JPH062054B2 - プロトプラスト培養によるイネ科穀物の育種方法 - Google Patents
プロトプラスト培養によるイネ科穀物の育種方法Info
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- JPH062054B2 JPH062054B2 JP60205263A JP20526385A JPH062054B2 JP H062054 B2 JPH062054 B2 JP H062054B2 JP 60205263 A JP60205263 A JP 60205263A JP 20526385 A JP20526385 A JP 20526385A JP H062054 B2 JPH062054 B2 JP H062054B2
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- callus
- protoplasts
- grasses
- medium
- plants
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/14—Plant cells
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- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 この発明は、イネ科穀物のプロトプラストを作出、培養
することにより、単一細胞起源の植物体を復原・育成す
る方法に関する。
することにより、単一細胞起源の植物体を復原・育成す
る方法に関する。
新品種の創生には、次のような手法ないしは原理があ
る。
る。
（１）特定の形質を交雑によって組合わせを変え、新し
い遺伝的形質を持たせて変異を起こさせる。
い遺伝的形質を持たせて変異を起こさせる。
（２）倍数体などにみられる染色体数の増減によって形
質に変異を起こさせる。
質に変異を起こさせる。
（３）化学物質、放射線等により突然変異を起こさせ
る。
る。
（４）組換えＤＮＡにより異種遺伝子を導入する。
（５）細胞融合による異種細胞質あるいは異種遺伝子の
組込みによって新しい形質を付与する。
組込みによって新しい形質を付与する。
しかして、植物体の細胞壁を除去して得られるプロトプ
ラストからの植物体の育成は、突然変異体の作出、その
選択、異種遺伝子の導入、細胞融合による育種のために
は必須の技術である。
ラストからの植物体の育成は、突然変異体の作出、その
選択、異種遺伝子の導入、細胞融合による育種のために
は必須の技術である。
プロトプラストの作出は古くから知られており、酵素を
用いた作出方法（Takabe等、1968年）が広範に研究さ
れ、その結果、多種の植物でプロトプラストの分離が可
能となった。
用いた作出方法（Takabe等、1968年）が広範に研究さ
れ、その結果、多種の植物でプロトプラストの分離が可
能となった。
たとえば、タバコでは分離したプロトプラストを培養
し、植物体に復原することが可能となった（Takabe等、
1971年）。また、分離した２種の植物のプロトプラスト
を融合させてから培養し、植物体に復原することも可能
となった（Carlson等、1972年）。
し、植物体に復原することが可能となった（Takabe等、
1971年）。また、分離した２種の植物のプロトプラスト
を融合させてから培養し、植物体に復原することも可能
となった（Carlson等、1972年）。
しかしながら、単子葉植物では、プロトプラストの分
離、培養は極めて困難であった。
離、培養は極めて困難であった。
イネ以外のイネ科植物では、プロトプラストからの植物
体の復原例は、僅かに２例が報告されているのみであ
る。即ち、Pennisetum americanum(I.K.Vasil等、1980
年）とPanicum maxim(Lee等、1981年）について、胚葉
体形成状態の液体培養細胞からのプロトプラストを分離
培養し、植物体を復原させることに成功しているが、花
粉や種子を起源とする任意のカルス組織から植物体を復
原することは成功していない。
体の復原例は、僅かに２例が報告されているのみであ
る。即ち、Pennisetum americanum(I.K.Vasil等、1980
年）とPanicum maxim(Lee等、1981年）について、胚葉
体形成状態の液体培養細胞からのプロトプラストを分離
培養し、植物体を復原させることに成功しているが、花
粉や種子を起源とする任意のカルス組織から植物体を復
原することは成功していない。
また、イネにあっては、プロトプラストの培養は長い間
成功せず、僅かにカルスの作出およびそれからの発根が
認められるのみであった（Deka及びSen、1976年）。
成功せず、僅かにカルスの作出およびそれからの発根が
認められるのみであった（Deka及びSen、1976年）。
本発明者等は、上記の技術水準に鑑みて、イネの組織培
養において培養条件、倍地成分等が再分化能と培養細胞
の遺伝的特性に及ぼす影響、およびプロトプラスト由来
のカルスからの植物体の再分化法について詳細に検討し
た結果、カルスを長期間安定して継代培養すること、お
よび継代しもしくは継代しない花粉もしくは種子起源の
カルスからイネ植物体を復原させることに成功した。花
粉もしくは種子起源のカルスから植物体を復原させえた
ことはイネ科穀物では始めてであり、また、種子カルス
を４年以上の長期にわたって継代培養し、ついでこのも
のから植物体を復原させえたことも勿論始めての知見で
ある。
養において培養条件、倍地成分等が再分化能と培養細胞
の遺伝的特性に及ぼす影響、およびプロトプラスト由来
のカルスからの植物体の再分化法について詳細に検討し
た結果、カルスを長期間安定して継代培養すること、お
よび継代しもしくは継代しない花粉もしくは種子起源の
カルスからイネ植物体を復原させることに成功した。花
粉もしくは種子起源のカルスから植物体を復原させえた
ことはイネ科穀物では始めてであり、また、種子カルス
を４年以上の長期にわたって継代培養し、ついでこのも
のから植物体を復原させえたことも勿論始めての知見で
ある。
本発明者等が開発し、以下に詳述する手法によって、カ
ルス細胞の培養期間中に、種々の突然変異誘発操作、異
種遺伝子の移入、異種植物間のプロトプラスト融合、お
よびこれらの操作を組合わせた細胞選択を容易に行うこ
とが可能となった。
ルス細胞の培養期間中に、種々の突然変異誘発操作、異
種遺伝子の移入、異種植物間のプロトプラスト融合、お
よびこれらの操作を組合わせた細胞選択を容易に行うこ
とが可能となった。
本発明の方法によれば、培養細胞の再分化能と遺伝的安
定性とを保持させつつ、カルスを誘導し、また誘導され
たカルスを継代培養するには、倍地中にオーキシンの
他、高濃度の塩あるいは糖の存在が必須である。このよ
うな塩としては、たとえば、ナトリウム、カリウム、カ
ルシウム、マグネシウム、マンガン等の塩化物や、硫酸
塩があげられる。これらの塩類は、単独であってもよ
く、また２種以上配合されていてもよい。含有量は、た
とえば食塩の場合、培地１中に２〜30g、好適には３
〜20g程度である。
定性とを保持させつつ、カルスを誘導し、また誘導され
たカルスを継代培養するには、倍地中にオーキシンの
他、高濃度の塩あるいは糖の存在が必須である。このよ
うな塩としては、たとえば、ナトリウム、カリウム、カ
ルシウム、マグネシウム、マンガン等の塩化物や、硫酸
塩があげられる。これらの塩類は、単独であってもよ
く、また２種以上配合されていてもよい。含有量は、た
とえば食塩の場合、培地１中に２〜30g、好適には３
〜20g程度である。
一方、塩とともに培地中に含まれる糖は、たとえば、マ
ニトール、ソルビトール、デキストリン等でありえ、こ
れらも単独または配合して使用される。培地中の糖の含
有量は、0.2〜1.0M、好適には0.3〜0.6M程度である。
ニトール、ソルビトール、デキストリン等でありえ、こ
れらも単独または配合して使用される。培地中の糖の含
有量は、0.2〜1.0M、好適には0.3〜0.6M程度である。
このようにして培養されたカルスを植物体分化させるに
は、上記の培地から、再分化培地へ移すことによって行
われる。再分化培地は、その目的で通常知られた組成を
有しており、たとえば、オーキシン、サイトカイニン等
の植物ホルモンおよび糖、イースト・エキストラクト、
カザミノ酸等あるいはプロリン等のアミノ酸が含有さ
れ、場合によっては、さらにアブサイジン酸、ジベレリ
ン等の植物ホルモンが含まれることもある。
は、上記の培地から、再分化培地へ移すことによって行
われる。再分化培地は、その目的で通常知られた組成を
有しており、たとえば、オーキシン、サイトカイニン等
の植物ホルモンおよび糖、イースト・エキストラクト、
カザミノ酸等あるいはプロリン等のアミノ酸が含有さ
れ、場合によっては、さらにアブサイジン酸、ジベレリ
ン等の植物ホルモンが含まれることもある。
本発明において、材料としての植物体はどの部分であっ
てもよく、たとえば、葉、種子、花粉、茎、根等であり
うるが、花粉および種子はとくに好適である。植物体か
ら分離したプロトプラストを培養して得られたカルスを
直ちに再分化させてもよいし、または、カルスを上記し
た条件下で継代培養し、任意の時期に取り出して再分化
処理を行ってもよい。
てもよく、たとえば、葉、種子、花粉、茎、根等であり
うるが、花粉および種子はとくに好適である。植物体か
ら分離したプロトプラストを培養して得られたカルスを
直ちに再分化させてもよいし、または、カルスを上記し
た条件下で継代培養し、任意の時期に取り出して再分化
処理を行ってもよい。
また、イネのプロトプラストを他のイネ科植物のプロト
プラストと融合させた融合プロトプラストも、本発明の
