CN105420274A - 一种农杆菌介导的玉米成熟胚茎尖转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及转基因玉米，具体公开了一种农杆菌介导的玉米成熟胚茎尖转化方法。本发明利用玉米茎尖作为受体不受基因型的限制，还开发了一套严格适用于玉米茎尖作为转化受体的培养基体系，实现玉米的高效遗传转化。本发明所述方法缩短了玉米的转化周期，以茎尖作为受体不受基因型的限制，还可以免除转基因过程中的植株再生等环节。突破了转化外植体的限制，提高了玉米的转化效率。该方法操作简便，简单易行，转化周期短，转化效率高，结果可靠，能够快速获取转基因玉米植株。
Description
技术领域
本发明涉及转基因玉米，具体地说，涉及一种农杆菌介导的玉米成熟胚茎尖转化方法。
背景技术
玉米在我国的栽培历史大约有470多年。目前我国播种面积在3亿亩左右，仅次于稻、麦，在粮食作物中居第三位，在世界上仅次于美国。玉米主要用作食量、饲料、能源、营养品以及医药工业的原料，其工业价值广泛用于造纸、食品、纺织、医药等行业，具有产量高、耐储存、再生产价值高的特点。
截止至2014年，转基因作物种植面积从1996年的170万公顷增长到2014年的1.815亿公顷，其中耐除草剂转基因玉米种植面积在800万公顷左右，抗虫转基因种植面积为600万公顷(中国生物技术信息网)。这一增长使得转基因技术以可观的利润成为现代农业史上应用最迅速的作物技术。转基因作物不仅对粮食安全做出了巨大贡献，在可持续性和气候变化等方面也有诸多贡献。
虽然玉米转基因技术的应用取得了巨大进展，但是仍然存在着很多问题。重要一点在于组织培养技术还不是很成熟，很大的抑制转化的成功，毕竟现在多数转化方法都是以植物组织培养为基础。自1975年以来已经从包括玉米幼胚、未成熟花序、小抱子、胚叶、雌雄幼穗等多种外植体诱导出愈伤组织。但是由于玉米品系众多、遗传背景复杂、离体培养影响因子多且相互作用等因素的影响，仍存在玉米组织培养愈伤诱导率低、质量不稳定、实验重复性差、再生植株成活率低等多重困难。现如今玉米的转化大多数采用转化幼胚的方法，而幼胚长度又和基因型及采样季节有很大关系。一般早熟品种授粉后幼胚生长较快。晚熟品种生长较慢；夏季高温季节授粉后幼胚生长较快，秋季温度较低时幼胚生长较慢。因此，采样时间要根据基因型、生长季节和幼胚大小来决定。基因型仍是幼胚培养的主要限制因素。
如公开号为CN1263949的中国专利申请，公开了一种建立玉米转基因受体体系的方法及应用。将玉米茎尖接种在附加不同激素组合的诱导培养基上，诱导茎尖培养物直接产生丛生芽或丛生芽组织块。取继代培养后处于旺盛生长期的丛生芽和丛生芽组织块为受体，采用农杆菌介导法、基因枪轰击法等将外源基因转入培养细胞，经过恢复、筛选等步骤获得转基因植株。但是，利用茎尖分化的丛生芽作为外植体仍需要长期的诱导、继代、分化等培养过程，培养周期较长的缺点制约着玉米遗传转化的研究进展。
再如公开号为CN102304544A的中国专利申请，公开了一种根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化方法，其步骤：A.大麦茎尖培养及载体构建：1)选取大麦颖果，去除稃片，剥取成熟胚，盾片向下放置在萌发培养基上萌发；2)从中间载体pMBL-3及和绿色荧光蛋白基因GFP用酶切和PCR方法获得玉米泛素启动子及相关序列；B、利用农杆菌介导大麦茎尖遗传转化，步骤：1)大麦茎尖的获取；2)茎尖的浸染；3)茎尖和农杆菌LBA4401共培养培养基：取出经农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液；4)茎尖的恢复培养基；5)茎尖的筛选培养基；6)再生植株的春化和栽培，得到候选的转化植株。方法易行，操作简便，周期短、效率高，程序简单，操作方便，结果可靠。但是，大麦与玉米虽都为单子叶植物，但大麦与玉米作为两种不同的作物也决定了在转化上的差异，而目前未见适用于玉米的技术方案。
目前，玉米遗传转化方法主要采用农杆菌介导法和基因枪法，其受体主要是幼胚和胚性愈伤组织，而愈伤组织形成的再生植株无性系变异大、周期长等缺点也制约着玉米遗传转化研究的发展。
因此，选择合适的外植体作为玉米遗传转化的受体，高效的遗传转化体系是转基因研究的重要环节。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种农杆菌介导的玉米成熟胚茎尖转化方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明首先提供一种农杆菌介导的玉米成熟胚茎尖转化方法，包括如下步骤：
