CN1066487C - 鉴定植物不育细胞质的基因及用其生产杂交植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种鉴别诸如十字花科植物雄性不育细胞质的新的基因以及用该基因生产杂交植物的方法。本发明的细胞质基因可用做新的cms细胞质基因，可用于植物杂交种子的生产，也可用于快速鉴别Kosena(萝卜)cms细胞质，该细胞质在育种方面表现出有用的特性，是一种新的细胞质。将获得的基因导入核基因组或直接导入线粒体基因组，不仅可以将cms添加到十字花科植物中，而且也可以将其添加到其它一般植物中。

Description

鉴定植物不育细胞质的基因及用其生产杂交植物的方法
技术领域
本发明涉及一种鉴别诸如十字花科植物雄性不育细胞质的新的基因以及用该基因生产杂交植物的方法。确切地说是关于为开发植物的F1品种，利用不育细胞质生产杂交植物的方法。
技术背景
一代杂种已应用于谷类、蔬菜类等多种主要作物。一代杂种具有以下等特征：1)利用其杂种优势形成优良的种植特性、2)收获物的均一性、3)因子代遗传性状分离而保护育种者的利益。
十字花科中，具有自交不亲合性的F1采种系已被广泛利用。目前正在探索在不具有稳定的自交不亲合性的油菜籽中，利用细胞质雄性不育[以下简称(cms)]的F1采种系。现已应用具有聚合体cms的F1采种系，但是雄性不育不稳定，因而花蕊的形态不良，以至影响产量。目前，正在探索改良的方法。
为替代聚合体cms，目前在油菜籽中，已逐渐应用从萝卜而来的Ogura cms。Ogura cms具有稳定的雄性不育性，可以通过单一的可育恢复基因[以下简称(Rf基因)]，恢复可育性。Ogura Rf基因，也可从萝卜导入油菜籽，导入油菜籽的萝卜的cms和Rf基因，在油菜籽的生产方面，是实用的。
cms细胞质不但不产生花粉，并且也影响到植物的其他形态。做为一种玉米细胞质的T-cms细胞质、曾广泛用于F1的育种，但其细胞质易受到芝麻叶枯病和yellow leaf bright两大病害，特别是易受到awanomega的侵蚀。1970年，一代杂玉米，即受到芝麻叶枯病的侵袭灾害。此后认为只用一种细胞质的F1种子育种是非常危险的。
cms细胞质可影响花的形态。例如油菜籽聚合体cms细胞质。现已知具有cms细胞质的油菜籽的花瓣底部有大的裂隙，从此裂隙中，由于蜜蜂吸蜜、授花花粉减少，而影响种子的收获量。萝卜的Oguracms质，通过花授粉传代的机会少，蜜的分泌量少。因此授粉昆虫不易飞来，而影响具有Ogura cms细胞质的萝卜的育种量。另一方面，利用具有Kosena萝卜的cms细胞质，比利用萝卜的Ogura cms的育种量多，考虑可能是因为具有Kosena的cms细胞质与Ogura的遗传性状不同。即由于做为细胞质遗传因子的线粒体和叶绿体的互相作用，而出现表现型的差异。将此细胞质与萝卜以外的有用作物杂交，通过导入的方法，而使细胞融合，一般认为与采用Ogura cms相比较，这种方法选择形态更优良的品种的可能性更大。
另外，将cms细胞质导入其他植物时，由于受不产生细胞质和核的不亲合性的影响，不能解决细胞融合的程度问题。通过细胞融合而产生的细胞质杂种植物的细胞质基因组(叶绿体及线粒体)，常具有双亲基因组的重组型。利用此现象，即可以选择只导入cms基因的细胞质杂种。可是，在此操作中，要保持花瓣及所分泌的蜜的数量不能减少，这样才能提高有利于育种的细胞质杂种的可能性。
发明的目的
导入油菜籽的萝卜细胞质，至今只有Ogura cms细胞质。可是考虑到玉米的先例，希望培育与Ogura cms遗传性状不同的细胞质进行育种。
所以，本发明者不断探索和Ogura cms遗传性状不同的细胞质，发现并获得了对于开发由Kosena萝卜而来的cms的植物F1品种极有用的基因。
因此本发明的目的是提供表达序列表中1号序列记录的氨基酸序列多肽的基因，及用其合成杂交植物的方法。
图的简单说明
图1是表示位于cms-KA、cms-KAC及cms-OGU中花粉的发育状况照片。图中，KAC表示cms-KAC、KA表示cms-KA、OGURA是表示cms-OGU。
图2是用PCR法鉴定的cms细胞质的电泳图谱照片。图中，SW18表示cms油菜籽、OGURA表示cms-OGU,KAC表示cms-KAC、KOS B表示Kosena萝卜正常型线粒体、KA表示cms-KA。
图3是证明rrn 26的cms-KA和cms-KAC的线粒体DNA的DNA杂交的电泳图谱照片。图中KA表示cms-KA，KAC表示cms-KAC。
图4是证明rrn 26的cms-KA和cms-KAC的RNA杂交的电泳图谱照片。图中KA表示cms-KA,KAC是表示cms-KAC,F、S分别表示可育和不可育。
图5是表示含有orf 125或orf 138线粒体DNA区域的物理图的图示。图中Ogura表示具有Ogura萝卜的cms型线粒体约2.5 kb NcoⅠDNA片断、Kosena表示具有Kosena萝卜的cms型线粒体约2.5 kb NcoⅠDNA片断、CMS cy brid(细胞质杂种)是表示具有油菜籽的线粒体，含有orf 125约3.2 kb的DNA片断。125是表示orf 125、138是表示orf138、B是表示orf B、Nc是表示NcoⅠ、Hc是表示Hin c Ⅱ、Xb是表示Xba Ⅰ的限制酶切割部位。箭头是表示cms油菜籽和Kosena萝卜的orf 125区域的不同的产生部位。箭头所示为从orf 125的终止密码子下游第34碱基到下游碱基序列的两者不同。
