JPH03119938A - イネカルスからの植物体の再分化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、植物組繊培養技術を用いた、イネ（」ユ旦５
ａｔｉｖａ　Ｌ、）植物体のカルスからの植物体再分化
法に関するものである。

［従来技術］ 近年、組織培養技術の発達により、多数の植物で大量増
殖による商業化の可能性が拓けつつある。

イネ（−釘ヱｚａ　　５ａｔｉｖａ　Ｌ、）についても
、大量増殖の可能性を示唆する技術がいくつか報告され
ているが、商業的に適用可能な技術に至っているとは言
い難い。

イネを組織培養によって増殖しようとする場合、次の２
通りが考えられる。まず、第１の方法としては、イネ植
物体ｍ織片より、直接、不定芽または不定胚を分化・誘
導してイネを増殖する方法が考えられる。この技術につ
いては既にり、ｔｌ、Ｌｉｎｇら（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１
ｌ　Ｒｅｐ、＋２，１７２　（１９８３））　、Ｗ、Ｗ
ｅｒｎｉｃｋｅら（Ｚ、Ｐｆｌａｎｚｅｎ　ｐｈｙｓｉ
ｏｌ、、１０３，３６１（１９８１）、Ｅｕｒｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、２４，３４７　（１９８１））　
、Ｄ、Ａ、５ｔｕａｒｔ　ａｎｄ　Ｓ。

Ｇ、　５ｔｒｉｃｋｌａｎｄ　　（国際公開公報　ｗｏ
　８７１０２７０１　）などによって報告されているが
、個体もしくは不定胚の分化・誘導率は大変低く、増殖
効率の点から、商業的な大量増殖技術には至っていない
。

第２の方法として、イネ植物体組織片より、カルスを誘
導・増殖し、カルスから不定芽または不定胚を誘導・作
出し、それらを植物体に再生する方法がある。イネカル
スの誘導には、子房、豹、未熟胚、完熟種子、幼若葉、
根、茎頂、幼穂等多くの部位が外植片として用いられて
いるが、いずれも再分化率が低く、少量の外植片から多
数の再生個体を得る大量増殖技術は開発されていない。

これらは、Ｗ、Ｍ、Ｎａｂｏｒｓ　ａｎｄ　Ｊ、Ｗ、ｔ
ｌｅｙｓｅｒ　　（Ｐｌａｎｔａ１５７．３８５（１９
８３）　）　、Ｓ、Ｓｉｒｉｗａｒｄａｎａ　ａｎｄ　
Ｍ、Ｗ、Ｎａｂｏｒｓ　［ＰＩａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ
、、７３，１４３（１９８３）　）などが指摘するよう
に、外植片から誘導されるカルスには不定胚形成能を持
つカルス、即ちエンプリオジエニイクなカルス（以下、
Ｅカルスと言う）と、不定胚形成能を持たないカルス、
即ちノンエンブリオジェニイクなカルス（以下、ＮＥカ
ルスと言う）の２つがあり、多くの場合、両者は混在し
ている。Ｅカルスの占める割合が高いほど、カルス全体
としての個体再生能力は高いが、通常は、継代・増殖が
進むに従ってＮＥカルスの占有率が高くなり、個体再生
能力は低下する傾向にある。これは、ＥカルスよりもＮ
Ｅカルスの方が増殖速度が早く、またＥカルスはＮＥ化
するが、逆にＮＥカルスがＥ化することはないためと考
えられている。

そこで、再分化率を向上させるためには、外植片からＥ
カルスだけを誘導し、これをＮＥ化させないように継代
・増殖させること、または誘導されたカルスからＥカル
スだけを選別すること、またはＥカルスだけが増殖する
選択的培地を考案することなどが有効と思われるが、各
々で実効性のある技術を確立したという報告は未だない
。

高率で不定胚を誘導した報告例としては、Ｋ。

Ｏｚａｗａ　ａｎｄ＾、Ｋｏｍａｍｉｎｅ　（Ｂｉｏ　
Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　６＋３４３３５０（１，９８９）　
　、　Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅむ、、７７．２
０５−２１１（１９８９）　）が、外植片として「Ｋｏ
ｎａｎｓｏｕ　Ｊ未熟胚を用い、誘導したカルスをプロ
リン及びカゼイン加水分解物を添加した液体増殖培地で
３日毎に継代維持することによりＥカルスを誘導・増殖
させ、固体培地で培養することにより、最高で移植した
カルスの１００％から不定胚を誘導している。しかし、
カルスを誘導する外植片が未熟胚に限定されており、他
の部位を外植片とした場合は当該技術は適用できないこ
とが明らかになっている。未熟胚を外植片とする場合、
外植片の供給が時間的制約を受け、且つ、多大な労力を
要する。外植片として未熟胚を用いても適用範囲が特定
の品種に限られており、通常の栽培品種には適用できな
いことが明らかになっている。また、不定胚からの植物
体の再生については一切開示されていない。

比較的高率で植物体を再生した報告例としては、Ｔ、八
ｂｅ　　ａｎｄ　　Ｙ、Ｆｕｔｓｕｈａｒａ　　　（Ｊ
、ＰＩａｎｔ　　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、１２１１１１−１
１８（１９８５）　）が、ｒＧａｉｙａ　Ｄｈａｎ　Ｔ
ｏｓａｒ」の根由来カルスを２．４−０３ｐｐｍを含む
ＭＳ寒天培地上で継代・増殖させ、これを再分化培地（
Ｋｉｎｅｔｉｎｌｐｐｍ、Ｃａ５ｅｉｎ　２０００ｐｐ
ｍを含むＭＳ寒天培地）に移植することにより、移植し
た６０％のカルスから植物体が再生し、最高で約０．４
５ｇのカルスがら８９木の植物体（２００個体／　１　
ｇカルスに相当）を得ている。Ｎ、Ｖ、Ｒａｇｈａｖａ
　Ｒａｍ　ａｎｄ　Ｍ、Ｗ、Ｎａｂｏｒｓ（Ｐｌａｎｔ
　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ、４．２４１−２１８（１９８５）　）は、ｒＰｏｋ
ｋａｌｉ　」の胚盤由来カルスにおいて、再分化培地（
ＢＡ　０．５ｐｐｍを含むＭＳ寒天培地）へのカルスの
置床密度を６．５ｍｇ／　１　ｍｌとすること、及び培
地のコンディショニング（Ｅカルスを２週間置床後除去
する）を行うことにより、計算上、１ｇのカルスから２
２０本の植物体を得ている。しかし、これらの報告は特
定の品種に関するものであり、彼等の方法を通常の栽培
品種に適用したところ、十分な再分化率は得られなかっ
た。

また、液体培地での不定胚及び胚様体の誘導については
、前述のに、Ｏｚａｗａ　ａｎｄ　Ａ、Ｋｏｍａｍｉｎ
ｅ（１９８９）、Ｔ、Ｙｏｓｈｉｄａ　　（ＢＲＡＩＮ
テクノニュース１３．１−２（１９８８））　、吉川ら
〔育種学雑誌（別２　）　、　１４０−１４１（１９８
８）、同（別１　）　、　６２−６３（１９８９）　）
　、Ｔ、Ａｂｅａｎｄ　Ｙ、Ｆｕｔｓｕｈａｒａ　　（
Ｊａｐａｎ、Ｊ、Ｂｒｅｅｄ、＋３６＋１−６（１９８
６）　）等があるが、適応可能な品種が限られている、
不定胚・胚様体からの苗化については一切開示されてい
ない、イネ植物体の生産効率が非常に低いといった問題
点があげられる。Ｔ、Ｙｏｓｈｉｄａの報告によればＩ
ｇの培養物から得られる植物体数は１８個体と非常に低
い値となっている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、外植片の胚盤よりＥカルスを誘導し、浸透圧
調節剤を含む増殖培地において極めて高い再分化能を保
持したまま増殖させることにより、植物の種類、品種に
制約されることなく、不定胚誘導の特別な過程を経ず、
固体培地に移植したカルスから直接的に、高頻度で安定
し、しかも短期間に植物体の再生を可能とするものであ
る。

また、本発明は液体培地においても、高頻度で安定して
植物体再生能の高い良質の不定胚の誘導を可能とするも
のであり、ジャーファーメンタ−等を用いた大量培養へ
の応用を容易にするものである。さらに、得られた不定
胚は高頻度で植物体に再分化させることが可能である。

［問題解決のための手段］ 本発明者は、イネ植物体の大量増、値方法、即ち、イネ
カルスの誘導方法、イネカル７の増殖方法、再分化方法
を鋭意検討することに１、す、本発明を完成するに至っ
た。

即ち、本発明によりイネ植物体の作出方法は、まず外植
片の胚盤からカルスを誘導しこれを前記胚盤より摘出し
、得られた該カルスを、少なくとも無機塩類、炭素源、
浸透圧ｓＩ！節剤及び１種または２種以上のオーキシン
を含む液体培地で培養し増殖させる。さらに好ましくは
、ＥカルスのＮＥ化の防止、増殖効率をふまえ増殖培地
での継代培養を１週間毎に行う。ついで増殖した該カル
スから、効率よく再分化させるために、少なくとも無機
塩類、炭素源を含む培地へ該カルスを移植し培養するこ
と、を特徴とするものである。

（発明の詳細な説明〕 ｌ）カルスの誘導に用いる植物体 本発明において、適応可能なイネ品種は、特に限定され
るものではなく、例えばジャポニカ、インデイカ、ジャ
バニカ、アフリカ稲及びこれらの雑種等を挙げることが
できる。

２）カルスの誘導に用いる外植片 カルスの誘導に用いる外植片として、イネの胚盤を含む
外植片を用いる。前記外植片としては、イネの種子自体
、前記種子より旺盛部分を摘出したもの、不定胚より得
られたもの等がある。

３）Ｅカルスの誘導 外植片からカルスを誘導するための培地（以下、「誘導
培地」という）は、少なくとも無機塩類、１種または２
種以上のオーキシン、炭素源を必須成分とし、浸透圧調
節剤、ビタミン類、アミノ酸類、カゼイン加水分解物、
ｐ　ｌ　調節剤等を必要に応じて添加したものである。

具体的には従来から植物の組織培養に用いられている基
本培地、例えば、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｉｇｅ、　Ｓｋ
ｏｏｇ：Ｐｈｙｓｉｏｌ、ＰＩａｎｔ、、１５゜４７３
−４９７（１９６２）　］　、Ｎ　６培地（Ｃｈｕ　ｅ
ｔ　ａｌ、：Ｓｃｉ、Ｓｉｎ、、１８，６５８−６６８
（１９７５））等にオーキシンを添加して調整される液
体培地もしくは固体培地を例示することができる。これ
らの従来公知の培地の組成等は、例えば、属国及び駒嶺
著［植物細胞組織培養Ｊ　ｐ３９０−３９１．理工７社
、１９８４年に記載されている。培地の炭素源としては
シュークロース、グルコース、フルクトース、マルトー
ス等を例示でき、その濃度は、０．１％〜１０％が好ま
しく、０．５％〜６％で用いることが特に好ましい。オ
ーキシンとしては、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（
２，４−Ｄ　）、インドール−３−酢酸（ＩＡＡ）、ナ
フタレン酢酸（ＮＡＡ）等を例示でき、これらを単独で
使用することができるが、組み合わせて使用することも
できる。その添加濃度は、２．４−Ｄの場合、０．１〜
２０ｐｐｍで用いることが好ましく、２〜６　ｐｐｍが
特に好ましい。浸透圧調節剤としてはソルビトール、マ
ンニトール等を例示でき、濃度としては０．５〜１２％
（Ｗ／Ｖ）が好ましく、１〜６％が特に好ましい。アミ
ノ酸類としてはＬ−プロリン等を例示でき、１〜１００
ｍＭの濃度で添加することが好ましい。

カゼイン加水分解物は、１０〜５００ｐｐｍの濃度で添
加することが好ましい。ｐ　１１３［節剤としてはＭＥ
Ｓ　（２−（Ｎ−Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅ
ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ、ｍｏｎｏｈｙｄｒａｔｅ
）等を例示でき、培地のｐ）Ｉは５．４〜６．４に調整
することが好ましい。固体培地を調整する際の培地のゲ
ル化剤としては寒天、ゲルライト等を例示でき、これら
の濃度は寒天０．８〜１％、ゲルライト０．２〜０．３
％が好ましい。

次に、外植片からＥカルスを誘導するための具体的な培
養条件を以下に記す。上述した誘導培地をまず調整し、
無菌の、または無菌化した外植片を置床する。外植片の
無菌化は、常法に従いエチルアルコール、次亜塩素酸ナ
トリウム水溶液等を用い実施できる。外植片を置床後、
１５〜３５°Ｃ（好ましくは２５〜３２°Ｃ）の温度下
、静置もしくは振とう培養することによりＥカルスが得
られる。