A、玉米茎尖培养及载体构建：
1)挑选饱满无损伤的种子，进行消毒处理后，取成熟胚放于萌发培养基上，在培养箱中经过低温处理，再置于23-28℃暗培养进行萌发；
2)构建携带目的基因的植物表达载体，将构建好的植物表达载体转化根癌农杆菌；
B、利用农杆菌介导玉米成熟胚茎尖遗传转化：
1)玉米成熟胚茎尖的获取：
待胚芽长到3-5cm时，在芽节点上方1-2mm的位置横切第一刀，将胚芽结上部切掉丢弃，得到茎尖，在茎尖切口处的中央部位向下纵切第二刀，切口稍越过结的下线约1mm，用刺针刺伤横切面生长点上端，在高渗培养基中放置1h以上；
2)茎尖的侵染：
从步骤1)得到的玉米成熟胚茎尖，加入用根癌农杆菌浸染培养基悬浮的根癌农杆菌LBA4401菌液，浸染茎尖4-6min；
3)茎尖和根癌农杆菌的共培养：
取出经根癌农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液，于共培养固体培养基上在24-28℃共培养3d；
4)茎尖的恢复培养：
将步骤3)中的茎尖转至恢复培养基，于22-24℃下培养至从生长点部位萌生出新的幼叶；
5)转化苗的转苗及栽苗：
将长出新叶的幼苗从恢复培养基中取出，洗掉多余的恢复培养基，栽入花盆中，在人工气候箱中光照培养，等叶片伸展后移栽到温室大棚中；
6)对伸展出新生叶的幼苗进行抗性筛选：
幼苗长到两叶一心时，用除草剂处理新生叶片，除草剂的喷施根据苗情来判断，筛选抗性幼苗，将正常生长的玉米幼苗连根挖出移栽入大田；
所述萌发培养基为：33000mg/LNH4NO3，38000mg/LKNO3，8800mg/LCaCl2·2H20，7400mg/LMgSO4·7H20，3400mg/LKH2PO4，4400mg/LMnS04·4H20，800mg/LH2BO3，1600mg/LKI，1600mg/LZnSO4·7H20，4.885mg/L氯化胆碱，2.445mg/L核黄素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L叶酸，9.97mg/L烟酸，23.611mg/L维生素BI，5.0mg/LD-泛酸钙，9.97mg/L盐酸吡哆辛，0.00675mg/L维生素B12，2.47mg/L对氨基甲苯，7.46mg/LNa2EDTA.2H2O，5.56mg/LFeSO4.7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL-脯氨酸，30000mg/L蔗糖，5000mg/L葡萄糖，100mg/L肌醇，8000mg/L琼脂粉pH5.8；
所述高渗培养基：56600mg/LKNO3，9260mg/LNH4SO4，3700mg/LMgSO4 .7H2O，8000mg/LKH2PO4，33200mg/LCaCl. 2H2O，100mg/LMnSO4 .4H2O，20mg/LZnSO4 .7H2O，0.25mg/LCoCl2 .6H2O，0.25mg/LCuSO4 .5H2O，2.5mg/LNaMoO4 .2H2O，4.885mg/L氯化胆碱，2.445mg/L核黄素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L叶酸，9.97mg/L烟酸，23.611mg/L维生素BI，5.0mg/LD-泛酸钙，9.97mg/L盐酸吡哆辛，0.00675mg/L维生素B12，2.47mg/L对氨基甲苯，7.46mg/LNa2EDTA.2H2O，5.56mg/LFeSO4 .7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL-脯氨酸，20000mg/L蔗糖，10000mg/L葡萄糖pH5.8；
所述浸染培养基为：56600mg/LKNO3，9260mg/LNH4SO4，3700mg/LMgSO4 .7H2O，8000mg/LKH2PO4，33200mg/LCaCl.2H2O，100mg/LMnSO4.4H2O，20mg/LZnSO4 .7H2O，0.25mg/LCoCl2 .6H2O，0.25mg/LCuSO4 .5H2O，2.5mg/LNaMoO4 .2H2O，4.885mg/L氯化胆碱，2.445mg/L核黄素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L叶酸，9.97mg/L烟酸，23.611mg/L维生素BI，5.0mg/LD-泛酸钙，9.97mg/L盐酸吡哆辛，0.00675mg/L维生素B12，2.47mg/L对氨基甲苯，7.46mg/LNa2EDTA.2H2O，5.56mg/LFeSO4 .7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL-脯氨酸，20000mg/L蔗糖，10000mg/L葡萄糖，100uM乙酰丁香酮pH5.8；
所述共培养固体培养基为：33000mg/LNH4NO3，38000mg/LKNO3，8800mg/LCaCl2·2H20，7400mg/LMgSO4·7H20，3400mg/LKH2PO4，4400mg/LMnS04·4H20，800mg/LH2BO3，1600mg/LKI，1600mg/LZnSO4·7H20，4.885mg/L氯化胆碱，2.445mg/L核黄素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L叶酸，9.97mg/L烟酸，23.611mg/L维生素BI，5.0mg/LD-泛酸钙，9.97mg/L盐酸吡哆辛，0.00675mg/L维生素B12，2.47mg/L对氨基甲苯，7.46mg/LNa2EDTA.2H2O，5.56mg/LFeSO4 .7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL-脯氨酸，30000mg/L蔗糖，5000mg/L葡萄糖，100mg/L肌醇，8000mg/L琼脂粉，100uM乙酰丁香酮pH5.8；
所述恢复培养基为：1/2MS培养基，30000mg/L蔗糖，5000mg/L葡萄糖，8000mg/L琼脂粉。
在实验探索的过程中，发现在茎尖处理的不同阶段，蔗糖与葡萄糖的比例可能影响到茎尖的生长以及转化的效率，核黄素、生物素等维生素成分在高渗培养基中对玉米茎尖的转化效率有一定影响。本发明通过调整培养基中蔗糖与葡萄糖的比例以及添加不同的维生素成分获得了适合玉米成熟胚茎尖转化的培养及体系，从而提高了玉米成熟胚茎尖的转化效率，也大幅度提高了了玉米转化的效率，在一定程度上缩短了玉米转化的周期。
进一步地，为了更好的获取玉米转化植株，本发明提供一种较佳的校服处理方法。
所述消毒处理包括具体为：将挑选好的饱满无损伤的种子在超净工作台上消毒两遍：
第一遍：用70％的乙醇灭菌8分钟，0.1％的升汞水溶液灭菌六分钟，无菌水洗涤三次：第一次2倍种子体积无菌水洗涤一分钟，第二次3倍种子体积无菌水洗2-3分钟，第三次2倍种子体积的无菌水洗涤一分钟，然后加1.5倍种子体积的无菌水24-26℃浸泡种子6小时(若温度过高，可适当的缩短时间)，泡的时间一定要把握好，时间太久的话种子容易发黑，萌发出牙率降低；
第二遍：用0.1％的升汞水溶液灭菌10分钟，无菌水洗涤五次，第一次1倍种子体积无菌水洗涤1分钟，第二次2倍种子体积无菌水洗涤一分钟，第三次3倍种子体积无菌水洗涤2-3分钟，第四次2倍种子体积无菌水洗涤5分钟，第五次0.5倍种子体积无菌水洗涤一分钟，灭菌完毕，放入萌发盒。
进一步地，为了使玉米成熟胚更好更快的萌发，本发明提供一种较佳的萌发过程，所述成熟胚的萌发过程为：将消毒后的种子取成熟胚，盾片向下置于萌发培养基上，在4℃暗培养12h，再转入到15℃条件下暗培养24h，此时胚开始萌发，然后转移到28℃暗培养2天。低温处理以利于种子萌发的一致性，同时低温处理以利于提高生长组织的分化率，时间可以自由调节，与后续的农杆菌培养的浓度达到一致。以在农杆菌最适的生长时期侵染茎尖，以提高转化的效率。
转化入玉米的目的基因可根据不同的应用目的进行任意选择，本发明对目的基因不作限定。
在本发明的一个具体实施方式中，本发明给出一个目的基因为抗虫基因的技术方案，旨在说明通过本发明所述方法制备转基因抗虫玉米。因此，所述植物表达载体为含有抗虫基因的植物表达载体。
进一步地，为了使玉米具有优良的抗虫能力，所述植物表达载体为含有Cry1AC抗虫基因的植物表达载体。
进一步地，为了更好的获得含有Cry1AC抗虫基因的植物表达载体，本发明提供所述载体的构建方法如下：利用PCR扩增技术获得Cry1AC抗虫基因，利用限制性内切酶酶切切除P3301载体质粒中的GUS基因，用T4连接酶将Cry1Ac抗虫基因连接到酶切后的P3301载体质粒中，构建P3301-Cry1Ac抗虫植物表达载体。
更进一步地，所述构建方法包括如下步骤：
(1)18-T-Cry1Ac载体用限制性内切酶NcoI和BstEII双酶切，电泳回收大片段；
(2)p3301载体用限制性内切酶NcoI和BstEII双酶切，电泳回收大片段；
(3)将步骤(2)电泳回收的线性化p3301载体和步骤(1)电泳回收的Cry1Ac片段用T4连接酶连接；
(4)将连接产物转化大肠杆菌DH5a，提取质粒，采用双酶切鉴定筛选阳性重组载体。(如图1所示，电泳图检测获得约560bp条带，载体P3301构建成功。)
本发明还进一步提供了前述方法在制备转基因玉米中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明利用玉米茎尖作为受体不受基因型的限制，还开发了一套严格适用于玉米茎尖作为转化受体的培养基体系，实现玉米的高效遗传转化。
本发明所述方法缩短了玉米的转化周期，以茎尖作为受体不受基因型的限制，还可以免除转基因过程中的植株再生等环节。突破了转化外植体的限制，提高了玉米的转化效率。根癌农杆菌介导的遗传转化具有转基因遗传稳定性高、转基因拷贝数低、减少基因沉默、转基因整合微店边界序列容易鉴定(转基因品种商品化的必要条件)、转化成本低等多种优势。该方法操作简便，简单易行，转化周期短，转化效率高，结果可靠，能够快速获取转基因玉米植株。
附图说明
图1为本发明构建的p3301-Cry1Ac载体经酶切后的琼脂糖凝胶电泳图。图中标注的1、2、3分别为Mark、p3301-Cry1Ac经BstEII单酶切片段、p3301-Cry1Ac经NcoI和BstEII双酶切的片段。
图2为本发明实施例1所述的T0代植株PCR检测结果。
图3为本发明实施例1所述的Cry1Ac基因RT-PCR凝胶电泳图。
图4为本发明实施例1所述的利用农杆菌介导玉米茎尖转化筛选的转化植株。
图5为本发明实施例1所述的转化植株自花授粉后得到的果穗。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
1实验实施材料
培养基及常用溶液配制
(1)LB(Luria-Bertani)培养基(1L体系)
胰蛋白胨(Tryptone)10g
酵母粉(Yeastextract)5g
NaCl10g
琼脂粉(Agar)15g
补水至1L(液体培养基无需加入琼脂粉)
(2)YEP培养基(1L体系)
胰蛋白胨(tryptone)10g
酵母粉(yeastextract)10g
NaCl5g
琼脂粉(agar)15g
补水至1L(液体培养基无需加入琼脂粉)
(3)卡那霉素溶液配制(50mg/ml)
称取2.5g卡那霉素，定容与50ml的灭菌水中，充分溶解。
0.22um滤膜过滤除菌，分装1ml，-20℃保存
(4)氨苄霉素配制(100mg/ml)
称取5g氨苄霉素，定容与50ml的灭菌水中，充分溶解。
0.22um滤膜过滤除菌，分装1ml，-20℃保存。
(5)利福平溶液配制(50mg/ml)称取2.5g利福平置于50ml塑料离心管中，加入40ml甲醇，振荡充分混合溶解之后定容50ml，可以涡旋。0.22um滤膜过滤除菌，分装1ml，-20℃保存。
配制时每毫升可加入3～5滴10NNaOH以助溶。若以DMSO做溶剂，可不滴加NaOH。
(6)IPTG配制(24mg/ml)
称取1.2gIPTG，定容与50ml的灭菌水中，充分溶解。
0.22um滤膜过滤除菌，分装1ml，-20℃保存。试剂
(7)升汞(千分之一)：用蒸馏水配制
(8)酒精
(9)乙酰丁香酮(AS)：每0.2克的AS粉末加10毫升的无水乙醇。转化前，最好让农杆菌在含乙酰丁香酮的缓冲液里低温处理一段时间，可以提高转化效率，如果8h还没能从0.3长到0.8左右，那么说明这批农杆菌的状态不佳。
实施例1
一、玉米茎尖培养及载体构建：
1、玉米茎尖培养
1.1挑选饱满无损伤的种子，放入三角瓶中进行两次灭菌处理:
第一遍：用70％的乙醇灭菌8分钟，0.1％的升汞水溶液灭菌六分钟，无菌水洗涤三次：第一次2倍种子体积无菌水洗涤一分钟，第二次3倍种子体积无菌水洗2-3分钟，第三次2倍种子体积的无菌水洗涤一分钟，然后加1.5倍种子体积的无菌水浸泡种子6小时(24-26摄氏度，若温度过高，可适当的缩短时间)，泡的时间一定要把握好，时间太久的话种子容易发黑，萌发出牙率降低；
第二遍：再用0.1％的升汞水溶液灭菌10分钟，无菌水洗涤五次，第一次1倍种子体积无菌水洗涤1分钟，第二次2倍种子体积无菌水洗涤一分钟，第三次3倍种子体积无菌水洗涤2-3分钟，第四次2倍种子体积无菌水洗涤5分钟，第五次0.5倍种子体积无菌水洗涤一分钟，灭菌完毕，放入萌发盒。
1.2萌种子
