CN103039357B - 稳定表达6个hmw-gs的普通小麦培育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法，属于植物染色体工程技术领域。该方法是以普通小麦为母本，野生二粒小麦为父本，将拥有4个HMW-GS的野生二粒小麦的花粉，授予六倍体的普通小麦，通过种间远缘杂交、多代自交及鉴定，选育出稳定表达6个HMW-GS的普通小麦。通过本发明方法培育获得的具有6个HMW-GS的新型普通小麦，不仅具有与母本相似的株叶型，而且还具有母本所没有的紫色茎秆性状，及较母本更优的籽粒粒积性状、产量性状和优异的品质特性，且通过连续对杂交种F10、F11和F12代的籽粒进行HMW-GS检测，证明了其拥有的1Ay基因能够代代稳定传递与表达。

Description

稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法
技术领域
本发明属于植物染色体工程技术领域，特别涉及一种将四倍体野生二粒小麦的功能性Ay型高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）编码基因引入普通小麦，实现全部6个HMW-GS均稳定表达的普通小麦的培育方法。
背景技术
小麦作为世界主要的大宗粮食作物，贡献了全球总谷物产量的30%左右而成为人类营养素来源的主要作物之一。据估计，到2020年，全球对小麦的需求量将增加40%左右，因而小麦对人类健康与生存具有举足轻重的作用。
大量研究表明，小麦的营养品质和面粉的加工品质都与种子蛋白的含量和组成密切相关。小麦高分子量谷蛋白亚基（High molecular weight glutenin subunits，HMW-GS）是小麦的主要贮藏蛋白之一，占小麦蛋白质的10%左右，与小麦面粉的弹性关系密切。业已证明，具有优质高分子量谷蛋白亚基或优质亚基组合的小麦品种具有优良的烘焙品质特性。研究表明，优质面粉所具有的高强度面筋主要在于其所含有的高交联度大聚合体，而麦谷蛋白的半胱氨酸残基是形成高交联度聚合体的决定因子，因而半胱氨酸残基的数量和/或位置是影响面粉加工品质的直接因素。在普通小麦（Triticum aestivum, 2n = 6x = 42，染色体组型为AABBDD）基因组中，编码HMW谷蛋白的基因Glu-A1, Glu-B1和Glu-D1分别位于1A，1B和1D染色体的长臂上，每一个高分子量麦谷蛋白基因位点内存在两个紧密连锁的基因，分别编码一个分子量较大的x型亚基，和一个分子量较小的y型亚基，所以，理论上普通小麦应含有6个HMW-GS亚基。但是，由于存在基因的沉默现象，其中，1By和1Ax常不表达，而1Ay则总是沉默的，致使Glu-A1位点常常没有HMW-GS而成为Null位点，因此，普通小麦通常只拥有3-5个高分子量谷蛋白亚基。现已证明， Glu-A1位点有一个亚基表达的比Null位点具有更高的面筋强度。因此，许多具有高产特性的小麦品种缺乏优良的烘焙品质性能。
国内外研究者试图从小麦近缘属物种中寻找活性1Ay基因，以改良普通小麦的加工品质特性。截至目前，已发现在小麦的近缘植物茹科夫斯基小麦（T. zhukovskyi, 2n=6x=42, AAAAGG）、提莫非维小麦(T. timopheevii, 2n=4x=28, AAGG）、野生二粒小麦（T. dicoccoides, 2n=4x=28, AABB）和二倍体一粒系的(2n=2x=14, AA)乌拉尔图小麦（T. urartu）,野生一粒小麦（T. boeoticum）和栽培一粒小麦（T. monococcum）中存在1Ay亚基的表达，而且已获得了12个活性1Ay基因的分子克隆。虽然Margeotta et al.(1996)报道在两个瑞典春小麦品系W 29323和W 3879中检测到表达的1Ay亚基，但其活性基因21*y的扩增片段短于Cheyemme品种中的无活性态等位基因，而且，其表达的Ay基因的来源也不清楚，仅仅是一种推测，认为很可能是某一种野生小麦被用在了育种过程中所引起的。之后，Rogers et al. (1997)报道将二倍体的野生一粒沙达小麦（T. boeoticum ssp. thaoudar）的Glu-A1位点的1Ax和1Ay基因，通过回交选育近等基因系的方法导入六倍体春小麦面包加工品种Sicco中。其方法是将居群为CL1020006和G3152的野生一粒沙达小麦(T. b. thaoudar)分别与硬粒小麦（T. durum, 2n=4x=28, AABB）品种Cando和中国春小麦杂交后再与Sicco回交5次，结果在对面筋强度或/和面筋粘性及和面的稳定性上稍微有所提高的同时，对籽粒蛋白质含量和籽粒产量均没有正效应。仅有的这两例报道所涉及的普通小麦都属于春小麦，而且缺乏其相应基因在普通小麦遗传背景下的分子结构特点分析。2008年，我国的马建华等用转基因工程方法将乌拉尔图小麦（T. urartu）的1Ay基因转入普通小麦兰考4号，但是，仅仅在T0代的1粒种子中检测到1Ay亚基，而且未见其稳定表达的报道。对于野生二粒小麦（T.dicoccoides）Glu-A1位点y-型亚基编码基因的利用，目前仅见Ciaffi et al.（1991）将其Ay亚基转入到四倍体的硬粒小麦（T.durum），有效地提高了硬粒小麦面筋强度的报道。野生二粒小麦（AABB）是上联原始的二倍体一粒系小麦（AA），下联进化的六倍体普通小麦（AABBDD）最原始的四倍体桥梁植物，比二倍体小麦更易与六倍体普通小麦有性杂交实现遗传重组。然而，迄今未见有关野生二粒小麦Glu-A1位点y型亚基编码基因向栽培面积更广阔，生产量和消费量更大的六倍体普通小麦引入的报道。
发明内容
本发明的目的在于为提高小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS），提供一种通过野生二粒小麦与普通小麦远缘杂交的染色体工程技术，获得全部6个HMW-GS均稳定表达的普通小麦培育方法。该方法能有效增加普通小麦基因组中的功能性1Ay基因，实现在普通小麦基因组中，Glu-A1、Glu-B1、Glu-D1位点的3个x型和3个y型全部6个HMW-GS基因的表达，从而培育出具有6个高分子量谷蛋白亚基新组合的新型普通小麦。 
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
一种稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法，其特征在于：以普通小麦为母本，野生二粒小麦为父本，将拥有4个HMW-GS的野生二粒小麦的花粉，授予六倍体的普通小麦，通过种间远缘杂交、多代自交及鉴定，选育出稳定表达6个HMW-GS的普通小麦。
所述母本选自高产但加工品质差的普通小麦，染色体组型为AABBDD。如小麦推广品种川农16，为春性冬小麦，其蛋白含量较低，仅有12.3%，只具有4个高分子量谷蛋白亚基，其1Ay亚基编码基因处于沉默态，具有序列表中SEQ ID NO.1-3所述的碱基、核苷酸及氨基酸序列。
所述父本选自Glu-A1和Glu-B1位点均表达的含有4个高分子量谷蛋白亚基的野生二粒小麦，染色体组型为AABB，其活性态的1Ay亚基基因具有序列表中SEQ ID NO.4-5所述的碱基、核苷酸及氨基酸序列。
所述杂交双亲的种植，是秋冬季按株距10cm，行距30cm，行长2m 进行双行田间播种。
所述双亲的杂交，是抽穗后对母本穗进行人工去雄，套上硫酸纸袋以防飞花，授以野生二粒小麦花粉后继续套袋直至成熟。
所述多代自交及鉴定包括如下方法步骤：
A、将经杂交产生的种子进行SDS-PAGE分析，并对其根尖体细胞染色体数目进行检测，选择具有双亲HMW-GS条带的、染色体数目为35条的杂种F1代植株。
    B、将经步骤A选取出的F1代植株在抽穗后套上硫酸纸袋自交，收取F2代种子，按步骤A所述方法进行SDS-PAGE分析和染色体数目检测，选取35≤2n≤42和HMW-GS为6条的籽粒继续种植套袋自交得F3代，再按步骤A所述方法对F3代籽粒进行检测和选取。
C、对步骤B获选的F3代种子进行发芽移栽，并自交，连续自交6代后获得F8代，且每代均选取株叶型、抽穗期、开花期、成熟期趋向母本普通小麦的单株。
D、随机抽取F8代单株，再从各单株收获籽粒中随机选取8粒，按步骤A所述的SDS-PAGE方法进行HMW-GS检测；选取具有6个HMW-GS的籽粒进行发苗移栽获得F9代植株，再自交，收获F9代植株上产生的F10代籽粒，再随机选取8粒按同样方法进行SDS-PAGE分析，对HMW谷蛋白亚基进行检测；然后再对HMW谷蛋白亚基谱带数均为6条，且电泳迁移率一致，并含有父本野生二粒小麦Glu-A1和Glu-B1位点y-型亚基的上述8粒籽粒，进一步按步骤A所述方法进行染色体数目均为2n=42的根尖染色体数目检测。
E、将步骤D选取的杂种F10代种子，同时与母本及父本的种子进行室内发芽，剪取幼嫩叶片提取基因组DNA，再对HMW-GS编码基因进行PCR扩增，选取1Ay的条带进行转化、阳性检测、测序和序列比较分析。
F、将步骤E获得的F10代种子与母本及父本的核苷酸及其氨基酸序列进行比较分析，确认杂种育成小麦的Glu-A1位点活性y型亚基编码基因与父本野生二粒小麦的Glu-A1位点活性y型亚基编码基因序列高度一致，均具有1830bp的核苷酸长度，都没有缺失/插入区段，都能编码608个氨基酸残基，且没有提前终止密码子，均属于活性态的Ay基因；而母本普通小麦Ay等位基因的核苷酸序列短于父本和育成小麦，为1791bp，而且其DNA分子结构上存在着3个区段的缺失，其中间重复区还存在1个提前终止密码子，处于沉默态，由此而确定野生二粒小麦Glu-A1位点的活性y型亚基编码基因已真实导入普通小麦基因组。
G、对步骤F鉴定的杂种后代中的活性Ay等位基因进行染色体工程遗传重组特性分析，确认育成普通小麦所拥有的活性Ay基因的DNA序列，在保持父本98.9%的1Ay基因核苷酸的同时，还存在21个单核苷酸的变异，其中14个位点为突变，7个位点为整合了母本普通小麦的核苷酸。
H、对经步骤G确定的育成普通小麦的1Ay基因的编码亚基活性进行异源表达分析，以证明育成普通小麦所拥有的1Ay 基因与父本野生二粒小麦的1Ay基因一样具有编码1Ay亚基的功能。
I、将经步骤D-H鉴定后获选的杂种种子的具有种胚的半粒进行培养皿内发芽移栽，再连续自交2代获得F11和F12代；继续对F11和F12代的籽粒进行HMW-GS检测，以进一步证明其拥有的6个HMW-GS能在普通小麦遗传背景中稳定传递。
    本发明的有益技术效果主要表现在：
1、通过本发明方法培育获得的具有6个HMW-GS的新型普通小麦，不仅具有与母本相似的株叶型，而且还具有母本所没有的紫色茎秆性状，及较母本更优的籽粒粒积性状、产量性状和优异的品质特性，对比结果如表1所示。
2、通过本发明方法，育成了含有1Ay亚基的普通小麦，其拥有的活性Ay基因的DNA序列，既保持了父本1Ay基因高达98.9%的核苷酸序列，又存在14个位点的突变，还整合了母本1Ay核苷酸序列的 7个位点，而成为育成小麦特有的1Ay亚基编码基因。
3、通过连续对杂交种F10、F11和F12代的籽粒进行HMW-GS检测，证明了其拥有的1Ay基因能够代代稳定传递与表达。
表1      育成小麦与母本在产量及品质特性方面的比较
附图说明
图1为育成小麦的杂交选育流程示意图。
图2为 SDS-PAGE分析高分子量谷蛋白亚基电泳图
其中，1-8为杂种F9代株系的随机8粒种子，箭头所示为1Ay。
图3为基因序列比较表
图中的“-”表示相同的碱基，“·”表示缺失的碱基。
图4为推导氨基酸序列比较表
图中的“-”表示相同的氨基酸，“·”表示缺失的氨基酸，“*”表示提前终止密码子，方框里的为半胱氨酸残基。
图5为1Ay基因原核表达分析电泳图，泳道1-4 为野生二粒小麦的1Ay蛋白表达谱，它们依次是未加IPTG诱导的细菌对照、细菌中经IPTG诱导的1Ay蛋白、细菌中经丙酮沉淀IPTG诱导的1Ay蛋白，以及野生二粒小麦种子的全蛋白；泳道5-10为杂种获选高代株系的1Ay蛋白表达谱，其中，泳道5、6、7分别为F10、F11和F12代种子的全蛋白，泳道8、9、10分别为细菌中丙酮沉淀IPTG诱导的、未经丙酮沉淀IPTG诱导的1Ay蛋白，以及未加IPTG诱导的细菌对照。箭头所示为1Ay蛋白。
图6为亲本与育成小麦的农艺性状对照图 A：植株；B：穗；C：小穗；D，E：种子形态及大小。 
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非是对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
实施例1  SDS-PAGE检测获取HMW-GS结果
提取溶液组成：62.5 mM Tris-HCl (pH=6.8)，10% (v/v) glycerol，2% (w/v) SDS， 0.002% (w/v) bromophenol blue，3.0% (v/v) β-巯基乙醇；
分离胶（Resolving gel）缓冲液（2.5 L）：溶解378g Tris，25g SDS，95g 硼酸，加水定容至2.5L，pH值为8.9。
浓缩胶（Stacking gel）缓冲液：1.0 M Tris-HCL，pH=6.8，10%(W/V)SDS。
电泳缓冲液：将分离胶缓冲液稀释10倍
聚丙烯酰胺凝胶组成:
浓缩胶(3%)            分离胶(10%)
40%丙烯酰胺，ml              0.375                  2.5
2%甲叉双丙烯酰胺，ml         0.2                    0.52
Resolving gel缓冲液，ml       0                      1
Stacking gel缓冲液，ml       0.62                    0
10%SDS（W/V），ml             0.04                    0
10%（W/V）过硫酸胺，ml       0.05                   0.09
TEMED，μl                     5                     4.2
H2O，ml                       3.7                    5.9
以双亲谷蛋白亚基作对照，恒流20mA电泳，待指示剂走出分离胶后，取下胶染色15分钟，用水脱震荡脱色至条带清晰后，保存于固定液中，照相保存SDS-PAGE分析结果。
染色液组成（1L）：650 ml蒸馏水、1 g考马斯亮蓝R-250、250 ml异丙醇、100 ml冰醋酸；
脱色液组成（1L）：650 ml蒸馏水、250 ml异丙醇、100 ml冰醋酸；
固定液组成（1L）：100 ml冰醋酸、900 ml蒸馏水。
实施例2  体细胞染色体数目检测
将杂交子代的种子在25℃恒温下萌发取根，根尖在冰水混合物冰冻处理24小时。卡诺氏Ⅰ固定液（酒精：冰醋酸=3：1）固定24 h后转入70%乙醇保存。将根尖放入1 mol/L盐酸中在60 ℃的恒温水浴锅中解离6-8 min，希夫（Schiff）试剂染色，改良苯酚品红常规压片进行体细胞染色体观查，每次观察50个细胞，统计数据。
实施例3  基因组DNA的提取
采用2×CTAB法提取普通小麦、野生二粒小麦和杂交子代的基因组DNA，提取步骤如下：
（1）取2 g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65 ℃的2×CTAB提取液（2% CTAB、1.4 M NaCl、0.1 M Tris-HCl pH=8.0、0.1 M EDTA pH=8.0，临用前加2% β-巯基乙醇）15 ml混匀；
（2）65 ℃水浴30-45 min，其间轻摇混匀。冷却至室温后加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000 rpm离心10 min。
（3）取上清液，加等体积异丙醇，冰浴2 h沉淀DNA；
（4）勾出DNA，用70%酒精洗2次，无水乙醇洗一次气干DNA，溶于适量pH=8.0的1×TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100 μg/μl；
（5）100 V恒定电压下，1%琼脂糖凝胶电泳30 min，检测DNA浓度及质量。
实施例4  PCR扩增
（1）根据已知相关序列的保守区域设计序列表中SEQ ID NO.8-9所示引物；
（2）PCR反应
反应体系如下：DNA                  2 μl
dNTP                 4 μl
引物PF1              1 μl
引物PR1              1 μl
ExTaq酶              0.3 μl
10×PCR缓冲液        5 μl
MgCl2                 4 μl
ddH2O                加至终体积50 μl
PCR反应程序：
（1）94℃         5 min
（2）94℃        40 sec
（3）68 ℃        8 min 
  重复（2）→（3）25次
（4）72℃        10 min
 （5）15℃        10 min
PCR反应在Effendorf Pro-S型PCR仪中进行。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上分离，130 V恒定电压电泳2h，30min。
（3）PCR产物回收和纯化
使用购自Tiangen公司的胶回收试剂盒，所有操作均按照说明书进行。
（4）连接
使用购自Takara公司的连接试剂盒，将回收产物连接到PMD-19T载体，反应体系如下：
PMD-19T载体                            0.3 μl（约15ng）
T4连接酶                                1 μl
T4连接Buffer                            1 μl
回收PCR产物，加至终反应体积10 μl，16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌DH10B。
（5）转化
感受态细胞的制备：
a 取在无抗生素平板上生长良好的DH10B单菌落，接种于2 ml LB液体培养基中振荡活化过夜；
b 将2 ml活化过夜的菌液倒入40 ml LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600=0.3；
c 将培养好的菌液倒入50 ml离心管中，冰浴放置10 min；
d 在预冷至4 ℃的离心机中，4000 rpm离心10 min后去掉上清液，收集菌体；
e 加入20 ml冰冷的0.1 M CaCl2于离心管中，均匀悬浮菌体后，冰浴30 min；
f  4℃下，4000 rpm离心10 min后去掉上清液，收集菌体，加入2 ml冰冷的0.1 M CaCl2溶液均匀悬浮菌体后，放入冰中待用。
转化步骤如下：
a 在连接产物中加入100 μl感受态细胞，充分混匀置于冰上30 min；
b 42℃热击2 min 30s，冰浴2 min后加入预热至37 ℃的200 μl LB液体培养基中；
c 37℃振荡（100 rpm）培养45 min；
d 将菌体均匀涂于含有氨苄青霉素（33 μg/ml）的LB固体培养基平板上；
e 37 ℃培养箱中培养14-16 h。
实施例5  阳性克隆的筛选
（1）挑取培养平板上生长良好的白色单菌落，在含有氨苄青霉素（33 μg/ml）的LB固体培养基平板上划线，扩大培养（37 ℃培养12 h）；
（2）挑取扩大培养后的菌进行PCR扩增， 反应体系如下：
DNA                  少许菌体
dNTPs                1.6 μl
引物M13R             0.4 μl 
引物M13F             0.4 μl 
rTaq酶               0.2 μl
10×PCR缓冲液        2.0 μl
MgCl2                 1.6 μl
ddH2O                加至终体积20 μl；
（3）PCR反应程序同前。扩增产物在1%琼脂糖凝胶上分离，160 V恒定电压电泳30-40 min，检测有无目的片段。
实施例6  序列测定与比较分析
随机选取3个独立的阳性克隆进行送样测序，序列测定由北京六合华大基因科技股份有限公司完成，测序结果比较分析采用NCBI网址中的blast (http://www. ncbi.nlm.nib.gov/BLAST/) 程序、MEGA 4.0和DNAman 5.2.2软件进行。
实施例7  1Ay的体外表达
（1）依据所测定的基因序列，设计可扩增整个基因编码区除信号肽区域的PCR引物，并在与基因N末端保守区结合部位的5’端添加限制性内切酶NdeI位点，另一引物的5’端添加XhoI位点，引物序列如序列表中SEQ ID NO.10-11所示；
（2）使用PCR方法从质粒中扩增出目的基因片段，回收扩增产物，方法同前；
（3）对PCR产物和pET-30a质粒载体进行NdeI和XhoI的37 ℃过夜酶切；
     双酶切体系如下(50 μl)：
PCR产物/PET30a         20 μl
     10×H buffer            5 μl
     NdeI                    4 μl
     XhoI                    4 μl
     ddH2O                   17 μl
（4）对酶切后的PCR产物和pET-30a载体进行回收，16℃过夜连接反应
连接体系如下(20μl)：
pET-30a载体                               2 μl
PCR回收产物                               6 μl
T4连接buffer                               2 μl
T4连接酶                                   1 μl
ddH2O                                      9 μl
（5）连接产物转化入DH10B感受态细胞，在25μg/ml的卡那霉素平板上筛选，挑选出阳性克隆（使用引物6-AyF和6-AyR，步骤同前面扩菌），提取质粒（Tiangen提取质粒试剂盒，操作步骤见说明书），转化入大肠杆菌BL21（DE3）plySs，在含25μg/ml的卡那霉素和34μg/ml的氯霉素的平板上涂板；
（6）取在平板上筛选到的单个菌落在2 ml含25μg/ml的卡那霉素和34μg/ml的氯霉素的LB液体培养基中过夜培养；（做三个重复）
（7）第2天将1 ml过夜的菌液加到30 ml含25μg/ml的卡那霉素和34μg/ml的氯霉素的2×YT液体培养基（每1 ml 2×YT中加25μl过滤灭菌的40%的葡萄糖）中培养至OD600=0.6时加入IPTG（1 mM）分别诱导4，5，6 h；另做一组不加IPTG的作为对照； 
（8）在37 ℃摇床培养4 h后开始取样收集菌体（每隔一小时取一个重复），诱导的和对照同时进行，其中8 ml收集菌体用来做谷蛋白常规提取，剩余的22 ml用来做丙酮沉淀；
（9）将22 ml菌液以5000 rpm，10 min离心收集的菌体中加入2 ml 70%乙醇，悬浮菌体后于室温振荡提取30 min。离心机预冷至0 ℃，15000 rpm离心5 min，弃上清重复提取一次；
（10）残渣中加2 ml 50%异丙醇悬浮后于60 ℃水浴中提取30 min，0℃，15000 rpm离心5 min，弃上清重复提取一次；
（11）残渣中加入200 μl提取液C（10 ml提取液C由5 ml异丙醇，800 μl 1MTris-HCL pH8.0，300μl β-巯基乙醇，3.9 ml水组成）混匀后于60℃水浴中提取30 min，0℃，15000 rpm离心5 min，保留上清，将剩余残渣重提一次合并上清液；
（12）将得到的上清液中加入总体积40%的丙酮，0 ℃放置10 min，0 ℃，15000 rpm离心5 min，离心弃上清，重复离心一次；
（13）将得到的沉淀晾干；
（14）将谷蛋白提取液加入干燥的沉淀中，室温振荡提取30min，沸水中煮5min，12000rpm离心5min，按实施例1方法进行SDS-PAGE电泳分析，照相保存表达分析结果。
实施例8 育成小麦双亲的种间杂交配组
（1）选取高产但烘焙品质差的，仅具有4个高分子量谷蛋白亚基（其1Ay亚基编码基因处于沉默态）的普通小麦品种川农16做母本（染色体组型为AABBDD）；
（2）选取Glu-A1和Glu-B1位点均表达的含有全部4个高分子量谷蛋白亚基的野生二粒小麦 (染色体组型为AABB)为父本；
（3）于秋冬季在田间按株距10cm，行距30cm, 行长2m，播种普通小麦川农16和野生二粒小麦，材料间空1行；各材料按10天的间隔分2-3期播种；抽穗后对母本川农16进行人工去雄并套上硫酸纸袋以防飞花，授以父本野生二粒小麦花粉后继续套袋直至成熟获得杂种F1种子。
实施例9  多代自交及鉴别方法
（1）对收获的F1代种子按实施例1所述方法进行SDS-PAGE分析，并按实施例2所述方法对其根尖体细胞染色体数目进行检测；
（2）选择具有双亲HMW-GS条带的、染色体数目为35条的杂种植株，在抽穗后套上硫酸纸袋自交，收取F2代种子，按步骤A所述方法进行SDS-PAGE分析和染色体数目检测，选取35≤2n≤42和HMW-GS为6条的籽粒继续种植套袋自交得F3代，再按步骤A所述方法对F3代籽粒进行检测和选取；
（3）发芽移栽获选的F3代植株，自交，连续自交6代。每代均选取株叶型、抽穗期、开花期、成熟期趋向川农16的单株；
（4）从随机抽取的F8代单株中，对各株收获的籽粒中再随机选取8粒，按上述SDS-PAGE方法进行HMW-GS检测。选取具有6个HMW-GS的籽粒进行发芽移栽获得F9代植株，再自交，收获F9代植株上产生的F10籽粒后，再随机选取8粒按同样方法进行SDS-PAGE分析，对HMW谷蛋白亚基进行检测。然后再对HMW谷蛋白亚基谱带数均为6条，且电泳迁移率一致，并含有父本野生二粒小麦Glu-A1和Glu-B1位点y-型亚基的上述8粒籽粒，进一步按上述方法进行根尖染色体数目检测，以确定染色体数目是否均为2n=42；
（5）对获选的F10代杂种种子和川农16及野生二粒小麦种子进行室内发芽，剪取幼嫩叶片按实施例3所述方法提取基因组DNA，按实施例4所述方法对HMW-GS编码基因进行PCR扩增，选取1Ay（其迁移率约1.8 kb）的条带进行转化，按实施例5所述方法进行阳性检测，按实施例6所述方法进行测序和序列比较分析；
（6）按实施例7所述方法，对1Ay基因的编码亚基活性进行异源表达分析；
（7）对入选杂种子代种子的具有种胚的半粒，再进行培养皿内发芽移栽，再连续自交2代获得F11和F12代。对收获的F11和F12代籽粒，按实施例1和实施例2的方法进行HMW-GS和根尖体细胞染色体数目的稳定性检测。 
序列表
<110>  伍，碧华
       王，真真
       胡，喜贵
       胡，继良
       郭，孝辉
       王，栋
       郑，有良
       刘，登才
       蒲，至恩
       陈，国跃
       代，寿芬 
<120>  稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法 
<130>  
<160>  11    
<170>  PatentIn version 3.3
<210>  1
<211>  1791
<212>  DNA
<213>  普通小麦（Triticum aestivum）  
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1791)
<400>  1 
atg gct aag cgg ttg gtc ctc ttt gcg aca gta gtc att ggc ctc gtg       48
Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Ala Thr Val Val Ile Gly Leu Val         
1               5                   10                  15              
tct ctc acc gtc gct gaa ggt gag gcc tct aag caa cta cag tgc gag       96
Ser Leu Thr Val Ala Glu Gly Glu Ala Ser Lys Gln Leu Gln Cys Glu         
            20                  25                  30                   
cgc gag ctc cag gag agt tcg ctt gag gca tgc cgg ctg gtc gtg gac      144
Arg Glu Leu Gln Glu Ser Ser Leu Glu Ala Cys Arg Leu Val Val Asp         
        35                  40                  45                       
caa cag ttg gcc agc cgg ctg cca tgg agc acg ggg ctc cag atg cgg      192
Gln Gln Leu Ala Ser Arg Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu Gln Met Arg         
    50                  55                  60                           
tgc tgc cag cag ctc cga gat att agt gcc aag tgt cgc ccc gtc gcc      240
Cys Cys Gln Gln Leu Arg Asp Ile Ser Ala Lys Cys Arg Pro Val Ala         
65                  70                  75                  80           
ctc agc caa gtc gca aga caa tat ggg caa acc gcg gtg ccg ccc aag      288
Leu Ser Gln Val Ala Arg Gln Tyr Gly Gln Thr Ala Val Pro Pro Lys         
                85                  90                  95              
ggc gga ccc ttc tac cat cgc gag acc acg cca ctg cag caa ctc caa      336
Gly Gly Pro Phe Tyr His Arg Glu Thr Thr Pro Leu Gln Gln Leu Gln         
            100                 105                 110                  
caa gga ata ttt ggg gga aca tct tca caa aca gta caa ggg tat tac      384
Gln Gly Ile Phe Gly Gly Thr Ser Ser Gln Thr Val Gln Gly Tyr Tyr         
        115                 120                 125                     
cca agt gta ata tct cct cag cag ggg tca tat tat cca ggc caa gct      432
Pro Ser Val Ile Ser Pro Gln Gln Gly Ser Tyr Tyr Pro Gly Gln Ala         
    130                 135                 140                          
tct cca caa cag cca gga aaa tgg caa gaa cta gga caa ggg caa caa      480
Ser Pro Gln Gln Pro Gly Lys Trp Gln Glu Leu Gly Gln Gly Gln Gln         
145                 150                 155                 160         
tgg tac tat cca act tct ctg cag cag cca gga caa ggg caa caa ggg      528
Trp Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly         
                165                 170                 175              
tac tac cga act tct ctg cag cag cca gga caa agg caa caa ggg tac      576
Tyr Tyr Arg Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Arg Gln Gln Gly Tyr         
            180                 185                 190                 
tac cga act tct ctg cag cag cta gga caa ggg caa cag ata gga caa      624
Tyr Arg Thr Ser Leu Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln         
        195                 200                 205                      
tgg caa caa ggg tac tac cca act tct ccg cag cac cca gga caa ggg      672
Trp Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln His Pro Gly Gln Gly         
    210                 215                 220                         
caa caa cca gga caa gtg caa aaa ata gga caa ggg caa caa cca gaa      720
Gln Gln Pro Gly Gln Val Gln Lys Ile Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu         
225                 230                 235                 240         
aaa ggg caa caa cta gga caa gag caa caa ata gga caa ggg caa caa      768
Lys Gly Gln Gln Leu Gly Gln Glu Gln Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln         
                245                 250                 255             
cca gaa caa ggg caa caa cca gga caa ggg caa caa ggg tac tac cca      816
Pro Glu Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro         
            260                 265                 270                 
act tct cta cag cag cca gga caa ggg caa caa cca gga caa tgg caa      864
Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Trp Gln         
        275                 280                 285                     
caa cca gga caa ggg caa caa ggg tac tac cca act tct ctg caa cag      912
Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln         
    290                 295                 300                         
cca gta caa ggg caa caa ggg cac tac cca gct tct cag cac cag cca      960
Pro Val Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Pro Ala Ser Gln His Gln Pro         
305                 310                 315                 320         
ggg cag ggg caa caa ggg cac cag cca gct tct ctg cag tag tca gga     1008
Gly Gln Gly Gln Gln Gly His Gln Pro Ala Ser Leu Gln     Ser Gly         
                325                 330                     335          
caa ggg caa caa ggg cac cac cca gct tct cta cag cag cca gga caa     1056
Gln Gly Gln Gln Gly His His Pro Ala Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln         
                340                 345                 350              
ggg aaa caa aca gga cag cga gaa caa agg caa caa cca ggg caa ggg     1104
Gly Lys Gln Thr Gly Gln Arg Glu Gln Arg Gln Gln Pro Gly Gln Gly         
            355                 360                 365                 
caa caa aca gga caa ggg caa cag cca gaa caa gag caa caa cca gga     1152
Gln Gln Thr Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu Gln Glu Gln Gln Pro Gly         
        370                 375                 380                      
caa ggg caa caa ggg tac tat cca ctt ctg caa cag cca gga caa ggg     1200
Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Leu Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly         
    385                 390                 395                         
caa cag cca gaa caa tgg caa caa cca gga caa ggt caa caa ggg cac     1248
Gln Gln Pro Glu Gln Trp Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly His         
400                 405                 410                 415         
tac cca gct tct ctg cag cag tca gga caa gga caa caa ggg cac tac     1296
Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr         
                420                 425                 430              
cca gct tct ctg caa cag cta gga caa gga caa cca gga caa acg caa     1344
Pro Ala Ser Leu Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Pro Gly Gln Thr Gln         
            435                 440                 445                  
caa cca gga caa ggg caa cag cca gaa caa gag gaa caa tca gga caa     1392
Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu Gln Glu Glu Gln Ser Gly Gln         
        450                 455                 460                      
ggg caa caa ggg tac tat cca act tct ccg cag caa cca gga caa ggg     1440
Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Gly         
    465                 470                 475                          
caa caa ggg cac ttc cca act tct gga caa gcg caa caa cca gga caa     1488
Gln Gln Gly His Phe Pro Thr Ser Gly Gln Ala Gln Gln Pro Gly Gln         
480                 485                 490                 495         
ggc caa caa ata gga caa gcg caa caa cta gaa caa ggg caa caa gga     1536
Gly Gln Gln Ile Gly Gln Ala Gln Gln Leu Glu Gln Gly Gln Gln Gly         
                500                 505                 510             
tac tac cca act tct ctg cag cag cca gga caa gag caa cag tca gga     1584
Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Glu Gln Gln Ser Gly         
            515                 520                 525                 
caa ggg caa cag tta gga caa gga cac caa cca gga caa ggg caa caa     1632
Gln Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gly His Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln         
        530                 535                 540                     
tca gga caa gag caa caa ggc tat gac agc cca tac cat gtt agc gtg     1680
Ser Gly Gln Glu Gln Gln Gly Tyr Asp Ser Pro Tyr His Val Ser Val         
    545                 550                 555                         
gag cag caa gcg gcc agc cca aag gtg gca aag gcg cac cat ccg gtg     1728
Glu Gln Gln Ala Ala Ser Pro Lys Val Ala Lys Ala His His Pro Val         
560                 565                 570                 575          
gca cag ctg ccg aca atg tgc cag atg gag ggg ggc gac gca ttg tcg     1776
Ala Gln Leu Pro Thr Met Cys Gln Met Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ser         
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gct agc cag tga tag                                                 1791
Ala Ser Gln                                                             
<210>  2
<211>  333
<212>  PRT
<213>  普通小麦（Triticum aestivum）
<400>  2
Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Ala Thr Val Val Ile Gly Leu Val 
1               5                   10                  15      
Ser Leu Thr Val Ala Glu Gly Glu Ala Ser Lys Gln Leu Gln Cys Glu 
            20                  25                  30           
Arg Glu Leu Gln Glu Ser Ser Leu Glu Ala Cys Arg Leu Val Val Asp 
        35                  40                  45              
Gln Gln Leu Ala Ser Arg Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu Gln Met Arg 
    50                  55                  60                   
Cys Cys Gln Gln Leu Arg Asp Ile Ser Ala Lys Cys Arg Pro Val Ala 
65                  70                  75                  80  
Leu Ser Gln Val Ala Arg Gln Tyr Gly Gln Thr Ala Val Pro Pro Lys 
                85                  90                  95      
Gly Gly Pro Phe Tyr His Arg Glu Thr Thr Pro Leu Gln Gln Leu Gln 
            100                 105                 110         
Gln Gly Ile Phe Gly Gly Thr Ser Ser Gln Thr Val Gln Gly Tyr Tyr 
        115                 120                 125             
Pro Ser Val Ile Ser Pro Gln Gln Gly Ser Tyr Tyr Pro Gly Gln Ala 
    130                 135                 140                  
Ser Pro Gln Gln Pro Gly Lys Trp Gln Glu Leu Gly Gln Gly Gln Gln 
145                 150                 155                 160 
Trp Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly 
                165                 170                 175     
Tyr Tyr Arg Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Arg Gln Gln Gly Tyr 
            180                 185                 190          
Tyr Arg Thr Ser Leu Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln 
        195                 200                 205             
Trp Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln His Pro Gly Gln Gly 
    210                 215                 220                 
Gln Gln Pro Gly Gln Val Gln Lys Ile Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu 
225                 230                 235                 240 
Lys Gly Gln Gln Leu Gly Gln Glu Gln Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln 
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Pro Glu Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro 
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Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Trp Gln 
        275                 280                 285             
Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln 
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<210>  3
<211>  261
<212>  PRT
<213>  普通小麦（Triticum aestivum）
<400>  3
Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly His His Pro Ala Ser Leu Gln Gln Pro 
1               5                   10                  15       
Gly Gln Gly Lys Gln Thr Gly Gln Arg Glu Gln Arg Gln Gln Pro Gly 
            20                  25                  30           
Gln Gly Gln Gln Thr Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu Gln Glu Gln Gln 
        35                  40                  45              
Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Leu Leu Gln Gln Pro Gly 
    50                  55                  60                    
Gln Gly Gln Gln Pro Glu Gln Trp Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln 
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Gly His Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly 
                85                  90                  95       
His Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Pro Gly Gln 
            100                 105                 110         
Thr Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu Gln Glu Glu Gln Ser 
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Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly 
    130                 135                 140                 
Gln Gly Gln Gln Gly His Phe Pro Thr Ser Gly Gln Ala Gln Gln Pro 
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Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln Ala Gln Gln Leu Glu Gln Gly Gln 
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Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Glu Gln Gln 
            180                 185                 190         
Ser Gly Gln Gly Gln Gln Leu Gly Gln Gly His Gln Pro Gly Gln Gly 
        195                 200                 205             
Gln Gln Ser Gly Gln Glu Gln Gln Gly Tyr Asp Ser Pro Tyr His Val 
    210                 215                 220                 
Ser Val Glu Gln Gln Ala Ala Ser Pro Lys Val Ala Lys Ala His His 
225                 230                 235                 240 
Pro Val Ala Gln Leu Pro Thr Met Cys Gln Met Glu Gly Gly Asp Ala 
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Leu Ser Ala Ser Gln 
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<210>  4
<211>  1830
<212>  DNA
<213>  野生二粒小麦（Triticum dicoccoides）
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1830)
<400>  4
atg gct aag cgg ttg gtc ctc ttt gcg aca gta gtc att ggc ctc gtg       48
Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Ala Thr Val Val Ile Gly Leu Val         
1               5                   10                  15              
tct ctc acc gtc gct gaa ggt gag acc tct aag caa cta cag tgc gag       96
Ser Leu Thr Val Ala Glu Gly Glu Thr Ser Lys Gln Leu Gln Cys Glu         
            20                  25                  30                   
cgc gag ctc cag ggg agt tcg ctt gag gca tgc cgg ctg gtc gtg gac      144
Arg Glu Leu Gln Gly Ser Ser Leu Glu Ala Cys Arg Leu Val Val Asp         
        35                  40                  45                      
caa cag ttg gcc ggc cgg ctg cca tgg agc acg ggg ctc cag atg cgg      192
Gln Gln Leu Ala Gly Arg Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu Gln Met Arg         
    50                  55                  60                          
tgc tgc cag cag ctc cga gat att agt gcc aag tgt cgc ccc gtc gcc      240
Cys Cys Gln Gln Leu Arg Asp Ile Ser Ala Lys Cys Arg Pro Val Ala         
65                  70                  75                  80          
cac agc caa gtc gca aga caa cat ggg caa acc gcg gtg ccg ccc aag      288
His Ser Gln Val Ala Arg Gln His Gly Gln Thr Ala Val Pro Pro Lys         
                85                  90                  95              
ggc gga tcc ttc tac cat cgc gag acc acg cca ctg cag caa ctc caa      336
Gly Gly Ser Phe Tyr His Arg Glu Thr Thr Pro Leu Gln Gln Leu Gln         
            100                 105                 110                 
caa gga ata ttt ggg gga aca tct tca caa aca gta caa ggg tat tac      384
Gln Gly Ile Phe Gly Gly Thr Ser Ser Gln Thr Val Gln Gly Tyr Tyr         
        115                 120                 125                     
cca agt gta ata tct cct cag cag ggg tca tat tat cca ggc caa gct      432
Pro Ser Val Ile Ser Pro Gln Gln Gly Ser Tyr Tyr Pro Gly Gln Ala         
    130                 135                 140                         
tct cca caa cag cca gga aaa tgg caa gaa cta gga caa ggg caa caa      480
Ser Pro Gln Gln Pro Gly Lys Trp Gln Glu Leu Gly Gln Gly Gln Gln         
145                 150                 155                 160          
tgg tac tat cca act tct ctg cag aag cca gga caa ggg caa caa ggg      528
Trp Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Lys Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly         
                165                 170                 175              
tac tac cga act tct ctg cag ccg cca gga caa agg caa caa ggg tac      576
Tyr Tyr Arg Thr Ser Leu Gln Pro Pro Gly Gln Arg Gln Gln Gly Tyr         
            180                 185                 190                  
tac cga act tct ctg cag cag cca gga caa ggg caa cag ata gga caa      624
Tyr Arg Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln         
        195                 200                 205                     
tgg caa caa ggg tac tac cca act tct ccg cag cac cca gga caa ggg      672
Trp Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln His Pro Gly Gln Gly         
    210                 215                 220                          
caa caa cca gga caa gtg caa aaa ata gga caa ggg caa caa cca gaa      720
Gln Gln Pro Gly Gln Val Gln Lys Ile Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu         
225                 230                 235                 240         
aaa ggg caa caa cta gga caa gag caa caa ata gga caa ggg caa caa      768
Lys Gly Gln Gln Leu Gly Gln Glu Gln Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln         
                245                 250                 255             
cca gaa caa ggg caa caa cca gga caa ggg caa caa cca gga caa ggg      816
Pro Glu Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly         
            260                 265                 270                 
caa caa ggg tac tac ccg act tct ctg cag cag cca gga caa ggg caa      864
Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln         
        275                 280                 285                     
caa cca gga caa tgg caa caa cca gta caa ggg caa caa ggg tac tac      912
Gln Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Val Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr         
    290                 295                 300                          
tca act tct ctg cag cag cca gta caa ggg caa caa ggg cac tac cta      960
Ser Thr Ser Leu Gln Gln Pro Val Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Leu         
305                 310                 315                 320         
gct tct cag cac cag cca ggg cag ggg caa caa ggg cac cac cca gct     1008
Ala Ser Gln His Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly His His Pro Ala         
                325                 330                 335             
tct ctg cag cag tca gga caa ggg caa caa ggg cac cac cca gct tct     1056
Ser Leu Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly His His Pro Ala Ser         
            340                 345                 350                 
cta cag cag cca gga caa ggg aag caa aca gga cag cga gaa caa agg     1104
Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Lys Gln Thr Gly Gln Arg Glu Gln Arg         
        355                 360                 365                      
caa caa cca gga caa ggg caa caa aca gga caa gag caa cag cca gaa     1152
Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Thr Gly Gln Glu Gln Gln Pro Glu         
    370                 375                 380                         
caa gag caa caa cta gga caa ggg caa caa ggg tac tat cca act tat     1200
Gln Glu Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Tyr         
385                 390                 395                 400          
ctg caa cag cca gga caa ggg cag cag cca gaa caa tgg caa caa cca     1248
Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu Gln Trp Gln Gln Pro         
                405                 410                 415             
gga caa ggt caa caa ggg cac tac cca gct tct ctg cag cag tca gga     1296
Gly Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Ser Gly         
            420                 425                 430                  
caa gga caa caa ggg cac tac cca gct tct ctg cag cag cta gga caa     1344
Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Leu Gly Gln         
        435                 440                 445                     
gga caa cca gga caa acg caa caa cca gga caa ggg caa cag cca gaa     1392
Gly Gln Pro Gly Gln Thr Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu         
    450                 455                 460                         
caa gag gaa caa tca gga caa ggg caa caa ggg tac tat cca act tct     1440
Gln Glu Glu Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser         
465                 470                 475                 480         
ccg cag caa cca gga caa ggg caa caa cca gga caa agg caa caa ggg     1488
Pro Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Arg Gln Gln Gly         
                485                 490                 495             
cac ttc cca act tct gga caa gcg caa caa cca gga caa ggc caa caa     1536
His Phe Pro Thr Ser Gly Gln Ala Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln         
            500                 505                 510                 
ata gga caa gcg caa caa cta gga caa ggg caa caa gga tac tac cca     1584
Ile Gly Gln Ala Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro         
        515                 520                 525                     
act tct ccg cag cag cca gga caa gag caa cag tca aga caa ggg caa     1632
Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Glu Gln Gln Ser Arg Gln Gly Gln         
    530                 535                 540                          
cag tta gga caa gga cac caa cca gga caa ggg caa caa tca gga caa     1680
Gln Leu Gly Gln Gly His Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln         
545                 550                 555                 560          
gag caa caa ggc tac gac agc cca tac cat gtt agc gtg gag cag caa     1728
Glu Gln Gln Gly Tyr Asp Ser Pro Tyr His Val Ser Val Glu Gln Gln         
                565                 570                 575             
gcg gcc agc cca agg gtg gca aag gcg cac cat ccg gtg gca cag ctg     1776
Ala Ala Ser Pro Arg Val Ala Lys Ala His His Pro Val Ala Gln Leu         
            580                 585                 590                 
ccg aca atg tgc cag atg gag ggg ggc gac gca ttg tcg gcc agc cag     1824
Pro Thr Met Cys Gln Met Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ser Ala Ser Gln         
        595                 600                 605                      
tga tag                                                             1830
<210>  5
<211>  608
<212>  PRT
<213>  野生二粒小麦（Triticum dicoccoides） 
<400>  5
Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Ala Thr Val Val Ile Gly Leu Val 
1               5                   10                  15      
Ser Leu Thr Val Ala Glu Gly Glu Thr Ser Lys Gln Leu Gln Cys Glu 
            20                  25                  30          
Arg Glu Leu Gln Gly Ser Ser Leu Glu Ala Cys Arg Leu Val Val Asp 
        35                  40                  45              
Gln Gln Leu Ala Gly Arg Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu Gln Met Arg 
    50                  55                  60                   
Cys Cys Gln Gln Leu Arg Asp Ile Ser Ala Lys Cys Arg Pro Val Ala 
65                  70                  75                  80   
His Ser Gln Val Ala Arg Gln His Gly Gln Thr Ala Val Pro Pro Lys 
                85                  90                  95       
Gly Gly Ser Phe Tyr His Arg Glu Thr Thr Pro Leu Gln Gln Leu Gln 
            100                 105                 110          
Gln Gly Ile Phe Gly Gly Thr Ser Ser Gln Thr Val Gln Gly Tyr Tyr 
        115                 120                 125             
Pro Ser Val Ile Ser Pro Gln Gln Gly Ser Tyr Tyr Pro Gly Gln Ala 
    130                 135                 140                 
Ser Pro Gln Gln Pro Gly Lys Trp Gln Glu Leu Gly Gln Gly Gln Gln 
145                 150                 155                 160 
Trp Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Lys Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly 
                165                 170                 175     
Tyr Tyr Arg Thr Ser Leu Gln Pro Pro Gly Gln Arg Gln Gln Gly Tyr 
            180                 185                 190         
Tyr Arg Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln 
        195                 200                 205             
Trp Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln His Pro Gly Gln Gly 
    210                 215                 220                 
Gln Gln Pro Gly Gln Val Gln Lys Ile Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu 
225                 230                 235                 240 
Lys Gly Gln Gln Leu Gly Gln Glu Gln Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln 
                245                 250                 255     
Pro Glu Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly 
            260                 265                 270         
Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln 
        275                 280                 285             
Gln Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Val Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr 
    290                 295                 300                 
Ser Thr Ser Leu Gln Gln Pro Val Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Leu 
305                 310                 315                 320 
Ala Ser Gln His Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly His His Pro Ala 
                325                 330                 335     
Ser Leu Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly His His Pro Ala Ser 
            340                 345                 350         
Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Lys Gln Thr Gly Gln Arg Glu Gln Arg 
        355                 360                 365             
Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Thr Gly Gln Glu Gln Gln Pro Glu 
    370                 375                 380                 
Gln Glu Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Tyr 
385                 390                 395                 400  
Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu Gln Trp Gln Gln Pro 
                405                 410                 415     
Gly Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Ser Gly 
            420                 425                 430          
Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Leu Gly Gln 
        435                 440                 445              
Gly Gln Pro Gly Gln Thr Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu 
    450                 455                 460                  
Gln Glu Glu Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser 
465                 470                 475                 480 
Pro Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Arg Gln Gln Gly 
                485                 490                 495     
His Phe Pro Thr Ser Gly Gln Ala Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln 
            500                 505                 510          
Ile Gly Gln Ala Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro 
        515                 520                 525             
Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Glu Gln Gln Ser Arg Gln Gly Gln 
    530                 535                 540                 
Gln Leu Gly Gln Gly His Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln 
545                 550                 555                 560  
Glu Gln Gln Gly Tyr Asp Ser Pro Tyr His Val Ser Val Glu Gln Gln 
                565                 570                 575     
Ala Ala Ser Pro Arg Val Ala Lys Ala His His Pro Val Ala Gln Leu 
            580                 585                 590         
Pro Thr Met Cys Gln Met Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ser Ala Ser Gln 
        595                 600                 605             
<210>  6
<211>  1830
<212>  DNA
<213>  普通小麦×野生二粒小麦
<220>
<221>  CDS
<222>  (1)..(1830)
<400>  6
atg gct aag cgg ttg gtc ctc ttt gcg aca gta gtc att ggc ctc gtg       48
Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Ala Thr Val Val Ile Gly Leu Val         
1               5                   10                  15              
tct ctc gcc gtc gct gaa ggt gag acc tct aag caa cta cag tgc gag       96
Ser Leu Ala Val Ala Glu Gly Glu Thr Ser Lys Gln Leu Gln Cys Glu         
            20                  25                  30                  
cgc gag ctc cag gag agt tcg ctt gag gca tgc cgg ctg gtc gtg gac      144
Arg Glu Leu Gln Glu Ser Ser Leu Glu Ala Cys Arg Leu Val Val Asp         
        35                  40                  45                      
caa cag ttg gcc ggc cgg ctg cca tgg agc acg ggg ctc cag atg cgg      192
Gln Gln Leu Ala Gly Arg Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu Gln Met Arg         
    50                  55                  60                          
tgc tgc cag cag ctc cga gat att agt gcc aag tgt cgc ccc gtc gcc      240
Cys Cys Gln Gln Leu Arg Asp Ile Ser Ala Lys Cys Arg Pro Val Ala         
65                  70                  75                  80          
cac agc caa gtc gca aga caa cat ggg caa acc gcg gtg ccg ccc aag      288
His Ser Gln Val Ala Arg Gln His Gly Gln Thr Ala Val Pro Pro Lys         
                85                  90                  95               
ggc gga tcc ttc tac cat cgc gag acc acg cca ctg cag caa ctc caa      336
Gly Gly Ser Phe Tyr His Arg Glu Thr Thr Pro Leu Gln Gln Leu Gln         
            100                 105                 110                  
caa gga ata ttt ggg gga aca tct tca caa aca gta caa ggg tat tac      384
Gln Gly Ile Phe Gly Gly Thr Ser Ser Gln Thr Val Gln Gly Tyr Tyr         
        115                 120                 125                     
cca agt gta ata tct cct cag cag ggg tca tat tat cca ggc caa gct      432
Pro Ser Val Ile Ser Pro Gln Gln Gly Ser Tyr Tyr Pro Gly Gln Ala         
    130                 135                 140                         
tct cta caa cag cca gga aaa tgg caa gaa cta gga caa ggg caa caa      480
Ser Leu Gln Gln Pro Gly Lys Trp Gln Glu Leu Gly Gln Gly Gln Gln         
145                 150                 155                 160          
tgg tac tat cca act tct ctg cag aag cca gga caa ggg caa caa ggg      528
Trp Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Lys Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly         
                165                 170                 175             
tac tac cga act tct ctg cag cag cca gga caa agg caa caa ggg tac      576
Tyr Tyr Arg Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Arg Gln Gln Gly Tyr         
            180                 185                 190                 
tac cga act tct ctg cag cag cca gga caa ggg caa cag ata gga caa      624
Tyr Arg Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln         
        195                 200                 205                     
tgg caa caa ggg tac tac cca acc tct ccg cag cac cca gga caa ggg      672
Trp Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln His Pro Gly Gln Gly         
    210                 215                 220                          
caa caa cca gga caa gtg caa aaa ata gga caa ggg caa caa cca gaa      720
Gln Gln Pro Gly Gln Val Gln Lys Ile Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu         
225                 230                 235                 240         
aaa ggg caa caa cta ggg caa gag caa caa ata gga caa ggg caa caa      768
Lys Gly Gln Gln Leu Gly Gln Glu Gln Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln         
                245                 250                 255             
cca gaa caa ggg caa caa cca gga caa ggg caa caa cca gga caa ggg      816
Pro Glu Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly         
            260                 265                 270                 
caa caa ggg tac tac cca act tct ctg cag cag cca gga caa ggg caa      864
Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln         
        275                 280                 285                      
caa cca gga caa tgg caa caa cca gta caa ggg caa caa ggg tac tac      912
Gln Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Val Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr         
    290                 295                 300                         
tca act tct ctg cag cag cca gta caa ggg caa caa ggg cac tac cta      960
Ser Thr Ser Leu Gln Gln Pro Val Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Leu         
305                 310                 315                 320         
gct tct cag cac cag cca ggg cag ggg caa caa ggg cac cac cca gct     1008
Ala Ser Gln His Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly His His Pro Ala         
                325                 330                 335             
tct ctg cag cag tca gga caa ggg caa caa ggg cac cac cca gct tct     1056
Ser Leu Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly His His Pro Ala Ser         
            340                 345                 350                  
cta cag cag cca gga caa ggg aaa caa aca gga cag cga gaa caa agg     1104
Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Lys Gln Thr Gly Gln Arg Glu Gln Arg         
        355                 360                 365                     
caa caa cca gga caa ggg caa caa aca gga caa gag caa cag cca gaa     1152
Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Thr Gly Gln Glu Gln Gln Pro Glu         
    370                 375                 380                         
caa gag caa caa cta gga cag ggg caa caa ggg tac tat cca act tat     1200
Gln Glu Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Tyr         
385                 390                 395                 400         
ctg caa cag cca gga caa ggg caa cag cca gaa caa tgg caa caa cca     1248
Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu Gln Trp Gln Gln Pro         
                405                 410                 415             
gga caa ggt caa caa ggg cac tac cca gct tct ctg cag cag tca gga     1296
Gly Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Ser Gly         
            420                 425                 430                 
caa gga caa caa ggg cac tac cca gct tct ctg cag cag cta gga caa     1344
Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Leu Gly Gln         
        435                 440                 445                      
gga caa cca gga caa acg caa caa cca gga caa ggg caa cag cca gaa     1392
Gly Gln Pro Gly Gln Thr Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu         
    450                 455                 460                         
caa gag gaa caa tca gga caa ggg caa caa ggg tac tat cca act tct     1440
Gln Glu Glu Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser         
465                 470                 475                 480          
ccg cag caa cca gga caa ggg caa caa cca gga caa ggg caa caa ggg     1488
Pro Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly         
                485                 490                 495             
cac ttc cca act tct gga caa gcg caa caa cca gga caa ggc caa caa     1536
His Phe Pro Thr Ser Gly Gln Ala Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln         
            500                 505                 510                 
ata gga caa gcg caa caa cta gga caa ggg caa caa gga tac tac cca     1584
Ile Gly Gln Ala Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro         
        515                 520                 525                      
act tct ccg cag cag cca gga cag gag caa cag tca aga caa ggg caa     1632
Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Glu Gln Gln Ser Arg Gln Gly Gln         
    530                 535                 540                         
cag tta gga caa gga cac caa cca gga caa ggg caa caa tca gga caa     1680
Gln Leu Gly Gln Gly His Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln         
545                 550                 555                 560         
gag caa caa ggc tac gac agc cca tac cat gtt agc gtg gag cag caa     1728
Glu Gln Gln Gly Tyr Asp Ser Pro Tyr His Val Ser Val Glu Gln Gln         
                565                 570                 575             
gcg gcc agc cca aag gtg gca aag gcg cac cat ccg gtg gca cag ctg     1776
Ala Ala Ser Pro Lys Val Ala Lys Ala His His Pro Val Ala Gln Leu         
            580                 585                 590                 
ccg aca atg tgc cag atg gag ggg ggc gac gca ttg tcg gct agc cag     1824
Pro Thr Met Cys Gln Met Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ser Ala Ser Gln         
        595                 600                 605                     
tga tag                                                             1830
<210>  7
<211>  608
<212>  PRT
<213>  普通小麦×野生二粒小麦
<400>  7
Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Ala Thr Val Val Ile Gly Leu Val 
1               5                   10                  15      
Ser Leu Ala Val Ala Glu Gly Glu Thr Ser Lys Gln Leu Gln Cys Glu 
            20                  25                  30          
Arg Glu Leu Gln Glu Ser Ser Leu Glu Ala Cys Arg Leu Val Val Asp 
        35                  40                  45               
Gln Gln Leu Ala Gly Arg Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu Gln Met Arg 
    50                  55                  60                  
Cys Cys Gln Gln Leu Arg Asp Ile Ser Ala Lys Cys Arg Pro Val Ala 
65                  70                  75                  80  
His Ser Gln Val Ala Arg Gln His Gly Gln Thr Ala Val Pro Pro Lys 
                85                  90                  95       
Gly Gly Ser Phe Tyr His Arg Glu Thr Thr Pro Leu Gln Gln Leu Gln 
            100                 105                 110          
Gln Gly Ile Phe Gly Gly Thr Ser Ser Gln Thr Val Gln Gly Tyr Tyr 
        115                 120                 125              
Pro Ser Val Ile Ser Pro Gln Gln Gly Ser Tyr Tyr Pro Gly Gln Ala 
    130                 135                 140                  
Ser Leu Gln Gln Pro Gly Lys Trp Gln Glu Leu Gly Gln Gly Gln Gln 
145                 150                 155                 160 
Trp Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Lys Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly 
                165                 170                 175      
Tyr Tyr Arg Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Arg Gln Gln Gly Tyr 
            180                 185                 190          
Tyr Arg Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln 
        195                 200                 205             
Trp Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln His Pro Gly Gln Gly 
    210                 215                 220                 
Gln Gln Pro Gly Gln Val Gln Lys Ile Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu 
225                 230                 235                 240 
Lys Gly Gln Gln Leu Gly Gln Glu Gln Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln 
                245                 250                 255     
Pro Glu Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly 
            260                 265                 270         
Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln 
        275                 280                 285             
Gln Pro Gly Gln Trp Gln Gln Pro Val Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr 
    290                 295                 300                 
Ser Thr Ser Leu Gln Gln Pro Val Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Leu 
305                 310                 315                 320 
Ala Ser Gln His Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly His His Pro Ala 
                325                 330                 335     
Ser Leu Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly His His Pro Ala Ser 
            340                 345                 350         
Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Lys Gln Thr Gly Gln Arg Glu Gln Arg 
        355                 360                 365             
Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Thr Gly Gln Glu Gln Gln Pro Glu 
    370                 375                 380                          
Gln Glu Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Tyr 
385                 390                 395                 400 
Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu Gln Trp Gln Gln Pro 
                405                 410                 415      
Gly Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Ser Gly 
            420                 425                 430         
Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Leu Gly Gln 
        435                 440                 445             
Gly Gln Pro Gly Gln Thr Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Glu 
    450                 455                 460                  
Gln Glu Glu Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser 
465                 470                 475                 480 
Pro Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly 
                485                 490                 495      
His Phe Pro Thr Ser Gly Gln Ala Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln 
            500                 505                 510          
Ile Gly Gln Ala Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro 
        515                 520                 525             
Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Glu Gln Gln Ser Arg Gln Gly Gln 
    530                 535                 540                 
Gln Leu Gly Gln Gly His Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln 
545                 550                 555                 560  
Glu Gln Gln Gly Tyr Asp Ser Pro Tyr His Val Ser Val Glu Gln Gln 
                565                 570                 575     
Ala Ala Ser Pro Lys Val Ala Lys Ala His His Pro Val Ala Gln Leu 
            580                 585                 590         
Pro Thr Met Cys Gln Met Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ser Ala Ser Gln 
        595                 600                 605             
<210>  8
<211>  25
<212>  DNA
<213>  PCR引物F
<400>  8
atggctcgga agctagtcct ctttg                                           25
<210>  9
<211>  25
<212>  DNA
<213>  PCR引物R
<400>  9
ctatcactgg ctagccgaca atgcg                                           25
<210>  10
<211>  28
<212>  DNA
<213>  表达引物F
<400>  10
acccatatgg aaggtgagac ctctaagc                                        28
<210>  11
<211>  28
<212>  DNA
<213>  表达引物R
<400>  11
ttcctcgagc tatcactggc tagccgac                                        28

Claims (2)

1.一种稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法，其特征在于：以普通小麦为母本，野生二粒小麦为父本，将拥有4个HMW-GS的野生二粒小麦的花粉，授予六倍体的普通小麦，通过种间远缘杂交、多代自交及鉴定，选育出稳定表达6个HMW-GS的普通小麦；
所述母本选自高产但加工品质差的普通小麦，染色体组型为AABBDD，具有4个高分子量谷蛋白亚基，其1Ay亚基编码基因处于沉默态，具有序列表中SEQ ID NO.1-3所述的碱基、核苷酸及相应的氨基酸序列；
所述父本选自Glu-A1和Glu-B1位点均表达的含有4个高分子量谷蛋白亚基的野生二粒小麦，染色体组型为AABB，其活性态的1Ay亚基基因具有序列表中SEQ ID NO.4-5所述的碱基、核苷酸及相应的氨基酸序列；
所述多代自交及鉴定包括如下方法步骤：
A、将经杂交产生的种子进行SDS-PAGE分析，并对其根尖体细胞染色体数目进行检测，选择具有双亲HMW-GS条带的、染色体数目为35条的杂种F1代植株；
B、将经步骤A选取出的F1代植株在抽穗后套上硫酸纸袋自交，收取F2代种子，按步骤A所述方法进行SDS-PAGE分析和染色体数目检测，选取35≤2n≤42和HMW-GS为6条的籽粒继续种植套袋自交得F3代，再按步骤A所述方法对F3代籽粒进行检测和选取；
C、对步骤B获选的F3代种子进行发芽移栽，并自交，连续自交6代后获得F8代，且每代均选取株叶型、抽穗期、开花期、成熟期趋向母本普通小麦的单株；
D、随机抽取F8代单株， 再从各单株收获籽粒中随机选取8粒，按步骤A所述的SDS-PAGE方法进行HMW-GS检测；选取具有6个HMW-GS的籽粒进行发苗移栽获得F9代植株，再自交，收获F9代植株上产生的F10代籽粒，再随机选取8粒按同样方法进行SDS-PAGE分析，对HMW谷蛋白亚基进行检测；然后再对HMW谷蛋白亚基谱带数均为6条，且电泳迁移率一致，并含有父本野生二粒小麦Glu-A1和Glu-B1位点y-型亚基的上述8粒籽粒，进一步按步骤A所述方法进行染色体数目均为2n=42的根尖染色体数目检测；
E、将步骤D选取的杂种F10代种子，同时与母本及父本的种子进行室内发芽，剪取幼嫩叶片提取基因组DNA，然后对HMW-GS编码基因进行PCR扩增，选取1Ay的条带进行转化、阳性检测、测序和序列比较分析；
F、将步骤E获得的F10代种子与母本及父本的核苷酸及其氨基酸序列进行比较分析，确认杂种育成小麦的Glu-A1位点活性y型亚基编码基因与父本野生二粒小麦的Glu-A1位点活性y型亚基编码基因序列高度一致，均具有1830bp的核苷酸长度，都没有缺失/插入区段，都能编码608个氨基酸残基，且没有提前终止密码子，均属于活性态的Ay基因；而母本普通小麦Ay等位基因的核苷酸序列短于父本和育成小麦，为1791bp，而且其DNA分子结构上存在着3个区段的缺失，其中间重复区还存在1个提前终止密码子，处于沉默态，由此而确定野生二粒小麦Glu-A1位点的活性y型亚基编码基因已真实导入普通小麦基因组；
G、对步骤F鉴定的杂种后代中的活性Ay等位基因进行染色体工程遗传重组特性分析，确认育成普通小麦所拥有的活性Ay基因的DNA序列，在保持父本98.9%的1Ay基因核苷酸的同时，还存在21个单核苷酸的变异，其中14个位点为突变，7个位点为整合了母本普通小麦的核苷酸；
H、对经步骤G确定的育成普通小麦的1Ay基因的编码亚基活性进行异源表达分析，以证明育成普通小麦所拥有的1Ay 基因与父本野生二粒小麦的1Ay基因一样具有编码1Ay亚基的功能；
I、将经步骤D-H鉴定后获选的杂种种子的具有种胚的半粒进行培养皿内发芽移栽，再连续自交2代获得F11和F12代；继续对F11和F12代的籽粒按步骤A的SDS-PAGE方法进行HMW-GS检测，以进一步证明其拥有的6个HMW-GS能在普通小麦遗传背景中稳定传递。
2.根据权利要求1所述的稳定表达6个HMW-GS的普通小麦培育方法，其特征在于：所述种间远缘杂交，是抽穗后对母本穗进行人工去雄，套上硫酸纸袋以防飞花，授以野生二粒小麦花粉后继续套袋直至成熟。
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