CN114847275A - 一种铁皮石斛种子长期保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种铁皮石斛种子长期保存方法，具体涉及农业种子保存技术领域，包括以下具体步骤：步骤一、每年11月‑12月，采集颜色正常、饱满、成熟、无病虫害、未开裂的铁皮石斛蒴果，切除蒴果两端，蒴果表皮清洗；步骤二、在无菌超净工作台里，将上述步骤二中收集的蒴果浸泡在75％的酒精中，然后用无菌水冲洗3次，再利用消毒剂进行杀菌、消毒处理；步骤三、收集蒴果内种子，在低倍显微镜下进行种子活力检测，选择胚饱满的种子备用。本发明采用的铁皮石斛种子长期保存方法，操作简单，成本较低，种子活力较高，取出后不需要对种子解冻即可进行无菌播种，在铁皮石斛种苗繁育阶段及在资源保存研究上值得使用。
Description
技术领域
本发明涉及农业种子保存技术领域，具体涉及一种铁皮石斛种子长期保存方法。
背景技术
铁皮石斛是兰科植物石斛属珍稀药用植物，目前野生资源已呈濒危状态，只能由人工培育获取药材产品满足市场需求。人工培育的关键环节之一是种苗繁育，种苗的来源是用其上一年度采集的种子进行人工试管苗培养，因此种子的生活力和种子保存方法对种苗繁育至关重要。铁皮石斛的种子存在其蒴果中，成熟的朔果饱满，表皮绿中带黄，含有几万粒粉末状的种子。
目前，生产上的液氮超低温保存石斛种子的方法，都要对种子进行预处理，预处理方法主要有干燥法、快冻法、玻璃化法，这些方法成本较高，解冻后成活力不高。
因此，发明一种铁皮石斛种子长期保存方法来解决上述问题很有必要。
发明内容
本发明的目的是提供一种铁皮石斛种子长期保存方法，通过配制的饱和氯化锂溶液液体干燥剂和干燥器去除种子细胞中的水分，并通过将种子装在玻璃小管中，再将多个玻璃小管放置在玻璃容器中，形成双重密封，提高密封效果，使得本发明操作简单，成本较低，种子活力较高，取出后不需要对种子解冻即可进行无菌播种，在铁皮石斛种苗繁育阶段及在资源保存研究上值得使用，以解决技术中的上述不足之处。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种铁皮石斛种子长期保存方法，包括以下具体步骤：
步骤一、每年11月-12月，采集颜色正常、饱满、成熟、无病虫害、未开裂的铁皮石斛蒴果，切除蒴果两端，蒴果表皮清洗；
步骤二、在无菌超净工作台里，将上述步骤二中收集的蒴果浸泡在75％的酒精中，然后用无菌水冲洗3次，再利用消毒剂进行杀菌、消毒处理；
步骤三、收集蒴果内种子，在低倍显微镜下进行种子活力检测，选择胚饱满的种子备用；
步骤四、配置饱和氯化锂溶液液体干燥剂，把该干燥剂放于干燥器中，同时在干燥器内平铺铁皮石斛种子，用凡士林密封干燥4天；
步骤五、将干燥后的种子迅速转移并装满至密封的玻璃小管中；
步骤六、选择体积大于步骤五中玻璃小管体积的密闭容器，在该密闭容器中装入硅胶作为干燥指示器，然后同时放置4-5个装有种子的密封玻璃小管；
步骤七、在步骤六的玻璃容器表面粘贴标签，该标签上填写有种子相关信息，然后把该玻璃容器放置在温度在零下20℃的冰箱中长期保存。
优选的，在步骤二中，种子浸泡在75％的酒精中的时间为1分钟，所使用的消毒剂为10％次氯酸钠、0.1％氯化汞、0.1％氯化汞与吐温20按照比例10000∶1的混合溶液中的一种，其中，使用10％次氯酸钠时需要浸泡15 分钟，使用0.1％氯化汞时需要浸泡7分钟，使用0.1％氯化汞与吐温20按照比例10000∶1的混合溶液需要浸泡7分钟。
