CN105154343A - 一种简易的稻曲菌分离和保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及稻曲菌分离和保存技术领域，具体为一种简易的稻曲菌分离和保存方法。其分离方法包括以下步骤：从发病的稻田中采集新鲜的黄色、绿色和黑色的稻曲球样本，室温干燥7-10d备用；从采集的样本中挑选厚垣孢子粉覆盖厚度大于1mm的稻曲球放在超净工作台上，用紫外灯杀菌30-40min；在无菌条件下用镊子取单粒稻曲球，轻轻震落稻曲球表面上少量的厚垣孢子粉末于PSA培养基上；用移液枪取150-200ul无菌水滴在含有厚垣孢子的PSA平板上等等步骤。利用本发明的方法可以快速的分离到目的菌株并保存，解决了稻曲菌在分离时耗时、效率低的问题，同时也解决了菌株在保存过程中致病性退化、耗占空间等问题。
Description
技术领域
本发明涉及稻曲菌分离和保存技术领域，具体为一种简易的稻曲菌分离和保存方法。
背景技术
水稻稻曲病（Ricefalsesmut）是由稻曲菌（Villosiclavavirens(Nakata)E.Tanaka&C.Tanaka）引起的一种重要的真菌病害，病菌侵染穗部后形成大于谷粒数倍的稻曲球，其表面覆盖大量粉状的黄色或墨绿色的厚垣孢子。稻曲球不但严重威胁水稻的产量和质量，且能产生对人和牲畜有剧毒作用的真菌毒素(Koisoetal.,1994;Lietal.,1995)。近些年，随着水稻的N肥料使用量增加、杂交稻的大面积的推广，稻曲病的发生严重度日益增加，在发病严重的年份，导致的产量损失可高达50%。
国内外研究者普遍认为稻曲菌的厚垣孢子和菌核是稻曲病发生的初侵染源，两者通过萌发产生薄壁分生孢子直接侵染水稻。在有关稻曲病人工接种技术研究中，采用分生孢子进行注射和喷雾法接种效果更好(伏荣桃等，2015)，因此，在这些研究中成功分离和保存稻曲菌菌株是试验成功的一个重点。稻曲菌寄生性强，腐生性弱的特点，使得分离材料稻曲球上寄生着许多其它的细菌和真菌，同时病菌在人工培养基上生长极其缓慢，因此在分离培养过程中极易被其它细菌和真菌污染(Fuetal.,2013;王永强等，2010)。
近些年来，研究者们已陆续对稻曲病原菌的分离方法进行了研究，大多采用厚垣孢子悬浮液法、稻曲球不同层组织块分离法、菌核培养法等分离方法(周永力，1999；刘明霞等，2009)。以上这些方法都比较耗时，分离的成功率往往较低，且不同的报道的分离方法又有许多不一致的方面。此外，稻曲菌的室内保存方法，目前还尚未见报道。
发明内容
本发明针对以上技术问题，提供种一种简易的稻曲菌分离和保存方法，利用本发明的方法可以快速的分离到目的菌株并保存，解决了稻曲菌在分离时耗时、效率低的问题，同时也解决了菌株在保存过程中致病性退化、耗占空间等问题。
本发明的技术方案为：
一种简易的稻曲菌分离和保存方法，该方法包括以下步骤：
1）稻曲菌菌株分离：
从发病的稻田中采集新鲜的黄色、绿色、黑色的稻曲球样本，室温干燥7-10d备用。从采集的样本中挑选厚垣孢子粉覆盖厚度大于1mm的稻曲球放在超净工作台上，用紫外灯杀菌30-40min；在无菌条件下用镊子取单粒稻曲球，轻轻震落稻曲球表面上少量的厚垣孢子粉末于PSA培养基上；用移液枪取150-200ul无菌水滴在含有厚垣孢子的PSA平板上，并用无菌的玻璃L棒将厚垣孢子均匀涂在平板上；将涂抹的平板用封口膜封口然后倒置放在28℃培养箱中，培养4-5天；用无菌解剖针挑取单个白色的或黄色的单菌落于PSA培养基上纯化培养。
2）稻曲菌菌株保存：
无菌滤纸准备：将圆形滤纸剪成5-6mm的方形小块，装入玻璃瓶中在121℃下高温湿热灭菌20min，然后放入干燥烘箱中烘干至含水量小于5%、备用。
将分离纯化的稻曲菌菌株转到XBZ培养基上培养5-7d；在无菌条件下用镊子把滤纸小块放在培养有稻曲菌的XBZ上，每个培养皿放入6-7个滤纸小块；将培养皿继续放入28℃培养箱中12h光暗交替培养4-5周，直到滤纸上长有稻曲菌黄色的厚垣孢子堆；无菌条件下取出粘有黄色厚垣孢子的滤纸块，放在超净工作台上风干至含水量小于5%；将风干的滤纸块放入无菌的4×7cm长方形保存纸袋中，透明胶布封口；将装有滤纸块的保存袋放在无菌的牛皮纸袋中，且放入20-30粒硅胶干燥剂颗粒，封口；再将牛皮纸袋放入-20℃冰箱中保存备用。
3）保存菌株的活性检测
菌株保存于-20℃冰箱后，每隔1个月在无菌条件下挑取粘有厚垣孢子滤纸片，将滤纸片上的厚垣孢子震落在XBZ培养基上；用移液枪取150ul无菌水滴在含有厚垣孢子的XBZ平板上，并用无菌的玻璃L棒将厚垣孢子均匀涂在平板上；将涂抹的平板用封口膜封口然后倒置放在28℃培养箱中，暗培养4-5天，观察厚垣孢子单菌落的生长情况。
由于绿色和黑色的稻曲球样本用于本申请中，其分离成功率较低，所以优选采用黄色的稻曲球标样。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
（一）、分离样本稻曲球直接用紫外光杀菌，而没用消毒剂处理，消除了消毒剂对厚垣孢子伤害作用；直接选用黄色的稻曲球作为分离样本，黄色的厚垣孢子萌发能力强于绿色和黑色等其它颜色的厚垣孢子；本发明提供的分离方法步骤简单，易操作，不宜受细菌污染，可重复性强，适合大数量范围的稻曲菌菌株分离。
(二)、本发明提供的保存菌株方法，保存时间可达2年以上，占用空间少，适用于大数量的菌株资源保存；避免了用平板法或斜面法保存菌株每隔3-4月就会继代一次，因稻曲菌随着继代次数的增加，产孢能力和致病能力就会逐渐减弱，导致保存的菌株失去原有的生物活性。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
实施例1：
供式培养基：
分离稻曲菌的PSA培养基：马铃薯300g、蔗糖15g、琼脂10g、蒸馏水定溶至1000mL，在121℃下高温湿热灭菌40min，待培养基冷却到不烫手的温度45±3℃时加入抑制杂菌生长氯霉素100μgml-1混匀，倒入培养皿中备用。
保存稻曲菌的XBZ培养基：马铃薯300g、蔗糖20g、Na2HPO4·12H2O2g、Ca(NO3)2·4H2O0.5g、蛋白胨5g、琼脂10g、蒸馏水定溶至1000mL，在121℃下高温湿热灭菌30min，冷却备用。
1）稻曲菌菌株的分离和纯化
(1)稻曲菌菌株的分离：2012年8月中旬从四川发病的稻田中采集新鲜的黄色稻曲球样本228个，室温干燥7-10d备用。从采集的样本中挑选厚垣孢子粉覆盖厚度大于1mm的稻曲球放在超净工作台上，用紫外灯杀菌30min；在无菌条件下用镊子取单粒稻曲球，轻轻震落稻曲球表面上少量的厚垣孢子粉末于PSA培养基上；用移液枪取150ul无菌水滴在含有厚垣孢子的PSA平板上，并用无菌的玻璃L棒将厚垣孢子均匀涂在平板上；将涂抹的平板用封口膜封口然后倒置放在28℃培养箱中，培养4-5天；用无菌解剖针挑取单个白色的或黄色的单菌落于PSA培养基上培养15d。实验证明通过以上方法分离稻曲菌菌株的成功率可达100%。
(2)稻曲菌菌株纯化：挑取培养好的稻曲菌菌丝片，用长有气生菌丝的一面与PSA平板表面摩擦画线，不断稀释菌丝表面产生的分生孢子直至能长出单个菌落，然后放置平板于28℃培养箱中，暗培养4-5天。
2)稻曲菌菌株保存：
无菌滤纸准备：将圆形滤纸剪成5-6mm的方形小块，装入玻璃瓶中在121℃下高温湿热灭菌20min，然后放入干燥烘箱中烘干至含水量小于5%、备用。
挑取上述纯化后的单菌落于XBZ固体培养基上培养5-7d；在无菌条件下用镊子把滤纸小块放在培养有稻曲菌的XBZ固体培养基上培养上，每个培养皿放入6-7个滤纸小块；将培养皿继续放入28℃培养箱中，12h光暗交替培养4周，直到滤纸上长有黄色的稻曲菌厚垣孢子堆；无菌条件下取出粘有黄色厚垣孢子的滤纸块，放在超净工作台上风干至含水量小于5%；将风干的滤纸块放入无菌的4×6cm长方形保存纸袋中，透明胶布封口；将装有滤纸块的保存袋放在无菌的牛皮纸袋中，且放入20-30粒硅胶干燥剂颗粒，封口；再将牛皮纸袋放入-20℃冰箱中保存备用。
3）保存菌株的活性检测
菌株保存于-20℃冰箱后，每隔1个月在无菌条件下挑取粘有厚垣孢子滤纸片，将滤纸片上的厚垣孢子震落在XBZ培养基上；用移液枪取150ul无菌水滴在含有厚垣孢子的XBZ平板上，并用无菌的玻璃L棒将厚垣孢子均匀涂在平板上；将涂抹的平板用封口膜封口然后倒置放在28℃培养箱中，暗培养4-5天，观察厚垣孢子单菌落的生长情况；此活性检测一直持续到2015年9份，结果发现保存在-20℃的厚垣孢子一直存在萌发力；因此表明此方法保存时间可达3年以上。
实施例2：
供式培养基：
分离稻曲菌的PSA培养基：马铃薯300g、蔗糖15g、琼脂10g、蒸馏水定溶至1000mL，在121℃下高温湿热灭菌40min，待培养基冷却到不烫手的温度45±3℃时加入抑制杂菌生长氯霉素100μgml-1混匀，倒入培养皿中备用。
保存稻曲菌的XBZ培养基：马铃薯300g、蔗糖20g、Na2HPO4·12H2O2g、Ca(NO3)2·4H2O0.5g、蛋白胨5g、琼脂10g、蒸馏水定溶至1000mL，在121℃下高温湿热灭菌30min，冷却备用。
1）稻曲菌菌株的分离和纯化
(1)稻曲菌菌株的分离：2013年8月中旬从四川发病的稻田中采集新鲜的黄色稻曲球样本230个，室温干燥7-10d备用。从采集的样本中挑选厚垣孢子粉覆盖厚度大于1mm的稻曲球放在超净工作台上，用紫外灯杀菌30min；在无菌条件下用镊子取单粒稻曲球，轻轻震落稻曲球表面上少量的厚垣孢子粉末于PSA培养基上；用移液枪取150ul无菌水滴在含有厚垣孢子的PSA平板上，并用无菌的玻璃L棒将厚垣孢子均匀涂在平板上；将涂抹的平板用封口膜封口然后倒置放在28℃培养箱中，培养4-5天；用无菌解剖针挑取单个白色的或黄色的单菌落于PSA培养基上培养15d。实验证明通过以上方法分离稻曲菌菌株的成功率可达100%。
(2)稻曲菌菌株纯化：挑取培养好的稻曲菌菌丝片，用长有气生菌丝的一面与PSA平板表面摩擦画线，不断稀释菌丝表面产生的分生孢子直至能长出单个菌落，然后放置平板于28℃培养箱中，暗培养4-5天。
2)稻曲菌菌株保存：
无菌滤纸准备：将圆形滤纸剪成5-6mm的方形小块，装入玻璃瓶中在121℃下高温湿热灭菌20min，然后放入干燥烘箱中烘干至含水量小于5%、备用。
挑取上述纯化后的单菌落于XBZ固体培养基上培养5-7d；在无菌条件下用镊子把滤纸小块放在培养有稻曲菌的XBZ固体培养基上培养上，每个培养皿放入6-7个滤纸小块；将培养皿继续放入28℃培养箱中，12h光暗交替培养4周，直到滤纸上长有黄色的稻曲菌厚垣孢子堆；无菌条件下取出粘有黄色厚垣孢子的滤纸块，放在超净工作台上风干至含水量小于5%；将风干的滤纸块放入无菌的4×6cm长方形保存纸袋中，透明胶布封口；将装有滤纸块的保存袋放在无菌的牛皮纸袋中，且放入20-30粒硅胶干燥剂颗粒，封口；再将牛皮纸袋放入-20℃冰箱中保存备用。
3）保存菌株的活性检测
菌株保存于-20℃冰箱后，每隔1个月在无菌条件下挑取粘有厚垣孢子滤纸片，将滤纸片上的厚垣孢子震落在XBZ培养基上；用移液枪取150ul无菌水滴在含有厚垣孢子的XBZ平板上，并用无菌的玻璃L棒将厚垣孢子均匀涂在平板上；将涂抹的平板用封口膜封口然后倒置放在28℃培养箱中，暗培养4-5天，观察厚垣孢子单菌落的生长情况；活性检测试验一直持续到2015年9份，结果发现保存在-20℃的厚垣孢子一直存在萌发力；因此表明此方法保存时间可达2年以上。
Claims (3)
1.一种简易的稻曲菌分离和保存方法，其特征在于包括以下步骤：
1）稻曲菌菌株分离：
从发病的稻田中采集新鲜的黄色、绿色、黑色的稻曲球样本，室温干燥7-10d备用；从采集的样本中挑选厚垣孢子粉覆盖厚度大于1mm的稻曲球放在超净工作台上，用紫外灯杀菌30-40min；在无菌条件下用镊子取单粒稻曲球，轻轻震落稻曲球表面上少量的厚垣孢子粉末于PSA培养基上；用移液枪取150-200ul无菌水滴在含有厚垣孢子的PSA平板上，并用无菌的玻璃L棒将厚垣孢子均匀涂在平板上；将涂抹的平板用封口膜封口然后倒置放在28℃培养箱中，培养4-5天；用无菌解剖针挑取单个白色的或黄色的单菌落于PSA培养基上纯化培养；
2）稻曲菌菌株保存：
无菌滤纸准备：将圆形滤纸剪成5-6mm的方形小块，装入玻璃瓶中在121℃下高温湿热灭菌20min，然后放入50℃干燥烘箱中烘干直至含水量小于5%、备用；将分离纯化的稻曲菌菌株转到XBZ培养基上培养5-7d；在无菌条件下用镊子把滤纸小块放在培养有稻曲菌的XBZ培养基上，每个培养皿放入6-7个滤纸小块；将培养皿继续放入28℃培养箱中12h光暗交替培养4-5周，直到滤纸上长有黄色的稻曲菌厚垣孢子堆；无菌条件下取出粘有黄色厚垣孢子的滤纸块，放在超净工作台上风干至含水量小于5%；将风干的滤纸块放入无菌的4×7cm长方形保存纸袋中，透明胶布封口；将装有滤纸块的保存袋放在无菌的牛皮纸袋中，且放入20-30粒硅胶干燥剂颗粒，封口；再将牛皮纸袋放入-20℃冰箱中保存备用。
2.根据权利要求1所述的简易的稻曲菌分离和保存方法，其特征在于：所述的PSA培养基为：取马铃薯300g、蔗糖15g、琼脂10g、用蒸馏水定溶至1000mL，在121℃下高温湿热灭菌40min，待培养基冷却到45±3℃时加入抑制杂菌生长的氯霉素100-150μgml-1混匀，倒入培养皿中备用。
3.根据权利要求1所述的简易的稻曲菌分离和保存方法，其特征在于：所述的XBZ培养基为：取马铃薯300g、蔗糖20g、Na2HPO4·12H2O2g、Ca(NO3)2·4H2O0.5g、蛋白胨5g、琼脂10g、蒸馏水定溶至1000mL，在121℃下高温湿热灭菌30min，冷却备用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |