CN1974770A - 野生二粒小麦α－淀粉酶抑制因子的核酸序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了野生二粒小麦α－淀粉酶抑制因子的编码基因序列及其氨基酸序列，分别如序列表SEQ ID No.1和SEQ ID No.2或SEQ ID No.3和SEQ ID No.4或SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示，属于生物基因工程技术领域。该基因序列可以通过基因枪、农杆菌介导、花粉管通道等本领域工作人员共知的方法导入小麦，培育出抗虫性优良的小麦品种。同时依据克隆得到的基因序列，可以建立特异、便捷的分子标记体系，通过该体系进行定向育种。并且通过依据基因序列，还可以建立含α－淀粉酶抑制因子编码基因的酵母表达载体，在酵母中表达，获得α－淀粉酶抑制因子，作为植物缘杀虫剂添加到普通杀虫剂中。

Description

野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的核酸序列及其应用

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，特别涉及一种小麦α-淀粉酶抑制因子编码基因的核酸序列，以及基于该序列通过生物技术方法改良小麦抗虫性的应用。

背景技术

由于受到各种害虫的攻击，每年世界上的粮食会减产37％。化学杀虫剂的深入研究和广泛应用，在生产上取得了显著的防虫效果，但同时化学杀虫剂防治虫害的成本高、对环境污染大、容易使害虫产生抗药性导致生态平衡失调。因此，近年来的研究重点集中在如何提高植物自身的抗虫性，开展了以异源(植物、动物、微生物)抗虫基因导入为目的的育种，以使植物获得抗虫基因。目前，已从不同物种中分离克隆了多种类型的抗虫基因，并导入植物体内而获得转基因抗虫植物。淀粉类的植物种子富含蛋白质、糖、脂质，因此容易受到害虫(特别是象鼻虫)的“攻击”。通常植物本身有一些抵抗害虫掠夺的机制，在某些程度上可以减低害虫的危害，这些机制是在植物长期进化过程中形成的。参与植物自身的防御体系有抗生素、生物碱、萜烯、氰化物和一些蛋白质，而酶抑制因子就是蛋白质类中重要的一种。α-淀粉酶抑制因子是属于糖(苷)水解酶抑制因子，是一个庞大的蛋白质家族，目前在医药和农业上具有广泛的用途。

麦类作物种子中富含多种形式的α-淀粉酶抑制因子，能抑制多种来自昆虫和脯乳动物的外缘或内缘α-淀粉酶。部分α-淀粉酶抑制因子只专一针对昆虫淀粉酶作用，因为它们对来源于昆虫的酶有强抑制作用，但是对来源于脯乳动物的唾液淀粉酶和胰淀粉酶作用却很小或者没有。其中分子量为12kDa(0.28family)和24kDa(0.19family)的两个抑制因子家族研究较为透彻。24kDa小麦二聚α-淀粉酶抑制因子(WDAI)是其中一类天然的抗虫蛋白，对某些害虫的α-淀粉酶具有抑制作用，这个蛋白家族中的抑制因子均为124个氨基酸残基的小蛋白质，其中WDAI-0.19和WDAI-0.53两个因子在氨基酸序列上仅有7个位子发生替换，有94％的同源性，但是0.19因子作用范围非常广泛而0.53因子则专一作用与昆虫α-淀粉酶，对同一淀粉酶的抑制活力也存在100倍的差异。Oda等对0.19因子的晶体结构做了详细研究，目前它是谷物α-淀粉酶抑制因子中唯一一个已知3D结构的蛋白因子(PDB ID-code：1HSS)。其与脯乳动物、昆虫α-淀粉酶的作用机理也有了深入研究。

植物种子和其他器官中的α-淀粉酶抑制因子能有效控制食叶类昆虫的数量，特别是控制高度依赖淀粉作为其能量供体的昆虫。Bt基因抗虫谱十分有限，无法对付western corn rootworm等农作物害虫，因为Cry蛋白无法结合到这种害虫的肠膜上，发挥不了作用。而α-淀粉酶抑制因子对几个目的昆虫均有毒性作用，抗虫谱较广，可以弥补Bt毒蛋白的这一缺憾。虽然大多数害虫可以利用多种不同特性的α-amylases来消化植物淀粉提供自身能量，使得没有特效的α-淀粉酶抑制因子。但是，人们仍然可通过植物基因工程手段利用α-amylase inhibitors控制害虫。1990年Teresa将菜豆中αAI21的基因成功转入两种豆科作物豌豆和豇豆，利用PHA的启动子获得αAI21蛋白的高效表达，转基因植物具有明显的抗虫性。2000年的大豆实验中转基因豌豆的抗虫率将近100％。转基因豌豆中含有3％的αAI，而在一般菜豆中只含有1％～2％。αAI可以抑制豌豆象岬幼虫的早期发育，这样可以减少大量损失。

将小麦24kDa二聚α-淀粉酶抑制因子用于转基因抗虫安全性好，更易于人们接受。但是目前还没有从基因水平研究不同抑制因子间的结构与功能差异，以及对不同来源的淀粉酶起到抑制作用，无法选择更合适的抑制因子基因进行转基因工作。

发明内容

本发明的目的是提供小麦α-淀粉酶抑制因子编码基因序列TD5-1、TD5-2和TD5-3。通过本发明人对小麦α-淀粉酶抑制因子编码基因进行的详细研究，首次从野生二粒小麦TD5中克隆得到3个编码基因完整序列。并且开展了基于该基因的分子标记研究。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明以普通小麦供体野生二粒小麦为材料，通过根据EST数据库中保守片段设计的引物，利用PCR技术扩增得到目的片段，并将目的片段克隆入pBluescript SK(+)载体中。获得3个小麦α-淀粉酶抑制因子编码基因序列和氨基酸序列。

野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-1)，该序列如下：TD5-1

1    ATGCTCGTGG CGACACCCAT AGCGGCCGAG TACGACGCAT GGAGCGTTAA CAGTGGTCCC

61   TGGATGTGCT ATCCAGGGTA TGCCTTTAAG GTGCCAGCGC TCCCTGGCTG TCGTCCAGTG

121  CTGAAGCTCC AGTGCAATGG CAGCCAGGTG CCCGAGGCTG TCCTAAGGGA CTGCTGCCAG

181  CAGCTCGCCG ACATCAGCGA GTGGTGCAGG TGCGGTGCCC TCTACAGCAT GTTGGACAGC

241  ATGTATAAGG AGCATGGCGT GCAGGAGGGA CAGGCGGGGA CAGGCGCGTT CCCAAGCTGC

301  CGGAGGGAGG TGGTGAAGCT GACGGCGGCG AGCATCACGG CGGTCTGCAA GCTACCCATC

361  GTCATTGATG CGTCTGGAGA TGGAGCGTAT GTCTGCAAGG GTGTGGCCGC ATACCCGGAC

421  GCCTAG

以上序列为野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-1)，运用基因工程的方法可对结构进行改造，得到野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-1)的衍生序列，该衍生序列包括新分离的具有与以上所述结构同样基本结构的基因序列及使用体外DNA操作技术通过碱基的置换、插入、缺失获得的该基因序列的各种变构体。