优选的，在步骤七中，标签上的种子相关信息包括种子来源、种子采收时间、种子采收地点、种子消毒处理方式、种子干燥处理方式、干燥时间、保存时间；长期保存阶段中，每年进行一次种子活力检测，淘汰没有活力的种子，具体操作为：在低倍显微镜下观测种子胚的发育情况，如种胚发育饱满的种子，留下继续使用。
优选的，在步骤一中挑选无病虫害的铁皮石斛蒴果的方法为：观察铁皮石斛植株叶片是否枯萎、观察铁皮石斛植株的叶片与茎枝是否出现褐色或灰色病斑、观察铁皮石斛植株叶片的边缘以及背面是否出现幼虫；在挑选的过程中，一旦发现铁皮石斛植株上出现上述三种情况之一，则说明该铁皮石斛蒴果存在病虫害，需要将其剔除。
优选的，在步骤四中饱和氯化锂溶液液体干燥剂的配制步骤如下所示：以配制1L饱和氯化锂溶液液体干燥剂为例：
S1、称量84.8g氯化锂；
S2、溶解：在烧杯中加入乙醇溶解氯化锂；
S3、恢复至室温转移：将烧杯内冷却后的溶液沿玻璃棒小心转入1L 的容量瓶中，玻璃棒下端应靠在容量瓶刻度线以下；
S4、洗涤：用乙醇洗涤烧杯和玻璃棒2-3次，并将洗涤液转入容器中，振荡，使溶液混合均匀；
S5、定容：向容量瓶中加乙醇至刻度线以下1cm-2cm处时，改用胶头滴管加乙醇，使溶液凹面恰好与刻度线相切；
S6、摇匀：盖好瓶塞，用食指顶住瓶塞，另一只手的手指托住瓶底，反复上下颠倒，使溶液混合均匀，最后将配制好的溶液倒入试剂瓶中，贴好标签，即得饱和氯化锂溶液液体干燥剂。
在上述技术方案中，本发明提供的技术效果和优点：
通过利用配置的饱和氯化锂溶液液体干燥剂和干燥器去除种子细胞中的水分，并将种子密封在一个干燥的玻璃小管中，以防止在零下20℃的条件下种子细胞中的水分在细胞内形成冰晶使细胞膜受损而造成细胞死亡，并通过将种子装在玻璃小管中，再将多个玻璃小管放置在玻璃容器中，形成双重密封，提高密封效果，与现有技术相比，本发明采用的铁皮石斛种子长期保存方法，操作简单，成本较低，种子活力较高，取出后不需要对种子解冻即可进行无菌播种，在铁皮石斛种苗繁育阶段及在资源保存研究上值得使用。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供了一种铁皮石斛种子长期保存方法，包括以下具体步骤：
步骤一、每年11月，采集颜色正常、饱满、成熟、无病虫害、未开裂的铁皮石斛蒴果，切除蒴果两端，蒴果表皮清洗；挑选无病虫害的铁皮石斛蒴果的方法为：观察铁皮石斛植株叶片是否枯萎、观察铁皮石斛植株的叶片与茎枝是否出现褐色或灰色病斑、观察铁皮石斛植株叶片的边缘以及背面是否出现幼虫；在挑选的过程中，一旦发现铁皮石斛植株上出现上述三种情况之一，则说明该铁皮石斛蒴果存在病虫害，需要将其剔除；
步骤二、在无菌超净工作台里，将上述步骤二中收集的蒴果浸泡在75％的酒精中，时间为1分钟，然后用无菌水冲洗3次，再利用消毒剂进行杀菌、消毒处理，其中，所使用的消毒剂为10％次氯酸钠，使用时将种子浸泡在10％次氯酸钠中15分钟即可；
步骤三、收集蒴果内种子，在低倍显微镜下进行种子活力检测，选择胚饱满的种子备用；
步骤四、配置饱和氯化锂溶液液体干燥剂，把该干燥剂放于干燥器中，同时在干燥器内平铺铁皮石斛种子，用凡士林密封干燥4天；
其中，饱和氯化锂溶液液体干燥剂的配制步骤如下所示：以配制1L饱和氯化锂溶液液体干燥剂为例：
S1、称量84.8g氯化锂；
S2、溶解：在烧杯中加入乙醇溶解氯化锂；