方法に従って継代培養し、また必要に応じて分化させる
ことが可能であり、それ故、本発明に包含される。
プラストと融合させた融合プロトプラストも、本発明の
方法に従って継代培養し、また必要に応じて分化させる
ことが可能であり、それ故、本発明に包含される。
次に、実施例をあげて本発明をより詳細に説明する。
実施例１ イネ（品種：日本晴）の葯を液体浮遊培養して花粉起源
カルスを誘導し、１穂由来の80個の単一花粉起源カルス
を分離した。これらのカルスをそれぞれ増殖させたの
ち、その全ＤＮＡを抽出し、制限酵素Bam HIで切断させ
たのち、サザーン・ブロッティング（Southern blottin
g）を行い、クローン化したイネリボソーム遺伝子ＤＮ
Ａとハイブリッド形成を行った。
カルスを誘導し、１穂由来の80個の単一花粉起源カルス
を分離した。これらのカルスをそれぞれ増殖させたの
ち、その全ＤＮＡを抽出し、制限酵素Bam HIで切断させ
たのち、サザーン・ブロッティング（Southern blottin
g）を行い、クローン化したイネリボソーム遺伝子ＤＮ
Ａとハイブリッド形成を行った。
50カルス中3カルスで、3.8〜3.9kbの本来の２本のリボ
ソームＤＮＡのバンド以外に、7.7kb付近に分子量の大
きなバンドが見出された。このような解析を含めて細胞
の生長が安定している１カルスからプロトプラストを分
離して培養した。酵素条件はマセロチームR10 0.5％、
ペクトリアーゼY-23 0.04％、セルラーゼRS ２％、マ
ニトール0.45Mであり、また培地は、Chu＋ナフタレン酢
酸ソーダ 10-5M＋カイネチン 10-6Mであった。
ソームＤＮＡのバンド以外に、7.7kb付近に分子量の大
きなバンドが見出された。このような解析を含めて細胞
の生長が安定している１カルスからプロトプラストを分
離して培養した。酵素条件はマセロチームR10 0.5％、
ペクトリアーゼY-23 0.04％、セルラーゼRS ２％、マ
ニトール0.45Mであり、また培地は、Chu＋ナフタレン酢
酸ソーダ 10-5M＋カイネチン 10-6Mであった。
３回の独立した分離、培養で得られたコロニーから、４
１個を分離し、カルス増殖を行った。
１個を分離し、カルス増殖を行った。
得られた全41カルスのうち、色調が異なるものが９個、
オーキシン非要求性のものが１５個であった。それぞれ
のコロニーの生長には大きな差異が認められ、プレート
あたり生体量が1.5〜2gのものから4.5〜5gのものまでに
分布した。カルスの一部を分化培地（大野、1975年）に
移植し、再分化能の有無を検討したところ、１カルスで
芽と根とが分化し、また２カルスでは根の分化が認めら
れ、再分化、復原が確認された。なお、ここで分化に用
いたプロトプラスト・カルスは、カルス誘導以来８回の
継代培養を経ており、プロトプラスト分離培養期間を含
めて約15ケ月間経過している。
オーキシン非要求性のものが１５個であった。それぞれ
のコロニーの生長には大きな差異が認められ、プレート
あたり生体量が1.5〜2gのものから4.5〜5gのものまでに
分布した。カルスの一部を分化培地（大野、1975年）に
移植し、再分化能の有無を検討したところ、１カルスで
芽と根とが分化し、また２カルスでは根の分化が認めら
れ、再分化、復原が確認された。なお、ここで分化に用
いたプロトプラスト・カルスは、カルス誘導以来８回の
継代培養を経ており、プロトプラスト分離培養期間を含
めて約15ケ月間経過している。
このことは、イネにおいても長期間培養カルスでの再分
化能の保持が可能なことを示している。
化能の保持が可能なことを示している。
実施例２ イネ（品種：日本晴）から注意深く自殖によって採取し
た種子を脱して用いた。種子を７０％エタノールで１
分間消毒し、さらに10％晒粉水溶液の上澄液に２０分間
浸漬して滅菌後、滅菌水で洗浄した。ついで種子をMura
shigeおよびSkoog（1962年）の基礎培地またはMiller(1
963年）の基礎培地に10-5Mの2,4−ジクロロフエノキシ
酢酸を加えたpH6.0の寒天培地上に置床した。
た種子を脱して用いた。種子を７０％エタノールで１
分間消毒し、さらに10％晒粉水溶液の上澄液に２０分間
浸漬して滅菌後、滅菌水で洗浄した。ついで種子をMura
shigeおよびSkoog（1962年）の基礎培地またはMiller(1
963年）の基礎培地に10-5Mの2,4−ジクロロフエノキシ
酢酸を加えたpH6.0の寒天培地上に置床した。
40〜50日後に、誘導されたカルスを食塩５〜18g/を含
む培地で４年間継代培養した。
む培地で４年間継代培養した。
このようなカルスを、セルラーゼRS２％、ペクトリアー
ゼ Y-23 0.05％、マニトール0.25M、ソルビトール0.2
M、塩化カルシウム 3mM、燐酸二水素カリウム0.35mM、
MES緩衝液 3mMで処理し、遊離したプロトプラストをス
テンレス・メッシュで選別し、マニトール・ソルビトー
ル混合液で洗浄したのち培養した。このようにして分離
したプロトプラストは10日後には分裂をおこなってお
り、充分に大きなカルス塊となったところでMurashige
およびSkoogの基礎培地に2,4-ジクロルフエノキシ酢酸
10-5Mを含む培地中で増殖させた。
ゼ Y-23 0.05％、マニトール0.25M、ソルビトール0.2
M、塩化カルシウム 3mM、燐酸二水素カリウム0.35mM、
MES緩衝液 3mMで処理し、遊離したプロトプラストをス
テンレス・メッシュで選別し、マニトール・ソルビトー
ル混合液で洗浄したのち培養した。このようにして分離
したプロトプラストは10日後には分裂をおこなってお
り、充分に大きなカルス塊となったところでMurashige
およびSkoogの基礎培地に2,4-ジクロルフエノキシ酢酸
10-5Mを含む培地中で増殖させた。
このように作出したカルスから、2,4-ジクロルフエノキ
シ酢酸を除去し、ついでナフタレン酢酸、ベンジルアデ
ニン、ゼアチン、イースト・エキストラクトを加えた分
化培地に移植し、20〜40日後に復原植物体を得た。
シ酢酸を除去し、ついでナフタレン酢酸、ベンジルアデ
ニン、ゼアチン、イースト・エキストラクトを加えた分
化培地に移植し、20〜40日後に復原植物体を得た。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】イネ科穀物から分離、培養された細胞をカ
ルス形成時から塩あるいは糖濃度が高い培地中で培養す
ることを特徴とするプロトプラスト法による培養細胞の
再分化能および遺伝的特性の保持方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60205263A JPH062054B2 (ja) | 1985-09-19 | 1985-09-19 | プロトプラスト培養によるイネ科穀物の育種方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60205263A JPH062054B2 (ja) | 1985-09-19 | 1985-09-19 | プロトプラスト培養によるイネ科穀物の育種方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6265680A JPS6265680A (ja) | 1987-03-24 |
| JPH062054B2 true JPH062054B2 (ja) | 1994-01-12 |
Family
ID=16504084
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60205263A Expired - Lifetime JPH062054B2 (ja) | 1985-09-19 | 1985-09-19 | プロトプラスト培養によるイネ科穀物の育種方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH062054B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01256381A (ja) * | 1988-03-31 | 1989-10-12 | Plant Genetics Inc | イネカルスの誘導・増植方法 |
| US5173423A (en) * | 1990-02-12 | 1992-12-22 | Sumitomo Chemical Company Limited | Process for breeding a glabrous variety of rice crop and a glabrous plant |
| JPH086469Y2 (ja) * | 1992-11-07 | 1996-02-28 | 株式会社釣研 | 中通しうき用棒状化学発光体取付け具 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS61265022A (ja) * | 1985-05-21 | 1986-11-22 | 三井東圧化学株式会社 | イネプロトプラストからの植物体の再生方法 |
-
1985
- 1985-09-19 JP JP60205263A patent/JPH062054B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 竹内正幸等編「新植物組織培養」朝倉書店（１９７９．９．２０）Ｐ．６５−６６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6265680A (ja) | 1987-03-24 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |