CN86103448B - 由原生质体再生稻株的方法 - Google Patents

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Abstract

由原生质体生成完全的水稻植株的方法。为得到此原生质体，由稻种的坯、盾片或坯根衍生出愈伤组织，在液体培养基中培养愈伤组织以形成易放出原生质体的细胞团。用原生质体释放酶溶液处理细胞团以得到原生质体。然后将原生质体培养成愈伤组织，再在分化培养基中培养此愈伤组织，再生出整株稻。

Description

由原生质体再生稻株的方法
本发明涉及一种用所谓原生质体法形成稻株的方法。更确切地说，本发明涉及一种由原生质体衍生出愈伤组织，再由它再生出稻株的方法，原生质体则来自于由稻种的胚、盾片或胚根产生的愈伤组织。
原生质体是植物、细菌、真菌之类的除去了细胞壁的细胞。因为原生质体没有细胞壁，故易于经受人工处理，例如细胞融合、基因控制、以及人为的体细胞突变等。于是，如果能由所处理的原生质体再生出一个完整的植株，则可能获得一种植物，它具有野生植物所没有的优点。作为发展这种所谓的原生质体法的第一步，对于所要研究的每个具体的有机体，都必须建立能够由原生质体再生出完整植株的方法。
对于双子叶植物，例如烟草，已知有一些方法可用来从原生质体中再生出完整的植株。在这方面常用的方法包括将原生质体埋置在半固态的琼脂培养基中、悬在液体培养基中、或利用喂养细胞培养等各种培养原生质体的方法。但是已经发现这些方法对于水稻原生质体的培养是无效的，如果用上述常规方法之一进行水稻原生质体的培养，原生质体不是死掉就是不能生长。
关于水稻原生物体的培养技术已有报导，由缺乏硝酸还原酶的细胞得到的原生质体衍生出愈伤组织（Wakasa et al.，J.plant physiol.117：pp.223-231，1984）。还有报导说，由花粉的愈伤组织得到的原生质体衍生出愈伤组织，从它产生出苗（ohno et al.，Japanese Journal of Breeding35：pp.54-55，1985）。但是还未曾有从水稻原生质体中再生出完整稻株的报导。
另一方面，很多研究者报导过，由水稻的培养细胞再生出完整植株（Nishi et al.，Nature 219：pp.508-509，1968）。但是，这些方法没有利用原生质体。另外还发现，用这些方法由具有高度分化能力的细胞很难得到原生质体。而且原生质体难以培养。
于是，如果建立起一种能由原生质体再生出完整水稻植株的方法，关于创造具有优异性能的水稻品种的研究就会前进一大步。
因此，本发明的目的是提供一种能够由原生质体再生出完整稻株[稻属作物，例如亚洲稻（Oryza sativa）、非洲稻（Oryza glaberrima）、多年生稻（Oryza perennis）等等]的方法。
在本发明的方法中，由水稻种子的胚、盾片或胚根中衍生出第一个愈伤组织，然后将其在液体培养基中培养，形成易于释放出原生质的细胞团。此细胞团用释放原生质的酶溶液处理以形成原生质体。将原生质体培养成第二个愈伤组织，在分化培养基中培养，再生出完整的植株。
利用本发明，第一次由原生质体再生出一个完整的稻株（属于稻属，例如亚洲稻、非洲稻、多年生稻等等）。
在本发明的方法中的第一步，由水稻种子的胚、盾片和胚根衍生出具有高度分化能力的愈伤组织，这可以用在琼脂培养基中培养得自水稻种子的胚、盾片或胚根的细胞来实现。培养基可以是MS培养基（Murashige和Skoog，physiol.plant.15，pp.473-479，（1962）），B5培养基[Gamborg et al.，Exp.Cell Res.50，pp.151-158，（1968）]，或N6培养基（Chu et al.Scientia Scinica 18 pp.659-663），R2培养基（Ohira et al.，plant Cell physiol.14，pp.1113-1121）。每种培养基含有：（1）0.01-1%（重量）的酵母抽提取，0.01-1%（重量）的麦芽汁，0.01-1%（重量）的酪蛋白水解物，或5-20%（重量）的马铃薯抽提物，（2）0.1-10mg/l的2，4-二氯苯氧基乙酸（以后称作2，4-D），它是一种植物激素，和（3）0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。培养温度可以从约20℃至约30℃，最好是26℃左右。可以采用继代培养的方式进行培养，由继代培养中得到愈伤组织。例如，可以每四周一次进行继代培养，直至得到愈伤组织。
这样得到的愈伤组织具有高度分化能力，但是难以从这些愈伤组织直接得到原生质体。于是在本发明中，先从愈伤组织得到小的细胞团，再由它们得到原生质。这些细胞团仍具有高的分化能力，但易于形成原生质体。
因此，本发明的第二步是由上述的第一步得到的愈伤组织形成一个细胞团，它仍保持着高度分化能力，但容易释放出原生质体。这一步可以通过在MS、N6或R2的液体培养基中培养愈伤组织来进行。每种培养基中含有：（1）0.1-1%（重量）的酵母抽提物，0.1-1（重量）的麦芽汁，0.1-1%（重量）的酪蛋白水解物，或5-20%（重量）的马铃薯抽提物，（2）0.1-10mg/l的2，4-D，和（3）0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。培养基中细胞的群体密度最好是0.3到3%（重量）。培养温度可为约20至30℃，可以继代培养的方式进行培养，由继代培养中得到细胞团。继代培养可以一周一次地进行。还可以采用转动培养的方式进行培养的方式进行培养，此时液体培养基的容器在某一转速，例如70转/分下水平地旋转。通过这种培养，可以得到直径为1到3mm的、仍保持高度分化能力的细胞团。
本发明的第三步是从第二步得到的细胞团中得出原生质体。这可以通过用形成原生质体的酶溶液处理细胞团来完成。举例来说，此溶液可以含有0.1-10%、最好是1-5%（重量）的纤维素酶，0.1-5%，最好是0.5-2%（重量）的浸解酶，0-5%、最好是0.1-1%（重量）的氯化钙，以及0-5%、最好是0.1-1%（重量）的葡聚糖硫酸酯的钾盐。此溶液还可以含有3-15%（重量）的甘露糖醇作为调节渗透作用的渗压剂。溶液的pH可为5.5，细胞团可在摇动下于酶溶液中在20-30℃孵化四至八小时。经过这样处理，细胞团可释放出大量的原生质体。将含有原生质体的酶溶液过滤以除去未消化的细胞团，在例如50克下离心滤液，收集原生质体。
本发明的第四步是培养这样得到的原生质体以产生愈伤组织。已经知道当愈伤组织连续地继代培养时其分化能力急剧下降。如果愈伤组织的分化能力低，则不能由它得到完整植株，因此，在这一步维持所要培养的细胞的高分化能力很重要。根据本发明，这可以用在N6、B5或R2培养基的条件培养基中培养原生质体来实现，每一种培养基中含有：（1）0.1-1%（重量）的酵母抽提物，0.1-1%（重量）的麦芽汁，0.1-1%（重量）的酪蛋白水解物，或5-20%（重量）的马铃薯抽提物，（2）0.1-10mg/l的2，4-D，和（3）0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。在上述第二步中使用的培养基的滤液可以方便地用作条件培养基。这时可以在滤液中补充新鲜的培养基。另外，本发明人曾发现，不用常规的渗压剂、例如甘露糖醇或它与蔗糖的混合物，而用蔗糖来调节培养基的渗透作用，可以促进原生质的分裂。于是，条件培养基中可以含有例如0.4M的蔗糖。培养基的pH最好是用盐酸调到5.2或更低。条件培养基中最好补加2，4-D以促进原生质体的增殖能力。另外，培养基的容器最好涂上亲水支持体，例如半固态的琼脂、藻酸、明胶等等，支持体中含有渗压剂，培养基置于亲水支持体层之上，其厚度为100-400微米、最好是200-300微米。与将介质放在未涂琼脂的容器中的情形相比，这样作的结果使细胞更多地与空气或氧接触。这是因为，若无琼脂涂层，培养基由于自身的表面张力而形成球形水滴，故每单位体积的介质与空气的接触面积减小;而当培养基置于琼脂层上时，琼脂层降低了培养基的表面张力，从而得到了200-300微米厚的培养基层，它具有较大的空气接触面积。本发明人发现，培养的需养条件对原生质生长很重要。琼脂层的厚度应为1毫米或更小。最好是200微米或更薄。随着培养的进行，培养基可能被补加的含有较低浓度渗压剂（例如蔗糖）的新鲜培养基所稀释。培养可以在大约20°-30℃的温度下进行，最好是27℃左右，直到得到愈伤组织。原生质体的群体密度应为104-107原生质体/毫升，最好是105-5×106原生质体/毫升。
在本发明的第五步中，通过在分化培养基中培养第四步中得到的愈伤组织的方法，再生出完整的水稻植株。这一步用的分化培养基可以是MS培养基，它含有;（1）0.1-1%（重量）的酵母抽提物，0.1-1%（重量）的麦芽汁，0.1-1%（重量）的酪蛋白水解物，或5-20%（重量）的马铃薯抽提物，和（2）0-10mg/l的苄基腺嘌呤或0-10mg/l的激动素，培养温度可为约20至30℃。在分化培养基中培养愈伤组织之前，最好先在生长培养基中培养。生长培养基可以是R2、N6或MS培养基，每一种里含有：（1）0.1-1%（重量）的酵母抽提物，0.1-1%（重量）的麦芽汁，0.1-1%（重量）的酪蛋白水解物，或5-20%（重量）的马铃薯抽提物，（2）0.1-10mg/l的2，4-D，以及（3）0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。培养温度可为约20至30℃。
通过下列例证将更易了解本发明。应该注意，下列例证仅作为说明用，本发明的应用范围决不限于此。
例1-Ⅰ具有高度分化能力的愈伤组织的诱导及其继代培养
水稻种（亚洲稻Oryza sativa栽培品系，品种：Nihonbare）在70%的乙醇水溶液中浸渍1分钟，而后在次氯酸钠水溶液[氯含量5%（重量）]中浸15分钟。用已灭菌的水洗种子三次，将种子种在N6琼脂培养基上，培养基中含有0.3%（重量）的酪蛋白水解物，2ppm的2，4-D和1ppm的苄基腺嘌呤。在26℃培养三周之后，由种子的盾片形成了愈伤组织。将这些愈伤组织在同样的条件下每四周继代培养一次。
例1-Ⅱ具有高度分化能力的愈伤组织的诱导及继代培养
将未成熟的水稻种（亚洲稻Oryza Sativa栽培品系，品种：Sasanishiki）在70%乙醇水溶液中浸泡1分钟以消毒其外表面，然后用已灭菌的水洗。由具外果壳的种子中取出未成熟的胚，将其种在含有0.3%（重量）酵母抽提物和2ppm2，4-D的MS琼脂培养基上。在26℃培养三周后生成愈伤组织。这些愈伤组织在同样条件下每四周一次进行继代培养。
例1-Ⅲ具有高度分化能力的愈伤组织的诱导与继代培养
将灭过菌的水稻（Oryza sativa栽培品系，品种：Koshihikari）种在由琼脂构成的培养基上，一周后，将长出的胚芽割下种在含有2ppm2，4-D的B5培养基上。在26℃下培养三周后生成了愈伤组织。这些愈伤组织在同样条件下每四周一次进行继代培养。
例2衍生出的愈伤组织在液体在培养基中的培养
将由例1-Ⅰ、1-Ⅱ。和1-Ⅲ中继代培养得到的愈伤组织转移到表1所列的液体培养基中进行继代培养。取30ml的各种液体培养基置于100ml瓶中，细胞在这些培养基中培养，其间在26℃下以70转/分的速度转动该瓶。每周进行一次继代培养。培养基中的细胞含量在培养开始时约为0.3%（重量），在结束时约为3%（重量）。
表1 液体培养基的成分
基础培养基 有其添加物 2，4-D 激动素 BA
MS CH0.1%(重量) 2.0mg/l 0 0
N6 YE0.3%(重量) 2.0mg/l 0 1.0mg/l
R2 PE10.0%(重量) 5.0mg/l 2.0mg/l 0
R2 CH0.2%(重量) 1.0mg/l 1.0mg/l 0
CH：酪蛋白水解物
YE：酵母抽提物
PE：马铃薯抽提物
BA：苄基腺嘌呤
例3 原生质体的分离
在继代培养后培养了七天的细胞用作为这一步的起始物。释放原生质的酶溶液中含有4.0%（重量）的纤维素酶（Cellulase）Onozuka RS（Yakult药厂有商品供应），1.0%（重量）的浸解酶（Macerozyme）R-10（Yakult药厂有商品供应），0.5%（重量）的氯化钙，0.5%（重量）的葡聚糖硫酸酯钾盐以及0.4M的甘露糖醇。在27℃下轻轻摇荡含有细胞的溶液6小时以得到原生质体。然后将含原生质体的酶溶液过滤，以除去未消化的细胞团。滤液在50g下离心5分钟使原生质体沉淀。沉下来的原生质体用0.4M的葡萄糖水溶液洗三次，在下一步培养。
例4 原生质体培养基的配方（条件培养基）
将上述例2中的培养基离心以除去细胞，在10ml培养物滤液中加入50μl 100ppm的2，4-D溶液和0.4M蔗糖，溶液的pH用0.1N的盐酸调至4.5。在此培养基中，按其体积的1/4加入同样的但是新鲜的基础培养基（例如，在例2中若用R2培养基，则是R2培养基），其中含有0.4M的蔗糖。
例5原生质体的培养
将200ml上述配方的条件培养基放在直径35mm的塑料的陪替氏培养皿中，培养皿底面上涂有一薄层琼脂。再加入30μl含有106原生质/ml的原生质体悬浮液，使混合物均匀铺展。在培养皿封口之后，在27℃下于暗处进行培养。
大约一周之后，观察到第一次分裂，大约一个月后形成了直径约100μm的小细胞团（见表2）。这时往培养物中加入200μl的同样的新鲜基础培养基，但它含的蔗糖较少，为3%（重量）。再过两周，重复同样的操作。在原生质起始培养的两个月之后，形成了直径1mm的小的愈伤组织。
表2
在培养一周之后，每个陪替氏培养皿中小细胞团的数目
基础 培养基 有机添加物 2,4-D 激动素 BA 每个培养 皿中小细 胞团的数 目
N6 N6 B5 R2 R2 MS CH0.3%（重量） YE0.3%（重量） ME0.3%（重量） PE10.0%（重量） YE0.2%（重量） YE0.3%（重量） 2.0mg/l 2.0mg/l 2.0mg/l 5.0mg/l 1.0mg/l 2.0mg/l 2.0mg/l 1.0mg/l 1.0mg/l 1500
1500
1.0mg/l 1200
500
1000
300
MS N6 B5 R2 2.0mg/l 2.0mg/l 2.0mg/l 5.0mg/l 2.0mg/l 0
0
1.0mg/l 0
30
例6 愈伤组织的生长
将由原生质体衍生出的愈伤组织转移到愈伤组织生长培养基中，使愈伤组织在26℃下生长约二周。生长培养基（琼脂）的成分及愈伤组织的生长速度如表3所示。
表3 生长培养基的成分与生长速度
培养基 编号 基础 培养基 有机添加物 2，4-D 激动素 BA ＊生长 速度
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 N6 N6 B5 R2 R2 MS MS N6 B5 R2 CH0.3%（重量） YE0.3%（重量） ME0.5%（重量） PE10.0%（重量） YE0.2%（重量） YE0.3%（重量） 2.0mg/l 2.0mg/l 2.0mg/l 5.0mg/l 1.0mg/l 2.0mg/l 2.0mg/l 2.0mg/l 2.0mg/l 5.0mg/l 2.0mg/l 1.0mg/l 1.0mg/l 1.0mg/l 1.0mg/l 2.0mg/l ++ ++ + ± ++ +++ ++ ++ + +
＊+++很高 ++高 +中等 ±几乎不生长
例7完整植株的再生
长在生长培养基上的愈伤组织于26℃下在表4所列的分化培养基（琼脂）上分化成完整的植株。在移载一周以后，形成了绿色斑点，移栽一个月以后再生出小时的完整植株。将它移载到盛在大试管里的琼脂上，得到了中等大小的完整植株。
表4 分化培养基的成分与完整植株的再生
分化培养基
基础 培养基 有机添加物 激动素 BA GM＊ 再分化＊＊
MS YE0.3%（重量） 5mg/l 1 好
MS YE0.3%（重量） 5mg/l 8 未观察到
MS ME0.5%（重量） 5mg/l 1 观察到
MS ME0.5%（重量） 5mg/l 1 观察到
MS PE10.0%（重量） 5mg/l 2 观察到
MS PE10.0%（重量） 5mg/l 8 未观察到
MS 5mg/l 3 观察到
MS 5mg/l 9 未观察到
MS 5mg/l 6 观察到
MS 5mg/l 7 未观察到
MS 5mg/l 1 未观察到
MS 5mg/l 8 未观察到
MS 5mg/l 1 未观察到
MS 5mg/l 8mg/l 8 未观察到
MS 5mg/l 3 未观察到
MS 5mg/l 9 未观察到
N6 CH0.3%（重量） 5mg/l 1 未观察到
B5 YE0.3%（重量） 5mg/l 1 未观察到
R2 ME0.5%（重量） 5mg/l 1 未观察到
＊GM：生长培养基（栏中的编号与表3中培养基编号相同）
＊＊再分化成完整植株

Claims (12)

1、一种形成水稻植株的方法，其特征在于包括下述步骤：
第一步是在MS、B5，N6或R2琼脂培养基中培养水稻种子的胚、盾片或胚根，再由水稻种子的胚、盾片或胚根衍生出第一个愈伤组织，而其中每种培养基中含有（1）0.01-1%（重）的酵母抽提物，0.01-1%（重）的麦芽汁，0.01-1%（重）的酪蛋白水解物，或5-20%（重）的马铃薯抽提物，（2）0.1-10mg/l的2，4-D，以及（3）0-5mg/l的苄基腺嘌呤0-5mg/l的激动素，
第二步是将第一个愈伤组织在R2，N6或MS培养基中培养成易释放出原生质体的细胞团，而其中每种培养基中含有（1）0.1-1%（重）的酵母抽提物，0.1-1%（重）的麦芽汁，0.1-1%（重）的酪蛋白水解物，或5-20%（重）的马铃薯抽提物，（2）0.1-10mg/l的2，4-D以及（3）0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素，培养基中的细胞浓度为0.3-3%（重），
第三步是用释放原生质体的酶溶液处理细胞团以释放出原生质体，而所述的酶溶液含有0.1-10%（重）的纤维素酶，0.1-5%（重）的浸解酶，0-5%（重）的氯化钙，0-5%（重）的葡聚糖硫酸酯的钾盐，以及3-15%（重）甘露糖醇，
第四步是在条件培养基中培养所述的原生质体，以培养出第二个愈伤组织，而所述的条件培养基是由第二步所用的培养基得到，并且放在含有渗压剂的亲水支持体层上，亲水支持体层上条件培养基的厚度为200-300μm，
第五步是将所述的第二个愈伤组织在分化培养基中培养，以再生出水稻植株，而所述的培养基是MS培养基，它含有0.1-1%（重）的酵母抽提物，0.1-1%（重）的麦芽汁，0.1-1%（重）的酪蛋白水解物或5-20%（重）的马铃薯抽提物，（2）0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。
2、根据权利要求1所述的方法，其中以继代培养方式培养胚、盾片或胚根。
3、根据权利要求1所述的方法，其中以继代培养的方式培养第一个愈伤组织。
4、根据权利要求1所述的方法，其中条件培养基的渗透作用用蔗糖调节，pH不大于5.2。
5、根据权利要求1所述的方法，其中亲水支持体采用琼脂、藻酸或明胶。
6、根据权利要求1所述的方法，其中水稻是稻（Oryza sativa）。
7、根据权利要求1所述的方法，其中第五步骤还包括在第二个愈伤组织在分化培养基中培养之前，先将它放在MS、B5、N6或R2培养基中生长，上述各培养基含有（1）0.1-1%（重）的酵母抽提物，0.1-1%（重）的麦芽汁，0.1-1%（重）的酪蛋白水解物，或5-20%（重）的马铃薯抽提物，（2）0.1-10mg/l的2，4-D，以及（3）0-5mg/l的苄基腺嘌呤或0-5mg/l的激动素。
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