S3、恢复至室温转移：将烧杯内冷却后的溶液沿玻璃棒小心转入1L 的容量瓶中，玻璃棒下端应靠在容量瓶刻度线以下；
S4、洗涤：用乙醇洗涤烧杯和玻璃棒2次，并将洗涤液转入容器中，振荡，使溶液混合均匀；
S5、定容：向容量瓶中加乙醇至刻度线以下1cm处时，改用胶头滴管加乙醇，使溶液凹面恰好与刻度线相切；
S6、摇匀：盖好瓶塞，用食指顶住瓶塞，另一只手的手指托住瓶底，反复上下颠倒，使溶液混合均匀，最后将配制好的溶液倒入试剂瓶中，贴好标签，即得饱和氯化锂溶液液体干燥剂；
步骤五、将干燥后的种子迅速转移并装满至密封的玻璃小管中；
步骤六、选择体积大于步骤五中玻璃小管体积的密闭容器，在该密闭容器中装入硅胶作为干燥指示器，然后同时放置4个装有种子的密封玻璃小管；
步骤七、在步骤六的玻璃容器表面粘贴标签，该标签上填写有种子相关信息，包括种子来源、种子采收时间、种子采收地点、种子消毒处理方式、种子干燥处理方式、干燥时间、保存时间等信息，然后把该玻璃容器放置在温度在零下20℃的冰箱中长期保存，长期保存阶段中，每年进行一次种子活力检测，淘汰没有活力的种子，具体操作为：在低倍显微镜下观测种子胚的发育情况，如种胚发育饱满的种子，留下继续使用。
实施例2
本发明提供了一种铁皮石斛种子长期保存方法，包括以下具体步骤：
步骤一、每年12月，采集颜色正常、饱满、成熟、无病虫害、未开裂的铁皮石斛蒴果，切除蒴果两端，蒴果表皮清洗，其中，挑选无病虫害的铁皮石斛蒴果的方法为：观察铁皮石斛植株叶片是否枯萎、观察铁皮石斛植株的叶片与茎枝是否出现褐色或灰色病斑、观察铁皮石斛植株叶片的边缘以及背面是否出现幼虫；在挑选的过程中，一旦发现铁皮石斛植株上出现上述三种情况之一，则说明该铁皮石斛蒴果存在病虫害，需要将其剔除；
步骤二、在无菌超净工作台里，将上述步骤二中收集的蒴果浸泡在75％的酒精中1分钟，然后用无菌水冲洗3次，再利用消毒剂进行杀菌、消毒处理，所使用的消毒剂为0.1％氯化汞与吐温20按照比例10000∶1的混合溶液，使用时，将种子浸泡在0.1％氯化汞与吐温20按照比例10000∶1的混合溶液中7分钟；
步骤三、收集蒴果内种子，在低倍显微镜下进行种子活力检测，选择胚饱满的种子备用；
步骤四、配置饱和氯化锂溶液液体干燥剂，把该干燥剂放于干燥器中，同时在干燥器内平铺铁皮石斛种子，用凡士林密封干燥4天；
其中，饱和氯化锂溶液液体干燥剂的配制步骤如下所示：以配制1L饱和氯化锂溶液液体干燥剂为例：
S1、称量84.8g氯化锂；
S2、溶解：在烧杯中加入乙醇溶解氯化锂；
S3、恢复至室温转移：将烧杯内冷却后的溶液沿玻璃棒小心转入1L 的容量瓶中，玻璃棒下端应靠在容量瓶刻度线以下；
S4、洗涤：用乙醇洗涤烧杯和玻璃棒3次，并将洗涤液转入容器中，振荡，使溶液混合均匀；
S5、定容：向容量瓶中加乙醇至刻度线以下2cm处时，改用胶头滴管加乙醇，使溶液凹面恰好与刻度线相切；
S6、摇匀：盖好瓶塞，用食指顶住瓶塞，另一只手的手指托住瓶底，反复上下颠倒，使溶液混合均匀，最后将配制好的溶液倒入试剂瓶中，贴好标签，即得饱和氯化锂溶液液体干燥剂；
步骤五、将干燥后的种子迅速转移并装满至密封的玻璃小管中；
步骤六、选择体积大于步骤五中玻璃小管体积的密闭容器，在该密闭容器中装入硅胶作为干燥指示器，然后同时放置5个装有种子的密封玻璃小管；
步骤七、在步骤六的玻璃容器表面粘贴标签，该标签上填写有种子相关信息，包括种子来源、种子采收时间、种子采收地点、种子消毒处理方式、种子干燥处理方式、干燥时间、保存时间等信息；然后把该玻璃容器放置在温度在零下20℃的冰箱中长期保存，长期保存阶段中，每年进行一次种子活力检测，淘汰没有活力的种子，具体操作为：在低倍显微镜下观测种子胚的发育情况，如种胚发育饱满的种子，留下继续使用。