４）Ｅカルスの増殖 Ｅカルスを増殖させるための培地（以下、「増殖培地」
という）は、少なくとも無機塩類、１種または２種以上
のオーキシン、炭素源、浸透圧調節剤を必須成分とし、
ビタミン類、アミノ酸類、カゼイン加水分解物、ｐＨ調
節剤等を必要に応じて添加したものである。具体的には
上記の誘導培地に浸透圧調節剤を添加した液体培地を例
示できる。

浸透圧調節剤としてはソルビトールまたはマンニトール
等を例示でき、濃度としては１〜１０％（Ｗ／Ｖ）が好
ましく、１〜６％が特に好ましい。Ｅカルスを誘導する
際に、誘導培地に添加すると好ましい結果が得られるビ
タミン類、アミノ酸類、カゼイン加水分解物、ｐＨ調節
剤等は、Ｅカルスの増殖においても同様な結果を有する
。

誘導されたＥカルスの具体的培養条件を以下に示す。上
記の誘導工程により、外植片からカルスが誘導されたら
、カルスを外植片から取り除き、増殖培地に移植し、誘
導工程と同じ条件で培養することによりＥカルスが増殖
される。また、増殖培地でのカルスの継代を１週間毎に
行うことにより、より好ましい結果が得られる。

このようにして得られたカルスは従来知られている０、
２〜０．３％ゲルライト等でゲル化した固体の不定胚誘
導培地に塗布した場合、極めて高い効率で不定胚が得ら
れる。さらに、この高い不定胚形成能力は２年以上保つ
ことができた。また、当該カルスは次に述べるような液
体培地においても極めて効率よく不定胚を誘導すること
ができる。

５）Ｅカルスからの不定胚の誘導 不定胚誘導培地は、少なくとも無機塩類、炭素源を必須
成分とし、必要に応じて植物成長調節物質、浸透圧調節
剤、ビタミン類、アミノ酸類、カゼイン加水分解物、ｐ
Ｈ調節剤等を添加した液体培地である。具体的には前記
ＭＳ培地、Ｎ６培地等を例示することができ、その無機
塩類は１７８〜４倍の濃度で用いることが好ましく、１
７４〜２倍の濃度で用いることが特に好ましい。炭素源
としてはシュークロース、グルコース、フルクトース、
マルトース等を例示でき、その濃度は、０．１％〜１０
％が好ましく、０．５％〜６％で用いることが特に好ま
しい。植物成長調節物質としてオーキシン、サイトカイ
ニン、アブシジン酸（ＡＢＡ）を例示することができ、
これらを単独で使用することができるが組み合わせるこ
とにより、より良好な結果が得られる。オーキシンとし
てＮＡＡ、　ＩＡＡ、２．４−Ｄ等を例示することがで
き、濃度としてはＮＡＡ及びｒＡＡ　Ｏ，０１〜１０ｐ
ｐｍ　、　２．４−Ｄ　Ｏ，００１〜０．ｌｐｐｍが好
ましく、ＮＡＡ　０．０４〜０．５ｐｐｍが特に好まし
い。また、これらを単独で使用することができるが、組
み合わせて使用することもできる。サイトカイニンとし
てＫｉｎｅｔｉｎ　、ベンジルアデニン（ＢＡ）、Ｚｅ
ａｔｉｎ等を例示することができ、０゜０１〜１０ｐｐ
ｍの濃度が好ましく、これらを単独で使用することがで
きるが、組み合わせて使用することもできる。ＡＢＡは
０〜Ｑ、　３　ｐｐｍの濃度が好ましい。

浸透圧調節剤としてはソルビトール、マンニトール等が
挙げられ、濃度として、０．５〜１２％（Ｗ／Ｖ）が好
ましく、１〜６％が特に好ましい。アミノ酸類としては
Ｌ７−プロリン等を例示でき、１〜１００ｍＭの濃度で
添加することが好ましい。カゼイン加水分解物は、１．
　Ｏ〜５０００ｐｐｍの濃度で添加することが好ましい
。ｐＨ調節剤としてはＭＥＳが挙げられ、濃度は１ｍＭ
〜４０ｍＭが好ましい。　次に、不定胚を誘導するため
の具体的な方法を以下に記す。増殖工程で得られたＥカ
ルスを収穫し、不定胚誘導培地に移植し、１５〜３５°
Ｃ（好ましくは２５〜３２°Ｃ）の温度で培養すること
により不定胚が誘導される。

６）不定胚からの植物体への再生 上述の不定胚誘導工程で得られた不定胚を下記の植物体
再生培地（以下、「苗化培地」と記す）へ移植し培養す
ることにより、イネ植物体を得ることができる。

苗化培地は、少なくとも無機塩類、炭素源を必須成分と
し、必要に応じて植物成長調節物質、浸透圧調節剤、ビ
タミン類、アミノ酸類、カゼイン加水分解物、ｐＨ調節
剤等を添加した固体培地である。具体的には前記ＭＳ培
地、Ｎ６培地等を例示することができ、炭素源としては
シュークロース、グルコース、フルクトース、マルトー
ス等ヲ例示でき、その濃度は、０．１％〜１０％が好ま
しく、０．５％〜６％で用いることが特に好ましい。

植物成長調節物質としてオーキシン、サイトカイニンを
例示することができ、これらを単独で使用することがで
きるが組み合わせることにより、より良好な結果が得ら
れる。オーキシンとしてはＮＡＡ、ＩＡＡ　、２．４−
Ｄ等を例示することができ、濃度としてはＮＡＡ及び１
４Ａ０．０１〜ＩＯｐｐｍ、２．４−Ｄｏ、００１〜０
．ｌｐｐｍが好ましく、また、これらを単独で使用する
ことができるが、組み合わせて使用することもできる。

サイトカイニンとしてはＫｉｎｅｔｉｎ、ＢＡ、　Ｚｅ
ａｔｉｎ等を例示することができ、０．Ｏ１〜１、０　
ｐ　ｐ　ｍの濃度が好ましい。浸透圧調節剤としてはソ
ルビトール、マンニトール等を例示でき、濃度としては
０．５〜１２％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、１〜６％が特に
好ましい。アミノ酸類としてはＬ−ブロリン等を例示で
き、１〜１００ｍＭの濃度で添加することが好ましい。

カゼイン加水分解物は、１０〜５０００ｐｐｍの濃度で
添加することが好ましい。培地のゲル化剤としては寒天
、ゲルライト等を例示することができ、その濃度は寒天
０．８〜１．８％、ゲルライト０．２〜０．９％で用い
ることが好ましい。特に、固体培地の通常用いられるゲ
ル化剤の濃度の約１．５倍以上の、寒天１．２〜１．６
％、ゲルライト０．４〜０．８％で用いることにより、
より好ましい結果が得られる。また、ゲル化剤の代わり
に市販のポリエステル等の培地支持体も利用でき、例え
ば、ブランチ・ノクス（東洋紡）を例示できる。

上記の苗化培地に、不定胚を置床し、１５〜３５°Ｃ（
好ましくは２５〜３２°Ｃ）の温度で培養することによ
り、イネ植物体が作出できる。また、苗化培地に不定胚
を置床する前に不定胚の脱水処理を行なうことにより、
より好ましい結果が得られる。

なお、不定胚を固体培地で培養する前に、脱水処理を行
うと、苗化率の向上が見られ、この場合の脱水処理は、
例えば風乾処理でよい。

７）カルスからの直接的植物体再生 Ｅカルスを下記の直接的植物体再生培地（以下、「直接
苗化培地」と記す）に移植することにより特別な不定胚
誘導の過程を経ずに直接的にイネ植物体を得ることがで
きる。

直接苗化培地は、少なくとも無機塩類、炭素源を必須成
分とし、必要に応じて、植物成長調節物質、浸透圧調節
剤、ビタミン類、アミノ酸類、カゼイン加水分解物、ｐ
＋＋調節剤、ゲル化剤等を添加したものである。具体的
には前記のＭＳ培地、Ｎ６培地等を例示することができ
る。炭素源としてはシュークロース、グルコース、フル
クトース、マルトース等を例示でき、その濃度は、０．
１％〜１０％が好ましく、０．５％〜６％で用いること
が特に好ましい。

植物成長調節物質としてはオーキシン、サイトカイニン
を例示することができ、これらを単独で使用することが
できるが組み合わせることにより、より良好な結果が得
られる。オーキシンとしてはＮＡ４、■八八、２．４−
Ｄ等を例示することができ、濃度としてはＮＩ’ｌＡ　
、及びＩＡＡ　　Ｏ，０１〜１０ｐｐｍ　、２，４Ｄ　
　Ｏ，００１〜Ｏ，ｌｐｐｍが好ましく、また、これら
を単独で使用することができるが、組み合わせで使用す
ることもできる。サイトカイニンとしてはＫｉｎｅｔｉ
ｎ　、　ＢＡ、Ｚｅａｔｉｎ等を例示することができ、
０゜０１〜１０ｐｐｍの濃度が好ましく、Ａｌ１八はＯ
〜０．３ｐｐｍの濃度が好ましい。浸透圧調節剤として
はソルビトール、マンニトール等を例示でき、濃度とし
ては０．５〜１２％（Ｗ／Ｖ）が好ましく、１〜６％が
特に好ましい。アミノ酸類としてはＬプロリン等を例示
でき、１〜１００ｍＭの濃度で添加することが好ましい
が、１〜２０ｍＭが特に好ましい。カゼイン加水分解物
は、１０〜５０００ｐｐｍの濃度で添加することが好ま
しいが、１００〜２０００ｐｐｍが特に好ましい。培地
のゲル剤としては寒天、ゲルライト等を例示することが
でき、その濃度は寒天０．８〜１．　８％、ゲルライト
０．２〜０．９％で用いることが好ましいが、特に、固
体培地の通常用いられるゲル化剤の濃度の約　１．５倍
以上の、寒天１．２〜１゜６％、ゲルライト０．４〜０
．８％で用いることにより、より好ましい結果が得られ
る。また、ゲル化剤の代わりに市販のポリエステル製等
の培地支持体も利用でき、例えば、プランテックス（東
洋紡）を例示できる。

上記の直接苗化培地に、Ｅカルスを置床し、１５〜３５
°Ｃ（好ましくは２５〜３２°Ｃ）の温度で培養するこ
とにより、イネ植物体が作出できる。

〔実施例〕

実施例１ イネ品種ｒｓａｓａｎｉｓｈｉｋｉ　」の完熟種子を剥
皮後、７０％エタノールで５秒間処理し、次亜塩素酸ナ
トリウム（有効塩素濃度ｌＯ％）で３０分間処理するこ
とにより殺菌し、滅菌水でよく洗浄した後、下記の誘導
培地上に置床した。２７℃、暗黒下で１０日間培養し、
胚盤の部分から生じたカルスを摘出し、カルス誘導培地
と同一の培地に移植し、１４日間さらに培養を続け、下
記の増殖培地に移植した。カルスは１週間毎に新鮮な増
殖培地に移植し、　　１６時間日長下（明期３０°Ｃ１
暗期２５’ｃ　）、　　９０ｒｐｍで旋回培養を行ない
継代維持した。液体増殖培地ＩＬ当り約ＬｏｇＯカルス
を置床し、１週間当りのカルスの生重量の増加は約５０
週間に亘り、３．７〜４．７倍で安定していた。

〈誘導培地−１〉 １％　シュークロース、３％　ソルビトール、１２ｍＭ
プロリン、１１００ｐｐ力ゼイン加水分解物、５ｉＭ　
　ＭＥＳ、　４ｐｐｍ　２．４−Ｄ、０．２％　ゲルラ
イトを含むＮ６固体培地。

〈増殖培地〉 １％　シュークロース、３％　ソルビトール、１２ｍＭ
　　プロリン、１１００ｐｐ力ゼイン加水分解物、５ｍ
Ｍ　　ＭＥＳ、４ｐｐｍ２．４　　Ｄを含むＮ６液体培
地。

液体増殖培地で数代継代したカルスを下記の不定胚誘導
培地に移植し、１６時間日長下（明ｉｙ＋　３０°Ｃ１
暗期２５°Ｃ）、　　１２Ｏｒｐｍで旋回培養を行った
ところ、約１週間口から不定胚が観察され、その後４週
間程連続して観察された。

また、得られた不定胚を下記の苗化培地で１６時間日長
下（明期３０°Ｃ１暗期２５°Ｃ）で静置培養した結果
、不定胚の約１５％が茎葉部が１　ｃｍ以上の幼植物体
へと再生した。

〈不定胚誘導培地−１〉 １％　シュークロース、３％　ソルビトール、２０００
ｐｐｍカゼイン加水分解物、５ｍＭＭＥＳを含むＭＳ液
体培地。

く苗化培地〉 ３％　シュークロース、２０００ｐｐｍカゼイン加水分
解物、５ｍＭ　　ＭＥＳ、０．５ｐｐｍカイネチン、０
、３％　ゲルライトを含むＭＳ固体培地。

実施例２ 実施例１と同様に殺菌した完熟種子を下記の誘導培地（
誘導培地−２）に置床し、１６時間日長下（明３１Ｊ１
３０°Ｃ１暗期２５°Ｃ）、９０ｒｐｍで１４４日間置
培養を行ない、旺盛よりカルスの誘導を行った。培地中
に遊離してきたカルスを回収し、下記の誘導培地（誘導
培地−２）と同一の培地で継代・増殖させた。　このカ
ルスを用いて実施例１と同様に不定胚を誘導した結果、
実施例１の結果と同様に不定胚が誘導された。

〈誘導培地−２〉 １％　シュークロース、３％　ソルビトール、１１００
ｐｐ力ゼイン加水分解物、４ｐｐｍ２．４−Ｄを含むＭ
Ｓ液体培地 実施例３ 実施例１において誘導し増殖させたカルスを用い、実施
例１に示した不定胚の誘導を行う際に不定胚誘導培地中
のＭＳ無機塩類を〜６無機塩類に変更しても同様の結果
が得られた。

実施例４ 実施例１において誘導し増殖させたカルスを用い、実施
例１に示した不定胚の誘導を行う隙に不定胚誘導培地に
ＮＡＡを０．０４〜０．４　ｐｐｍの範囲で添加したと
ころ、不定胚誘導培地に移植したカルス当りの不定胚数
が向上した。

実施例５ 実施例１において誘導し増殖させたカルスを用い、実施
例１に示した不定胚の誘導を行う際に不定胚誘導培地に
ＮＡＡをＱ、４ｐｐｍ、カイネチンを０．５ｐｐｍ、プ
ロリンを１２ｍＭ添加した培地（不定胚誘導培地−２）
で培養したところ、さらに良好な結果が得られ、カルス
２０ｍｇ当たり７２個体の不定胚（カルス１ｇ当り３６
００個の不定胚に相当）が得られた。

く不定胚誘導培地−２〉 １％　シュークロース、３％　ソルビトール、０．４ｐ
ｐｍＮＡＡ、０゜５　ｐｐｍカイネチン、１２ｍ１プロ
リン、２０００ｐｐｍカゼイン加水分解物、５ｍＭＭＥ
Ｓを含むＭＳ液体培地 実施例６ 実施例５に示した不定胚誘導培地（不定胚誘導培地−２
）で得られた不定胚を脱水処理の有無、下記の苗化培地
のゲルライトａ度を０．３％及び０．６％と変更したも
ので１６時間日長下（明ｕｐ　ｓ　。

゛Ｃ８暗朋２５°Ｃ）で静置培養した結果を表１に示す
。なお、脱水処理は不定胚をろ紙上に２日間置き、風乾
することにより実施した。

表１　不定胚の苗化率 ％が茎葉部が１　ｃｍ以上の幼植物体へと再生した。

実施例７ 実施例１において誘導し増殖させたカルスを用い、下記
の直接苗化培地のゲル化剤（寒天、ゲルライト）の濃度
を変更した培地に移植し、１６時間日長下（明朗３０℃
、暗Ｍ２５°Ｃ）で静地培養を行った結果を表２に示す
。

（本頁以下余白） 〈苗化培地〉 ３％　シュークロース、２０００ｐｐｍカゼイン加水分
解物、５ｍＭ　　ＭＥＳ、Ｏ；５ｐｐｍカイネチン、０
、３％ゲルライトを含むＭＳ固体培地（結果）脱水処理
及びゲルライトの濃度を０．６％と高くすることにより
、不定胚の苗化率が向上し、両者を同時に実施すること
により不定胚の７５表２　カルスからの直接苗化 ゲルライト濃度（％） ０．２　０．３　０．４　０．５　０．６　０．７　０
．８　０．９１　　４　５．２　４．８　５．２　３゜
６　２．６　２．２寒天濃度（％） ０．８　　　　１．４ く直接苗化培地−１〉 ３％　シュークロース、２０００ｐｐｍカゼイン加水分
解物、５ｍＭ　　ＭＥＳ、０．５　ｐｐｍカイネチン、
ゲル化剤を含むＭＳ固体培地 （結果）ゲルライト、寒天の濃度を通常用いられる濃度
より高くすることにより、再分化率が向上した。

実施例８ 実施例１において誘導し増殖させたカルスを用い、実施
例１に示したように液体増殖培地で数代継代したカルス
を下記の直接苗化培地に移植し、１６時間日長下（明期
３０°Ｃ１暗期２５°Ｃ）で静地培養を行ったところ、
カルス２０■当り６８個体の植物体（カルスＩｇ当り３
４００個体に相当）が得られた。

〈直接苗化培地−２〉 １％　シュークロース、３％　ソルビトール、１００　
ｐｐｍカゼイン加水分解物、５ｍＭ　　ＭＥＳ、０．５
ｐｐｍＮＡＡ、２　ｐｐｍカイネチン、０．３％ゲルラ
イトを含むＭＳ固体培地 実施例９ 実施例８の直接苗化培地のカゼイン加水分解物の濃度を
ｌｏｏｏｐｐｍに改変し、さらに１ｍＭのプロリンを添
加することにより（下記の直接苗化培地−３）、カルス
１２■当り４５個体の植物体（カルス１ｇ当り３７５０
個体に相当）が得られた。

〈直接苗化培地−３〉 １％　シュークロース、３％　ソルビトール、１ｍＭ　
　プロリン、１１０００ｐｐ力ゼイン加水分解物、５ｍ
Ｍ　　ＭＥＳ、０．５ｐｐＩＩＩＮＡＡ、２ｐｐｍカイ
ネチン、０．３％ゲルライトを含むＭＳ固体培地（発明
の効果〕 本発明により、Ｅカルスを誘導・増殖させることが可能
となり、植物体の再生率・液体培地中での不定胚誘導率
は従来法に比べ著しく向上した。

また、良質の不定胚が得られるようになり、不定胚から
の植物体再生率も著しく向上した。すなわち、本発明は
、本発明で得たＥカルスから植物体を誘導することによ
り、イネのクローン増殖を可能とする。また、本発明に
より不定胚誘導の過程を液体培地で行うことが可能とな
り、タンク培養等による大量生産が可能となった。組織
培養によるクローン増殖技術は採種のための圃場を必要
とせず、自然条件にも左右されることなく、工業的にイ
ネ幼植物体（即ち苗）を生産することを可能とする。ま
た、本発明では固定品種のみならず未固定品種にも適用
可能であり、従来、品種となり得なかった交配後代の未
固定系統等をも品種ならしめることが可能である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、イネの胚盤を含む外植片を、少なくとも無機塩類、
   炭素源、１種または２種以上のオーキシンを含む培地で
   培養して、前記胚盤からカルスを誘導し、前記カルスを
   前記の胚盤の部分より摘出することを特徴とする、再分
   化能の極めて高いカルスの生産方法。 ２、請求項１記載の方法でイネカルスを生産し、ついで
   、このカルスを少なくとも無機塩類、炭素源、１種また
   は２種以上のオーキシン、浸透圧調節剤を含む液体培地
   で培養することにより、再分化能を維持したままカルス
   を増殖することを特徴とするイネカルスの増殖方法。 ３、請求項２記載の方法でイネカルスを増殖し、このカ
   ルスを少なくとも無機塩類、炭素源を含む液体培地で培
   養し、イネの不定胚を誘導する方法。 ４、請求項３記載の方法でイネの不定胚を誘導し、この
   不定胚を、少なくとも無機塩類、炭素源を含む固体培地
   で培養し、イネの植物体へ再分化させる方法。 ５、固体培地のゲル化剤の濃度が通常用いられる濃度の
   約１．５倍以上であることを特徴とする請求項４記載の
   方法。 ６、不定胚を固体培地で培養する前に、脱水処理するこ
   とを特徴とする請求項４記載の方法。 ７、請求項２記載の方法でイネカルスを増殖し、このカ
   ルスを少なくとも無機塩類、炭素源を含む固体培地で培
   養し、イネの植物体へ再分化させる方法。 ８、固体培地のゲル化剤の濃度が通常用いられる濃度の
   約１．５倍以上であることを特徴とする請求項７記載の
   方法。