图6是用PCR法鉴定线粒体的电泳图谱。A表示将引物放入序列表中的3号和6号序列，进行PCR，B表示将引物放入序列表中的3号和5号序列，进行PCR。图中，1表示cms-KA(可育)，5表示Kosena萝卜正常型线粒体、6表示SW 18、7表示SW 12、8表示FW 18、9表示油菜籽正常型线粒体、10表示pKOS 2.5、11表示pSW 18×17、M为度量标记物。
图7是用限制酶NcoⅠ切割各线粒体DNA，证明orf 125的DNA杂交电泳图谱照片。图中，KOSB是表示具有正常型线粒体的Kosena萝卜、KA是表示cms-KA、KAC是表示cms-KAC、SW 18是表示cms油菜籽、FW 18是表示油菜籽可育恢复系统、SW 12是表示cms油菜籽，Wes是表示具有正常型线粒体的油菜籽。
图8是证明orf 125的RNA杂交的电泳图谱照片。图中，KOSB是表示具有正常型线粒体的Kosena萝卜，KA是表示Cms-KA，KAC是表示cms-KAC、SW 18是表示cms油菜籽，Wes是表示具有正常型线粒体的油菜籽，F、S分别表示可育和不可育。
图9是用orf 125抗体，进行线粒体蛋白质的蛋白质印迹法分析结果的照片。A为对全部线粒体蛋白质分析的结果，图中SW 18是cms油菜籽，WES是具有正常型线粒体的可育油菜籽，FW 18是油菜籽可育恢复系统。B是对cms油菜籽的线粒体蛋白质分析结果。图中TOTAL是表示全部线粒体，SOL是具有膜组分的蛋白质，MB是表示有膜组分的蛋白质。
图10是用于转化的双载体(binary veceor)的构造示意图。A是双载体pKM 424。B为pKCM 125及并列的pKCMD 125，所示为用启动子序列、基因及终止序列联接pKM 424的多克隆部位(MCS)的Hin d Ⅲ(H)及Eco RⅠ(E)切割部位的结果。图中，35S是表示菜花花叶病病毒35S启动子序列，125是表示orf 125基因，D为线粒体移行序列NOS及NOST是兰曙红(nopalin)合成酶基因终止序列，RB为Raitoborder序列，NPT Ⅱ为新霉素磷酸转乙酰基转移酶基因，NOSP为兰曙红合成酶基因启动子序列，Spec R为耐壮观要素基因，Tc R为耐四环素基因。
发明的详细介绍
以下，就本发明进行详细说明
首先，通过杂交了解Kosena萝卜(Raphanus sativus.CV.Kosena)属的cms细胞质和Rf遗传学的特征。例如，任意选择雄性不育(cms)Kosena萝卜(R.sativus.CMS系)，将可育的Kosena萝卜或者栽培萝卜品种，如圆红(R.sativus.CV.Yuanghong)等，进行花粉间杂交，观察不育个体和可育个体杂交后得子代个体的可育性。在与不育的Kosena萝卜杂交者中，全部子代个体是可育的杂交花粉亲代，均携带Rf基因，因此可推断这样花粉亲代为Rf系统。
其次，任意多次选择Kosena萝卜属的雄性不育个体，将单一的不育个体与上述结果推断的多数Rf系统杂交，观察子代的可育性。由此可推断cms细胞质和Rf基因的对应关系。
然后，将Kosena萝卜的cms，通过细胞融合等方法(专利公开在平成1年(1989)-21 85 30号公报)，导入上述阐明对应关系的具有Rf基因的植物中。
其次，通过细胞融合，在已将部分Kosena萝卜的线粒体导入的植物中，通过杂交实验及分析染色体数目，选择核单基因完全恢复可育性的植物。
其次，鉴定Kosena萝卜CMS型细胞质，单独分离基因。具体的作法是，从具有cms细胞质的Kosena萝卜(R.sativus CMS系)的种子而发芽长为幼小植物，按常规方法提取线粒体，从该线粒体中，按常规方法提取DNA。将所得到的线粒体DNA，用适当的限制酶切割后，与pUC 19等克隆培养物联接，将此导入大肠杆菌反应潜能细胞。将生长的大肠杆菌菌落，用尼龙膜等收取，证明为Ogura cms细胞质基因(WO92 10 52 51号公布)时，选择杂交后的菌落。从得到的菌落中，按常规方法提取质粒DNA，通过Sanger氏双去氧等方法，最终可确定DNA片断的碱基序列。如此得到的DNA片断的碱基序列，例如所列出的表达序列表中1号序列所记录的编码氨基酸序列的多肽的基因，可很好地表达序列表所示的碱基序列，而且获得的DNA片断，因由Kosena萝卜而来，植物特别是十字花科植物，在不损伤其恢复可育性机能的范围内，即使发生缺失、插入、修饰或添加部分碱基等改变，均不会有影响。
进而，为区别因核的单基因而具有恢复可育性特征的线粒体和其他线粒体的不同，发现了线粒体基因组特异的基因，并且利用得到的基因，建立了简便的区别方法。
本发明用熟知的方法将上述所得到的基因通过导入核基因组，或者将该基因直接导入基因组，能够得到重组的线粒体基因组，进而得到含具有该线粒体基因组的雄性不育细胞质的转化植物或细胞质杂种植物，能够用该植物生产杂交植物。例如，就植物中的油菜籽来说，所谓转化法，即是通过前角无芽胞杆菌属，将DNA导入，使之再生的方法(专利发表于平成1年(1989)1-50 07 18公报)。细胞质杂种方法，即是通过电极法，将DNA导入原生质，经过培养使植物体再生的等已知的方法。(Plant Science,52,111-116,1987)。
供转化的植物有十字花科、茄子科等，较好的还有油菜籽、烟草等，优选的为油菜籽。
例如，用欧洲专利公开第59 90 42号报道的方法，将上述转化植物或细胞质杂种植物的受粉系统，与已经导入针对该植物的细胞质雄性不育而恢复花粉可育性的基因的植物授粉系统杂交，得到杂交植物。
本发明优选实施例
以下，通过本发明的实施例，更加具体地说明。但只要不超越其要求，本发明并不局限于这些实施例。
实施例1 Kosena萝卜的cms的遗传方式分析
