CN107548605A - 一种板栗离体胚快速精准脱水方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种板栗离体胚快速精准脱水的方法，解决了顽拗性种子板栗种质资源长期保存过程中离体胚无法快速准确脱水的问题。本发明采集成熟板栗种子，经过清理、消毒之后，剥取离体胚，使用自制的快速脱水装置对离体胚进行脱水处理，测定不同脱水时间离体胚干重，最后用烘箱测定最终含水量，根据干重和含水量构建离体胚精准脱水曲线，建立板栗离体胚快速精准脱水方法。本发明的优点是:能够精准测定板栗离体胚致死含水量，有效提高离体胚脱水耐受性，延长离体胚超低温保存寿命。该方法可操作性强，简单实用，脱水速度快，含水量精准，对板栗等顽拗性种子种质资源保存具有重要的现实意义和良好的应用前景。

Description

一种板栗离体胚快速精准脱水方法

技术领域

本发明属于种子保存领域，特别涉及一种板栗离体胚快速精准脱水方法。

背景技术

板栗(Castanea mollissimaBl.)属于壳斗科栗属植物，是典型的顽拗性种子。板栗种子富含蛋白质、淀粉、微量元素、维生素等营养，具有较高食用和药用价值，素有“干果之王”、“铁杆庄稼”的美誉，是国家木本粮油战略实施的重要载体。我国板栗年产量195万吨，约占全球板栗总产量的84％，板栗种子是典型顽拗性种子，无法正常脱水和低温保存，这严重制约了板栗种质资源的长期保存和板栗产业发展。

短期贮藏板栗种子，主要使用沙藏和流水贮藏。沙藏：在通风的室内，将板栗种子与沙混合贮藏，或者在室外挖沙藏坑，将种子和湿沙按照一定比例沙藏。流水贮藏:用网兜等装种子，放于流水中保存。短期保存方法虽然能够在一定的时间内保持种子活力，但是受自然条件限制较大，微生物及鼠害虫害导致种子霉变和污染严重，保存效果欠佳。

目前，顽拗性种子板栗尚无有效的长期保存方法，最可能的保存方法是超低温(液氮)保存，但是超低温保存由于费用高、空间小，不可能保存种子，只能保存离体胚。由于板栗种子是典型的顽拗性种子，其离体胚不耐慢速脱水，临界安全含水量难以控制，容易导致脱水致死，因此找到一种快速精准的脱水方法，才能实现板栗种质资源的长期保存。

发明内容

为了克服上述不足，本发明提供了一种板栗离体胚快速精准脱水方法。解决板栗种质资源保存过程中离体胚脱水速度慢，含水量不可控制的问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种板栗离体胚快速精准脱水方法，包括：

对板栗进行预处理，得离体胚；

将离体胚试样置于密闭装置中在硅胶和风扇共同作用下进行脱水，测定不同脱水时间离体胚试样的含水量和最终的干重，绘制离体胚脱水曲线；

对目标离体胚进行脱水。

优选的，所述预处理包括：

(1)将采集的板栗种子进行消毒，擦拭干净后，置于阴凉通风处晾干；

(2)将消毒、晾干之后的板栗种子低温保存；

(3)从低温保存后的种子取出、剥离离体胚。

更优选的，步骤(1)中，所述消毒的具体步骤为用纱布擦拭干净，除去杂质并清洁表面，使用10％的次氯酸钠表面消毒3分钟；

更优选的，步骤(2)中，所述低温保存的具体步骤为将板栗种子放入大号自封袋中，置于2～4℃的冰箱中保存，每10天取出种子，使用医用纱布将种子表面的凝结水擦拭干净。

更优选的，步骤(3)中，所述离体胚的剥离的具体步骤为在铺有灭菌滤纸的培养皿中，戴手套剥去坚硬的外种皮，然后用灭菌的解剖刀将胚及部分子叶组织取下，用解剖刀和镊子逐层剥离子叶组织，取下完整的离体胚。

优选的，所述脱水的具体步骤为：脱水时间0分钟～85分钟但不包括0分钟，每5分钟测定1次重量，5个离体胚为1组，3组重复，对每个脱水时间的离体胚称重，最后将离体胚放入103℃的烘箱中17小时烘干，称干重。

本发明还提供了一种板栗离体胚快速精准脱水装置，包括：种子密封保存罐、硅胶、无极变速风扇、筛网、培养皿、金属盘；所述种子密封保存罐底部填充有硅胶，所述硅胶上部设置有筛网，筛网上设置有风扇，所述风扇上部设置有培养皿，所述培养皿中设置有盛放离体胚的金属盘。

优选的，所述装置含包括计时装置和称重装置。

优选的，所述风扇为直径9cm的无极变速风扇；

优选的，所述金属盘的直径为1cm。

本发明还提供了任一上述的板栗离体胚快速精准脱水装置在顽拗性种子离体胚脱水中的应用。

本发明的有益效果

(1)本发明通过板栗离体胚快速精准脱水技术，能够精准测定板栗离体胚致死含水量，有效提高顽拗性种子板栗离体胚脱水耐受性，延长离体胚超低温保存寿命，对顽拗性植物的种质资源长期保存具有重要的现实意义和良好的应用前景。

