CN106171957B - 一种利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法，该育种方法的步骤包括：（1）筛选小麦耐盐资源和育种主干亲本；（2）确定小麦耐盐筛选压；（3）将小麦耐盐资源和育种主干亲本杂交，获得F1杂交种；（4）F1杂交种花培获得单倍体植株；（5）单倍体植株继代壮根；（6）单倍体植株浸根加倍；（7）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、耐盐性筛选获得小麦耐盐新品系。本发明的利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法显著缩短小麦耐盐育种周期，大大加快了小麦耐盐育种速度，3年即可实现小麦耐盐育种，具有重要的产业价值。

Description

一种利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种能够显著缩短小麦耐盐育种周期、大大加快小麦耐盐育种速度的利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法。

背景技术

土壤盐渍化是一个世界性的资源问题和生态问题。据统计，全球有各种盐渍土约9.5亿公顷，占全球陆地面积的10%，广泛分布于100多个国家和地区。而且，全球灌溉土地面积中，约50%的土地在不同程度地遭受着土壤盐碱化的危害，由于土壤的次生盐渍化，全球盐渍化面积还在迅速增加。土壤盐渍化的发展，带来了严重的经济损失和生态危害。来自世界粮农组织和教科文组织的统计表明，全世界灌溉土地约有一半不同程度遭受盐渍化危害，每年约有100万公顷土地因土壤的次生盐渍化而废弃。我国盐碱化土壤主要分布在华北、西北、东北、黄泛区和滨海地带，总面积达4万公顷，约占总耕地面积的10%，是世界上盐碱土较多的国家之一，而且盐碱土面积还将不断扩大，土地盐碱化形势十分严峻。为了合理开发和利用盐碱土地资源，人们进行了不懈的努力，采取了多种措施。在盐碱地利用的众多方式中，筛选利用耐盐植物新品种是改良盐碱地最经济有效的方法之一。

小麦是世界上分布区域最广，总产量最高，贸易额最大的粮食作物，同时小麦是我国主要的粮食作物之一，产量仅次于水稻，在国民经济中占重要地位，也是我国盐碱地地区主要栽培作物。因此，培育耐盐小麦新品种，成为小麦育种工作的重要任务之一。

目前小麦耐盐育种方法主要有选择育种、杂交育种、诱变育种和基因工程的方法，其中杂交育种仍是培育小麦耐盐品种较为普遍的方法。我国利用杂交育种已培育出的耐盐小麦品种有德选1号、德抗961、鲁麦10号、轮抗6号、轮抗7号、新春16、新春29和新冬34等。印度和巴基斯坦采用杂交育种育成的品种有KRL1-4、KRL19、LU26S和SARC-1等。但是杂交育种具有筛选工作量大、育种周期长、费时费力的缺点，诱变育种具有诱变效率低、工作量大的缺点，已越来越不能满足育种产业的发展，而基因工程育种依赖于小麦耐盐基因的发掘，未能得到普遍性的应用。

与传统的育种方法相比，单倍体育种可以缩短育种时间提高选择效率。从20世纪70年代以来，单倍体育种技术已广泛用于小麦育种，至今已培育出许多优良品种，是小麦育种的有效途径之一，而且单倍体诱导可以与分子标记和遗传操作技术相结合用于作物的遗传改良研究。目前，小麦单倍体育种主要是通过花药培养途径来实现的。

小麦属中度耐盐植物，当土壤盐分超过一定限度时，小麦生长会受到抑制，轻则生长发育受到影响，重则造成植株死亡。研究发现，在小麦在不同生育时期都具有耐盐碱性，小麦组织细胞分化过程已显著表现出耐感的差异。国内外一些科研单位已采用盐处理小麦组织的方法来进行小麦耐盐变异体的筛选，也有将小麦花药培养筛选耐盐变异体培育小麦耐盐品种的报道，但是在小麦单倍体途径的拓展利用上有所缺乏。普通小麦是6倍体，体细胞中含有6个染色体组，42条染色体，基因组庞大，小麦耐盐机理非常复杂，是大量基因协调表达的结果，其中盐诱导表达基因的作用非常重要，小麦对盐分的抗性受数量性状控制，基因的补偿效应导致常规的小麦组织对盐害的抵抗消弱了小麦组织盐处理的敏感性，导致常规的耐盐筛选敏感性不强。

通常花药培养育种阶段会产生大量的小麦单倍体植株，常规的花药培养途径中诱导培养阶段和分化培养阶段应尽量减少单倍体植株的比例，通过自然加倍或者人工诱导加倍来尽量实现单倍体植株恢复倍性。然而，单倍体植株由于其染色体组和染色体数量减半，单倍体植株对盐处理的敏感性大大提高，成为我们的重点研究方向。

发明内容

本发明的目的是针对常规小麦耐盐育种的缺陷，提供了一种显著缩短小麦耐盐育种周期、大大加快小麦耐盐育种速度的利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法，其特征在于：该育种方法的步骤如下：

（1）筛选小麦耐盐资源和育种主干亲本：采用盐池鉴定法对小麦资源库各材料进行耐盐性鉴定，选取相对盐害指数低于8%的小麦品种或家系作为小麦耐盐资源；选择小麦耐盐性不足但农艺性状优良的地方主栽品种作为育种主干亲本；正季种植小麦耐盐资源和育种主干亲本；

（2）确定小麦耐盐筛选压：选取步骤（1）种植的小麦耐盐资源和育种主干亲本的花药分别进行花药诱导培养获得花药愈伤，在分化培养基中加入梯度浓度的NaCl溶液，然后将小麦耐盐资源和育种主干亲本的花药愈伤转移到该分化培养基中进行分化培养，筛选小麦耐盐资源和育种主干亲本花药愈伤分化率均为0.75%～1.5%的分化培养基添加的NaCl浓度，将二者的平均值浓度的NaCl溶液确定为小麦耐盐筛选压；

（3）将小麦耐盐资源和育种主干亲本杂交，获得F1杂交种：将步骤（1）正季种植的小麦耐盐资源和育种主干亲本杂交，获得F1杂交种；

（4）F1杂交种花培获得单倍体植株：F1杂交种正季播种种植，选取健壮主穗花药进行花药诱导培养，获得花药愈伤组织，并挑选直径0.5～0.8cm的花药愈伤接种于添加了小麦耐盐筛选压的分化培养基中分化培养，获得单倍体植株；

（5）单倍体植株继代壮根：待单倍体植株苗长至3～5cm之后转接于生根培养基进行继代壮根，15d后可观察到单倍体植株生长出旺盛的白色根系，打开封口膜炼苗；

（6）单倍体植株浸根加倍：将壮根并炼苗后的小麦单倍体植株取出，洗净根部培养基残留，剪去部分根须，留根长度2～3cm，用添加了2%二甲基亚砜+0.5‰秋水仙碱溶液浸泡根系，25℃条件下处理24h，处理结束后再用清水将药液冲洗干净，然后将植株移栽到温室中，遮阴5～7d后常规栽培管理；

（7）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、耐盐性筛选获得小麦耐盐新品系：温室种植小麦花培苗，单株收种获得小麦耐盐新家系，不同花培家系进一步大田播种，农艺性状、耐盐性筛选获得农艺形状良好且耐盐性得到改良的小麦新品系。

所述步骤（1）中对小麦资源库各材料进行耐盐性鉴定的盐池鉴定法的具体步骤为：将盐池中盐分浓度控制在0.42%～0.48%，设置淡水池作为对照，鉴定材料按株系种植，每个株系种植2行，每行20株，株距3cm，行距20cm，待小麦生长至起身-拔节期和孕穗期，调查记载单株盐害症状和盐害级别，计算相对盐害指数。

所述单株盐害级别的分级标准为：生长发育正常、不表现任何盐害症状为0级，生长发育基本正常、叶尖略有盐害表现为1级，生长发育接近正常、基部叶片干枯、中上部叶片1/3表现盐害为2级，生长发育受抑制、基部叶片及中部叶片干枯、上部叶片1/2表现盐害为3级，生长发育严重受抑制、只上部顶端有绿叶为4级，植株死亡或临近死亡为5级；所述相对盐害指数的计算方法为：相对盐害指数=分级记载的株数与该级别数值乘积的总和/（调查总株数×5）×100%。

所述步骤（2）和步骤（4）中小麦花药诱导培养的过程如下：

（a）花药取材与低温预处理：花培材料常规大田种植，4月中下旬小麦孕穗期时于每日9点～11点取材小孢子发育处于单核晚期的主茎穗的中部小穗，剥掉旗叶外其他叶子，75%酒精擦拭表面后插入盛少许纯净水的烧杯中，用黑色塑料袋套住杯子，放入4℃冰箱低温预处理3～5d；

（b）花药接种：预处理后取出材料，用75%酒精消毒幼穗表面，然后放进超净工作台，从旗叶中拨出麦穗放入灭菌过的消毒盒中，倒入1‰升汞溶液至幼穗浸没，期间不时晃动瓶子，保证幼穗与消毒液浸泡均匀，消毒10min后，将幼穗用无菌水冲洗3～4次，用消毒后的镊子夹取幼穗中部小穗两边的花药，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于小麦花药诱导培养基上；

（c）诱导培养：将小麦花药诱导培养基置于24～26℃的黑暗环境中诱导愈伤组织，30～40天后在花药的边缘出现白-淡黄色的无定型细胞团，即小麦花药愈伤组织。

所述步骤（a）中的取材小孢子发育处于单核晚期的麦穗的形态学标准为：幼穗顶部位于旗叶的叶耳与旗叶叶耳1/3～2/3处的小麦植株，用剪刀沿着茎部剪断所获得的部分。

所述步骤（b）和（c）中的小麦花药诱导培养基为改良癸培养基，其配方为：NH₄NO₃200mg/L，KNO₃ 1400mg/L，KH₂PO₄ 500mg/L，CaCl₂ 150mg/L，MgSO₄∙7H₂O 100mg/L，Na₂-EDTA37.25mg/L，FeSO₄∙7H₂O 27.85mg/L，MnSO₄∙4H₂O 4.0mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 2.0mg/L，生物素2.0mg/L，H₃BO₃ 1.5mg/L，KI 1.0mg/L，CaSO₄∙5H₂O 0.1mg/L，CoCl₂∙6H₂O 0.2mg/L，甘氨酸2.0mg/L，维生素B1 1.0mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸 0.5mg/L，肌醇 100mg/L，KT 1.5mg/L，IAA 0.5mg/L，丝氨酸 0.25mg/L，谷氨酰胺 5.0mg/L，水解酪蛋白 0.4g/L，植物血凝素3.5mg/L，AgNO₃ 5.0mg/L，幼穗提取液 25mg/L，琼脂 7g/L，麦芽糖 90g/L，pH值为5.8。

所述幼穗提取液的获取方法为：将小麦幼穗洗净后称取30g，切成碎片，加入100ml蒸馏水，煮沸20min，用4～6层纱布过滤静置，待沉淀后取上清液。

所述步骤（2）和（4）中的分化培养基的配方为：C17+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+AgNO₃1.5mg/L+山梨醇80mol/L+NAA 0.15mg/L+KT 1.5mg/L+ABA 0.1mg/L，pH值为5.8；所述的分化培养的条件为：将分化培养基置于温度为25～27℃，光照强度为1500～2000Lx，光周期为光14h/暗10h的培养室条件下进行分化培养。

所述步骤（5）中的生根培养基的配方为：1/2MS基本培养基+多效唑3.0g/L，pH值为5.8；所述的生根培养的条件为：将生根培养基置于温度为27～29℃，光照强度为2500～3000Lx，光周期为光14h/暗10h的培养室条件下生根壮苗。

所述步骤（5）中的炼苗方法为：将生根培养的培养瓶封口膜打开，在培养室内进行开瓶练苗4～6天，然后转移到光照强度为3000～6000Lx，温度为10～30℃，湿度为70～85%，利用自然光炼苗7～10天。

本发明相比现有技术有如下优点：

本发明的育种方法与常规育种方法相比，通过调控小麦花药培养过程，大大提高了小麦单倍体植株的比例，利用小麦单倍体植株对盐处理敏感度高的优点进行耐盐性筛选，极大地提高了筛选效率，进而利用单倍体加倍手段获得倍性恢复的正常六倍体小麦植株，从而大大加快了小麦耐盐育种速度，显著缩短耐盐育种周期，3年即可实现耐盐育种，具有重要的产业价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

一种利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法，该育种方法的步骤如下：

（1）筛选小麦耐盐资源和育种主干亲本：采用盐池鉴定法对小麦资源库各材料进行耐盐性鉴定，首先将盐池中盐分浓度控制在0.42%～0.48%，设置淡水池作为对照，鉴定材料按株系种植，每个株系种植2行，每行20株，株距3cm，行距20cm，待小麦生长至起身-拔节期和孕穗期，调查记载单株盐害症状，根据单株盐害级别分级标准区分盐害级别；

单株盐害级别分级标准为：生长发育正常、不表现任何盐害症状为0级，生长发育基本正常、叶尖略有盐害表现为1级，生长发育接近正常、基部叶片干枯、中上部叶片1/3表现盐害为2级，生长发育受抑制、基部叶片及中部叶片干枯、上部叶片1/2表现盐害为3级，生长发育严重受抑制、只上部顶端有绿叶为4级，植株死亡或临近死亡为5级；

根据相对盐害指数计算方法：相对盐害指数=分级记载的株数与该级别数值乘积的总和/（调查总株数×5）×100%，进一步计算相对盐害指数；

选取相对盐害指数低于8%的小麦品种或家系作为小麦耐盐资源；选择小麦耐盐性不足但农艺性状优良的地方主栽品种作为育种主干亲本；正季种植小麦耐盐资源和育种主干亲本；

（2）确定小麦耐盐筛选压：选取步骤（1）种植的小麦耐盐资源和育种主干亲本的花药分别进行花药诱导培养，诱导培养的过程如下：

（a）花药取材与低温预处理：花培材料常规大田种植，4月中下旬小麦孕穗期时于每日9点～11点取材小孢子发育处于单核晚期的主茎穗的中部小穗，小孢子发育处于单核晚期的形态学标准为：幼穗顶部位于旗叶的叶耳与旗叶叶耳1/3～2/3处的小麦植株，用剪刀沿着茎部剪断所获得的部分；剥掉旗叶外其他叶子，75%酒精擦拭表面后插入盛少许纯净水的烧杯中，用黑色塑料袋套住杯子，放入4℃冰箱低温预处理3～5d；

（b）花药接种：预处理后取出材料，用75%酒精消毒幼穗表面，然后放进超净工作台，从旗叶中拨出麦穗放入灭菌过的消毒盒中，倒入1‰升汞溶液至幼穗浸没，期间不时晃动瓶子，保证幼穗与消毒液浸泡均匀，消毒10min后，将幼穗用无菌水冲洗3～4次，用消毒后的镊子夹取幼穗中部小穗两边的花药，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于小麦花药诱导培养基上，小麦花药诱导培养基为改良癸培养基，其配方为：NH₄NO₃200mg/L，KNO₃ 1400mg/L，KH₂PO₄ 500mg/L，CaCl₂ 150mg/L，MgSO₄∙7H₂O 100mg/L，Na₂-EDTA37.25mg/L，FeSO₄∙7H₂O 27.85mg/L，MnSO₄∙4H₂O 4.0mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 2.0mg/L，生物素2.0mg/L，H₃BO₃ 1.5mg/L，KI 1.0mg/L，CaSO₄∙5H₂O 0.1mg/L，CoCl₂∙6H₂O 0.2mg/L，甘氨酸2.0mg/L，维生素B1 1.0mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸 0.5mg/L，肌醇 100mg/L，KT 1.5mg/L，IAA 0.5mg/L，丝氨酸 0.25mg/L，谷氨酰胺 5.0mg/L，水解酪蛋白 0.4g/L，植物血凝素3.5mg/L，AgNO₃ 5.0mg/L，幼穗提取液 25mg/L（幼穗提取液的获取方法为：将小麦幼穗洗净后称取30g，切成碎片，加入100ml蒸馏水，煮沸20min，用4～6层纱布过滤静置，待沉淀后将取上清液），琼脂 7g/L，麦芽糖 90g/L，pH值为5.8；

（c）诱导培养：将小麦花药诱导培养基置于24～26℃的黑暗环境中诱导愈伤组织，30～40天后在花药的边缘出现白-淡黄色的无定型细胞团，即小麦花药愈伤组织；

获得花药愈伤后，在分化培养基（配方为：C17+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+AgNO₃1.5mg/L+山梨醇80mol/L+NAA 0.15mg/L+KT 1.5mg/L+ABA 0.1mg/L，pH值为5.8）中加入梯度浓度的NaCl溶液，然后将小麦耐盐资源和育种主干亲本的花药愈伤转移到该分化培养基中，将分化培养基置于温度为25～27℃，光照强度为1500～2000Lx，光周期为光14h/暗10h的培养室条件下分化培养；筛选小麦耐盐资源和育种主干亲本花药愈伤分化率均为0.75%～1.5%的分化培养基添加的NaCl浓度，将二者的平均值浓度的NaCl溶液确定为小麦耐盐筛选压；

（3）将小麦耐盐资源和育种主干亲本杂交，获得F1杂交种：将步骤（1）正季种植的小麦耐盐资源和育种主干亲本杂交，获得F1杂交种；

（4）F1杂交种花培获得单倍体植株：F1杂交种正季播种种植，选取健壮主穗花药进行花药诱导培养，药诱导培养的培养基配方、培养条件和过程同步骤（2），获得花药愈伤组织，并挑选直径0.5～0.8cm的花药愈伤接种于添加了小麦耐盐筛选压的分化培养基中分化培养，获得单倍体植株，分化培养的培养基配方、培养条件、赤霉病粗毒素获取方法和过程均同步骤（2）；

（5）单倍体植株继代壮根：待单倍体植株苗长至3-5cm之后转接于生根培养基（生根培养基的配方为：1/2MS基本培养基+多效唑3.0g/L，pH值为5.8），然后将生根培养基置于温度为27～29℃，光照强度为2500～3000Lx，光周期为光14h/暗10h的培养室条件下生根壮苗；15d后可观察到单倍体植株生长出旺盛的白色根系，将生根培养的培养瓶封口膜打开，在培养室内进行开瓶练苗4～6天，然后转移到光照强度为3000～6000Lx，温度在10～30℃，湿度为70～85%，利用自然光炼苗7～10天；

（6）单倍体植株浸根加倍：将壮根并炼苗后的小麦单倍体植株取出，洗净根部培养基残留，剪去部分根须，留根长度2～3cm，用添加了2%二甲基亚砜+0.5‰秋水仙碱溶液浸泡根系，25℃条件下处理24h，处理结束后再用清水将药液冲洗干净，然后将植株移栽到温室中，遮阴5～7d后常规栽培管理；

（7）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、耐盐性筛选获得小麦耐盐新品系：温室种植小麦花培苗，单株收种获得小麦耐盐新家系，不同花培家系进一步大田播种，农艺性状、耐盐性筛选获得农艺形状良好且耐盐性得到改良的小麦新品系。

实施例

2011年开始，采用本发明的利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法进行优质中筋小麦新品种济麦22的耐盐性改良工作，其育种步骤如下。

（1）分别筛选新冬34号和济麦22作为小麦耐盐亲本和育种主干亲本：

济麦22是山东省农业科学院作物研究所育成的超高产、多抗、优质中筋小麦新品种，亩有效穗40-45万穗，穗粒数36-38粒，千粒重42-45克，容重800克/升左右，各地普遍反映产量高、增产潜力大，综合抗性突出、稳产性好（抗寒、抗倒、抗病、抗干热风），适应性广、易于栽培和获得高产，对灾害性气候的适应性尤其好，解决了淮北地区小麦品种的安全性问题，应用前景十分广阔。然而，济麦22对盐害耐性不佳，2011年盐池鉴定，相对盐害指数为48.2%，耐盐级别为3级，因此，急需进行耐盐改良。新冬34号是由中国科学院新疆生态与地理研究所多年选育而成的优质中筋耐盐冬小麦，表现出较强的抗盐碱特性和明显的丰产优势，平均亩产达到403.32公斤，不仅具有耐盐性好的优点，还具有抗病、抗倒性好的特点。2011年盐池鉴定，新冬34号相对盐害指数为3.1%，耐盐级别为1级，耐盐性极佳。

（2）确定小麦耐盐筛选压：2012年正季种植新冬34号和济麦22，选取单核晚期的花药分别进行花药诱导培养，分别获得花药愈伤，在分化培养基中加入梯度浓度的NaCl溶液，然后将新冬34号和济麦22的花药愈伤转移到该分化培养基中进行分化培养，结果如下表1和表2；

由上表1和表2我们可以发现，济麦22的花药愈伤分化率为1%的分化培养基添加的NaCl溶液浓度约为2‰，新冬34号的花药愈伤分化率为1%的分化培养基添加的NaCl溶液浓度约为5‰，取二者的平均值3.5‰的NaCl浓度确定为小麦耐盐筛选压。

同时，我们选择不加NaCl的分化培养基分化出的花培植株进行倍性鉴定，发现花培植株中单倍体植株的比例高达92.5%，远远高于常规花药培养中单倍体植株的比例，进一步统计添加了NaCl的分化培养基中分化苗的单倍体植株比例，发现二者并无显著差异。因此可以发现，本发明提供的分化培养基可以大大提高愈伤组织分化出单倍体植株的比例，减少了单倍体植株自然加倍的出现。

（3）将新冬34号和济麦22杂交，获得F1杂交种，F1杂交种花培获得单倍体植株：

将2012年正季种植的新冬34号和济麦22杂交，获得F1杂交种，F1杂交种2013年正季种植，选取健壮主穗花药进行花药诱导培养，获得花药愈伤组织，并挑选直径0.5～0.8cm的花药愈伤接种于添加了3.5%NaCl的分化培养基中分化培养，获得单倍体植株175棵。

（4）单倍体植株继代壮根：

待单倍体植株苗长至3-5cm之后转接于生根培养基进行继代壮根，待单倍体植株生长出旺盛的白色根系后，将生根培养的培养瓶封口膜打开，在培养室内进行开瓶练苗4～6天，然后转移到光照强度为3000～6000Lx，温度为10～30℃，湿度为70～85%的条件下，利用自然光炼苗7～10天。

（5）单倍体植株浸根加倍：

将壮根并炼苗后的小麦单倍体植株取出，洗净根部培养基残留，剪去部分根须，留根长度2～3cm，用添加了2%二甲基亚砜+0.5‰秋水仙碱溶液浸泡根系，25℃条件下处理24h，处理结束后再用清水将药液冲洗干净，然后将植株移栽到温室中，遮阴5～7d后常规栽培管理。

（6）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、耐盐性筛选获得小麦耐盐新品系：

2014年温室种植小麦花培苗，单株收种获得169个花培家系，2014年正季大田播种，2015年春季进行农艺性状和耐盐鉴定筛选到了农艺形状良好且耐盐性得到改良的小麦新品系3个。

由此可见，本发明的育种方法与常规育种方法相比，通过调控小麦花药培养过程，大大提高了小麦单倍体植株的比例，利用小麦单倍体植株对盐处理敏感度高的优点进行耐盐性筛选，极大地提高了筛选效率，进而利用单倍体加倍手段获得倍性恢复的正常六倍体小麦植株，从而大大加快了小麦耐盐育种速度，显著缩短耐盐育种周期，3年即可实现耐盐育种，具有重要的产业价值。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims (7)

1.一种利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法，其特征在于：该育种方法的步骤如下：

（1）筛选小麦耐盐资源和育种主干亲本：采用盐池鉴定法对小麦资源库各材料进行耐盐性鉴定，选取相对盐害指数低于8%的小麦品种或家系作为小麦耐盐资源；选择小麦耐盐性不足但农艺性状优良的地方主栽品种作为育种主干亲本；正季种植小麦耐盐资源和育种主干亲本；

（2）确定小麦耐盐筛选压：选取步骤（1）种植的小麦耐盐资源和育种主干亲本的花药分别进行花药诱导培养获得花药愈伤，在分化培养基中加入梯度浓度的NaCl溶液，然后将小麦耐盐资源和育种主干亲本的花药愈伤转移到该分化培养基中进行分化培养，筛选小麦耐盐资源和育种主干亲本花药愈伤分化率均为0.75%～1.5%的分化培养基添加的NaCl浓度，将二者的平均值浓度的NaCl溶液确定为小麦耐盐筛选压；

（3）将小麦耐盐资源和育种主干亲本杂交，获得F1杂交种：将步骤（1）正季种植的小麦耐盐资源和育种主干亲本杂交，获得F1杂交种；

（4）F1杂交种花培获得单倍体植株：F1杂交种正季播种种植，选取健壮主穗花药进行花药诱导培养，获得花药愈伤组织，并挑选直径0.5～0.8cm的花药愈伤接种于添加了小麦耐盐筛选压的分化培养基中分化培养，获得单倍体植株；

（5）单倍体植株继代壮根：待单倍体植株苗长至3～5cm之后转接于生根培养基进行继代壮根，15d后可观察到单倍体植株生长出旺盛的白色根系，打开封口膜炼苗；

（6）单倍体植株浸根加倍：将壮根并炼苗后的小麦单倍体植株取出，洗净根部培养基残留，剪去部分根须，留根长度2～3cm，用添加了2%二甲基亚砜+0.5‰秋水仙碱溶液浸泡根系，25℃条件下处理24h，处理结束后再用清水将药液冲洗干净，然后将植株移栽到温室中，遮阴5～7d后常规栽培管理；

（7）花培苗单株收种获得花培家系，进一步农艺性状、耐盐性筛选获得小麦耐盐新品系：温室种植小麦花培苗，单株收种获得小麦耐盐新家系，不同花培家系进一步大田播种，农艺性状、耐盐性筛选获得农艺形状良好且耐盐性得到改良的小麦新品系；

所述步骤（2）和步骤（4）中小麦花药诱导培养的过程如下：

（a）花药取材与低温预处理：花培材料常规大田种植，4月中下旬小麦孕穗期时于每日9点～11点取材小孢子发育处于单核晚期的主茎穗的中部小穗，剥掉旗叶外其他叶子，75%酒精擦拭表面后插入盛少许纯净水的烧杯中，用黑色塑料袋套住杯子，放入4℃冰箱低温预处理3～5d；

（b）花药接种：预处理后取出材料，用75%酒精消毒幼穗表面，然后放进超净工作台，从旗叶中拨出麦穗放入灭菌过的消毒盒中，倒入1‰升汞溶液至幼穗浸没，期间不时晃动瓶子，保证幼穗与消毒液浸泡均匀，消毒10min后，将幼穗用无菌水冲洗3～4次，用消毒后的镊子夹取幼穗中部小穗两边的花药，最后用消毒过的剪刀剪开花药上部，抖药法接种花药于小麦花药诱导培养基上；

（c）诱导培养：将小麦花药诱导培养基置于24～26℃的黑暗环境中诱导愈伤组织，30～40天后在花药的边缘出现白-淡黄色的无定型细胞团，即小麦花药愈伤组织；

所述步骤（b）和（c）中的小麦花药诱导培养基为改良癸培养基，其配方为：NH₄NO₃200mg/L，KNO₃ 1400mg/L，KH₂PO₄ 500mg/L，CaCl₂ 150mg/L，MgSO₄∙7H₂O 100mg/L，Na₂-EDTA37.25mg/L，FeSO₄∙7H₂O 27.85mg/L，MnSO₄∙4H₂O 4.0mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 2.0mg/L，生物素2.0mg/L，H₃BO₃ 1.5mg/L，KI 1.0mg/L，CaSO₄∙5H₂O 0.1mg/L，CoCl₂∙6H₂O 0.2mg/L，甘氨酸2.0mg/L，维生素B1 1.0mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸 0.5mg/L，肌醇 100mg/L，KT 1.5mg/L，IAA 0.5mg/L，丝氨酸 0.25mg/L，谷氨酰胺 5.0mg/L，水解酪蛋白 0.4g/L，植物血凝素3.5mg/L，AgNO₃ 5.0mg/L，幼穗提取液 25mg/L，琼脂 7g/L，麦芽糖 90g/L，pH值为5.8；

所述幼穗提取液的获取方法为：将小麦幼穗洗净后称取30g，切成碎片，加入 100ml蒸馏水，煮沸20min，用4～6层纱布过滤静置，待沉淀后取上清液；

所述步骤（2）和（4）中的分化培养基的配方为：C17+蔗糖30g/L+琼脂5.5g/L+ AgNO₃ 1.5mg/L+山梨醇80mol/L+NAA 0.15mg/L+KT 1.5mg/L+ABA 0.1mg/L，pH值为5.8；

所述步骤（5）中的生根培养基的配方为：1/2MS基本培养基+多效唑3.0g/L，pH值为5.8。

2.根据权利要求1所述的利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法，其特征在于：所述步骤（1）中对小麦资源库各材料进行耐盐性鉴定的盐池鉴定法的具体步骤为：将盐池中盐分浓度控制在0.42%～0.48%，设置淡水池作为对照，鉴定材料按株系种植，每个株系种植2行，每行20株，株距3cm，行距20cm，待小麦生长至起身-拔节期和孕穗期，调查记载单株盐害症状和盐害级别，计算相对盐害指数。

3.根据权利要求1或2所述的利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法，其特征在于：所述单株盐害级别的分级标准为：生长发育正常、不表现任何盐害症状为0级，生长发育基本正常、叶尖略有盐害表现为1级，生长发育接近正常、基部叶片干枯、中上部叶片1/3表现盐害为2级，生长发育受抑制、基部叶片及中部叶片干枯、上部叶片1/2表现盐害为3级，生长发育严重受抑制、只上部顶端有绿叶为4级，植株死亡或临近死亡为5级；所述相对盐害指数的计算方法为：相对盐害指数=分级记载的株数与该级别数值乘积的总和/（调查总株数×5）×100%。

4.根据权利要求1所述的利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法，其特征在于：所述步骤（a）中的取材小孢子发育处于单核晚期的麦穗的形态学标准为：幼穗顶部位于旗叶的叶耳与旗叶叶耳1/3～2/3处的小麦植株，用剪刀沿着茎部剪断所获得的部分。

5.根据权利要求1所述的利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法，其特征在于：所述的分化培养的条件为：将分化培养基置于温度为25～27℃，光照强度为1500～2000Lx，光周期为光14h/暗10h的培养室条件下进行分化培养。

6.根据权利要求1所述的利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法，其特征在于：所述的生根培养的条件为：将生根培养基置于温度为27～29℃，光照强度为2500～3000Lx，光周期为光14h/暗10h的培养室条件下生根壮苗。

7.根据权利要求1所述的利用花培单倍体筛选优良耐盐株系的小麦耐盐育种方法，其特征在于：所述步骤（5）中的炼苗方法为：将生根培养的培养瓶封口膜打开，在培养室内进行开瓶练苗4～6天，然后转移到光照强度为3000～6000Lx，温度为10～30℃，湿度为70～85%，利用自然光炼苗7～10天。