任意选择cms Kosena萝卜10个个体(R.sativus,CV,Kosena CMS系；KOSA),10个个体分别与可育的Kosena萝卜(R.Sativus CV.Kosena)或者与做为萝卜培育的圆红(R.SativusCV.Yuanghong)，心里美(R.Sativus,CV.Xinlimei)的花粉母代杂交。另外，通过16个花粉母代的自身授粉获得种子。其次，取9-25个体，了解cms Kosena萝卜和可育的萝卜的16个杂交子代的可育性。结果如表1所示。这里的全部个体均具有可育性的组合后的花粉母代，即Kos6、Kos8、Xin1、Xin2、Xin4、Xin8、Yuan1、Yuan6、Yuan7、Yuan8、Yuan10、Yuan3，认为均具有Rf基因,称Rf系统。表1关于雄性不育Kosena萝卜的恢复基因的遗传模式
    杂交组合 F1代的可育性  可育个体的基因型
不育1)  ×   可育2) 不育：  可育     推断
KosA2   ×   Kos1KosA11  ×   Kos5KosA11  ×   Kos6KosA8   ×   Kos7KosA8   ×   Kos8KosA2   ×   Xin1KosA1   ×   Xin2KosA7   ×   Xin4KosA11  ×   Xin8KosA2   ×   Yuan1KosA5   ×   Yuan6KosA1   ×   Yuan7KosA12  ×   Yuan8KosA13  ×   Yuan9KosA14  ×   Yuan10KosA15  ×   Yuan13     7    1525    00    226     30    180    250    250    250    250    250    250    250    2511   140    250    25     RfrfrfrfRfRfRfrfRfRfRfRfRfRfRfRfRfRfRfRfRfRfRfRfRfRfRfrfRfRfRfRf
1)．KOSA：为Kosena萝卜(R.Sativus CV.Kosena)的cms系统。2)．表示具有Kosena cms细胞质恢复基因系统。Kos：Kosena萝卜(R.Sativua CV.Kosena)、Xin：心里美(R.Sativus CV.Xinlimei)、Yuan：圆红(R.Sativus CV.Yuanhong)。
其次，任意选取cms Kosena萝卜，选择与上述实验确定的Rf系统中的Kos6和Yuan10杂交，了解子代的可育性。其结果证明，无论是和Yuan10杂交的子代，还是与任意一种与Yuan10及Kos6中任意一种的杂交子代，都存在有恢复可育性的cms细胞质，分别简称为cms-KAC和cms-KA。
其次，将Kos6及Yuan10与Ogura萝卜的不育系(R.sativus，CV.Ogura CMS系)杂交。其结果为：与Yuan10杂交的子代全部恢复可育性，与Kos6杂交的子代不能恢复可育性。可知具有cms-KA恢复系统的Kos6，不具有针对Ogura cms的Rf基因。从此可判断Kosena cms细胞质中，存在有与原来的Ogura细胞质[以下简称为(cms-OGU)]遗传性状不同的细胞质cms-KA。如表2所示。表2遗传性状不同的Kosena细胞质雄性不育
细胞质及其恢复基因的遗传分析结果
    杂交组合不育    ×    可育 F1代的可育性分离可育： 不育 可育个体的基因型推断
cms-KAC     ×    Yuan10cms-KA      ×    Yuan10cms-OGU     ×    Yuan10cms-KAC     ×    Kos6cms-KA      ×    Kos6cms-OGU     ×    Kos6  10      05      010      00      825      00      15 Rf1 Rf2Rf1 Rf2Rf1 Rf2rf1 Rf2rf1 Rf2rf1 Rf2
cms-KA及cms-KAC的花粉退化期也与Cms-OGU不同(图1)。通过醋酸洋红染色，了解具有各细胞质的萝卜的花蕾长度和花粉的发育状况，通过细胞质及不同核基因组，了解花粉的退化时期、发育程度的差异。如图1所示。cms表示细胞质，Nuc表示核基因组的组成。核基因组的组成如下。
表3
细胞质 核的记号     核基因组
    cms-KAC     kos/yuankos     kosena 6 × yuanhong 10kosena 6
    cms-KA     kos     kosena 5
    cms-OGU     kos/oguogu     kosena 6 × ogura 3ogura 3
cms-OGU，在花蕾长为3mm时，花粉即已退化。与其相比，cms-KA和cms-KAC的花粉退化是在花蕾长4.5mm时退化。因核基因组的变化是相同的，所以与其说是细胞核的原因，不如说是由于细胞质基因的差异而造成的差别。
实施例2通过单基因探索恢复可育性的cms细胞质
以前都是将Kosena萝卜的cms通过细胞融合，试探性地导入油菜籽(B.napus)(专利发表于平成1年(1989)-21 85 30号，平成2年(1990)-30 34 26号各公报)。此油菜籽，不恢复本身存在的基因的可育性。此油菜籽的可育性，通过与具有Rf基因的萝卜杂交后恢复，但不了解从萝卜导入的Rf基因的数量及遗传方式，所以要检测所得到的油菜籽细胞质，是否为单一的Rf基因恢复的cms细胞质，是否由细胞融合产生的Kosena萝卜和油菜籽的线粒体组合的油菜籽。[以下简称为(cms油菜籽)]。
把具有Kosena萝卜Rf系统的Yuan10与cms油菜籽杂交所得到的多倍体中，将恢复可育性的个体[以下略称(cms/Rf油菜籽)]与不具有cms细胞质的可育的地方品种Westar(B.napus.CV.Westar)再度杂交，其后选择可育性良好的个体，与cms油菜籽进行杂交(专利发表于平成4年(1992)-27 60 69号)。结果如表4示。表4 用cms油菜籽的Kosena恢复基因的遗传分析
cms油菜籽  ×  恢复系统     F1代的可育性可育：不育
 SW18      ×    RF138SW18      ×    RF88     84  ： 8980  ： 71
其结果，出现子代中不育与可育的比例，几乎为1∶1。另外，将cms/Rf油菜籽的染色体通过醋酸洋红染色检查，回交的品种与原来的油菜籽相同的有38棵。由此了解到，cms/Rf油菜籽的Rf基因，通过易位已重组于油菜籽基因组中。这里，认为多数Rf基因的同一染色体的易位可能性非常小，因而可判断，此cms油莱籽的cms细胞质，可通过单基因恢复可育性，cms细胞质在育种上是非常有价值的。
实施例3通过线粒体基因鉴定cms细胞质
目前，已有分离Ogura cms细胞质特异基因[以下简称为orf 138)]的方法(WO92/05 25 1号公布)，这里对与Kosena萝卜相同的基因进行分离。
(1)线粒体DNA的提取
取5克具有cms细胞质的Kosena萝卜(R.sativus,CMS系)种子，于暗处发芽，5日后将幼小植物放入提取线粒体用的缓冲液[1g组织加入2ml的0.4M山梨醇/1mM EDTA/0.1％BSA/0.1MTris-HCl(pH8.0)]，加入适量海砂C冷却，用研棒和研钵研磨，将研磨液在200×g、4℃条件下，离心5分钟，取上清液移入新离心管，再将此在1,500×g、4℃条件下离心5分钟，取上清液移入新离心管，反复操作2次。接着，在1,500×g、4℃条件下离心5分钟，使线粒体沉淀。将此沉淀，放入1g幼小植物中，加入含有10μgDNA酶的缓冲液[0.3M蔗糖/50mM Tris-HCl(pH 7.5)/10mMMgCl2]2ml，静止悬浮，4℃放置30分钟。将此线粒体悬浮液置于15ml Shelf缓冲液[0.6M蔗糖/20mM EDTA/10mMTris-HCl(pH7.2)]中，15,000×g,4℃离心5分钟。沉淀后再将线粒体放入15ml Shelf缓冲液中，静止悬浮沉淀后，15,000×g，4℃离心5分钟，将线粒体用15ml提取DNA缓冲液[1％N-十二烷酰肌氨酸/20mM EDTA/50mM Tris-HCl(pH8.0)]充分溶解后，加入1.5g的CsCl并使其溶解。然后加溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓溶解至200μg/ml，充分混合后，350,000×g，离心14分钟，选取含有线粒体DNA的界面，用正丁醇除去溴化3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓后，在10mMTris-HCl、1mM EDTA(pH8.0)的缓冲液中透析，除去CsCl。
(2)分离Kosena cms型线粒体中特异DNA
用NcoⅠ切割线粒体DNA，产生平头末端与质粒媒介-pUC 19的SmaⅠ切割部位联接。将此导入大肠杆菌DH 5a的反应潜能细胞，在含氨苄西林50μg/ml的LB琼脂培养基上培养。将生长的大肠杆菌菌落，用尼龙膜收取，在含各溶液的滤纸上，用10％SDS溶菌5分钟，用碱性溶液(1.5M NaCl/0.5M NaOH)对DNA进行变性、中和处理(3M醋酸钠pH5.2)后，将膜80℃干燥10分钟，然后放入6×SSC(1×SSC：150mM NaCl、15mM枸橼酸钠)中，浸泡30分钟。将膜表面所含的6×SSC用JK刷子轻轻擦拭，去掉污物后，放入6×SSC中振荡洗净，80℃完全干燥。然后，用随机引物标记含Ogura Cms细胞质特异基因约0.7kb的orf 138的Hin cⅡ片断，证明为杂交体。此杂交体，在5×SSCP(1×SSCP：50mM磷酸钠(pH6.8)、120mM NaCl、15mM枸橼酸钠)、50％甲酰胺、100μg/ml热交性鲑鱼精子DNA、0.5％脱脂乳、0.5％SDS中42℃处理16小时。然后，把膜一边在2×SSC、42℃振荡15分钟，边洗净三次后，65℃30分钟洗净。用X线检测残留于膜上的放射活性，取出放射标记强的菌落，培养大肠杆菌，提取质粒DNA。此质粒含有约2.5kb的DNA片断[以下简称(pKOS 2.5)]。然后用限制酶Hin cⅡ切割pKOS 2.5，用上述结果进行DNA杂交后，因检出了约0.65kb的电泳带，故用此0.65的Hin cⅡ片断与质粒媒介物-BluescriptⅡ(Stratagene)的Sma Ⅰ切割部位联接。用双去氧法确定其Hin cⅡDNA片断的碱基序列，得到659bp的碱基序列(序列表的1号序列)。
在该碱基序列中，存在对应于125个氨基酸的基因[以下简称(orf 125)]。orf 125缺失Ogura的orf 138碱基序列中的39碱基。此缺失是具有orf 138的重组DNA序列中的一部分。检出此重组序列的长度，制成引物(序列表中的2号和3号序列)，将具有cms-KA、cms-KAC、正常型细胞质的Kosena萝卜、cms油菜籽及cms-OGU的全部DNA，分别在94℃25秒、52℃30秒、72℃1分30秒条件下，循环40次，进行PCR反应。[Am.J.Hum.Genet.,37,172(1985)]。电泳图谱如图2所示。检出了Ogura型cms细胞质的278bpKosena cms细胞质的239bp的电泳带。其结果说明，Kosena萝卜正常型线粒体和cms-OGU中不存在orf 125而是含有cms-KA、cms-KAC及cms-油菜籽。由此可知，orf 125特异地决定了Kosena萝卜的cms线粒体。