(2)本发明装置结构简单、脱水效率高、实用性强，易于推广。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1是硅胶+风扇脱水响应曲线图；

图2是硅胶脱水响应曲线图；

图3是自然脱水响应曲线图；

图4是本发明的装置结构图，其中，1种子保存罐、2硅胶、3筛网、4风扇、5金属盘、6培养皿、7金属盘、8离体胚。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

本发明实施例提供了一种板栗离体胚快速精准脱水方法。所述技术方案如下:

野外采集板栗种子，用纱布擦拭干净，除去杂质并清洁表面；

使用10％的次氯酸钠表面消毒3分钟，取出种子后用纱布擦拭干净，置于阴凉通风处晾干1小时；

将所述板栗种子置于2～4℃冷藏环境中保存备用；

取出25粒保存的板栗种子，使用烘箱分别测定种子和胚的含水量，烘干条件为103℃，17小时；

本发明自制一种快速精准脱水装置，主要包括：种子密封保存罐、硅胶、无极变速风扇(直径9cm)、筛网、培养皿、计时器、分析天平(精度0.1微克)、金属盘(直径1cm)；

所述快速精准脱水装置使用方法：将1瓶硅胶倒入搪瓷盘，103℃，干燥24小时，将干燥后的硅胶装入种子密封保存罐，在硅胶表面放上筛网，装入无极变速风扇，风扇上面放培养皿，培养皿中放入金属盘，离体胚放在金属盘中脱水，使用计时器计时，分析天平称重；

取出10粒保存完好的板栗种子，剥取离体胚，放入金属盘中；

使用上述的快速精准脱水装置，为离体胚轴快速脱水；

使用精度0.1微克的分析天平，将不同脱水时间的板栗离体胚称重；

将失水后的板栗离体胚放入烘箱中，103℃，17小时测定干重；

根据离体胚的鲜重和干重，计算离体胚含水量；

根据离体胚含水量和不同脱水时间离体胚重量，建立板栗离体胚精准脱水方法模型；

实施例1:

材料:本实例以山东省济南市历城区西营镇板栗种植园采集的板栗品种“烟泉”种子为实施对象；

本发明自制一种快速精准脱水装置，主要包括：种子密封保存罐、硅胶、无极变速风扇(直径9cm)、筛网、培养皿、计时器、分析天平(精度0.1微克)、金属盘(直径1cm)；

所述快速精准脱水装置使用方法：将1瓶硅胶倒入搪瓷盘，103℃，干燥24小时，将干燥后的硅胶装入种子密封保存罐，在硅胶表面放上筛网，装入无极变速风扇，风扇上面放培养皿，培养皿中放入金属盘，离体胚放在金属盘中脱水，使用计时器计时，分析天平称重；

步骤(1)：取材

9月下旬到10月初于西营镇板栗种植园采集板栗果实,果实表面为棕褐色，且表皮坚硬。

步骤(2)：材料消毒

将摘取的板栗成熟果实用毛刷清洁表面，然后用10％的次氯酸钠表面消毒3分钟，取出种子后用纱布擦拭干净，置于阴凉通风处晾干。

步骤(3)：种子初步保存

将消毒、晾干之后的板栗种子放入大号自封袋中，置于4℃的冰箱中保存，每10天取出种子，使用医用纱布将种子表面的凝结水擦拭干净。

步骤(4):离体胚的剥离

从冰箱中取出种子，置于铺有灭菌滤纸的培养皿中，戴手套剥去坚硬的外种皮，然后用灭菌的解剖刀将胚及部分子叶组织取下，用解剖刀逐渐剥离子叶组织，取下完整的离体胚。

步骤(5):离体胚的快速精准脱水

在20℃室内，称取离体胚鲜重S0，采用上述的快速精准脱水装置，为离体胚快速精准脱水，脱水时间0分钟～85分钟，每5分钟测定1次重量，5个离体胚为1组，3组重复，对每个脱水时间的离体胚称重S1，最后将离体胚放入103℃的烘箱中17小时烘干，称重S2。

步骤(6)：建立离体胚快速精准脱水模型

离体胚含水量W0(％)＝(S0-S2)/S0×100％，不同脱水时间离体胚含水量W1(％)＝[(S0-S2)/S0-(S0-S1)/S0]×100％。根据离体胚含水量和脱水时间的关系，构建离体胚快速精准脱水曲线，详见附图1。根据精准脱水曲线，对板栗离体胚实施精准脱水。

实施例2

一种板栗离体胚快速精准脱水装置，包括：种子密封保存罐1、硅胶2、无极变速风扇4、筛网3、培养皿6、金属盘5；所述种子密封保存罐1底部填充有硅胶2，所述硅胶2上部设置有筛网3，筛网3上设置有风扇4，所述风扇4上部设置有培养皿6，所述培养皿6中设置有盛放离体胚的金属盘5。

实施例3

一种板栗离体胚快速精准脱水装置，包括：种子密封保存罐1、硅胶2、无极变速风扇4、筛网3、培养皿6、金属盘5；所述种子密封保存罐1底部填充有硅胶2，所述硅胶2上部设置有筛网3，筛网3上设置有风扇4，所述风扇4上部设置有培养皿6，所述培养皿6中设置有盛放离体胚的金属盘5。

所述装置含包括计时装置和称重装置。

实施例4

一种板栗离体胚快速精准脱水装置，包括：种子密封保存罐1、硅胶2、无极变速风扇4、筛网3、培养皿6、金属盘5；所述种子密封保存罐1底部填充有硅胶2，所述硅胶2上部设置有筛网3，筛网3上设置有风扇4，所述风扇4上部设置有培养皿6，所述培养皿6中设置有盛放离体胚的金属盘5。

所述风扇4为直径9cm的无极变速风扇。

实施例5

一种板栗离体胚快速精准脱水装置，包括：种子密封保存罐1、硅胶2、无极变速风扇4、筛网3、培养皿6、金属盘5；所述种子密封保存罐1底部填充有硅胶2，所述硅胶2上部设置有筛网3，筛网3上设置有风扇4，所述风扇4上部设置有培养皿6，所述培养皿6中设置有盛放离体胚的金属盘5。

所述金属盘5的直径为1cm。

对比例1:

步骤(1)～(4)同实施例1。离体胚脱水方式，采用自然环境脱水，将离体胚放在金属盘上，置于20℃室内，5个离体胚为1组，3组重复，测定离体胚鲜重S0，对脱水0分钟～420分钟的离体胚，每30分钟测定1次离体胚重量S1，最后将离体胚放入103℃的烘箱中17小时烘干，称重S2。离体胚含水量测定同步骤(6)，根据离体胚含水量和脱水时间的关系，建立自然脱水含水量-脱水时间拟合曲线模型，详见附图2。

对比例2:

步骤(1)～(4)同实施例1。在20℃室内，剥取离体胚，测定离体胚鲜重S0，采用硅胶脱水，将离体胚放在金属盘上，放入实施例1所述的快速精准脱水装置，去掉内置风扇，仅用硅胶脱水，5个离体胚为1组，3组重复，对脱水0分钟～420分钟的离体胚，每30分钟测定1次离体胚重量S1，最后将离体胚放入103℃的烘箱中17小时烘干，称重S2。离体胚含水量测定同步骤(6)，根据离体胚含水量和脱水时间的关系，建立硅胶脱水含水量-脱水时间拟合曲线模型，详见附图3。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种板栗离体胚快速精准脱水方法，其特征在于，包括：

对板栗进行预处理，得离体胚；

将离体胚试样置于密闭装置中在硅胶和风扇共同作用下进行脱水，测定不同脱水时间离体胚试样的含水量和最终的干重，绘制离体胚脱水曲线；

对目标离体胚进行脱水。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预处理包括：

(1)将采集的板栗种子进行消毒，擦拭干净后，置于阴凉通风处晾干；

(2)将消毒、晾干之后的板栗种子低温保存；

(3)从低温保存后的种子取出、剥离离体胚。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消毒的具体步骤为用纱布擦拭干净，除去杂质并清洁表面，使用10％的次氯酸钠表面消毒3分钟。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述低温保存的具体步骤为将板栗种子放入大号自封袋中，置于2～4℃的冰箱中保存，每10天取出种子，使用医用纱布将种子表面的凝结水擦拭干净。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述离体胚的剥离的具体步骤为在铺有灭菌滤纸的培养皿中，戴手套剥去坚硬的外种皮，然后用灭菌的解剖刀将胚及部分子叶组织取下，用解剖刀和镊子逐层剥离子叶组织，取下完整的离体胚。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱水的具体步骤为：脱水时间0分钟～85分钟但不包括0分钟，每5分钟测定1次重量，5个离体胚为1组，3组重复，对每个脱水时间的离体胚称重，最后将离体胚放入103℃的烘箱中17小时烘干，称干重。

7.一种板栗离体胚快速精准脱水装置，其特征在于，包括：种子密封保存罐、硅胶、无极变速风扇、筛网、培养皿、金属盘；所述种子密封保存罐底部填充有硅胶，所述硅胶上部设置有筛网，筛网上设置有风扇，所述风扇上部设置有培养皿，所述培养皿中设置有盛放离体胚的金属盘。

8.如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述装置含包括计时装置和称重装置。

9.如权利要求7所述的装置，其特征在于，所述风扇为直径9cm的无极变速风扇；

或所述金属盘的直径为1cm。

10.权利要求7-9任一项所述的板栗离体胚快速精准脱水装置在顽拗性种子离体胚脱水中的应用。