CN115606361A - 一种铁皮石斛种子贮存方法 - Google Patents

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董志渊
杨丽英
胡明举
丛琨
石亚娜
石瑶
袁理春
王家金
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Institute of Medicinal Plants Yunnan Academy of Agricultural Sciences
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01C—PLANTING; SOWING; FERTILISING
    • A01C1/00—Apparatus, or methods of use thereof, for testing or treating seed, roots, or the like, prior to sowing or planting

Abstract

本发明涉及种子保存技术领域，具体是一种铁皮石斛种子贮存方法，本发明不需要用液氮冷冻，通过将消毒后的铁皮石斛种子用干燥器干燥，然后再在4‑25℃贮存，可有效延长种子的贮存期，且贮存后6个月后的种子仍能保持较好活性，本发明可降低铁皮石斛种子的储存成本和储存难度。

Description

一种铁皮石斛种子贮存方法
技术领域
本发明属于种子保存技术领域，具体的说，涉及一种铁皮石斛种子贮存方法。
背景技术
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科石斛属附生植物，以干燥茎入药，为我国的传统药材，味甘，微寒，具益胃生津，滋阴清热等功效。铁皮石斛药材长期依赖野生资源，导致资源日渐枯竭， 20世纪90年代以来，铁皮石斛人工栽培技术逐步成熟，采用种子无菌萌发技术，成功实现种苗规模化生产。
由于铁皮石斛蒴果完全成熟时易开裂，种子暴露在空气中，不方便外植体消毒，目前生产中一般采用随采随播的方式，即消毒处理成熟未开裂蒴果，切取种子进行无菌播种。
石斛新鲜种子含水量较高（30-40%），生理代谢活动较旺盛，采摘后如果不及时播种，直接长时间储存，种子易失去活性。由于铁皮石斛种子细小，一个蒴果含有上万粒种子，非常适合采用超低温保存技术进行贮存。将种子存放在-196℃液氮超低温环境中，几乎可完全停止种子生命代谢活动，从而达到长期储存的目的。相关研究表明，经干燥处理24ｈ的铁皮石斛种子在液氮(-196℃)中保存60、90 d，种子活力显著高于常温、４℃及-20℃下的种子活力，而种子常温（25℃）保存90 d，种子活力下降明显，萌发率仅为33.80％；4℃下保存90天，种子活性降低至52.21%。张治国等研究发现铁皮石斛种子含水量降到 8.21%，其萌发率与未脱水的种子萌发率相近，而种子含水量8.21 % -18.79 %时，液氮冷冻贮存萌发率与正常种子没有明显差别。王君晖等研究发现铁皮石斛种子含水量为 8%-19%时, 液氮超低温保存后种子的存活率可达95%。但液氮保存石斛种子中，冻存和化冻两个过程，易发生细胞损伤，影响种子活性，往往需要添加PVS2等保护剂进行预处理，增强种子的超低温耐性。这无形中增加了液氮储存石斛种子的难度和成本。此外，研究也发现液氮储存的石斛种子，萌发期会延长7-10 d。关于超低温贮存前后细胞生理生化变化规律仍不清楚。
对于石斛种苗生产企业，超低温贮存需要具备专门液氮存贮设备及相应种子贮存操作技术，推广应用难度较大，生产中急需一种有效简便的种子贮存技术方法，以满足石斛种子中短期贮存需要。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供一种铁皮石斛种子贮存方法，通过在无菌条件下控制干燥湿度，降低石斛种子含水量，不需要冷冻即可有效延长石斛种子的保存期，且所得种子保存时间可达6个月以上，贮存后种子活力90.00%以上。本发明的技术降低了石斛种子的保存成本和技术难度，满足了种苗生产企业对铁皮石斛种子中短期贮存的需要。
为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
一种铁皮石斛种子贮存方法，包括以下步骤：
（1）无菌条件下，用吸水剂脱水干燥种子至含水量3.00-7.00%；
（2）将脱水干燥后的种子，在无菌环境中转入无菌的冻存管中，密封贮存。
进一步，步骤（1）中，干燥过程中环境湿度1-3%RH，干燥温度20-25℃。
进一步，步骤（2）中，密封贮存温度为4-25℃。
进一步，步骤（1）中，无菌环境中，消毒灭菌处理后蒴果，切取种子，放入已灭菌的带除菌过滤膜的培养盒中进行吸水干燥。
进一步，所述的灭菌种子来源于采收饱满、未开裂，果皮黄绿色的蒴果。
进一步，所述吸水剂为变色硅胶或氯化钙。
本发明的有益效果：
本发明通过在无菌条件下控制干燥湿度，降低石斛种子含水量，不需要冷冻即可延长石斛种子的保存期，且所得种子保存时间可达6个月以上，贮存后的种子存活率达90.00%以上，降低了石斛种子的保存成本和技术难度。
附图说明
图1是铁皮石斛蒴果和种子形态；
图2是TTC染色法检测铁皮石斛种子活力图片；
图中，1为铁皮石斛蒴果；2为铁皮石斛种子（光学显微）；3为铁皮石斛种子（扫描电镜）；1和2中小方格边长为1 mm。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的说明，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下多获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了更清楚说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。
实施例1
铁皮石斛种子贮存方法，包括以下步骤：
（1）每年3-4月铁皮石斛开花期，人工授粉，当年10-11月，授粉后约210 d，采收饱满、未开裂，果皮黄绿色的蒴果。
（2）超净工作台上，采用10%次氯酸钠溶液消毒处理蒴果30 min，无菌水清洗3次，切开6个蒴果，取出种子，放入已灭菌的带除菌过滤膜的培养盒中混匀。
（3）将3个培养盒放入干燥器中，采用硅胶进行种子脱水干燥处理，环境湿度控制在3%RH以下，干燥温度25℃，每500 g变色硅胶约脱水干燥处理18个铁皮石斛蒴果的种子，持续脱水处理至96 h，取出约0.20 g种子，测含水量为3.59%。
（4）将干燥种子在超净工作台上，快速转入无菌的冻存管中密封，环境温度4℃条件下贮存。
（5）种子贮存150 d后，测得种子活力为90.43%。
通常，种子含水量越低，贮存种子的寿命越长。当种子含水量小于5%时，称为种子超干贮存。但不同植物的种子耐脱水性存在较大差异。当种子含水量低于该植物的安全含水量下限，会发生种子的损伤。本发明通过研究发现，将含水量为3.59%的石斛种子在4℃储存150天，仍能保持高活性。
相对于现有技术，常规种子保存90天后活力仅为52.21%的情况，本发明技术处理后石斛种子的超干保存显然延长了种子的保存期。
在本发明中，种子的干燥环境湿度和干燥温度需同时保证。
种子含水量检测方法：
种子含水量测定采用高恒温烘干法，130℃鼓风干燥1 h 。
种子水分含量 =（M2-M3) ÷ (M2-M1) ×100%
其中M1表示种子和铝盒盖的重量(g)，M2表示铝盒和铝盒盖及种子的烘干前重量（g），M3表示铝盒和铝盒盖及种子烘干后的重量（g）。
种子活力检测方法：
采用0.3% H2O2 浸泡处理种子30 min， 蒸馏水清洗3次，1％ TTC（2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑），环境温度30℃，黑暗条件染色24 h，显微镜检测种子染色情况。胚染为红色的为具活力的种子，不染色、染色浅的以及胚为没有活力的种子。
种子活力 =（胚染为红色的种子数目 ÷ 具胚的种子数目）× 100%。
本发明将种子干燥选择在干燥器中，采用吸水剂降低环境湿度进行种子脱水。与热风干燥法比较，可降低种子脱水速率，避免种子干燥过快，影响种子活性，且在干燥器中干燥，使种子在较低温度下干燥，较好保持种子的活性。
实施例2
铁皮石斛种子贮存方法，包括以下步骤：
（1）每年3-4月铁皮石斛开花期，人工授粉，当年10-11月，授粉后约210 d，采收饱满、未开裂，果皮黄绿色的蒴果。
（2）超净工作台上，采用10%次氯酸钠溶液消毒处理蒴果30 min，无菌水清洗3次，切开6个蒴果，取出种子，放入已灭菌的带除菌过滤膜的培养盒中。
（3）将3个培养盒放入干燥器中，采用硅胶进行种子脱水干燥处理，硅胶质量为500g，环境湿度3%RH以下，将种子含水量降至6.81%。
（4）将脱水干燥后的种子，超净工作台上，转入无菌的冻存管中密封，环境温度25℃条件下贮存。
（5）种子贮存贮存180 d，种子活力为91.24%。
实施例3
铁皮石斛种子贮存方法，包括以下步骤：
（1）每年3-4月铁皮石斛开花期，人工授粉，当年10-11月，授粉后约210 d，采收饱满、未开裂，果皮黄绿色的蒴果。
（2）超净工作台上，采用10%次氯酸钠溶液消毒处理蒴果30 min，无菌水清洗3次，切开6个蒴果，取出种子，放入已灭菌的带除菌过滤膜的培养盒中。
（3）将3个培养盒放入干燥器中，采用硅胶进行种子脱水干燥处理，硅胶质量为500g，环境湿度3%RH以下，将种子含水量降至6.81%。
（4）将脱水干燥后的种子，超净工作台上，转入无菌的冻存管中密封。
（5）将步骤（4）的种子分为四批，分别在25℃、4℃、-80℃、-196℃（液氮）的温度下贮存180d，然后检测种子活性，检测结果如下表。
表1 不同贮存环境温度的种子活力
贮存环境温度（℃） 种子活力（%）
25 91.24
4 93.33
-80 90.96
-196 96.56
经检测，本发明将石斛种子水分降低至6.81%后，在常温下保存种子仍能有较高活性。
备注：本发明未作特殊说明时，所述百分含量均为质量百分含量。
最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种铁皮石斛种子贮存方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）无菌条件下，用吸水剂脱水干燥种子至含水量3.00-7.00%；
（2）将脱水干燥后的种子，在无菌环境中转入无菌的冻存管中，密封贮存。
2.根据权利要求1所述的铁皮石斛种子贮存方法，其特征在于，步骤（1）中，干燥过程中环境湿度控制在1-3%RH，干燥温度20-25℃。
3.根据权利要求1所述的铁皮石斛种子贮存方法，其特征在于，步骤（2）中，密封贮存温度为4-25℃。
4.根据权利要求1至3任一项所述的铁皮石斛种子贮存方法，其特征在于，步骤（1）中，无菌环境中，消毒灭菌处理后蒴果，切取种子，放入已灭菌的带除菌过滤膜的培养盒中进行吸水干燥。
5.根据权利要求4所述的铁皮石斛种子贮存方法，其特征在于，所述的灭菌种子来源于采收饱满、未开裂，果皮黄绿色的蒴果。
6.根据权利要求1所述的铁皮石斛种子贮存方法，其特征在于，所述吸水剂为变色硅胶或氯化钙。
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张治国 等: "铁皮石斛种子的超低温保存研究", 《安徽中医学院学报》, vol. 16, no. 5, pages 40 - 41 *
耿丽霞: "铁皮石斛试管开花、种子保存及杂交种鉴定的研究", 《《南京师范大学硕士学位论文》》, pages 24 *

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