实施例3
选取100颗种子均分为2组，将2组种子分别按照上述实施例1和实施例2中的方式进行保存一个月，然后再选取同样的种子50颗作为对照，采用市面上的液氮超低温保存方法(具体为：将果实消毒后，取出种子置培养皿中无菌滤纸上，在培养皿中放20克变色硅胶，脱水时间为24小时，然后将脱水后的种子密封于冷冻管中，直接投入液氮中保存)保存一个月；然后分别将种子取出，对照例中还需要将种子放置在40℃的水浴中进行解冻，然后对上述三组种子进行种子活力检测并比较保存所花费的成本，统计结果如下表所示。
其中，在检测种子活力时，通过将种子接种在真菌纯培养的树叶上，然后在45天时统计发芽率，利用该发芽率表示种子的活力情况。
| 样本 | 发芽率 | 保存成本与对照组的比值 | 保存后是否需要解冻 |
| 实施例1 | 98％ | 0.8 | 否 |
| 实施例2 | 95％ | 0.7 | 否 |
| 对照组 | 82％ | 1 | 是 |
由上述表格可以直接看出，实施例1和实施例2中采用了本发明所提供的铁皮石斛种子的发芽率均高于对照组，说明采用本发明的保存方法保存的种子的活力更高，而且实施例1和实施例2中保存所花费的成本也都小于对照组，说明采用本发明的保存方法具有更高的经济价值，而且本发明中的实施例1和实施例2在取出后都不需要进行解冻操作，能够立即使用，节约了现有技术中解冻操作所花费的时间成本和经济成本。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
Claims (7)
1.一种铁皮石斛种子长期保存方法，其特征在于：包括以下具体步骤：
步骤一、每年11月-12月，采集颜色正常、饱满、成熟、无病虫害、未开裂的铁皮石斛蒴果，切除蒴果两端，蒴果表皮清洗；
步骤二、在无菌超净工作台里，将上述步骤二中收集的蒴果浸泡在75％的酒精中，然后用无菌水冲洗3次，再利用消毒剂进行杀菌、消毒处理；
步骤三、收集蒴果内种子，在低倍显微镜下进行种子活力检测，选择胚饱满的种子备用；
步骤四、配置饱和氯化锂溶液液体干燥剂，把该干燥剂放于干燥器中，同时在干燥器内平铺铁皮石斛种子，用凡士林密封干燥4天；
步骤五、将干燥后的种子迅速转移并装满至密封的玻璃小管中；
步骤六、选择体积大于步骤五中玻璃小管体积的密闭容器，在该密闭容器中装入硅胶作为干燥指示器，然后同时放置4-5个装有种子的密封玻璃小管；
步骤七、在步骤六的玻璃容器表面粘贴标签，该标签上填写有种子相关信息，然后把该玻璃容器放置在温度在零下20℃的冰箱中长期保存。
2.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛种子长期保存方法，其特征在于：在步骤二中，种子浸泡在75％的酒精中的时间为1分钟。
3.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛种子长期保存方法，其特征在于：在步骤二中所使用的消毒剂为10％次氯酸钠、0.1％氯化汞、0.1％氯化汞与吐温20按照比例10000:1的混合溶液中的一种，其中，使用10％次氯酸钠时需要浸泡15分钟，使用0.1％氯化汞时需要浸泡7分钟，使用0.1％氯化汞与吐温20按照比例10000:1的混合溶液需要浸泡7分钟。
4.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛种子长期保存方法，其特征在于：在步骤七中，标签上的种子相关信息包括种子来源、种子采收时间、种子采收地点、种子消毒处理方式、种子干燥处理方式、干燥时间、保存时间。
5.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛种子长期保存方法，其特征在于：在步骤七的长期保存阶段中，每年进行一次种子活力检测，淘汰没有活力的种子，具体操作为：在低倍显微镜下观测种子胚的发育情况，如种胚发育饱满的种子，留下继续使用。
6.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛种子长期保存方法，其特征在于：在步骤一中挑选无病虫害的铁皮石斛蒴果的方法为：观察铁皮石斛植株叶片是否枯萎、观察铁皮石斛植株的叶片与茎枝是否出现褐色或灰色病斑、观察铁皮石斛植株叶片的边缘以及背面是否出现幼虫；在挑选的过程中，一旦发现铁皮石斛植株上出现上述三种情况之一，则说明该铁皮石斛蒴果存在病虫害，需要将其剔除。
7.根据权利要求1所述的一种铁皮石斛种子长期保存方法，其特征在于：在步骤四中饱和氯化锂溶液液体干燥剂的配制步骤如下所示：以配制1L饱和氯化锂溶液液体干燥剂为例：
S1、称量84.8g氯化锂；
S2、溶解：在烧杯中加入乙醇溶解氯化锂；
S3、恢复至室温转移：将烧杯内冷却后的溶液沿玻璃棒小心转入1L的容量瓶中，玻璃棒下端应靠在容量瓶刻度线以下；
S4、洗涤：用乙醇洗涤烧杯和玻璃棒2-3次，并将洗涤液转入容器中，振荡，使溶液混合均匀；
S5、定容：向容量瓶中加乙醇至刻度线以下1cm-2cm处时，改用胶头滴管加乙醇，使溶液凹面恰好与刻度线相切；
S6、摇匀：盖好瓶塞，用食指顶住瓶塞，另一只手的手指托住瓶底，反复上下颠倒，使溶液混合均匀，最后将配制好的溶液倒入试剂瓶中，贴好标签，即得饱和氯化锂溶液液体干燥剂。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115428614A (zh) * | 2022-10-19 | 2022-12-06 | 湖北崇杰农业发展股份有限公司 | 一种黄精种子预处理方法 |
| CN115606361A (zh) * | 2022-10-27 | 2023-01-17 | 云南省农业科学院药用植物研究所 | 一种铁皮石斛种子贮存方法 |
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| CN103918418A (zh) * | 2014-04-15 | 2014-07-16 | 高辉 | 铁皮石斛种子的保藏装置及其保藏方法 |
| CN105746037A (zh) * | 2016-03-13 | 2016-07-13 | 贵州省亚热带作物研究所 | 一种铁皮石斛种子保存方法 |
| CN106717266A (zh) * | 2016-12-09 | 2017-05-31 | 浙江大学 | 铁皮石斛蒴果/种子的长期保存方法 |
-
2022
- 2022-06-13 CN CN202210663726.8A patent/CN114847275A/zh active Pending
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