CN101213939A - 非洲菊离体高频再生繁殖方法 - Google Patents

非洲菊离体高频再生繁殖方法 Download PDF

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Abstract

一种非洲菊离体高频再生繁殖方法，本发明以非洲菊试管苗叶柄作为高频离体再生的材料，经过花托初代培养，愈伤组织诱导、不定芽分化和继代增殖，生根培养和试管苗移栽等培养步骤，在培养繁殖的各阶段调配优选的培养基，包括：花托初代培养基，愈伤组织诱导初代诱导培养基，愈伤组织诱导培养基，愈伤组织增殖和分化培养基，生根培养基和移栽培养基，提供合适的温度和光照控制条件，使非洲菊能基于叶柄进行离体高濒快速繁殖而进行种苗生产，并能应用于非洲菊的遗传转化，满足非洲菊种苗市场和进行遗传工程育种的需要。

Description

非洲菊离体高频再生繁殖方法
技术领域
本发明涉及植物的组织培养培养繁殖技术，具体地说，涉及以非洲菊叶柄为材料进行非洲菊高濒快速繁殖而进行种苗生产的方法。
背景技术
非洲菊(Gerbera janesonii)俗称扶郎花，国际著名的五大鲜切花品种之一，市场需求量大。非洲菊的繁殖可采用播种、分株和组织培养。种子繁殖后代性状易产生分离，分株繁殖速度慢，商业种苗生产中均很少使用。自上世纪七十年代，国内外就开始将组织培养技术应用于非洲菊种苗生产各和遗传转化，但是再生效果不理想，特别是以花蕾直接出芽的方式严重制约了植物基因工程技术在非洲菊中的应用。
发明内容
本发明的目的是提出一种基于叶柄的非洲菊离体高频再生繁殖方法，以便利用非洲菊试管苗叶柄为材料进行非洲菊高濒快速繁殖而进行种苗生产，并应用于非洲菊的遗传转化，满足非洲菊种苗市场和进行遗传工程育种的需要。
本发明所提出的非洲菊离体高频再生繁殖方法，包括下述培养步骤：
(1)花托初代培养：在生长季节选取生长健壮的非洲菊的幼嫩花托为外植体，先在70％-75％酒精中浸泡10-30秒，再用0.1％升汞溶液消毒5-10分钟，无菌水冲洗4～5次，接种到花托初代培养基中，培养温度26～30℃，光照度1500～2000lx，光照8～12h/天，培养50-70天至形成完整小植株；所述的花托初代培养基每升中含有6-苄基嘌呤(6-BA)5.0～10.0mg，萘乙酸(NAA)0.5～1.0mg，蔗糖20～30g和琼脂5～7g，其余为MS，pH5.5～5.8；
(2)愈伤组织诱导、不定芽分化和继代增殖：取上述花托初代培养育成的小植株的叶片的叶柄接种到愈伤初代诱导培养基，培养13-17天，所述的愈伤初代诱导培养基每升中含有1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲(TDZ)0.2-1.0mg，萘乙酸(NAA)0.05-0.2mg，蔗糖20～30g，琼脂5～7g，其余为MS，pH5.5～5.8；再转到愈伤组织诱导培养基上培养至产生愈伤组织，所述的愈伤组织诱导培养基每升中含有6-苄基嘌呤(6-BA)1.0-3.0mg，萘乙酸(NAA)0.05-0.2mg，蔗糖20～30g，琼脂5～7g，其余为MS，pH 5.5～5.8；再将所产生的愈伤组织转移到愈伤组织增殖和分化培养基培养，使愈伤组织的增殖和分化不定芽，所述的愈伤组织增殖和分化培养基每升中含有6-苄基嘌呤(6-BA)0.5-2.0mg，萘乙酸(NAA)0.2-1.0mg，蔗糖20～30g，琼脂5～7g，其余为MS，pH5.5～5.8；上述各阶段的培养条件均为：培养温度26～30℃，光照度1500～2000lx，光照8～12h/天；
(3)生根培养和试管苗移栽：将上述所产生的不定芽转移到生根培养基上培养20～30天至每株苗生根4～8条，所述的生根培养基每升中含有吲哚丁酸(IBA)0.5-0.8mg，蔗糖20～30g，琼脂5～7g，其余为MS，pH5.5～5.8；再使生根苗在自然光照下炼苗7-10天后，移栽到泥炭和蛭石按1∶1(重量)混配的混合基质中。
本发明利用非洲菊试管苗叶柄为材料进行非洲菊高濒快速繁殖而进行种苗生产，同时其体系能应用于非洲菊的遗传转化，具有投入少，产出高的特点。是利用植物组织细胞的全能性和植物组织培养等技术进行种苗的规模化生产的高新生物技术。
实施该发明只需有简单的植物组织培养设备即可进行。
具体实施方式
实施例一
1.材料：非洲菊(Gerbera janesonii“Sunanda”)。
2.培养步骤：
(1)花托初代培养：在生长季节选取生长健壮的非洲菊的幼嫩花托为外植体，先在70％酒精中浸泡10秒，再用0.1％升汞溶液消毒5分钟，无菌水冲洗4次，接种到MS+6-BA 5.0mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂5g·L-1的花托初代培养基(pH5.5)中，50天能形成完整小植株。培养温度26℃，光照度1500lx，光照8h/天。
(2)愈伤组织诱导、不定芽分化和继代增殖：取试管内小植株的叶片的叶柄接种到MS+TDZ 0.2mg·L-1+NAA 0.05mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂5g·L-1的愈伤初代诱导培养基(pH5.5)对叶柄进行17天的培养后，再转到MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA 0.05mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂5g·L-1的愈伤组织诱导培养基(pH 5.5)上培养，愈伤分化频率可达60％。再将愈伤组织转移到MS+6-BA 0.5mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂5g·L-1的愈伤组织增殖和分化培养基(pH5.5)上培养，8天能见到愈伤组织的增殖和不定芽的分化，25天时分化率达90％，每个叶柄的平均不定芽数可达10个。上述各阶段的培养条件均为：培养温度26℃，光照度1500lx，光照12h/天。
(3)生根培养和试管苗移栽：将不定芽转移到MS+吲哚丁酸(IBA)0.5mg·L-1+蔗糖20g·L-1+琼脂5g·L-1的生根培养基(pH5.5)上培养30天时生根率可达100％，每株苗有根数4条。生根苗在自然光照下炼苗7天，移栽到泥炭和蛭石(1∶1)的混合基质中，成活率95％。
实施例二
1.材料：非洲菊(Gerbera janesonii“Sunanda”)。
2.培养步骤：
(1)花托初代培养：在生长季节选取生长健壮的非洲菊的幼嫩花托为外植体，先在70％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒8分钟，无菌水冲洗5次，接种到MS+6-BA 8.0mg·L-1+NAA 0.8mg·L-1+蔗糖25g·L-1+琼脂6g·L-1的花托初代培养基(pH5.7)中，60天能形成完整小植株。培养温度28℃，光照度1600lx，光照10h/天。
(2)愈伤组织诱导、不定芽分化和继代增殖：取试管内小植株的叶片的叶柄接种到MS+TDZ 0.5mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1+蔗糖25g·L-1+琼脂6g·L-1的愈伤初代诱导培养基(pH 5.6)对叶柄进行15天的培养后，再转到MS+6-BA 2.0mg·L-1+NAA 0.1mg·L-1+蔗糖25g·L-1+琼脂6g·L-1的愈伤组织诱导培养基(pH 5.6)上培养，愈伤分化频率可达70％。再将愈伤组织转移到MS+6-BA 1.0mg·L-1+NAA 0.5mg·L-1+蔗糖25g·L-1+琼脂6g·L-1的愈伤组织增殖和分化培养基(pH 5.6)上培养，10天能见到愈伤组织的增殖和不定芽的分化，20天时分化率达95％，每个叶柄的平均不定芽数可达20个。上述各阶段的培养条件均为：培养温度28℃，光照度1600lx，光照10h/天。
(3)生根培养和试管苗移栽：将不定芽转移到MS+吲哚丁酸(IBA)0.6mg·L-1+蔗糖25g·L-1+琼脂6g·L-1的生根培养基(pH 5.6)上培养30天时生根率可达100％，每株苗有根数7条。生根苗在自然光照下炼苗10天，移栽到泥炭和蛭石(1∶1)的混合基质中，成活率100％。
实施例三
1.材料：非洲菊杂交种(Gerbera hybrida)
2.培养步骤：
(1)花托初代培养：在生长季节选取生长健壮的非洲菊的幼嫩花托为外植体，先在75％酒精中浸泡30秒，再用0.1％升汞溶液消毒10分钟，无菌水冲洗5次，接种到MS+6-BA 10.0mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂7g·L-1的花托初代培养基(pH 5.8)中，70天能形成完整小植株。培养温度30℃，光照度2000lx，光照12h/天。
(2)愈伤组织诱导、不定芽分化和继代增殖：取试管内小植株的叶片的叶柄接种到MS+TDZ 1.0mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂7g·L-1的愈伤初代诱导培养基(pH5.8)对叶柄进行17天的培养后，再转到MS+6-BA 3.0mg·L-1+NAA 0.2mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂7g·L-1的愈伤组织诱导培养基(pH5.8)上培养，愈伤分化频率可达65％。再将愈伤组织转移到MS+6-BA 2.0mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂7g·L-1的愈伤组织增殖和分化培养基(pH 5.8)上培养，12天能见到愈伤组织的增殖和不定芽的分化，25天时分化率达90％，每个叶柄的平均不定芽数可达20个。上述各阶段的培养条件均为：培养温度30℃，光照度2000lx，光照12h/天。
(3)生根培养和试管苗移栽：将不定芽转移到MS+吲哚丁酸(IBA)0.8mg·L-1+蔗糖30g·L-1+琼脂7g·L-1的生根培养基(pH5.8)上培养30天时生根率可达100％，每株苗有根数8条。生根苗在自然光照下炼苗10天，移栽到泥炭和蛭石(1∶1)的混合基质中，成活率98％。

Claims (1)

1.非洲菊离体高频再生繁殖方法，其特征在于包括下述培养步骤：
(1)花托初代培养：在生长季节选取生长健壮的非洲菊的幼嫩花托为外植体，先在70％-75％酒精中浸泡10-30秒，再用0.1％升汞溶液消毒5-10分钟，无菌水冲洗4～5次，接种到花托初代培养基中，培养温度26～30℃，光照度1500～2000lx，光照8～12h/天，培养50-70天至形成完整小植株；所述的花托初代培养基每升中含有6-苄基嘌呤5.0～10.0mg，萘乙酸0.5～1.0mg，蔗糖20～30g和琼脂5～7g，其余为MS，pH5.5～5.8；
(2)愈伤组织诱导、不定芽分化和继代增殖：取上述花托初代培养育成的小植株的叶片的叶柄接种到愈伤初代诱导培养基，培养13-17天，所述的愈伤初代诱导培养基每升中含有1-苯基-3-(1，2，3-噻二唑-5-基)脲0.2-1.0mg，萘乙酸0.05-0.2mg，蔗糖20～30g，琼脂5～7g，其余为MS，pH5.5～5.8；再转到愈伤组织诱导培养基上培养至产生愈伤组织，所述的愈伤组织诱导培养基每升中含有6-苄基嘌呤1.0-3.0mg，萘乙酸0.05-0.2mg，蔗糖20～30g，琼脂5～7g，其余为MS，pH5.5～5.8；再将所产生的愈伤组织转移到愈伤组织增殖和分化培养基中培养，使愈伤组织的增殖和分化不定芽，所述的愈伤组织增殖和分化培养基每升中含有6-苄基嘌呤0.5-2.0mg，萘乙酸0.2-1.0mg，蔗糖20～30g，琼脂5～7g，其余为MS，pH 5.5～5.8；上述各阶段的培养条件均为：培养温度26～30℃，光照度1500～2000lx，光照8～12h/天；
(3)生根培养和试管苗移栽：将上述所产生的不定芽转移到生根培养基上培养20～30天至每株苗生根4～8条，所述的生根培养基每升中含有吲哚丁酸0.5-0.8mg，蔗糖20～30g，琼脂5～7g，其余为MS，pH5.5～5.8；再使生根苗在自然光照下炼苗7-10天后，移栽到泥炭和蛭石按重量1∶1混配的混合基质中。
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