CN1621412A

CN1621412A - 小麦的高分子量谷蛋白亚基及其编码基因与应用

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Publication number: CN1621412A
Application number: CN 200310103893
Authority: CN
Inventors: 张学勇; 王汉潜
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-11-24
Filing date: 2003-11-24
Publication date: 2005-06-01
Anticipated expiration: 2023-11-24
Also published as: CN1301266C

Abstract

本发明公开了一种小麦高分子量谷蛋白亚基及其编码基因与应用。本发明所提供的小麦高分子量谷蛋白亚基，它是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。小麦高分子量谷蛋白亚基的编码基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；2)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；3)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；4)与序列表中SEQ ID №：1或SEQID №：3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的小麦高分子量谷蛋白亚基的编码基因1By15将在谷类作物特别是小麦品质的转基因育种中得到广泛的应用。

Description

小麦的高分子量谷蛋白亚基及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中小麦的高分子量谷蛋白亚基及其编码基因与应用。

背景技术

小麦加工品质在遗传上主要受谷蛋白(Glutenin)和醇溶蛋白(Gliadin)组成、直链淀粉和支链淀粉比例的影响，其中高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)组成对品质的影响最为突出(Payne et al，1983；Shewry et al 1992)。

加工品质是小麦国际市场竞争的核心。在影响品质的众多遗传因子中，高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)的作用举足轻重，例如1D染色体上“5+10”组合常与优良烘烤品质密切相关，其它组合方式常导致烘烤品质的下降。本发明的发明人对国内1000余个小麦推广品种电泳后发现，我国北方小麦主产区的优质源品种有两个，“中作8131-1”(由中国农业科学院作物育种栽培研究所曾道孝、国淑惠等育成，携带优质亚基编码基因1Dx5+1Dy10，详见张学勇等：中国农业科学，34：355-362，2001)和“小偃6号”(由原中国科学院西北植物研究所李振声等人育成，携带优质亚基编码基因1Bx14+1By15，详见张学勇等：中国农业科学，34：355-362，2001)。1Bx14+1By15亚基对在我国优质小麦育种和生产上发挥了比较大的作用，一些著名的优质品种如小偃54号、高优503、陕优225、陕优229，Ph82-2-2均携带这两个基因，但该亚基对在我国育成品种中出现频率仅为5.01％(张学勇等2002，中国农业科学，35(11)：1302-1310)，其潜在价值并未得到充分发挥。

1Bx14及其启动子已被克隆得到，其N端比其它亚基少两个半胱氨酸残基(专利申请号：01143428.7)。但与1Bx14紧密连锁的1By15亚基却一直没有被克隆到。

发明创造内容

本发明的目的是提供普通小麦一个优质高分子量谷蛋白亚基及其编码基因。

本发明所提供的小麦高分子量谷蛋白亚基1By15，来源于小麦品种小偃6号，它是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID №：2是由723个氨基酸残基组成的蛋白质。

小麦高分子量谷蛋白亚基1By15的编码基因1By15，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；

3)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

4)与序列表中SEQ ID №：1或SEQ ID №：3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中序列1的DNA序列由2175个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1位到第2175位碱基；序列表中序列3的DNA序列由2175个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1位到第2175位碱基。其中，SEQ ID №：3是通过嵌套缺失方法得到的小麦高分子量谷蛋白亚基1By15的全长cDNA序列(SEQ ID №：3)。

含有小麦高分子量谷蛋白亚基编码基因的表达载体和细胞系也属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体和工程菌，如重组表达载体PET-3a-1By15(M)和含有重组表达载体PET-3a-1By15(M)的E.coliBL21(DE3)。

本发明采用与小麦高分子量谷蛋白亚基专一结合的单克隆抗体(专利申请号：01144781.8)作探针，对小偃6号胚乳发育时期表达文库实施筛选，分离和克隆了高分子量谷蛋白亚基编码基因1By15，序列分析发现高分子量谷蛋白亚基1By15与已克隆的此类基因在结构上存在比较大的差异，并发现其表达量与加工品质成正相关。

本发明的小麦高分子量谷蛋白亚基的编码基因1By15将在谷类作物、特别是小麦品质的转基因育种中得到广泛的应用，同时本发明也为从大基因组植物中克隆基因开辟了一条新的思路。

附图说明

图1小偃6号1By15基因克隆流程图

图2单克隆抗体筛选小麦开花16天种子的cDNA表达文库结果

图3采用PCR方法筛选插入片段大于2kb的阳性噬菌斑的电泳图谱

图4阳性克隆亚克隆后的酶切分析电泳图谱

图5采用嵌套缺失方法构建的一系列一端固定另一端长短不一的阳性克隆的缺失突变体的电泳图谱

图6小麦优异高分子量谷蛋白亚基1By15的原核表达的SDS-PAGE分析(A)和免疫印迹(B)分析

图7用CLUSTAL W(1.82)对HMW-GS1By15、1By8、1By9和1Dy10进行序列比对分析

图8为PET-3a的物理图谱

图9为小偃6号选系Y152和Y224及对照京411的烘烤品质比较

具体实施方式

实施例1、小麦高分子量谷蛋白亚基编码基因1By15的克隆

小麦高分子量谷蛋白亚基编码基因1By15的克隆流程如图1所示，具体包括以下步骤：

一、小偃6号小麦开花后16天的种子cDNA表达文库的构建

取小偃6号小麦开花后16天的种子，采用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)提取总R N A。然后采用CLONTECH公司SMART cDNA文库构建试剂盒完成cDNA表达文库构建。

二、cDNA表达文库的免疫筛选

方法参照Sambrook et al(1989)，具体步骤如下：

1、与小麦高分子量谷蛋白亚基专一结合的单克隆抗体(专利申请号：01144781.8)的预处理

采用大肠杆菌裂解液吸收法。E.coli XL1-Blue裂解液的制备如下：

(1)在500ml LB培养基中培养E.coli XL1-Blue菌达到饱和。37℃，200rpm振荡过夜。4℃，4000rpm离心10分钟，收获细菌沉淀。

(2)细菌沉淀重悬于15ml 50M Tris-Cl(PH8.0)，10mM EDTA(PH8.0)中。-70℃冷冻，室温或者37℃融化，反复冻融多次。再于0℃，用超声波处理6次，每次20秒。

(3)4℃下，15000rpm离心10分钟，将上清液转移到另一试管内，所得裂解液贮存于-20℃备用。

(4)使用时以每10ml单抗细胞上清液中加入1毫升大肠杆菌裂解液，混合后于室温温育4小时以上或者于4℃过夜。注意可加入终浓度为0.05％NaN₃，保存于4℃以备免疫学筛选时使用。

2、宿主菌菌悬液的制备

挑取E.coli XL1-Blue单菌落接种于50ml MgSO₄/麦芽糖LB培养基中，37℃，200rpm振荡过夜后，分装于两个50ml无菌圆底离心管中，4000rpm室温离心10分钟，倾去上清，分别用10ml 0.01M MgSO₄重悬沉淀，置4℃贮存备用。可用3周。

3、免疫筛选cDNA表达文库

铺板

(1)首先在eppendorf管中加入0.15ml XL1-Blue菌悬液和0.15ml含3×10⁴pfu含有插入片段的λTriplEx2噬菌体(参见CLONTECH公司的SMART^TM cDNAlibrary construction kit user mannual)表达文库的SM(初筛时要高密度铺板)，混合后置于37℃温育20分钟，以使噬菌体吸附大肠杆菌。

(2)然后，将eppendorf管内容物转入到与直径为150mm平皿相对应的无菌试管(10×130mm)中。各试管内继续加入7.5ml融化的顶层琼脂糖，混匀后立即倾注到LB琼脂平板上。待凝固后置于42℃温育4-5小时。

