CN111226794A - 枫香属植物体胚培养成苗的方法及枫香属植物的繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种枫香属植物体细胞胚胎(简称体胚)培养成苗的方法及枫香属植物繁殖方法，属于林木组培技术领域，该成苗方法对枫香属植物的成熟体胚进行液体培养(体胚的液体悬浮萌发培养、浸润式萌发培养)。采用本发明方法对枫香属植物的成熟体胚进行液体培养，促使枫香属植物成熟体胚在液体培养基中迅速萌发，形成无菌体胚苗，可以在短时间内利用生物反应器生产大量的体胚苗。本发明方法的成苗效率高，操作方法简便，出苗整齐一致、移栽成活率较高，便于养护管理。整个生产过程能节约人力，降低成本，且可以不受季节限制，持续获得再生植株，特别适用于枫香苗木产业化生产。

Description

枫香属植物体胚培养成苗的方法及枫香属植物的繁殖方法

技术领域

本发明涉及一种植物组织培养的方法，特别涉及枫香属植物成熟体细胞胚胎(简称体胚)经过液体悬浮培养成成苗的方法，属于林业行业中的林木组培技术领域。

背景技术

枫香属(Liquidambar spp.)树种是世界性重要林业资源，特别是枫香(L.formosana)和北美枫香(L.styraciflua)，二者具有较高经济价值、观赏价值和生态价值，且二者杂交获得的杂交枫香具有杂种优势。

枫香属离体器官再生繁殖方法的研究众多。在诸多无性离体繁殖方法中，体胚技术具有彻底幼化，繁殖效率高等特点，因此受到广泛重视。近年来，Sommer和Brown利用北美枫香胚轴切段进行体胚诱导，随后美国佐治亚大学Merkle团队分别用北美枫香和杂交枫香未成熟胚和花序成功建立了北美枫香和杂交枫香体胚发生体系，完成对胚性愈伤组织的悬浮培养，以及胚胎同步化发育的研究(Merkle,Neu et al.1998；Vendrame,Holliday etal.2001；Merkle,Battle et al.2003)。

枫香属植物的体胚可以在固体培养基上成熟(Merkle,Battle et al.2003)，也可以在液体培养基里成熟(Kong,Zhang et al.2019)。植物的液体培养具有很多优点，是工业化生产中不可或缺的方法。液体培养基制作及液体培养技术过程相对简单。需要较少的人工同时也会省去购买培养基固化剂的成本。在放置植物材料时，过程相对简单，人工较少。植物的液体培养还有一个极大的优势，就是可以使用生物反应器，从而能极大的提高生产效率，降低成本。

虽然枫香属离体器官再生繁殖方法的研究众多，而且在众多的无性离体繁殖方法的研究中，都着重研究体胚技术的彻底幼化和体胚的高效率繁殖，然而枫香属植物的成熟体胚都必须在固体萌发培养基上经过固体培养，萌发长成无菌小苗。萌发培养基的固化是因为添加了培养基固化剂，如植物凝胶，褐藻胶等。在制备固体培养基时，需要在其冷却凝固前倒入容器(如培养皿，培养瓶)中。待培养基冷却凝固后，将植物体胚均匀地放置在固体培养基上。固体萌发培养由于操作过程较复杂，需要较多的人工，同时污染的机率也较大，导致枫香属植物组培无菌小苗萌发率低；另外在固体培养基上成熟体胚再分化、生根形成的组培苗容易根部相连，不利于体胚苗的移栽、分离；而且固体培养过程中接种的体胚少，不能大量、快速繁殖，不利于工业化生产。

由于现有的固体、半固体培养转化成苗的方法培养步骤较多，且不能使用生物反应器，因而需要较多的人工。同时制作固体培养基的过程较复杂，培养基凝固剂的质量难以控制，而影响培养基质量。另外，培养基凝固剂的使用必然增加生产成本。

枫香属植物成熟体胚液体培养成苗的方法之前未见报道。这是因为植物液体培养成苗时，体胚不易萌发且萌发的小苗极易玻璃化，而玻璃化的小苗成活率非常低。所以一般液体培养只用于胚胎萌发的前期处理，作用是让胚胎吸水伸长，这种处理一般用浸润式生物反应器进行。吸水伸长后胚胎的后续萌发转化成苗过程，还需要在固体萌发培养基上进行。在植物组织培养中，液体悬浮培养成苗的方法极为少见，这是因为在悬浮培养的过程中，很多种植物的小苗易受到培养过程中的物理性损伤。

发明内容

本发明的目的是针对现有枫香属植物的组织培养快速繁殖方法中存在枫香属植物成熟体胚(即成熟体细胞胚胎)需要在固体萌发培养基上进行萌发，培养成体胚苗，且在固体萌发培养基上培养成体胚苗的过程中存在操作过程复杂，需要耗费大量人力，同时容易造成污染，导致枫香属植物组培无菌小苗萌发率低等技术缺陷，本发明提供一种枫香属植物成熟体胚培养成苗的方法，本发明方法促进枫香属植物成熟体胚转化成苗，成熟体胚萌发率高，污染小，体胚苗成活率高，降低了生产成本，体胚苗生产量高，而且枫香属植物的体胚萌发能进行同步化处理，出苗整齐一致、操作方法简便，再生周期短，繁殖系数高，移栽成活率高，便于养护管理，节约人力及土地资源，生产成本低，不受季节限制持续获得再生植株，特别适用于枫香苗木产业化生产。

为实现本发明的目的，本发明一方面(1)提供一种枫香属植物成熟体胚培养成苗的方法，将枫香属植物的成熟体胚接种于体胚液体萌发培养基中，进行液体培养。

其中，所述枫香属植物为枫香、北美枫香或杂交枫香。

特别是，所述杂交枫香为(北美枫香×枫香)。

其中，所述液体培养为对枫香属植物的成熟体胚进行液体悬浮培养(suspensionculture)、液体浸润式培养(liquid diffusion culture)或液体间歇性浸没式培养(temporary immersion culture)。

所述液体悬浮培养是将枫香属植物的成熟体胚接种于液体培养基中，体胚浸没并悬浮在液体培养基中的培养，获得成熟的体胚苗；在悬浮培养时，植物材料(成熟体胚)悬浮在液体培养基内，且随培养基在容器内一同运动。例如摇床摇动，使得液体培养基与悬浮在其内部的成熟体胚一起转动。

所述液体浸润式培养为将枫香属植物的成熟体胚接种于生物反应器的支撑面上，用液体培养基浸润培养，获得成熟的体胚苗。在浸润式培养时，植物材料(成熟体胚)放置在浸没于液体培养基中的支撑面上，植物材料的底部或下部与液体培养基接触，且植物材料在支撑面上的位置不发生变化或尽量不变化。

特别是，所述体胚液体萌发培养基为体胚液体萌发培养基，其中所述体胚液体萌发培养基为改良Blaydes基本培养基+蔗糖10-60g/L，优选为改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L。

尤其是，所述液体悬浮培养的培养条件为：(25±2)℃条件下，暗培养。

特别是，所述液体悬浮培养过程中控制培养基转动，且转速为100-120转/分钟。

尤其是，液体悬浮培养时间为5-8周。

尤其是，所述液体悬浮培养过程中，控制接种量为每100mL体胚液体萌发培养基中接种(2-6)g成熟体细胞胚胎，优选为4g/100mL。

特别是，还包括将液体悬浮培养5-8周后的体胚苗转移至固体成苗培养基中进行成苗光培养，其中成苗光培养的温度为(25±2)℃；光周期为16h光照/8h黑暗；光照强度为1500-2000Lux。

特别是，所述液体悬浮培养的培养条件为：(25±2)℃条件下，光照。

尤其是，所述液体悬浮培养过程中控制光照的光周期为(16-10h)光照/(8-14h)黑暗，优选为16h光照/8h黑暗。

特别是，所述液体悬浮培养过程中控制光照的光照强度为1500-2000Lux。

特别是，在光照条件下的液体悬浮培养过程中控制每1000mL容量的反应器内的通气量为每分钟通入50-400mL空气，并且每1000mL的反应器内含有100-500mL体胚液体萌发培养基。

尤其是，在光照条件下的液体悬浮培养过程中控制每1000mL的反应器内的通气量为每分钟通入100-200mL空气，并且每1000mL的反应器内含有200-400mL体胚液体萌发培养基。

特别是，每1000mL容量的反应器内含有100-500mL体胚液体萌发培养基，优选为200-400mL体胚液体萌发培养基。

尤其是，所述液体悬浮培养过程中，控制接种量为每100mL体胚液体萌发培养基中接种(2-6)g成熟体细胞胚胎，优选为4g/100mL。

特别是，所述液体浸润培养的培养条件为：(25±2)℃条件下，光照。

尤其是，所述液体浸润培养过程中控制光照的光周期为(16-10h)光照/(8-14h)黑暗，优选为16h光照/8h黑暗；控制光照的光照强度为1500-2000Lux。

特别是，在液体浸润培养过程中将枫香属植物成熟体胚置于浸没在液体培养基中的支撑面上，植物材料的底部或下部与液体培养基接触，且植物材料在支撑面上的位置不发生变化或尽量不变化。

通过控制液体培养基液面的高度，体胚不被液体培养基淹没，对体胚进行液体浸润式培养；体胚的下部或体胚全部被液体培养基淹没，对体胚进行液体浸没式培养。

本发明另一方面(2)提供一种枫香属植物成熟体胚培养成苗的方法，将枫香属植物的成熟体胚接种于体胚液体萌发培养基中，在黑暗条件下进行液体悬浮培养。

其中，所述液体悬浮培养为枫香属植物的成熟体胚悬浮在所述的体胚液体萌发培养基，成熟体胚萌发，形成初期体胚苗。所述体胚液体萌发培养基为改良Blaydes基本培养基+蔗糖10-60g/L，优选为改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L。

特别是，所述液体悬浮培养的培养温度为(25±2)℃。

尤其是，在进行所述液体悬浮培养过程中，将接种成熟体胚后的体胚液体萌发培养基置于摇床上进行所述液体悬浮培养，其中控制转速为100-120转/min。

特别是，所述液体悬浮培养过程中，控制接种量为每100mL体胚液体萌发培养基中接种(2-6)g成熟体细胞胚胎，优选为4g/100mL。

尤其是，液体悬浮培养时间为5-8周。

特别是，还包括将液体悬浮培养5-8周后的体胚苗转移至固体成苗培养基中进行成苗光培养，其中成苗光培养的温度为(25±2)℃；光周期为(10-16)光照/(8-14h)黑暗；光照强度为1500-2000Lux。

尤其是，所述成苗光培养的光周期优选为16h光照/8h黑暗。

本发明又一方面(3)提供一种枫香属植物成熟体胚培养成苗的方法，将枫香属植物的成熟体胚接种于体胚液体萌发培养基中，在光照条件下进行液体悬浮培养。

其中，所述液体悬浮培养为枫香属植物的成熟体胚悬浮在所述的体胚液体萌发培养基中，成熟体胚萌发，形成体胚苗。

特别是，所述液体悬浮培养的培养温度为(25±2)℃；且悬浮培养过程中控制每1000mL容量的反应器内的通气量为每分钟通入50-400mL空气，并且每1000mL容量的反应器内含有100-500mL体胚液体萌发培养基。

尤其是，悬浮培养过程中控制每1000mL容量的反应器内的通气量为每分钟通入100-200mL空气，并且每1000mL容量的反应器内含有200-400mL体胚液体萌发培养基。

特别是，采用气动式生物反应器进行所述的液体悬浮培养，其中控制每1000mL容量的反应器内的通气量为每分钟通入50-400mL空气，并且每1000mL容量的反应器内含有100-500mL体胚液体萌发培养基；优选为100-200mL空气/min。

尤其是，所述液体悬浮培养过程中，控制接种量为每100mL体胚液体萌发培养基中接种(2-6)g成熟体细胞胚胎，优选为4g/100mL。

特别是，所述液体悬浮培养过程中控制光周期为(10-16)光照/(8-14h)黑暗，优选为16h光照/8h黑暗。

尤其是，所述液体悬浮培养过程中控制光照强度为1500-2000Lux。

本发明再一方面(4)提供一种枫香属植物成熟体胚培养成苗的方法，将枫香属植物的成熟体胚接种于体胚液体萌发培养基中，在光照条件下进行液体浸润培养。

其中，所述液体浸润培养时，植物材料(即成熟体胚)被置放在充满液体培养基的支撑面上，支撑面浸没于液体培养基中，植物材料的底部或下部与液体培养基接触或部分浸没在液体培养基中，且植物材料在支撑面上的位置不发生变化或尽量不变化。

液体浸润培养为枫香属植物的成熟体胚置于浸没在体胚液体萌发培养基中的支撑面上，体胚液体萌发培养基的浸润/浸没成熟体胚，体胚萌发形成体胚苗。

特别是，所述液体浸润培养的培养温度为(25±2)℃；且浸润培养过程中控制光周期为(16-10h)光照/(8-14h)黑暗，优选为16h光照/8h黑暗。

特别是，所述液体浸润培养过程中，控制接种量为每100平方厘米培养支撑面上接种(1-4)g成熟体细胞胚胎，优选为2g/100平方厘米。

其中，所述液体浸润培养过程中控制光照强度为1500-2000Lux。

特别是，采用浸没式生物反应器进行所述的液体浸润培养，其中通过控制液面的高度，来确定浸润式(植物材料不被淹没)或浸没式(植物材料部分或全部被淹没)培养。

浸没式生物反应器选择授权公告号为CN209420590U，发明名称为：一种势能驱动间歇浸没式生物反应器的中国实用新型专利所公开的生物反应器，除此之外，其他植物组培浸没式的生物反应器均适用于本发明。

本发明又一方面(5)提供一种枫香属植物的繁殖方法，包括对枫香属植物的成熟体胚或萌发阶段的体胚进行液体成苗培养。

特别是，还包括将液体培养后的体胚苗移栽至硬化无土栽培基质培养基中，进行硬化培养。

其中，所述硬化培养的培养条件为：温度为28-35℃，相对湿度为(90±10)％。

特别是，无土栽培基质硬化培养基为草炭、蛭石、珍珠岩，其中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为3:1:1(v:v:v)。

尤其是，硬化培养时间为1-3周，优选为2周。

特别是，将硬化培养后的体胚苗转移至温室内，进行温室培养，获得成熟完整的植株苗。

本发明再一方面提供一种枫香属植物的繁殖方法，包括如下步骤：

A)将灭菌的杂交枫香的外植体接种到诱导培养基上，进行胚性组织诱导培养；

B)将诱导培养获得的胚性愈伤组织接种到增殖培养基上，进行胚性愈伤组织增殖培养；

C)将增殖培养后的胚性愈伤组织接种到体胚发生培养基上，进行体胚发生培养，获得未成熟体胚；

D)将具有未成熟体胚的愈伤组织接种到体胚液体成熟培养基中，进行体胚液体成熟培养，获得成熟体胚；

E)将成熟体胚接种到体胚液体萌发培养基中，进行液体培养，获得体胚苗；

F)对体胚苗进行炼苗，温室培养，移栽。

其中，所述液体培养为对枫香属植物的成熟体细胞胚胎进行液体悬浮培养或液体浸润式培养。

特别是，所述液体浸润培养过程中，控制体胚液体萌发培养基的交换次数为0-2次/天，优选为1-2次/天，进一步优选为1次/天；或者控制交换次数为1次/2-4天。

所述浸润式培养是通过控制液体培养基的液面的高度，使得植物材料(枫香属植物成熟体胚)不被液体培养基淹没，即植物材料部分浸没在液体培养基中，一部分突出在液体培养基外面。

即通过控制液体培养基液面的高度来确定浸润式(植物材料不被淹没)或浸没式(植物材料部分或全部被淹没)培养。一般在前期(1-3周)采用浸润式培养，之后用短期浸没式培养以减少植物材料在培养盒内位置的变化。

与现有枫香属植物的组织培养繁殖方法相比，本发明具有如下优点：

1、本发明方法克服了现有枫香属植物体细胞胚胎只能固体培养萌发成无菌小苗的技术缺陷，本发明方法将成熟体胚直接进行液体培养，获得大量无菌体胚苗，体胚苗成活率高。

2、采用本发明的液体培养方法，能高效生产大量无菌体胚苗,即在更短的时间里生产更多的体胚苗，进而提供更多的造林用枫香苗。

3、采用本发明方法显著降低了枫香属植物繁殖的生产成本。

4、采用本发明的液体培养方法，使得枫香属植物的体胚萌发能进行同步化处理，使体胚发育能更加同步，便于后续的培养和管理。

5、采用本发明的枫香属树种的体胚液体培养成苗方法能促使枫香属植物体胚在液体培养基内或其上正常萌发。本发明的液体培养成苗的方法能与生物反应器连用，在较短时间内生产大量的枫香体胚萌发小苗。本发明省略了一些常规培养步骤，方法简便，节约人力，同时避免在体胚萌发培养基中使用培养基固化剂，降低了生产成本，体胚萌发小苗的移栽成活率较高。本发明适用于枫香苗木产业化生产。

附图说明

图1A为杂交枫香的固体成熟培养的成熟体胚；

图1B为杂交枫香的液体成熟培养的成熟体胚；

图2为杂交枫香的成熟体胚经液体悬浮暗培养(三角瓶，摇床)的萌发状况；

图3A为杂交枫香的成熟体胚经液体悬浮光培养(气动式生物反应器)萌发初期状况；

图3B为杂交枫香的成熟体胚经液体悬浮光培养(气动式生物反应器)后的萌发的体胚苗状况；

图3C为杂交枫香的成熟体胚经气动式生物反应器培养转化成的不同尺寸的体胚幼苗；

图4为杂交枫香的成熟体胚经液体浸润光培养(浸没式生物反应器)的萌发状况；

图5为杂交枫香液体培养体胚苗的硬化和温室培养，其中A：硬化处理实验；B：硬化后温室生长中的体胚小苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

一、试验方法

本发明实施例参照下列已发表学术论文中的方法：W.A.Vendrame·C.P.Holliday·S.A.Merkle等，Clonal propagation of hybrid sweetgum(Liquidambarstyraciflua×L.formosana)by somatic embryogenesis，Plant Cell Rep(2001)20:691–695。

二、试验材料

1、杂交枫香未成熟种子

本发明以杂交枫香(北美枫香为母本，枫香优树为父本)的未成熟种子为外植体实验材料。

于每年6,7月，采集杂交枫香(北美枫香×枫香)未成熟的球形蒴果，从中取出种子，作为外植体材料。

2、植物生长调节剂

本发明中所使用的植物生长调节剂采用6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)。

3、培养基

(1)改良的Blaydes培养基(Merkle et al.,1998)

表1改良Blaydes培养基的配方

改良的Blaydes培养基为基本培养基，根据配制培养基的体积，向去离子水中依次加入所需的大量元素母液、微量元素母液和有机成分母液成分和称量好的植物凝胶、蔗糖、水解酪蛋白，pH调整至5.8。在温度121℃下恒温灭菌15分钟。

改良的Blaydes培养基基本配方参考：Merkle SA,Neu KA,Battle PJ,BaileyRL.1998.Somatic embryogenesis and plantlet regeneration from immature andmature tissues of sweetgum(Liquidambar styraciflua).Plant Science 132:169-178.

(2)诱导培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 1-4mg/L+6-BA 0-2mg/L。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(3)继代培养基：改良Blaydes基本培养基+水解酪蛋白1g/L+蔗糖40g/L+植物凝胶0.5-3％+2,4-D 0.5-2mg/L+6-BA0-1mg/L。调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(4)体胚发生培养基、体胚固体成熟培养基：改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶3％，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(5)体胚液体成熟培养基：改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(6)体胚固体萌发培养基：改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶3％，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

(7)体胚液体萌发培养基：改良Blaydes基本培养基+蔗糖10-60g/L，优选为改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L，调节pH值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

4、培养条件

(1)胚性组织的诱导培养、继代培养、增殖固体培养的培养条件：黑暗条件，培养温度(25±2)℃。

(2)胚性组织增殖液体培养的培养条件：三角瓶，黑暗条件，培养温度(25±2)℃，摇床(100-120转/分)。

(3)体胚发生、固体成熟培养：置于(25±2)℃条件下，暗培养。

(4)体胚液体成熟培养：三角瓶，置于(25±2)℃条件下，暗培养，摇床(100-120转/分)。

(5)体胚液体悬浮培养：三角瓶/培养瓶/生物反应器，置于(25±2)℃条件下，暗培养，摇床(100-120转/分)。

(6)体胚液体浸润培养：培养盒/培养瓶/生物反应器，置于(25±2)℃条件下，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1500-2000Lux；培养时间为6-8周。

实施例2

1、外植体的灭菌、胚性愈伤组织诱导、继代增殖培养

参照W.A.Vendrame·C.P.Holliday·S.A.Merkle等，Clonal propagation ofhybrid sweetgum(Liquidambar styraciflua×L.formosana)by somaticembryogenesis，Plant Cell Rep(2001)20:691–695)的方法进行外植体的灭菌和胚性愈伤组织诱导培养。

外植体未成熟合子胚在诱导培养基上培养3-4周后，胚性组织的生长速度开始变慢且外植体开始褐化，此时将胚性组织选出进行胚性组织继代增殖培养，转至继代培养基上于黑暗条件、(25±2)℃下进行重复继代增殖培养(每3周继代培养一次)。

2、体胚发生培养

将继代增殖培养的杂交枫香胚性组织接种到体胚发生培养基上，在黑暗条件下进行体胚的发生培养，其中，培养温度为(25±2)℃，体胚发生培养基为改良的Blaydes培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶3g/L。

杂交枫香在体胚发生培养过程中，在增殖愈伤组织上形成未成熟体胚(即从初步发育的球形胚到未成熟子叶胚中任何发育阶段的体胚)，体胚发生培养2个月(通常为1至4个月)后，获得具有初步发育体胚的愈伤组织，即胚性愈伤组织在体胚发生培养基上培养，转化成在肉眼下表面呈白色或淡黄色，体视镜下可以观察到大量微小的位于球形胚或/和心形胚发育阶段的初期体胚(即未成熟体胚，优选为“球形体胚、心形体胚和鱼雷形胚”)。

外植体的灭菌、胚性愈伤组织诱导、继代增殖培养、体胚发生培养、按照中国发明专利申请“申请号：201910776425.4；发明名称：一种促进枫香属植物体胚成熟的液体悬浮培养方法”进行处理，具体操作与该专利的具体实施方式的实施例2相同。

3、体胚固体成熟培养：

将体胚发生培养后的具有初步发育体胚的愈伤组织接种到体胚固体成熟培养基中，在黑暗条件下进行体胚的固体成熟培养，其中，培养温度为(25±2)℃，体胚固体成熟培养基为改良的Blaydes培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶3g/L。

体胚固体成熟培养约4周(通常为3-6周)后，多数体细胞胚胎发育成具有两片子叶的成熟胚胎。在体胚固体成熟培养基上成熟的众多体细胞胚胎中，其发育阶段和大小常常不等(如图1A)。

实施例2A1、外植体的灭菌、胚性愈伤组织诱导、继代增殖培养

与实施例2的步骤1)相同。

2、体胚发生培养

与实施例2的步骤2)相同。

3、体胚液体成熟培养：

将在体胚发生培养基上培养得到的初期体胚(即未成熟体胚，优选为“初期球形、心形体胚、鱼雷型胚”)的胚性愈伤组织选出，接种于体胚液体成熟培养基中，体胚液体成熟培养基置于三角锥形瓶内，接种量为每100ml体胚成熟液体培养基中接种2g(通常为1-5g/100ml)，在摇床上进行体胚的悬浮液体成熟培养。杂交枫香体胚的液体成熟培养在黑暗条件下进行，培养温度为(25±2)℃，每分钟100-120转，体胚液体成熟培养基为改良的Blaydes培养基+蔗糖40g/L。

杂交枫香体胚液体成熟培养4-8周后获得成熟体胚(即成熟胚或后期子叶胚)，观察体胚的生长状况和形态，成熟体胚体积增大，体积数倍至数十倍于球形胚和心形胚，每个成熟体胚具有两片发育良好的子叶，成熟体胚在液体培养基中呈独立、分散状态(如图1B)。

通常，枫香体胚液体成熟培养过程中每3-4周更换新培养基，进行继代培养，以提供充足的营养成分以保证体胚的持续生长、成熟。成熟体胚的体积比接种时的初期幼小体胚显著增大，成熟体胚具有两片发育良好的子叶，如图1B。

外植体的灭菌、胚性愈伤组织诱导、继代增殖培养、体胚发生培养、体胚液体成熟培养按照中国发明专利申请“申请号：201910776425.4；发明名称：一种促进枫香属植物体胚成熟的液体悬浮培养方法”进行处理。

实施例3A枫香成熟体胚的液体悬浮培养

杂交枫香的成熟体胚在液体悬浮暗培养中(三角瓶，摇床)萌发,光下成苗

将实施例2中在体胚固体成熟培养基上培养成熟的体胚(如图1A)接种于装有体胚液体萌发培养基的三角培养瓶内，接种量为每100ml体胚液体萌发培养基中接种4g(通常为2-6g/100ml)成熟体胚，在摇床上进行体胚的液体悬浮萌发培养，其中液体悬浮萌发培养在黑暗条件下进行，培养温度为(25±2)℃，每分钟100-120转；体胚液体萌发培养基为改良的Blaydes培养基+蔗糖40g/L。

体胚液体悬浮萌发培养5-8周后，杂交枫香植物体胚的下胚轴明显伸长，具有明显的根部和茎尖生长点，获得萌发体胚苗。由于是暗培养，萌发体胚苗整个植株呈乳白色，植株长度不等，长度大约为1～3厘米，无真叶形成(如图2)。每个三角瓶可产生多到500-800个萌发的体胚苗。

将巳萌发的体胚小苗再转到培养瓶中的固体成苗培养基上，进行光培养(25±2℃，光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1500-2000Lux)。固体成苗培养基为改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L+植物凝胶3％。

体胚小苗在光下很快变绿，培养2-3周后形成具有两个活跃生长端的体胚苗，有显著的真叶生长。组培苗的培养共需要6～8周，成苗的效率在90％以上。长成的无菌小苗再移到温室进行硬化处理和温室培养。

实施例3B枫香成熟体胚的液体悬浮培养

将实施例2或2A中在体胚固体或者液体培养基上培养成熟的成熟体胚接种于装有体胚液体萌发培养基的气动式生物反应器反应瓶内，进行液体悬浮萌发培养。在容量为1000ml的气动生物反应器内，加入300mL(通常为100-500mL，优选为200～400mL)液体萌发培养基。成熟体胚的接种量为每100ml液体萌发培养基中接种2g成熟体胚(通常2-6g/100ml)；每1000mL容量的气动生物反应器的通气量为150ml/min(通常为50-400ml/min，优选为200-400ml/min),以保证植物材料能在液体培养基里均匀地运转为准。气动式生物反应器置于25±2℃，光周期为16h光照/8h黑暗(通常为(10-16)h光照/(8-14)h黑暗)，光照强度为1500-2000Lux条件下培养，体胚液体萌发培养基为改良的Blaydes培养基+蔗糖40g/L。

成熟胚胎在液体萌发培养基里生长萌发，下胚轴伸长生长，出现根的生长端，根伸长生长(如图3A)；培养2-4周后其另一顶端的子叶展开，真叶生长，培养5-8周后形成具有两个活跃生长端的体胚苗。气动生物反应器内液体悬浮培养获得的体胚苗按照颜色的深浅、植株长度进行分类，多数体胚苗呈绿色，颜色深浅不一，植株长度不等，长度大约为0.8～4厘米(如图3B)。

长成的无菌小苗再移到温室进行硬化处理和温室培养。光周期为(10-16)h光照/(8-14)h黑暗均适用于本发明；本发明的空气通气量使得悬浮在液体萌发培养基内的体胚随着培养基一通运动，而且悬浮在液体萌发培养基内的体胚不会因相互碰撞发生损伤，提供充足的氧气，促进体胚萌发，更为重要的是，还能协助降低体胚苗的玻璃化。

杂交枫香的成熟体胚经气动式生物反应器培养转化成体胚幼苗，其形态尺寸如图3C所示。

本发明中使用的气动式生物反应器除了选择授权公告号为CN203840895U，发明名称为“生物反应器系统”的中国实用新型专利所公开的生物反应器之外，其他植物组培气动式的生物反应器均适用于本发明。

实施例4A枫香成熟体胚的液体浸润式培养

将实施例2或2A中在体胚固体或者液体培养基上培养成熟的成熟体胚放置于培养盒内，培养盒通常为长方体透明塑料盒(18×12×5cm)，底部有均匀分布的多个(通常为5个)供液体培养基自由流动的小孔，并且在每个培养盒内放置4层纸面巾，成熟体胚放置在纸巾的上面。

将培养盒放入第二长方体透明塑料盒(20×15×8cm)内，其中第二长方体透明塑料盒的体积、尺寸均大于培养盒，接着向第二长方体透明塑料盒内加入100-200mL体胚液体萌发培养基，确保液体萌发培养基能通过纸面巾的润吸进入培养盒内。在浸湿的纸面巾上层，均匀放置4g(通常为2-8g)成熟体胚，即每培养盒中接种4g(通常为2-8g)成熟体胚，其中所述体胚液体萌发培养基为改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L(通常为改良Blaydes基本培养基+蔗糖10-60g/L)。

内部放置了培养盒的第二长方体透明塑料盒置于支架上，于(25±2)℃，光周期16h光照/8h黑暗，光照强度为1500-2000Lux的条件下进行液体浸润式培养。液体萌发培养基吸人并扩散到整个纸面巾的支撑面，成熟胚胎在纸面巾的表层生长萌发，培养5-8周后形成体胚苗(如图4)。每个培养盒内可生产多达90个具有两个顶端生长点的体胚苗。

每个培养盒内约需撒上4g(通常为2-8g)枫香成熟胚胎。培养盒容器内的体胚液体萌发培养基可以通过底部的硅胶管与更换新的液体萌发培养基，培养盒内的液体萌发培养基交换次数0-2次/天，一般每天一次。

本发明的枫香植物成熟体胚液体培养成体胚苗萌发率高，体胚苗成苗率高，而且在液体培养过程中，体胚苗损伤小，液体萌发培养得到的体胚苗能在温室正常生长。尤其是本发明枫香植物成熟体胚在液体萌发培养过程中，克服了体胚萌发培养过程中萌发的体胚苗容易褐化，或玻璃化的缺陷。采用本发明方法萌发的体胚苗玻璃化小苗少。小苗在温室培养前，容易清洗，分离分类，便于移栽。另外，本发明采用液体培养因而具有液体培养的共同优点：1)液体培养基制作时可以通过高压高温灭菌，或者过滤灭菌。操作程序简单，可保护易受高温影响的培养基成分。2)由于不使用培养基凝固剂，可以节约成本。3)可以使用生物反应器进行规模化生产。生物反应器的容量可以根据生产需要进行配置，可以节省培养空间。4)由于使用生物反应器，一些常规培养步骤可省略，方法简便，节约人力。5)可以使用固体成熟胚胎，成团状，在液体培养下，成团的胚胎分离，成单独分散的体胚苗，利于后续栽培。

实施例4B枫香成熟体胚的液体浸润式培养

将实施例2或2A中在体胚固体或者液体培养基上培养成熟的成熟体胚放置于浸润式生物反应器的培养组件的培养箱内的内支撑盒内，且在内支撑盒的底部铺设无菌纸巾，成熟体胚放置在内支撑盒底部；将体胚液体萌发培养基注入液体组件的储液箱内。调节升降组件的高度，使得体胚液体萌发培养基流入内支撑盒内，通过控制体胚液体萌发培养基的液面高度使得放置在内支撑盒内的成熟体胚浸润(或浸没)体胚液体萌发培养基，进行成熟体胚的液体浸润式(或浸没式)培养，其中体胚液体浸润式培养过程中生物反应器的每个培养箱(2000ml总容量)内加入100-200ml(通常为100～300ml)液体培养基，并且接种4g(通常2～8g)成熟体胚，培养箱的内支撑盒底面上放置体胚的纸巾的面积约为200平方厘米。培养条件为25±2℃，光周期16h光照/8h黑暗，光照强度为1500-2000Lux，其中所述体胚液体萌发培养基为改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L(通常为改良Blaydes基本培养基+蔗糖10-60g/L)。

其中，光周期为(10-16)h光照/(8-14)h黑暗均适用于本发明；控制体胚液体萌发培养基的液面高度不淹没成熟体胚底部，液体萌发培养基的液面润湿体胚底部，进行浸润式培养；液体萌发培养基的液面部分或全部淹没成熟体胚下部，且体胚在内支撑盒内位置不发生变化，进行浸没式培养。

培养箱内的液体萌发培养基吸入并扩散到整个内支撑盒的底面铺设的纸巾上，成熟胚胎在纸面巾的表层生长萌发。体胚液体浸润式培养过程中，组培组件内的体胚液体萌发培养基可以通过下部的连接管道与液体组件内的液体培养基进行交换，交换次数为1次/天(通常为0-2次/天，优选为1-2次/天)。培养5-8周后形成体胚苗。每个内支撑盒内可生产多达90个具有两个顶端生长点的体胚苗。

本发明中使用的浸润式生物反应器除了选择授权公告号为CN209420590U，发明名称为：一种势能驱动间歇浸没式生物反应器的中国实用新型专利所公开的生物反应器之外，其他植物组培浸没式的生物反应器均适用于本发明。

上述枫香植物体胚苗的培养过程中，除了使用枫香成熟体胚进行液体培养(液体悬浮培养、液体浸润培养)之外，还可以使用萌发阶段的体胚进行液体培养，也能获得相同的体胚苗。

实施例5枫香液体培养的体胚苗的硬化和温室培养

将草炭、蛭石、珍珠岩按照体积比为3:1:1(v:v:v)的比例混合，配制成枫香无土栽培基质后装入深穴盘(50孔)中；将经过液体培养获得的体胚苗(例如实施例3A、3B、4A、4B中获得的体胚苗)用自来水洗净残留的培养基后，移栽至装有枫香无土栽培基质的深穴盘中，如图5A。

在栽苗的当天，在浇透水的深穴盘表面再覆盖一层蛭石，用喷嘴头将蛭石全部淋湿，减少移栽过程中，苗与基质间的摩擦。移栽过程中最适合深度埋到茎基部0.3cm，保证枫香苗的根部完全被土壤覆盖，但不能将顶芽埋住，每孔栽一株苗，移栽完成后用水将基质淋平，防止根漏气。将穴盘移至加湿棚，在温度为28-35℃，相对湿度为(90±10)％的加湿棚中缓苗2周，期间不需要过强光照，烈日下需用遮阳网。当温度超过40℃时，适当通风；当湿度低于60％时开始加湿。

小苗5-7天以后开始自主生长，生出新根。在25±5℃环境下每周会长出1到2片新叶。在加湿棚内培养2周后，将苗从加湿棚移至玻璃温室苗床，在温室环境继续生长，得到杂交枫香体胚幼苗(如图5B)。

实施例5A枫香液体培养的体胚苗成苗率试验

将实施例3B中经过液体悬浮培养获得的体胚苗按照表3中小苗的颜色和长度分成4类，每类50个；然后将无菌的体胚小苗按照实施例5的方法进行培养。

将无菌体胚苗移栽至深穴盘内，在栽苗的当天，按照与实施例5相同的方法进行处理；然后再将深穴盘移至加湿棚进行缓苗培养，缓苗培养条件与实施例5相同；缓苗培养2周后，将苗从加湿棚移至玻璃温室苗床，在温室环境继续生长，得到杂交枫香体胚幼苗，并统计成活的体胚幼苗，计算体胚苗成活率，实验结果如表3。

表3杂交枫香液体悬浮培养体胚苗的温室培养成苗情况

小苗颜色	长度(mm)	总数	成苗数	成苗率(％)
					绿色	≧15	50	26	52
绿色	<15	50	8	16
					绿偏白色	≧15	50	14	28
绿偏白色	<15	50	3	6

实验证明，杂交枫香体胚苗的成苗率与液体萌发后小苗的质量密切相关(表3)。在悬浮培养中萌发的小苗中，质量好的小苗标准为绿色苗，长度在15毫米以上，具有明显的茎端顶笌和根尖结构，成熟体胚液相悬浮培养体胚小苗在温室的成活率高，甚至可高达80％以上。

本发明上述实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种枫香属植物体胚培养成苗的方法，其特征是，将枫香属植物的成熟体胚接种于体胚液体萌发培养基中，进行液体培养。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是，所述液体培养为对枫香属植物的成熟体胚进行液体悬浮培养、液体浸润式培养或液体浸没式培养。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述体胚液体萌发培养基为体胚液体萌发培养基，其中所述体胚液体萌发培养基为改良Blaydes基本培养基+蔗糖10-60g/L，优选为改良Blaydes基本培养基+蔗糖40g/L。

4.一种枫香属植物体胚培养成苗的方法，其特征是，将枫香属植物的成熟体胚接种于体胚液体萌发培养基中，在黑暗条件下进行液体悬浮培养。

5.如权利要求4所述的方法，其特征是，所述液体悬浮培养的培养温度为(25±2)℃；且悬浮培养过程中控制转速为100-120r/min。

6.一种枫香属植物体胚培养成苗的方法，其特征是，将枫香属植物的成熟体胚接种于体胚液体萌发培养基中，在光照条件下进行液体悬浮培养。

7.如权利要求6所述的方法，其特征是，所述液体悬浮培养的培养温度为(25±2)℃；且悬浮培养过程中控制通气量为每1000mL容量的反应器中每分钟通入50-400mL空气，并且每1000mL容量反应器中含有100-500mL(优选为200-400mL)体胚液体萌发培养基；优选为每分钟通入100-200mL空气。

8.一种枫香属植物体胚培养成苗的方法，其特征是，将枫香属植物的成熟体胚接种于体胚液体萌发培养基中，在光照条件下进行液体浸润或间歇性浸没式培养。

9.如权利要求8所述的方法，其特征是，所述液体浸润培养的培养温度为(25±2)℃；且浸润培养过程中控制光周期为(16-10h)光照/(8-14h)黑暗。

10.一种枫香属植物的繁殖方法，其特征是，包括对枫香属植物的成熟体胚或处于萌发阶段的体胚进行液体成苗培养。

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