种子萌发过程，是将消毒后的种子置于萌发培养基上，在4℃暗培养12h，再转入到15℃条件下暗培养24h，此时胚开始萌发，然后转移到28℃暗培养两天，方可获取遗传转化的茎尖。低温处理以利于种子萌发的一致性，同时低温处理以利于提高生长组织的分化率，时间可以自由调节，与后续的农杆菌培养的浓度达到一致。以在农杆菌最适的生长时期侵染茎尖，以提高转化的效率。
2、利用PCR扩增技术获得Cry1AC抗虫基因，利用限制性内切酶酶切切除P3301载体质粒中的GUS基因，用T4连接酶将Cry1Ac抗虫基因连接到酶切后的P3301载体质粒中，构建P3301-Cry1Ac抗虫植物表达载体，将构建好的植物表达载体转化根癌农杆菌。
具体为：
2.1Cry1Ac的克隆
利用人工合成的引物，以质粒pUC19Ac为模板进行扩增。
PCR反应体系(40μL)：
注：Prime引物稀释：5’primer5μL+3’primer5μL+ddH2O240μL
按照以下程序进行扩增：94℃预变性5min；94℃变性40sec；56℃退火45sec；72℃延伸1min，30个循环；72℃保持5min，4℃保温。
2.2大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
(1)从于37℃培养16-20h新鲜平板上挑取一个单菌落，接种于15mlLB液体培养基的三角瓶中，37℃，190rpm振荡培养过夜(约14h)。
(2)取1.6ml菌液接到一个含有14.4mlLB液体培养基三角瓶中，37℃，210rpm培养90min。
(3)再取出10ml菌液转接到一个含有90mlLB液体培养基三角瓶中，37℃，210rpm培养10min
(4)将菌液分装到2个50ml离心管中，冰上放置10min，4℃，5000rpm离心7min，倒出培养液，回收菌体，将管倒置1min以便培养液流尽。(注意无菌操作)
(5)用冰预冷的0.1MCaCl2(新鲜解冻的)0.5ml在冰上用枪吸打，使其沉淀悬浮。再补加0.1MCaCl2至20ml。立即放在冰上静置30min(从接触CaCl2开始计时)。4℃，5000rpm离心7min，回收菌体。加入2ml冰预冷的0.1MCaCl2悬浮细胞(冰浴上操作)。
(6)分装：感受态细胞85μL，加上15μL纯甘油。100μL分装，-80℃保存。
2.3农杆菌的准备
农杆菌电击感受态细胞的制备及转化
(1)取单菌落接种于10ml液体YMBroth(0.4g酵母提取物，10g甘露醇，0.1gNaCl，0.1gMgSO4，0.5gK2HPO4·3H2O，pH7.0，定容至1L)中，28℃摇床培养过夜。
(2)取10ml按1％接种于1LYMBroth培养液中，200转28℃摇菌3-4小时，至OD值为0.6-0.8。
(3)，4℃，4000rpm离心10min，收集菌体。
(4)弃上清，菌体归于一管，加50ml预冷的超纯水悬浮细胞。
(5)4℃，4000rpm离心10min，弃上清，加100ml预冷的10％甘油悬浮细胞。
(6)重复5。
(7)4℃，4000rpm离心10min，菌体悬于1.5ml无菌预冷的1M山梨醇。
(8)将细胞悬液分装于0.5ml小管中，每管200μl。液氮速冻后现用或-80℃保存备用。
(9)其转化参照大肠杆菌电击感受态细胞的转化。
2.4表达载体向农杆菌感受态细胞的转化
取100μl感受态细胞，加入10μl构建好的质粒DNA，冰浴30分钟，液氮中速冻2min后37℃水浴2min，加入600μlLB培养液，28℃慢速振荡培养3-4小时；10000rpm离心30sec收集菌，涂板于KTG平板上，28℃培养约24-36小时
2.5制备转化用的农杆菌菌液
2.5.1灭菌试管400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个(250ml)。
2.5.2试剂：YEP1200ml(每瓶300ml共4瓶)+Kan1；1000，Rif1:500。
1/2MS+2％蔗糖(灭菌115度20分钟)，Silwet在-20℃贮存。
2.5.3
共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按(1：400)及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5～3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶(灭菌)，4℃，4000g离心10min。用10％蔗糖(含0.02％silwet)稀释至OD600约为0.8--1.0左右即，用10％蔗糖作对照。转化时将茎尖在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。
二、利用农杆菌介导玉米成熟胚茎尖遗传转化：
1)玉米成熟胚茎尖的获取：
待胚芽长到3-5cm时，在芽节点上方1-2mm的位置横切第一刀，将胚芽结上部切掉丢弃，得到茎尖，在茎尖切口处的中央部位纵切第二刀，切口稍越过结的下线，用刺针刺伤生长点上端，在高渗培养基中放置1h以上。
2)茎尖的侵染：
从步骤1)得到的玉米成熟胚茎尖，加入用根癌农杆菌浸染培养基悬浮的根癌农杆菌LBA4401菌液，浸染茎尖5min。
3)茎尖和根癌农杆菌的共培养：
取出经根癌农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液，于共培养固体培养基上在24-28℃共培养3d。
4)茎尖的恢复培养：
将步骤3)中的茎尖转至恢复培养基，于22-24℃下培养至从生长点部位萌生出新的幼叶。
在转苗的过程中要小心操作，尽量避免沾染菌液的芽尖碰到培养基或者培养瓶内壁，以防止芽尖上的农杆菌污染培养基，另外茎尖接触培养基茎尖部位会分化出根组织，影响分化。
5)转化苗的转苗及栽苗：
将长出新叶的幼苗从恢复培养基中取出，洗掉多余的恢复培养基，栽入花盆中，在人工气候箱中光照培养，等叶片伸展后移栽到温室大棚中。
6)对转化苗进行抗性筛选：
喷除草剂，对转化苗进行抗性筛选：等小苗长到两叶一心时，喷除草剂，除草剂的喷施根据苗情来判断，筛选抗性幼苗。将将筛选得到的阳性玉米幼苗连根挖出移栽入大田。温度在23℃-30℃，2000Lux。如图4所示，筛选的抗性植株。
7)自交授粉：
移入田间的植株套袋自交授粉，单穗收获。如图5所示，转化植株自花授粉后得到的果穗。
三、T1代检测
T0代的种子播种后，等有苗族长到两叶一心或者是三个叶片时，在最上面的叶子中下部用棉棒涂抹除草剂，涂抹时要避开叶脉部分，每株涂抹一片叶子，涂抹时，先用记号笔画个小圈再涂抹，所用除草剂的剂量与T0代一致，
等除草剂见效时，就可以进行筛选，涂抹部位附近叶片发黄即可认定转化不成功，当然会有部分叶片萎蔫或者发黄是因为机械损伤或者是光照不充分的缘故，对于不确定的植株可以再等一段时间，等可以确认时再剔除。
四、实验实施结果与分析
1)p3301-Cry1AC植物表达载体的PCR检测、酶切检测：提取转化后农杆菌质粒，用设计好Cry1Ac引物进行PCR扩增。用NcoⅠ和BstEII的2限制性内切酶酶切个p3301质粒及p3301Cry1Ac质粒，如图1酶切结果，电泳图检测获得约560bp条带，载体P3301构建成功。
2)农杆菌转化玉米植株的PCR检测：提取玉米叶片DNA，用设计好Cry1Ac引物进行PCR扩增。由图2可知，转化植株经PCR扩增有约560bp的条带。证明转化植株为阳性。
3)RT-PCR检测：提取转基因玉米愈伤组织的RNA，反转录为cDNA，用RT-PCR的方法检测Cry1AC的转录情况。如图3所示，RT-PCR结果表明，所转化的玉米植株Cry1Ac抗虫基因得以转录。
4)以玉米成熟胚茎尖作为受体免除转基因过程中的植株再生等环节整个转化周期约2周左右可以鉴定是否转化成功，与玉米外植体组织组织培养、愈伤组织转化相比较，大大缩短了玉米转化的周期，且过程容易鉴定，转化成本低。
5)用农杆菌介导法转化玉米成熟胚茎尖，获得87株转化苗，经过300mgL的除草剂(Basra)筛选，共获得43株转基因植株。进一步进行PCR检测，其中株13表现阳性，转化率达14.94％。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中。而现如今玉米平均的转化率在5％-7％左右，也有相关报道玉米转化率达10％左右，但用农杆菌介导法转化玉米成熟胚茎尖转化效率达14.94％。这表明农杆菌介导法转化玉米成熟胚茎尖转化具有较高的转化效率。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种农杆菌介导的玉米成熟胚茎尖转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、玉米茎尖培养及载体构建：
1)挑选饱满无损伤的种子，进行消毒处理后，取成熟胚放于萌发培养基上，在培养箱中经过低温处理，再置于23-28℃暗培养进行萌发；
2)构建携带目的基因的植物表达载体，将构建好的植物表达载体转化根癌农杆菌；
B、利用农杆菌介导玉米成熟胚茎尖遗传转化：
1)玉米成熟胚茎尖的获取：
待胚芽长到3-5cm时，在芽节点上方1-2mm的位置横切第一刀，将胚芽结上部切掉丢弃，得到茎尖，在茎尖切口处的中央部位向下纵切第二刀，切口稍越过结的下线约1mm，用刺针刺伤横切面生长点上端，在高渗培养基中放置1h以上；
2)茎尖的侵染：
从步骤1)得到的玉米成熟胚茎尖，加入用根癌农杆菌浸染培养基悬浮的根癌农杆菌LBA4401菌液，浸染茎尖4-6min；
3)茎尖和根癌农杆菌的共培养：
取出经根癌农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液，于共培养固体培养基上在24-28℃共培养3d；
4)茎尖的恢复培养：
将步骤3)中的茎尖转至恢复培养基，于22-24℃下培养至从生长点部位萌生出新的幼叶；
5)转化苗的转苗及栽苗：
将长出新叶的幼苗从恢复培养基中取出，洗掉多余的恢复培养基，栽入花盆中，在人工气候箱中光照培养，等叶片伸展后移栽到温室大棚中；
6)对伸展出新生叶的幼苗进行抗性筛选：
幼苗长到两叶一心时，用除草剂处理新生叶片，除草剂的喷施根据苗情来判断，筛选抗性幼苗，将正常生长的玉米幼苗连根挖出移栽入大田；
常规方法在转苗前惊醒筛选培养，而成熟胚茎尖转化是转化的生长点，所以幼苗长到两叶一心时，才能用除草剂处理新生叶片。
所述萌发培养基为：33000mg/LNH4NO3，38000mg/LKNO3，8800mg/LCaCl2·2H20，7400mg/LMgSO4·7H20，3400mg/LKH2PO4，4400mg/LMnS04·4H20，800mg/LH2BO3，1600mg/LKI，1600mg/LZnSO4·7H20，4.885mg/L氯化胆碱，2.445mg/L核黄素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L叶酸，9.97mg/L烟酸，23.611mg/L维生素BI，5.0mg/LD-泛酸钙，9.97mg/L盐酸吡哆辛，0.00675mg/L维生素B12，2.47mg/L对氨基甲苯，7.46mg/LNa2EDTA.2H2O，5.56mg/LFeSO4.7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL-脯氨酸，30000mg/L蔗糖，5000mg/L葡萄糖，100mg/L肌醇，8000mg/L琼脂粉pH5.8；
所述高渗培养基：56600mg/LKNO3，9260mg/LNH4SO4，3700mg/LMgSO4·7H2O，8000mg/LKH2PO4，33200mg/LCaCl·2H2O，100mg/LMnSO4·4H2O，20mg/LZnSO4·7H2O，0·25mg/LCoCl2·6H2O，0.25mg/LCuSO4·5H2O，2.5mg/LNaMoO4·2H2O，4.885mg/L氯化胆碱，2.445mg/L核黄素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L叶酸，9.97mg/L烟酸，23.611mg/L维生素BI，5.0mg/LD-泛酸钙，9.97mg/L盐酸吡哆辛，0.00675mg/L维生素B12，2.47mg/L对氨基甲苯，7.46mg/LNa2EDTA·2H2O，5.56mg/LFeSO4·7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL-脯氨酸，20000mg/L蔗糖，10000mg/L葡萄糖pH5.8；
所述浸染培养基为：56600mg/LKNO3，9260mg/LNH4SO4，3700mg/LMgSO4·7H2O，8000mg/LKH2PO4，33200mg/LCaCl·2H2O，100mg/LMnSO4.4H2O，20mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LCoCl2·6H2O，0.25mg/LCuSO4·5H2O，2.5mg/LNaMoO4·2H2O，4.885mg/L氯化胆碱，2.445mg/L核黄素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L叶酸，9.97mg/L烟酸，23.611mg/L维生素BI，5.0mg/LD-泛酸钙，9.97mg/L盐酸吡哆辛，0.00675mg/L维生素B12，2.47mg/L对氨基甲苯，7.46mg/LNa2EDTA·2H2O，5.56mg/LFeSO4·7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL-脯氨酸，20000mg/L蔗糖，10000mg/L葡萄糖，100uM乙酰丁香酮pH5.8；