转膜

(3)把约与平板大小相同的，预先在10mM IPTG水溶液中饱和的硝酸纤维素膜晾干后，覆盖于平板上，37℃培养过夜。

(4)掀开平皿上盖，于37℃继续温育20分钟。将平板移到室温下，用针头对膜和平板作不对称标记。然后，小心地揭下膜，把膜放入大量TNT中。

免疫杂交

(5)用TNT缓冲液洗膜两次，每次20分钟。然后，用TNT+5％脱脂奶粉封闭液浸泡膜30-60分钟，并轻轻摇动。

(6)倾去封闭液，用TNT+5％脱脂奶粉+单抗(1∶20稀释)浸泡膜30-60分钟，并轻轻摇动。

(7)用TNT洗膜3次，每次10分钟。

(8)用10mM Tris-Cl(PH7.5)，150mM NaCl溶液洗涤10分钟，把膜转移到7.5ml含有以1∶20000稀释的第二抗体(碱性磷酸酶偶联羊抗鼠抗体)的10mMTris-Cl(PH7.5)，150mM NaCl溶液中，于室温下轻轻摇动1.5-2小时。

(9)用10mM Tris-Cl(PH7.5)，150mM NaCl溶液洗膜3次，每次10分钟。

免疫显色

(10)把膜转移到新鲜配制的显色液中，显色1-4小时。

(11)然后用蒸馏水略洗2遍，终止显色。

插入片段大于2kb的阳性噬菌斑的筛选

(12)找出对应于膜上阳性噬菌斑克隆，然后用牙签挑取阳性噬菌斑，以λTriplEx2载体的特异序列：5′-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3′为5′端引物；5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′为3′端引物。用PCR技术扩增阳性噬菌斑中的插入片段，以推断插入片段的大小。由于小麦的高分子量谷蛋白亚基基因的长度均大于2kb，所以只保留插入片段大于2kb的阳性噬菌斑，结果如图3所示，筛选得到一个插入片段大于2kb阳性噬菌斑(图中箭头所指)。

后续筛选

(13)对应于膜上阳性克隆的琼脂块(含有噬菌体)用宽口pipette小心地吸出来，放到加有2滴氯仿的1ml SM中。于4℃放置过夜或者室温下60分钟，使噬菌体从琼脂块中洗脱出来。然后确定洗脱液中噬菌体的滴度，以低密度铺板，如上述那样进行杂交显色，直到筛选到一致的免疫阳性噬菌斑。结果如图2所示，表明经过两次筛选，得到一致的免疫阳性噬菌斑，图2中，黑点表示筛选得到的阳性噬菌斑，A为第一次筛选结果，B为第二次筛选结果。

三、将带有插入片段的λTriplEx2噬菌体载体的阳性克隆质粒化

1、质粒化

将得到的带有插入片段的λTriplEx2噬菌体载体通过Crex/Loxp内删除系统转变为带有插入片段的pTriplEx2质粒载体，实验过程如下：

(1)挑取E.coli BM25.8单菌落，接种于10ml MgSO₄/LB培养基中，31℃，150rpm振荡过夜，直至培养物的OD达到1.1-1.4。向培养物中加入100μl 1M MgCl₂，使其浓度达到10mM。

(2)从几轮筛选后的平板上挑取一个阳性噬菌斑，浸入350μl SM中，4℃过夜，使其洗脱出来。

(3)将200μl BM25.8细菌培养物和150μl噬菌斑洗脱液混合，31℃下温育30分钟，然后加入400μl LB培养基，31℃，225rpm剧烈震摇1小时，取出5μl，均匀涂布于LB/Amp平板上，31℃培养过夜。挑取数个菌落，以提取质粒DNA。

2、质粒提取

(1)将转化好的单菌落接种入2ml LB/Amp液体培养基中，37℃振荡培养过夜。取1.5ml培养物倒入eppendorf管中，4000rpm离心2分钟。弃上清，使细菌沉淀尽可能干燥。

(2)将细菌沉淀悬浮于100μl溶液I中，充分混匀，室温放置10分钟。然后加200μl新鲜配制溶液II，盖紧管盖，混匀内容物，将离心管放在冰上5分钟。然后加入200μl预冷的溶液III，盖紧管盖，颠倒数次混匀，将离心管放在冰上15分钟。12000rpm室温离心15分钟，将上清液转入另一eppendorf管中。

(3)向上清液加入等体积酚∶氯仿(1∶1)，反复混匀，12000rpm室温离心5分钟，将上清液转入另一eppendorf管中。

(4)向上清液加入2倍体积乙醇混匀，室温放置5-10分钟，12000rpm室温离心5分钟，倒去上清液，把eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

(5)用1ml 70％乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，弃上清，真空抽干。加50μl TE缓冲液使DNA完全溶解，-20℃保存。

四、将带有插入片段的pTriplEx2质粒进行亚克隆

由于pTriplEx2质粒载体上具有单一EcoRI和SalI的酶切位点，对将带有插入片段的pTriplEx2质粒进行EcoRI/SalI双酶切，琼脂糖凝胶电泳分离并回收酶切片段，与同样双酶切纯化的pBSK(pBluescriptII SK简写为pBSK)载体连接，得到重组质粒pBSK/1By15，转化E.coli DH5α细胞。完成阳性克隆从载体pTriplEx2到载体pBSK的亚克隆。对得到的pBSK/1By15进行EcoRI单酶切和EcoRI/SalI双酶切分析，结果如图4所示，表明质粒pBSK/1By15中插入片段的长度在2-3kb之间(图中箭头所指)。图4中，1为质粒pB SK/1By15，2为质粒pB SK/1By15经EcoRI酶切，3为质粒pBSK/1By15经EcoRI/SalI双酶切分析，M为标准分子量。

五、阳性克隆的全长cDNA序列测定

用嵌套缺失方法构建一系列一端固定、另一端长短不一的阳性克隆的缺失突变体。以限制酶ApaI和SalI解释嵌套缺失方法的原理：ApaI酶切后产生3’突出端，可以抵抗外切酶ExoIII的作用；而SalI酶切后产生3’凹端，受外切酶ExoIII的作用而逐步去除核苷酸。由于SalI酶切位点离插入片段更近，插入片段靠近SalI酶切位点的一端逐步降解，而远离SalI酶切位点的一端保持不变。ExoIII作用时间不同，就可以产生长短不一的片段。这些片段用核酸酶S削平突出端，连接环化后转化E.coli DH5α，可以一套嵌套缺失突变体。具体过程如下：用ApaI和SalI双酶切pBSK/1By15重组质粒。酚/氯仿抽提后，用ExoIII消化线性质粒，ExoIII作用时间不同，就可以产生长短不一的片段。接着用核酸酶S削平突出端，连接转化E.coliDH5α。使用ABI3700测序仪完成缺失突变体的序列测定，用DNAstar软件的Seqman程序对序列进行拼接，完成全长cDNA序列的测定。

其电泳结果如图5所示，表明pBSK/1By15重组质粒用ApaI和SalI双酶切后，用ExoIII消化作用不同时间所得线性质粒的电泳图谱。ExoIII消化作用的时间从0时开始，每隔1分钟取样，共获得16个样品。最后在1％琼脂糖凝胶上点样。由图5可知ExoIII作用时间不同，就可以产生长短不一的线性质粒(片段)，从最长的5kb到3kb。使用ABI3700测序仪完成嵌套缺失突变体的序列测定，用DNAstar软件的Seqman程序对序列进行拼接，完成全长cDNA序列(SEQ ID №：3)的测定。SEQ ID №：3中，自5′端第1位至第3位为起始密码子ATG，自5′端第2170位至第2175位为终止密码子TGATAG，自5′端第2226位至第2231位为多聚A加尾信号AATAAA。

六、小麦优异高分子量谷蛋白亚基1By15的原核表达

序列分析表明：HMW-GS1By15cDNA内部编码区内有一个的BamHI酶切位点。为将1By15克隆到带有NdeI/BamHI酶切位点的原核表达载体PET-3a(其物理图谱如图8所示)，需要采用大引物(Megaprimer)PCR方法，对1By15cDNA进行消除BamHI酶切位点的同义点突变。具体如下：设计一个含有由原来BamHI酶切位点中点突变而来碱基(G→A)的引物(15mer，5’-GGGTAGAA AGATCCG-3’)，而编码成熟蛋白质的氨基端且另外在其5’端附加上Nde I酶切位点的序列为另一个引物(27mer，5’-ACC CATATGGAAGGTGAGGCCTCTAGG-3’)，以pBSK/1By15为模板，采用PCR方法，由此扩增出的一段序列作为大引物，然后和编码成熟蛋白质的羧基端且其5’端另附加上BamHI酶切位点的序列组成上下游引物(34mer，5’-AAT GGATCCGCAAGTTGCAAAGAGTTCTATCACT-3’)，最终得到消除BamHI酶切位点并经测序验证正确的1By15(M)。

用CLUSTAL W(1.82)对HMW-GS1By15、1By8、1By9和1Dy10进行序列分析，结果如图7所示，表明1By15基因与已克隆的此类基因在结构上存在比较大的差异。

然后将1By15(M)基因与经NdeI/BamHI双酶切的表达载体PET-3a相连，构建重组表达载体PET-3a/1By15(M)。转化E.coli BL21(DE3)，对表达的蛋白质进行SDS-PAGE(A)和免疫印迹[采用与小麦高分子量谷蛋白亚基专一结合的单克隆抗体(专利申请号：01144781.8)]分析，结果如图6所示，表明1By15(M)基因在E.coli成功表达，1By15(M)基因在E.Coli表达的1By15(M)亚基(图中箭头所指)。1By15(M)亚基虽然其N端有一个多出甲硫氨酸，但其电泳迁移率与“小偃54”种子贮藏蛋白1By15基本一致。证明克隆的基因是编码高分子量谷蛋白亚基1By15的基因。图6中A为SDS-PAGE分析图谱，B为为免疫印迹分析图谱，1为小偃54号种子提取物；2为重组表达载体PET-3a/1By15(M)在E.coli BL21(DE3)中经IPTG诱导后的表达产物；3为重组表达载体PET-3a/1By15(M)在E.coliBL21(DE3)，未经IPTG诱导的表达产物；4为表达载体PET-3a在E.coli BL21(DE3)，经IPTG诱导后的表达产物。

实施例2、1By15对面包烘烤品质的影响

称取同等重量的小偃6号选系Y152和Y224(1Bx14和1By15携带者)及对照京411(不携带1Bx14和1By15)的面粉，在同样条件下利用相同重量的面团烘烤面包，结果如图9所示，从图中可以看出，携带1Bx14和1By15的品系面包膨胀系数大，蜂窝均匀，颜色发白，不携带1Bx14和1By15的品系面包体积较小，蜂窝不均匀，颜色发黄。

序列表

<160>3

<210>1

<211>2175

<212>DNA

<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)

<400>1

atggctaagc ggttggtcct ctttgcgaca gtagtcatca ccctcgtggc tctcgctgct 60

gctgaaggtg aggcctctag gcaactacag tgtgagcgcg agctccagga gagctcgctt 120

gaggcatgcc gacaggtcgt ggaccaacag ttggccggtc ggctgccatg gagcacgggg 180

ctccagatgc gatgctgcca gcagctccga gatgttagcg ctaagtgccg ccccgtcgcc 240

gtcagccaag tcgtaagaca atatgagcaa accgtggtgc cgcccaaggg cggatccttc 300

taccctggcg agaccacacc actgcagcaa ctccaacaag taatattttg gggaacatct 360

tcacaaacag tacaagggta ttacccaagc gtaagttctc ctcagcaggg gccatattat 420

ccaggccaag cttctccaca acagccagga caaaggcaac agccaggcaa atggcaagaa 480

ctgggacaag ggcaacaagg gtattaccca acttctctgc atcagtcagg acaaggacaa 540

caagggtact acccatcttc tctgcagcaa ccaggacaag ggcaacagac aggacaaggg 600

caacaaggat actacccaac ttctctgcag cagccaggac aagggcaaca gataggacaa 660

gggcaacaag ggtactaccc aacttctccg cagcacccag gacaaaggca acaaccagga 720

caagggcagc aaataggaca agggcaacaa ccaggacaag ggcggcaaat aggacaaggg 780

caacaatcag gacaagagca acaagggtac tatgcaactt ctccacagca gctaggacaa 840

gggcaacaac caggacaatg gcaacaatca ggacaagggc aacaaaggta ctacccaact 900

tctcagcagc agccaggaca agggcaacag gggcagtacc cagcttctca gcagcagcca 960

gcacaagggc aacaagggca gtacccagca tctcagcagc agccagcaca agggcaacaa 1020

gggcagtacc cagcttctca gcagcagcca ggacaagggc aacaagggca gtacccagct 1080

tctcagcagc agccagcaca agggcaacaa gggcagtacc cagcttctca acagcagcca 1140

ggacaagggc aacaagggca ctacccagct tctgagcagc agccaggaca agggcaacaa 1200

cggcactacc cagcttctct gcagcaacca ggacaagggc aacaaaggca ttacgcagct 1260

tctctgcagc aaccaggaca agggcaacaa gggcattacc cagcttctct gcagcaggta 1320

ggacaaggac aacaaatagg acagccagga caaaggcaac aaccaggaca agggcaacaa 1380

acagaacaag ggcaacaact agaacaaggg caacaaccag gacaagggca acaagggtac 1440

tatccaactt ctccacaaca gtcaggacaa gggcaacaac caggacaatc gcaacaacca 1500

ggacaagggc aacaagggta ctactcaact tctctacaac agccaggaca agggcaacaa 1560

gggcactacc caacttctct gcagcagcca ggacaaggac atccaggaca aaggcaacaa 1620

ccaggacaag ggcaacaacc agaacaaggg caacaaccag gacaggggca acaagggtat 1680

tatccaactt ctccgcagca gccaggacaa gggaaacaac taagacaagg gcaacaaggg 1740

tactacccaa cttctctgca acagccagga caagggcaac aaccaggaca agggcaacaa 1800

tcaggacaag ggcaacaagg gcactgccca acttctccgc aacagacagg acaagcgcaa 1860

caaccaggac aaggccaaca aataggacaa gtgcaacaac caggacaagg gcaacaaggg 1920

tactacccaa tttctctgca gcagtcagga caagggcaac agtcaggaca agggcaacaa 1980

tcaggacaag gacaccaact aggacaaggg cagcaatcag gacaagagca acaaggctac 2040

gacaacccat accatgttaa cacagagcag caaacggcca gcccaaaggt ggcaaaggtg 2100

cagcaacccg cgacacagct gccgataatg tgtcggatgg aggggggcga cgcattatcg 2160

gctagccagt gatag 2175

<210>2

<211>723

<212>PRT

<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)

<400>2

Met Ala Lys Arg Leu Val Leu Phe Ala Thr Val Val Ile Thr Leu Val

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Ala Glu Gly Glu Ala Ser Arg Gln Leu Gln Cys Glu

20 25 30

Arg Glu Leu Gln Glu Ser Ser Leu Glu Ala Cys Arg Gln Val Val Asp

35 40 45

Gln Gln Leu Ala Gly Arg Leu Pro Trp Ser Thr Gly Leu Gln Met Arg

50 55 60

Cys Cys Gln Gln Leu Arg Asp Val Ser Ala Lys Cys Arg Pro Val Ala

65 70 75 80

Val Ser Gln Val Val Arg Gln Tyr Glu Gln Thr Val Val Pro Pro Lys

85 90 95

Gly Gly Ser Phe Tyr Pro Gly Glu Thr Thr Pro Leu Gln Gln Leu Gln

100 105 110

Gln Val Ile Phe Trp Gly Thr Ser Ser Gln Thr Val Gln Gly Tyr Tyr

115 120 125

Pro Ser Val Ser Ser Pro Gln Gln Gly Pro Tyr Tyr Pro Gly Gln Ala

130 135 140

Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Arg Gln Gln Pro Gly Lys Trp Gln Glu

145 150 155 160

Leu Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu His Gln Ser

165 170 175

Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Ser Ser Leu Gln Gln Pro Gly

180 185 190

Gln Gly Gln Gln Thr Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser

195 200 205

Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln Gly

210 215 220

Tyr Tyr Pro Thr Ser Pro Gln His Pro Gly Gln Arg Gln Gln Pro Gly

225 230 235 240

Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Arg Gln

245 250 255

Ile Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln Glu Gln Gln Gly Tyr Tyr Ala

260 265 270

Thr Ser Pro Gln Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Trp Gln

275 280 285

Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Arg Tyr Tyr Pro Thr Ser Gln Gln Gln

290 295 300

Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Pro Ala Ser Gln Gln Gln Pro

305 310 315 320

Ala Gln Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Pro Ala Ser Gln Gln Gln Pro Ala

325 330 335

Gln Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Pro Ala Ser Gln Gln Gln Pro Gly Gln

340 345 350

Gly Gln Gln Gly Gln Tyr Pro Ala Ser Gln Gln Gln Pro Ala Gln Gly

355 360 365

Gln Gln Gly Gln Tyr Pro Ala Ser Gln Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln

370 375 380

Gln Gly His Tyr Pro Ala Ser Glu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln

385 390 395 400

Arg His Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Arg

405 410 415

His Tyr Ala Ala Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly His

420 425 430

Tyr Pro Ala Ser Leu Gln Gln Val Gly Gln Gly Gln Gln Ile Gly Gln

435 440 445

Pro Gly Gln Arg Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Thr Glu Gln Gly

450 455 460

Gln Gln Leu Glu Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr

465 470 475 480

Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln

485 490 495

Ser Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Ser Thr Ser Leu

500 505 510

Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly His Tyr Pro Thr Ser Leu Gln

515 520 525

Gln Pro Gly Gln Gly His Pro Gly Gln Arg Gln Gln Pro Gly Gln Gly

530 535 540

Gln Gln Pro Glu Gln Gly Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly Tyr

545 550 555 560

Tyr Pro Thr Ser Pro Gln Gln Pro Gly Gln Gly Lys Gln Leu Arg Gln

565 570 575

Gly Gln Gln Gly Tyr Tyr Pro Thr Ser Leu Gln Gln Pro Gly Gln Gly

580 585 590

Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Gly His

595 600 605

Cys Pro Thr Ser Pro Gln Gln Thr Gly Gln Ala Gln Gln Pro Gly Gln

610 615 620

Gly Gln Gln Ile Gly Gln Val Gln Gln Pro Gly Gln Gly Gln Gln Gly

625 630 635 640

Tyr Tyr Pro Ile Ser Leu Gln Gln Ser Gly Gln Gly Gln Gln Ser Gly

645 650 655

Gln Gly Gln Gln Ser Gly Gln Gly His Gln Leu Gly Gln Gly Gln Gln

660 665 670

Ser Gly Gln Glu Gln Gln Gly Tyr Asp Asn Pro Tyr His Val Asn Thr

675 680 685

Glu Gln Gln Thr Ala Ser Pro Lys Val Ala Lys Val Gln Gln Pro Ala

690 695 700

Thr Gln Leu Pro Ile Met Cys Arg Met Glu Gly Gly Asp Ala Leu Ser

705 710 715 720

Ala Ser Gln

<210> 3

<211>2363

<212>DNA

<213>小麦属小麦(Triticum aestivum L.)

<400>3

atggctaagc ggttggtcct ctttgcgaca gtagtcatca ccctcgtggc tctcgctgct 60

gctgaaggtg aggcctctag gcaactacag tgtgagcgcg agctccagga gagctcgctt 120

gaggcatgcc gacaggtcgt ggaccaacag ttggccggtc ggctgccatg gagcacgggg 180

ctccagatgc gatgctgcca gcagctccga gatgttagcg ctaagtgccg ccccgtcgcc 240

gtcagccaag tcgtaagaca atatgagcaa accgtggtgc cgcccaaggg cggatccttc 300

taccctggcg agaccacacc actgcagcaa ctccaacaag taatattttg gggaacatct 360

tcacaaacag tacaagggta ttacccaagc gtaagttctc ctcagcaggg gccatattat 420

ccaggccaag cttctccaca acagccagga caaaggcaac agccaggcaa atggcaagaa 480

ctgggacaag ggcaacaagg gtattaccca acttctctgc atcagtcagg acaaggacaa 540

caagggtact acccatcttc tctgcagcaa ccaggacaag ggcaacagac aggacaaggg 600

caacaaggat actacccaac ttctctgcag cagccaggac aagggcaaca gataggacaa 660

gggcaacaag ggtactaccc aacttctccg cagcacccag gacaaaggca acaaccagga 720

caagggcagc aaataggaca agggcaacaa ccaggacaag ggcggcaaat aggacaaggg 780

caacaatcag gacaagagca acaagggtac tatgcaactt ctccacagca gctaggacaa 840

gggcaacaac caggacaatg gcaacaatca ggacaagggc aacaaaggta ctacccaact 900

tctcagcagc agccaggaca agggcaacag gggcagtacc cagcttctca gcagcagcca 960

gcacaagggc aacaagggca gtacccagca tctcagcagc agccagcaca agggcaacaa 1020

gggcagtacc cagcttctca gcagcagcca ggacaagggc aacaagggca gtacccagct 1080

tctcagcagc agccagcaca agggcaacaa gggcagtacc cagcttctca acagcagcca 1140

ggacaagggc aacaagggca ctacccagct tctgagcagc agccaggaca agggcaacaa 1200

cggcactacc cagcttctct gcagcaacca ggacaagggc aacaaaggca ttacgcagct 1260

tctctgcagc aaccaggaca agggcaacaa gggcattacc cagcttctct gcagcaggta 1320

ggacaaggac aacaaatagg acagccagga caaaggcaac aaccaggaca agggcaacaa 1380

acagaacaag ggcaacaact agaacaaggg caacaaccag gacaagggca acaagggtac 1440

tatccaactt ctccacaaca gtcaggacaa gggcaacaac caggacaatc gcaacaacca 1500

ggacaagggc aacaagggta ctactcaact tctctacaac agccaggaca agggcaacaa 1560

gggcactacc caacttctct gcagcagcca ggacaaggac atccaggaca aaggcaacaa 1620

ccaggacaag ggcaacaacc agaacaaggg caacaaccag gacaggggca acaagggtat 1680

tatccaactt ctccgcagca gccaggacaa gggaaacaac taagacaagg gcaacaaggg 1740

tactacccaa cttctctgca acagccagga caagggcaac aaccaggaca agggcaacaa 1800

tcaggacaag ggcaacaagg gcactgccca acttctccgc aacagacagg acaagcgcaa 1860

caaccaggac aaggccaaca aataggacaa gtgcaacaac caggacaagg gcaacaaggg 1920

tactacccaa tttctctgca gcagtcagga caagggcaac agtcaggaca agggcaacaa 1980

tcaggacaag gacaccaact aggacaaggg cagcaatcag gacaagagca acaaggctac 2040

gacaacccat accatgttaa cacagagcag caaacggcca gcccaaaggt ggcaaaggtg 2100

cagcaacccg cgacacagct gccgataatg tgtcggatgg aggggggcga cgcattatcg 2160

gctagccagt gatagaactc tttgcaactt gcatggtgct tggtatgcat gccccttagc 2220

tatccaataa acatgacgtg tgttcacagg ttttcatgta actagagtaa aacccaataa 2280

taatgcaaaa tgaaaagctt ctccaactaa aaaacaacaa aacgggcgtt gtgcaaaaaa 2340

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2363

Claims

l、普通小麦一个优质高分子量谷蛋白亚基，它是具有序列表中SEQ ID №：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №：2衍生的蛋白质。
2、根据权利要求1所述的小麦高分子量谷蛋白亚基，其特征在于：所述小麦高分子量谷蛋白亚基是序列表中的SEQ ID №：2。
3、一种小麦高分子量谷蛋白亚基的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)序列表中SEQ ID №：3的DNA序列；

3)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

4)与序列表中SEQ ID №：1或SEQ ID №：3限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述小麦高分子量谷蛋白亚基的编码基因是序列表中的SEQ ID №：2。
5、含有权利要求3所述的基因的表达载体。
6、根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为重组表达载体PET-3a-1By15(M)。
7、含有权利要求3所述的基因的细胞系。
8、根据权利要求7所述的细胞系，其特征在于：所述细胞系为含有重组表达载体PET-3a-1By15(M)的E.coli BL21(DE3)。
9、权利要求3所述基因在谷类作物育种中的应用。
10、权利要求3所述基因在小麦育种中的应用。