(3)cms-KA和cms-KAC的识别
已知cms-KA和cms-KAC遗传性状的不同是取决于cms细胞质。那么就要考察线粒体基因组的差异程度。提取2个cms型的线粒体DNA，用含有若干线粒体基因的DNA片断，通过DNA杂交，检出其不同点。用于证明的DNA片断为以下物质。atpA(远藤)、atp9(远藤)、atp6(埃特拉(エノララ)、cob(玉米)、cox1、rps13和nad1(埃特拉)、coxⅡ(玉米)、coxⅢ(埃特拉)、rrn5、rrn18和nad5(埃特拉)及rrn26(远藤)。杂交按前述条件进行。其结果是，检出了只证明含远藤rrn26 0.5 kb的Eco RⅠ-SalⅠ DNA片断的cms-KA中约6.0kb的特异电泳带(图3)。
其次，具有cms-KA及cms-KAC型线粒体的值物，分别从可育和不可育的个体花蕾中提取全部RNA，用以下方法提取RNA。取1克花蕾置液氮中，用乳钵和乳棒磨碎，用RNA提取缓冲液[4M亚胺脲硫氰酸/25mM枸橼酸钠(pH7.0)/0.5％N-十二烷酰肌氨酸钠/0.1M EDTA]10ml混合后，移入离心管，加1ml 2M醋酸钠混合，然后加入10ml饱和石炭酸和2ml二氯甲烷/异戊醇(24∶1)，充分混合，1,500×g 4℃20分钟离心后取上清液，用三氯甲烷/异戊醇萃取，并分取上清，反复操作2次后，用等量的氯丙啶醇ピル，使RNA沉淀，15,000×g 4℃10分钟离心后，在沉淀中加入1ml RNA萃取缓冲液充分溶解，加入1ml 2M醋酸(pH4.6)1ml饱和石炭酸及0.2ml的三氯甲烷/异戊醇充分混合，7,500×g4℃20分钟离心，分取上清，用三氯甲烷/异戊醇萃取，反复操作2次后，用二倍体积的乙醇，使RNA沉淀。取RNA 15,000×g 4℃10分钟离心收集后，溶于灭菌水。然后，将10μg各RNA用甲醛变性并进行凝胶电泳后，证明是rrn26，并且进行RNA杂交。杂交按前述条件进行。结果表明，具有cms-KA和cms-KAC型线粒体的植物杂交的图谱不同。无论是可育还是不可育，在cms-KAC中检出了在cms-KA中未发现的约4.5kb的电泳带(图4)。从以上结果看出，cms-KA和cms-KAC不具有同rrn26相同线粒体基因组区域，可以用DNA杂交和RNA杂交方法来证明和识别rrn26。
(4)鉴定具有单一的Kosena Rf基因可育恢复cms油菜籽的cms细胞质的DNA片断
困要进一步识别具有单一的Kosena Rf基因恢复可育性的cms细胞质，所以要探索此cms油菜籽的特异的线粒体基因组区域。提取cms油菜籽的线粒体DNA。用限制酶NcoⅠ、Hin c Ⅱ及XbaⅠ切割含orf125 5＇端约0.33 kb的DNA片断Hin c Ⅱ-Xba Ⅰ和含3＇端约0.33kb的Xba Ⅰ-Hin cⅡ片断，进行DNA杂交分别证明各片断。其结果为含具有cms油菜籽的orf 125区域的物理图(图5)与Kosena萝卜的不同。Ogura萝卜的cms型线粒体中，在orf 138及相邻下游，存在有orf B。Kosena萝卜当中具有cms-KA、cms-KAC任何一个cms型线粒体的orf 125的2.5kb NcoⅠ DNA片断，在orf 125相邻下游，存在有orf B(图5)。另一方面，在cms油菜籽orf 125下游与Kosena萝卜的不同。用Hin cⅡ切割Kosena萝卜cms型线粒体DNA如果用orf 125的3＇端约0.33kb的Xba Ⅰ-Hin cⅡ片断进行DNA杂交来验证的话，即可检出约650bp的电泳带，在cms油菜籽，可检出2.5kb的电泳带。图5所示，含orf 125 2.5kb的Hin cⅡ DNA片断具有特异的cms油菜籽线粒体，可以通过是否含有此物来识别cms油菜籽的细胞质。
(5)具有上述油菜籽的cms细胞质DNA片断的碱基序列的确定
用限制酶Xba Ⅰ切割cms油菜籽(SW 18系统)的线粒体DNA，与质粒媒介物pBluescript Ⅱ(Stratagene)的XbaⅠ联接导入大肠杆菌DH5a的反应潜能细胞，进行转化。与证明为orf 125编码区域的菌落杂交，得到两种阳性克隆。用其提取质粒DNA，用限制酶制成物理图后，即可识别含有orf 125的5＇端pSWX 2.8和含有orf 125的3＇端的pSWX 1.7的2种菌落。
其次，用限制酶Eco RV切割pSWX 1.7后，在pBluescript Ⅱ(Stratagene)中，进行亚克隆培养，得到含orf 125的克隆pSWV 0.7和含其相邻下游序列的pSWV 0.2。然后将其做为克隆的DNA片断，和含orf 125的N末端区域的pSWX 2.8的Hinc Ⅱ-Xba I片断，用双去氧法确定碱基序列(序列表的4号序列)。具有cms油菜籽SW18系统的orf 125区域终止密码子下游的第34号碱基序列，与Kosena萝卜的完全不同，不存在orf B。以下将具有cms油菜籽的orf 125区域称为orf 125C。
其次就cms油菜籽的线粒体而言，通过PCR法，确定是否存在含有orf 125以外的Kosena萝卜线粒体的orf 125区域(图5)。PCR是用2种组合引物，一种是orf 125密码区域中的碱基序列5＇-GACATCTAGAGAAGTTAAAAAAT-3＇(序列表的3号序列)和具有pSWV 0.7的orf 125c的下游区域的碱基序列5＇-TCTGACAGCTTACGATG-3＇(序列表的5号序列)。另一种是由上述序列表的3号序列和被认为是pKOS 2.5的orf B下游的碱基序列5＇-CTACCAGAGGTATCTATAGAAT-3＇(序列表的6号序列)组成的。在cms油菜籽SW 18系统中，以前者为引物时，能检出约0.55kb的电泳带，而以后者为引物时，未检出电泳带(图6的第6线)。另一方面，在cms Kosena萝卜和cms油菜籽SW 12系统中，用前组组合引物时，可检出与SW 18相同的0.55kb的电泳带，用后组组合引物时，能检出约0.9kb的电泳带(图6的第1～4线及第7线)，这样即可确定具有cms油菜籽SW 18系统的orf 125C是由Kosena萝卜cms型线粒体而来的。所以，当cms油菜籽SW 18系统的线粒体基因组与Kosena萝卜的细胞融合时，选择性地导入orf 125C，通过PCR法，即可简单地区别Kosena萝卜的cms型线粒体基因组。
(6)orf 125和雄性不育的关系
按前述方法，从cms Kosena萝卜和cms油菜籽的花蕾中，提取全部线粒体RNA，并按上述方法进行RNA杂交，确定orf 125的密码区域。可检出cms Kosena萝卜中的1.4kb的电泳带和cms油菜籽中的1.2kb电泳带(图8)，可知orf 125是由cms油菜籽线粒体复制的。
用cms油菜籽SW 18系统中具有正常细胞质而不具有Rf的油菜籽的花粉杂交后，所得到的子代植物群中，可见有完全可育性的个体。此个体自身授粉的后代，全部具有可育性。将此称为油菜籽可育恢复系统FW 18。通过PCR法和DNA杂交法来确定这个FW 18系统的线粒体基因中是否含有orf 125，结果表明，哪一种方法都不能检出orf 125(图6的第8线，图7)。从以上结果可知orf 125是CMS的结构基因。
(7)用orf 125基因进行植物转化
以在暗处发芽生长到第5天的幼芽为材料将线粒体纯化，取线粒体全部蛋白质约10μg，用10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离后，用orf 125的氨基酸序列的第78位列92位的15个氨基酸序列的抗体进行蛋白质印迹法分析后，检出在cms由菜籽中，具有正常型线粒体的可育油菜籽及油菜籽可育回归系统中未见的约17KDa的特异的电泳带(图9A)。其次，从cms油菜籽纯化的线粒体蛋白质分离可溶性组分和膜组分后，用上述抗体进行蛋白质印迹法分析，结果表明17KDa中存在有cms油菜籽线粒体膜组分(图9B)。orf 125与目前所报道的玉米的cms基因产物urf 13蛋白质一样，由于线粒体膜的存在，而阻碍了线粒体的正常功能[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,5374-5378(1987)；Science,239,239-295(1988)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,4435-4439(1989)；EMBO.,9,339-347(1990)]。
所以，把orf 125通过前角无芽胞杆菌法，导入烟草，来研究orf 125对细胞植物的影响。将orf 125基因，或者甘薯的F0-F1ATP酶δ亚组的线粒体的转移序列[Plant cell Physiol.,34,177-183(1937)]添加在orf 125中形成嵌合体基因，分别把菜花花叶病病毒35S启动子(35S)和兰曙红合成酶基因末端与上述嵌合体联接，并与双载体pKM 424的多克隆部位的Hin d Ⅲ及Eco RⅠ切割点联接，分别得到pKM 125及pKCMD 125(图10A、B)。对照实验是用含有35S、β-葡萄糖醛酸酶基因(GUS)、NOST的pLAN 411[Plant Cell Rep.,10,286-290(1991)]。其次，按上述冻干/溶解双载体法，分别导入无芽胞杆菌EHA 101株。烟草的转化按照Rogers氏的方法[Methods Enzymol 118,627-640(1986)]如下进行。把导入双载体的EHA 101放入含50μg/ml壮观霉毒、2.5μg/ml四环素及50μg/ml卡那霉素的YEB培养基中培养，27℃振荡培养16小时，将无菌烟草叶切成约1cm的四方碎片，放入含3％蔗糖的MS培养基中悬浮(1次实验约用20个)将上述的前角无芽胞杆菌液按1/50容量加入MS培养基，27℃静置两昼夜，共生培养，然后把共生培养后的烟草碎片，放入含0.2mg/l的疏基腺嘌呤、200μg/ml卡那霉素、500μg/ml Curaflane、3％蔗糖及0.2％凝胶MS培养基中，27℃培养20天，通过此方法，计算所形成的不定形的芽叶数/全叶切片数，了解植物的再生率。结果如表5所示。
表5orf 125的转化对植物不定形芽形成的影响
实验次数     叶切片周围的不定形芽形成率
pLAN411     pKCM125  pKCMD125
    12345     0.460.830.331.100.67     0.320.13---     0.140.020.12--
其结果为，通过pLAN 411的转化，一叶切片周围的不定形芽的形成率平均为0.68,pKCM 125的为0.22,pKCMD 125的是0.07。然后将形成不定形芽的烟草切叶片，移入组分与上述的相同的培养基中继续培养，形成1-2cm不定形芽时，切取叶片，放入不含卡那霉素和6疏基腺嘌呤的上述MS培养基中生长，导入GUS的植物，几乎都显示了正常的形态，与其相反，导入orf 125的植物，出现很高频率的玻璃样的异常形态植物(表6)。
表6 orf 125对植物再生形态的影响
Figure 9419085600222
以上结果显示，orf 125存在于线粒体中影响植物细胞的形态。把orf 125通过转化法导入植物中可以合成雄性不育植物。
本发明的用途
本发明的细胞质基因可用于植物，诸如十字花科植物的杂交育种，可形成新的cms细胞质基因，并且可以快速识别cms细胞质，该细胞质在育种方面表现出有用的特性，是一种新的细胞质。
此外，将获得的基因，通过导入核基因组或直接导入线粒体基因组，可将CMS添加到除十字花科植物以外的其他植物中。
                         序列表序列编号：1序列长度：659序列类型：核酸链的数目：双链1链状：直链序列种类：基因组DNA来源
生物名称：ラファテスサティバス(Raphanus sativus)
株名：Kosena萝卜
细胞器名称：线粒体序列特征
表示特征的符号：CDS
存在位置：162..536
确定特征的方法：S序列AACTCATCAG GCTCATGACC TGAAGATTAC AGGTTCAAAT CCTGTCCCCG CACCGTAGTT  60TCATTCTGCA TCACTCTCCC TGTCGTTATC GACCTCGCAA GGTTTTTGAA ACGGCCGAAA 120CGGGAAGTGA CAATACCGCT TTTCTTCAGC ATATAAATGC A ATG ATT ACC TTT TTC 176
                                          Met Ile Thr Phe Phe
                                            1               5GAA AAA TTG TCC ACT TTT TGT CAT AAT CTC ACT CCT ACT GAA TGT AAA   224Glu Lys Leu Ser Thr Phe Cys His Asn Leu Thr Pro Thr Glu Cys Lys
             10                  15                  20GTT AGT GTA ATA AGT TTC TTT CTT TTA GCT TTT TTA CTA ATG GCC CAT   272Val Ser Val Ile Ser Phe Phe Leu Leu Ala Phe Leu Leu Met Ala His
         25                  30                  35ATT TGG CTA AGC TGG TTT TCT AAC AAC CAA CAT TGT TTA CGA ACC ATG   320Ile Trp Leu Ser Trp Phe Ser Asn Asn Gln His Cys Leu Arg Thr Met
     40                  45                  50AGA CAT CTA GAG AAG TTA AAA ATT CCA TAT GAA TTT CAG TAT GGG TGG   368Arg His Leu Glu Lys Leu Lys Ile Pro Tyr Glu Phe Gln Tyr Gly Trp
 55                  60                  65CTA GGT GTC AAA ATT ACA ATA AAA TCA AAT GTA CCT AAC GAT GAA GTG   416Leu Gly Val Lys Ile Thr Ile Lys Ser Asn Val Pro Asn Asp Glu Val70                  75                  80                  85ACG AAA AAA GTC TCA CCT ATC ATT AAA GGG GAA ATA GAG GGG AAA GAG   464Thr Lys Lys Val Ser Pro Ile Ile Lys Gly Glu Ile Glu Gly Lys Glu
             90                  95                 100GAA AAA AAA GAG GGG AAA GGG GAA ATA GAG GGG AAA GAG GAA AAA AAA   512Glu Lys Lys Glu Gly Lys Gly Glu Ile Glu Gly Lys Glu Glu Lys Lys
        105                 110                 115
GAG GTG GAA AAT GGA CCG AGA AAA TAATGCTTTG TGAACCCAAT TGCTTTGACA  566
Glu Val Glu Asn Gly Pro Arg Lys Stop
        120                 125
AAAATAAAGA  AAGAAGCAAA  ATCTCATTCA  ATTTGAAATA  GAAGAGATCT  CTATGCCCCC  626
TGTTCTTGGT  TTTCTCCCAT  GCTTTTGTTG  GTC                                 659序列编号：2序列长度：22序列类型：核酸链的数目：单链链的形状：直链序列种类：其他核酸合成DNA序列
GACATCTAGA  GAAGTTAAAA  AT                                              22序列编号：3序列长度：22序列类型：核酸链的数目：单链链的形状：直链序列的种类：其他核酸合成DNA序列
AGCAATTGAA  TTCACAAAGC  AT                                              22序列编号：4序列长度：1242序列类型：核酸链的数目：双链链状：直链序列种类：基因组DNA来源
生物名称：ブラシカナアス (Brassicanapus)
株名：SW18
细胞器名称：线粒体序列
AACTCATCAG  GCTCATGACC  TGAAGATTAC  AGGTTCAAAT  CCTGTCCCCG  CACCGTAGTT        60
TCATTCTGCA  TCACTCTCCC  TGTCGTTATC  GACCTCGCAA  GGTTTTTGAA  ACGGCCGAAA       120
CGGGAAGTGA  CAATACCGCT  TTTCTTCAGC  ATATAAATGC  AATGATTACC  TTTTTCGAAA       180
AATTGTCCAC  TTTTTGTCAT  AATCTCACTC  CTACTGAATG  TAAAGTTAGT  GTAATAAGTT       240
TCTTTCTTTT  AGCTTTTTTA  CTAATGGCCC  ATATTTGGCT  AAGCTGGTTT  TCTAACAACC       300
AACATTGTTT  ACGAACCATG  AGACATCTAG  AGAAGTTAAA  AATTCCATAT  GAATTTCAGT       360
ATGGGTGGCT  AGGTGTCAAA  ATTACAATAA  AATCAAATGT  ACCTAACGAT  GAAGTGACGA       420
AAAAAGTCTC  ACCTATCATT  AAAGGGGAAA  TAGAGGGGAA  AGAGGCAAAA  AAAGAGGGGA       480
AAGGGGAAAT  AGAGGGGAAA  GAGGAAAAAA  AAGAGGTGGA  AAATGGACCG  AGAAAATAAT       540
GCTTTGTGAA  CCCAATTGCT  TTGACAAAAA  TATATGAAGA  ATCAGTGCTA  TTGAGGAACA       600
TTTTATAGAA  AGAAAAGAAA  AAGAAGCAAT  AGTAAAGGAG  GGCTTTCCCA  GTGCATGAAG       660
GGAGGGTGAA  GCAGGGTAAG  TCATAAGAAT  CCGCTTTCTT  ACAAAGACCT  CCTGCTATGC       720
TAATGAGGGG  TCTTAAGCAA  ACAAAGTACC  AAGAACTTTG  GATATTATCC  GTTTTTCTAT       780
TATATCCCAT  TTTATCCTTC  CGCTTTAGGA  TTAGCCCAGC  TTTTTCGAAA  CGGACGGAAG       840
GCCTAACTAG  AAGCTATTTG  GCGCCTTCCC  CTCGATGAAT  ACTTGGAAAT  TTGTCTTGCA       900
TCGTAAGCTG  TCAGAAGAAA  GTAAGACTTA  GAAAGAAGAC  AGTAAGTAAG  AGAACTACGA       960
TTTACTTGAT  TCCCAAAGTG  GTACGTAGGC  AGCCAAGGAC  GAATCCTTAT  CCAGTTCTTT     1020
GTTAGTAAGT  GAGGAAAAGA  TATCAAACTT  TTTTTTGAAA  AAAGTTCGTA  GTTAATCTAC     1080
CTCGGACGTA  CCCATGGCGT  GTGGGGTTCG  CGTGGGGAAC  CGAGTAACCA  AAGTCACGAT     1140
CAGTCTAAGG  TTGAAATCTG  GATGGTCTTT  TTGCCAGACG  CGCTGGTTCG  AGTCCAGCTC     1200
GTGACAAAAG  GCTACCCTTT  CTCTTAAGAG  AATCTCGATA  TC                         1242序列编号：5序列长度：17序列类型：核酸链的数目：单链链的形状：直链序列的种类：其他核酸合成DNA序列
TCTGACAGCT  TACGATG                                                        17序列长度：22序列类型：核酸链的数目：单链链的形状：直链序列的种类：其他核酸合成DNA序列
CTACCAGAGG  TATCTATAGA  AT                                                 22

Claims (8)

1．编码具有序列表序列号1的氨基酸序列的多肽的基因。
2．权利要求1的基因，其中所述基因具有序列表序列号1的核苷酸序列。
3．权利要求2的基因，其中所述基因来源于Kosena萝卜。
4．具有序列表序列号4的核苷酸序列，并含有编码权利要求1的多肽的基因的DNA片段。
5．一种产生细胞质雄性不育植物的方法，该方法包括将权利要求1或2的基因导入植物的核或细胞器中。
6．一种产生细胞质雄性不育植物的方法，该方法包括将具有序列表序列号4的核苷酸序列，并编码权利要求1的多肽的基因导入植物的核或细胞器中。
7．权利要求5或6的方法，其中植物是十字花科植物。
8．权利要求5或6的方法，其中植物是油菜籽。
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