苗为材料，用无菌手术刀将无菌苗的丛生芽切割分离，最后保留丛生芽芽点及其周围4片叶片，并将其转移到草莓材料预培养基中，培养室环境中培养21天备用；
S2：材料切割取材，在无菌环境下，取出S1中生长于草莓材料预培养基的草莓材料，将其叶片剪下后放置于湿润的培养皿中，用锋利的手术刀或者专用打孔器将草莓叶片小叶切割处理为0.5cm×0.5cm的叶圆盘片；
S3：分化培养，将S2中获得的叶圆盘片平铺于离体叶片再生培养基表面以使得叶圆盘片周围与培养基充分接触，将铺好的培养基于培养室环境中培养天21天即可观察到分化出来的不定芽，继续培养21天，可以获得大量的不定芽。
本发明还提供了一种栽培草莓离体叶片高频再生方法在遗传转化中的应用方法，该栽培草莓离体叶片高频再生方法在遗传转化中的应用方法具体步骤如下：
步骤1：材料预处理:在无菌环境下，以生长于1/2MS培养基中生长状态良好的栽培草莓无菌苗为材料，用无菌手术刀将无菌苗的丛生芽切割分离，最后保留丛生芽芽点及其周围4片叶片，并将其转移到草莓材料预培养基中，在培养室环境中培养21天后取出生长于草莓材料预培养基的草莓材料，将其叶片剪下后放置于湿润的培养皿中，用锋利的手术刀或者专用打孔器将草莓叶片小叶切割处理为0.5cm×0.5cm的叶圆盘片，将叶圆盘片平铺于离体叶片再生培养基表面以使得叶圆盘片周围与培养基充分接触，将铺好的培养基于培养室环境中预培养天3天；
步骤2：准备菌株:用热激法质粒载体转化进入GV3101农杆菌工程菌中，并通过固体培养基筛选和PCR手段获得含有正确质粒载体的GV3101单克隆农杆菌，把单克隆农杆菌接种到含有抗生素的1mlYEP培养基中，在29摄氏度环境中，200rpm震荡培养2天直到培养基可见混浊，将混浊的菌液在无菌环境下吸取到25mlYEP培养基中进行震荡培养，培养环境为27摄氏度，震荡速度为200rpm，将菌液培养到OD600＝0.1-0.15时加入乙酰丁香酮溶液(100mM)20ul，将菌液继续培养3h后取出，在2000g的加速度下旋转离心5分钟，弃掉上清液并加入含有乙酰丁香酮100uM的MS液体培养基25ml，轻轻震荡悬浮菌体备用；
步骤3：材料侵染:取出步骤1中的叶圆盘片放置于湿润的培养皿中，将2步骤中制备得到的菌液倒入装叶圆盘片的培养皿中，并轻轻摇晃使菌液和叶圆盘片充分接触混合侵染，侵染时间为35分钟，侵染期间每隔5分钟晃动培养皿一次直到侵染结束，将叶片转移到含有乙酰丁香酮的离体叶片再生培养基中黑暗培养3天作为共培养；
步骤4：材料分化再生与抗性筛选:将步骤3中共培养基中的叶圆盘片转移到含有抗菌抗生素的离体叶片再生培养基中培养7天作为延迟筛选培养，最后将延迟筛选培养基中的叶圆盘片转移到含有抗菌抗生素和筛选抗生素的离体叶片再生培养基中进行筛选培养56天即可获得健壮的转基因抗性芽。
步骤2中的质粒载体选择Cambia1301载体，此载体具有表达出可以被GUS染色的蛋白和抵抗潮霉素筛选的抗性蛋白，可以用于遗传转化后期组织染色鉴定和抗性筛选。步骤4中的抗菌抗生素种类与浓度分别为:特美汀(Timentin):250mg/L和羧苄青霉素:250mg/L。在步骤2中使用Cambia1301载体，则在步骤4中的筛选抗生素的种类和浓度为:潮霉素B(Hygromycin B)5mg/L，并且在步骤4中，筛选培养每隔14天需将外殖体转移到新的筛选培养基中，同时逐渐增加潮霉素B的浓度到7mg/L。
实施例3
一种栽培草莓离体叶片高频再生方法，该栽培草莓离体叶片高频再生方法的具体步骤如下：
S1：材料预处理，在无菌环境下，以生长于1/2MS培养基中生长状态良好的栽培草莓无菌苗为材料，用无菌手术刀将无菌苗的丛生芽切割分离，最后保留丛生芽芽点及其周围5片叶片，并将其转移到草莓材料预培养基中，培养室环境中培养24天备用；
S2：材料切割取材，在无菌环境下，取出S1中生长于草莓材料预培养基的草莓材料，将其叶片剪下后放置于湿润的培养皿中，用锋利的手术刀或者专用打孔器将草莓叶片小叶切割处理为0.5cm×0.5cm的叶圆盘片；
S3：分化培养，将S2中获得的叶圆盘片平铺于离体叶片再生培养基表面以使得叶圆盘片周围与培养基充分接触，将铺好的培养基于培养室环境中培养天21天即可观察到分化出来的不定芽，继续培养21天，可以获得大量的不定芽。
本发明还提供了一种栽培草莓离体叶片高频再生方法在遗传转化中的应用方法，该栽培草莓离体叶片高频再生方法在遗传转化中的应用方法具体步骤如下：
步骤1：材料预处理:在无菌环境下，以生长于1/2MS培养基中生长状态良好的栽培草莓无菌苗为材料，用无菌手术刀将无菌苗的丛生芽切割分离，最后保留丛生芽芽点及其周围5片叶片，并将其转移到草莓材料预培养基中，在培养室环境中培养24天后取出生长于草莓材料预培养基的草莓材料，将其叶片剪下后放置于湿润的培养皿中，用锋利的手术刀或者专用打孔器将草莓叶片小叶切割处理为0.5cm×0.5cm的叶圆盘片，将叶圆盘片平铺于离体叶片再生培养基表面以使得叶圆盘片周围与培养基充分接触，将铺好的培养基于培养室环境中预培养天3天；
步骤2：准备菌株:用热激法质粒载体转化进入GV3101农杆菌工程菌中，并通过固体培养基筛选和PCR手段获得含有正确质粒载体的GV3101单克隆农杆菌，把单克隆农杆菌接种到含有抗生素的1mlYEP培养基中，在30摄氏度环境中，200rpm震荡培养2天直到培养基可见混浊，将混浊的菌液在无菌环境下吸取到25mlYEP培养基中进行震荡培养，培养环境为27摄氏度，震荡速度为200rpm，将菌液培养到OD600＝0.1-0.15时加入乙酰丁香酮溶液(100mM)20ul，将菌液继续培养3h后取出，在2000g的加速度下旋转离心5分钟，弃掉上清液并加入含有乙酰丁香酮100uM的MS液体培养基25ml，轻轻震荡悬浮菌体备用；
步骤3：材料侵染:取出步骤1中的叶圆盘片放置于湿润的培养皿中，将2步骤中制备得到的菌液倒入装叶圆盘片的培养皿中，并轻轻摇晃使菌液和叶圆盘片充分接触混合侵染，侵染时间为40分钟，侵染期间每隔5分钟晃动培养皿一次直到侵染结束，将叶片转移到含有乙酰丁香酮的离体叶片再生培养基中黑暗培养3天作为共培养；
步骤4：材料分化再生与抗性筛选:将步骤3中共培养基中的叶圆盘片转移到含有抗菌抗生素的离体叶片再生培养基中培养7天作为延迟筛选培养，最后将延迟筛选培养基中的叶圆盘片转移到含有抗菌抗生素和筛选抗生素的离体叶片再生培养基中进行筛选培养56天即可获得健壮的转基因抗性芽。
步骤2中的质粒载体选择Cambia1301载体，此载体具有表达出可以被GUS染色的蛋白和抵抗潮霉素筛选的抗性蛋白，可以用于遗传转化后期组织染色鉴定和抗性筛选。步骤4中的抗菌抗生素种类与浓度分别为:特美汀(Timentin):250mg/L和羧苄青霉素:250mg/L。在步骤2中使用Cambia1301载体，则在步骤4中的筛选抗生素的种类和浓度为:潮霉素B(Hygromycin B)5mg/L，并且在步骤4中，筛选培养每隔14天需将外殖体转移到新的筛选培养基中，同时逐渐增加潮霉素B的浓度到7mg/L。
本发明中采用了预处理的无菌草莓叶片作为外殖体,经过预处理后的无菌草莓叶片增加3倍从而提供了大量的叶片外殖体作为后期分化的原材料。相比于单一使用分化培养基,本发明对材料进行了预处理培养可以提高叶片外殖体的再生效率。并且可以达到90％以上的的不定芽再生效率,远高于现有其他方案。由于本发明中所提出的分化培养基可以使栽培草莓离体叶片高频分化，因此可以应用于栽培草莓遗传转化中，可以获得良好的再生分化效果并获得转基因草莓株系
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种栽培草莓离体叶片高频再生方法，其特征在于，该栽培草莓离体叶片高频再生方法的具体步骤如下：
S1：材料预处理，在无菌环境下，以生长于1/2MS培养基中生长状态良好的栽培草莓无菌苗为材料，用无菌手术刀将无菌苗的丛生芽切割分离，最后保留丛生芽芽点及其周围3-5片叶片，并将其转移到草莓材料预培养基中，培养室环境中培养18-24天备用；
S2：材料切割取材，在无菌环境下，取出S1中生长于草莓材料预培养基的草莓无菌苗，将其叶片剪下后放置于湿润的培养皿中，用锋利的手术刀或者专用打孔器将草莓叶片的小叶基部进行切割处理成为0.5cm×0.5cm的叶圆盘片；
S3：分化培养，将S2中获得的叶圆盘片平铺于离体叶片再生培养基表面以使得叶圆盘片周围与培养基充分接触，将铺好的培养基于培养室环境中培养天21天即可观察到分化得到的不定芽，继续培养21天，可以获得大量的不定芽。
2.一种根据权利要求1所述的栽培草莓离体叶片高频再生方法在遗传转化中的应用方法，其特征在于，该栽培草莓离体叶片高频再生方法在遗传转化中的应用方法具体步骤如下：
步骤1：材料预处理:在无菌环境下，以生长于1/2MS培养基中生长状态良好的栽培草莓无菌苗为材料，用无菌手术刀将无菌苗的丛生芽切割分离，最后保留丛生芽芽点及其周围3-5片叶片，并将其转移到草莓材料预培养基中，在培养室环境中培养18-24天后取出生长于PM的草莓材料，将其叶片剪下后放置于湿润的培养皿中，用锋利的手术刀或者专用打孔器将草莓叶片小叶切割处理为0.5cm×0.5cm的叶圆盘片，将叶圆盘片平铺于离体叶片再生培养基表面以使得叶圆盘片周围与培养基充分接触，将铺好的培养基于培养室环境中预培养天3天；
步骤2：准备菌株:用热激法质粒载体转化进入GV3101农杆菌工程菌中，并通过固体培养基筛选和PCR手段获得含有正确质粒载体的GV3101单克隆农杆菌，把单克隆农杆菌接种到含有抗生素的1mlYEP培养基中，在27-30摄氏度环境中，200rpm震荡培养2天直到培养基可见混浊，将混浊的菌液在无菌环境下吸取到25mlYEP培养基中进行震荡培养，培养环境为27摄氏度，震荡速度为200rpm，将菌液培养到OD600＝0.1-0.15时加入乙酰丁香酮溶液(100mM)20ul，将菌液继续培养3h后取出，在2000g的加速度下旋转离心5分钟，弃掉上清液并加入含有乙酰丁香酮100uM的MS液体培养基25ml，轻轻震荡悬浮菌体备用；
步骤3：材料侵染:取出步骤1中的叶圆盘片放置于湿润的培养皿中，将2步骤中制备得到的菌液倒入装叶圆盘片的培养皿中，并轻轻摇晃使菌液和叶圆盘片充分接触混合侵染，侵染时间为30-40分钟，侵染期间每隔5分钟晃动培养皿一次直到侵染结束，将叶片转移到含有乙酰丁香酮的离体叶片再生培养基中黑暗培养3天作为共培养；
步骤4：材料分化再生与抗性筛选:将步骤3中共培养基中的叶圆盘片转移到含有抗菌抗生素的离体叶片再生培养基中培养7天作为延迟筛选培养，最后将延迟筛选培养基中的叶圆盘片转移到含有抗菌抗生素和筛选抗生素的离体叶片再生培养基中进行筛选培养56天即可获得健壮的转基因抗性芽。
3.根据权利要求2所述的一种栽培草莓离体叶片高频再生方法在遗传转化中的应用方法，其特征在于，步骤2中的质粒载体选择Cambia1301载体，此载体具有表达出可以被GUS染色的蛋白和抵抗潮霉素筛选的抗性蛋白，可以用于遗传转化后期组织染色鉴定和抗性筛选。
4.根据权利要求2所述的一种栽培草莓离体叶片高频再生方法在遗传转化中的应用方法，其特征在于，步骤4中的抗菌抗生素种类与浓度分别为:特美汀:250mg/L和羧苄青霉素:250mg/L。
5.根据权利要求2所述的一种栽培草莓离体叶片高频再生方法在遗传转化中的应用方法，其特征在于，在步骤2中使用Cambia1301载体，则在步骤4中的筛选抗生素的种类和浓度为:潮霉素B 5mg/L，并且在步骤4中，筛选培养每隔14天需将外殖体转移到新的筛选培养基中，同时逐渐增加潮霉素B的浓度到7mg/L。
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