所述共培养固体培养基为：33000mg/LNH4NO3，38000mg/LKNO3，8800mg/LCaCl2·2H20，7400mg/LMgSO4·7H20，3400mg/LKH2PO4，4400mg/LMnS04·4H20，800mg/LH2BO3，1600mg/LKI，1600mg/LZnSO4·7H20，4.885mg/L氯化胆碱，2.445mg/L核黄素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L叶酸，9.97mg/L烟酸，23.611mg/L维生素BI，5.0mg/LD-泛酸钙，9.97mg/L盐酸吡哆辛，0.00675mg/L维生素B12，2.47mg/L对氨基甲苯，7.46mg/LNa2EDTA·2H2O，5.56mg/LFeSO4·7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL-脯氨酸，30000mg/L蔗糖，5000mg/L葡萄糖，100mg/L肌醇，8000mg/L琼脂粉，100uM乙酰丁香酮pH5.8；
所述恢复培养基为：1/2MS培养基，30000mg/L蔗糖，5000mg/L葡萄糖，8000mg/L琼脂粉。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消毒处理包括具体为：将挑选好的饱满无损伤的种子在超净工作台上消毒两遍：
第一遍：用70％的乙醇灭菌8分钟，0.1％的升汞水溶液灭菌六分钟，无菌水洗涤三次：第一次2倍种子体积无菌水洗涤一分钟，第二次3倍种子体积无菌水洗2-3分钟，第三次2倍种子体积的无菌水洗涤一分钟，然后加1.5倍种子体积的无菌水24-26℃浸泡种子6小时(若温度过高，可适当的缩短时间)，泡的时间一定要把握好，时间太久的话种子容易发黑，萌发出牙率降低；
第二遍：用0.1％的升汞水溶液灭菌10分钟，无菌水洗涤五次，第一次1倍种子体积无菌水洗涤1分钟，第二次2倍种子体积无菌水洗涤一分钟，第三次3倍种子体积无菌水洗涤2-3分钟，第四次2倍种子体积无菌水洗涤5分钟，第五次0.5倍种子体积无菌水洗涤一分钟，灭菌完毕，放入萌发盒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成熟胚的萌发过程为：将消毒后的种子取成熟胚，盾片向下置于萌发培养基上，在4℃暗培养12h，再转入到15℃条件下暗培养24h，此时胚开始萌发，然后转移到28℃暗培养2天。(低温处理以利于种子萌发的一致性，同时低温处理以利于提高生长组织的分化率，时间可以自由调节，与后续的农杆菌培养的浓度达到一致。以在农杆菌最适的生长时期侵染茎尖，以提高转化的效率。)
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体为含有抗虫基因的植物表达载体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物表达载体为含有Cry1AC抗虫基因的植物表达载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，含有Cry1AC抗虫基因的植物表达载体的构建方法为：利用PCR扩增技术获得Cry1AC抗虫基因，利用限制性内切酶酶切切除P3301载体质粒中的GUS基因，用T4连接酶将Cry1Ac抗虫基因连接到酶切后的P3301载体质粒中，构建P3301-Cry1Ac抗虫植物表达载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述P3301-Cry1Ac抗虫植物表达载体的构建方法包括如下步骤：
(1)18-T-Cry1Ac载体用限制性内切酶NcoI和BstEII双酶切，电泳回收大片段；
(2)p3301载体用限制性内切酶NcoI和BstEII双酶切，电泳回收大片段；
(3)将步骤(2)电泳回收的线性化p3301载体和步骤(1)电泳回收的Cry1Ac片段用T4连接酶连接；
(4)将连接产物转化大肠杆菌DH5a，提取质粒，采用双酶切鉴定筛选阳性重组载体。(如图1所示，电泳图检测获得约560bp条带，载体P3301构建成功。)
8.权利要求1～7任一项所述的方法在制备转基因玉米中的应用。
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