根据野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-1)，得到其氨基酸序列，该序列如下：

1    MLVATPIAAE YDAWSVNSGP

21   WMCYPGYAFK VPALPGCRPV

41   LKLQCNGSQV PEAVLRDCCQ

61   QLADISEWCR CGALYSMLDS

81   MYKEHGVQEG QAGTGAFPSC

101  RREVVKLTAA SITAVCKLPI

121  VIDASGDGAY VCKGVAAYPD

141  A*

野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-2)，该序列如下：TD5-2

1    ATGCTCGTGG CGACACCCGT AGCGGCTAAG TACGATGCAT GGAGCGATAA CAGTGGTCCT

61   TGGATGTGCT ATCCAGGGTA TGCCTTCCAG GTGCCCGCGC TCCCTGGCTG TCGTCCACTG

121  CTGAAGCTCC AGTGCAATGG CAGCCAGGTG CCCGAGGCTG TCGTAAGGGA CTGCTGCCAG

181  CAGCTCGCCA ACATCAGCGA GTGGTGCAGG TGCGATGCCC TCTACAACAT GTTGGATAGC

241  ATGTATAAGG AGCATGGCGC GCAGGAGGGA CAGGCGGGGA CAGGAGAGTT CCCACGCTGC

301  CGGAGGGAGG TGGTGAAGCT GACGGCGGCG AGCATCACGG CGGTCTGCAA GCTACCCATC

361   GTCATTGATG CGTCGGGAGG TAGAGCGTAT ATCTGCAAGG ATGTGGCCAC ATACCGGGAC

421   GCCTAG

以上序列为野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-2)，运用基因工程的方法可对结构进行改造，得到野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-1)的衍生序列，该衍生序列包括新分离的具有与以上所述结构同样基本结构的基因序列及使用体外DNA操作技术通过碱基的置换、插入、缺失获得的该基因序列的各种变构体。

根据野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-2)，得到其氨基酸序列，该序列如下：

1    MLVATPVAAK YDAWSDNSGP

21   WMCYPGYAFQ VPALPGCRPL

41   LKLQCNGSQV PEAVVRDCCQ

61   QLANISEWCR CDALYNMLDS

81   MYKEHGAQEG QAGTGEFPRC

101  RREVVKLTAA SITAVCKLPI

121  VIDASGGRAY ICKDVATYRD

141  A*

野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-3)，该序列如下：TD5-3

1    ATGCTCGTGG CGACACCCAT AGCGTCCGAG TACGGCGCAT GGAGCTATAA CAGTGGTCCC

61   TGGATGTGCT ATCCGGGGCA GGCCTTCCAG GTGCCCGCGC TCCCTGGCTG TCGTCCATTG

121  CTGAAGCTCC AGTGCAATGG CAGCCAGGTG CCCGAGGCTG TCCTAAGGGA CTGCTGCCAG

181  CAGCTCGCCG ATATCAGTGA GTGGTGCAGG TGCGGTGCCC TCTACAGCAT GTTGGATAGC

241  ATGTATAAGG AGCATGGCGT GTCGGAGGGA CAGGCGGGGA CAGGCGCATT CCCAAGCTGC

301  CGGAGGGAGG TGGTGAAGCT GACGGCGGCG AGCATCACGG CGGTCTGCAG GCTACCCATC

361  GTCGTTGATG CGTCCGGAGA TGGAGCGTAT GTCTGCAAGG ATGTGGCCGC ATACCCGGAT

421  GCCTAG

以上序列为野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-3)，运用基因工程的方法可对结构进行改造，得到野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-3)的衍生序列，该衍生序列包括新分离的具有与以上所述结构同样基本结构的基因序列及使用体外DNA操作技术通过碱基的置换、插入、缺失获得的该基因序列的各种变构体。

根据野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列(TD5-3)，得到其氨基酸序列，该序列如下：

1    MLVATPIASE YGAWSYNSGP

21   WMCYPGQAFQ VPALPGCRPL

41   LKLQCNGSQV PEAVLRDCCQ

61   QLADISEWCR CGALYSMLDS

81   MYKEHGVSEG QAGTGAFPSC

10   1RREVVKLTAA SITAVCRLPI

121  VVDASGDGAY VCKDVAAYPD

141  A*

本发明的有益效果为：

小麦α-淀粉酶抑制因子编码基因TD5-1、TD5-2和TD5-3存在与普通小麦的四倍体供体野生二粒小麦中，是编码该基因位点的一种变异类型。α-淀粉酶抑制因子与种子抗虫性相关，是独特的优质基因资源。本发明所述的野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的核酸序列可以通过基因枪、农杆菌介导、花粉管通道等本领域工作人员共知的方法导入小麦，培育出抗虫性优良的小麦品种。

本发明所述的野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的核酸序列经测序结果表明，3个基因相互间具有很高的同缘性，但是又并不完全相同，均为新α-淀粉酶抑制因子编码基因类型。

克隆出的α-淀粉酶抑制因子可通过以下方法应用：

1、基因序列可以通过基因枪、农杆菌介导、花粉管通道等本领域工作人员共知的方法导入小麦，培育出抗虫性优良的小麦品种。

2、依据克隆得到的基因序列，可以建立特异、便捷的分子标记体系，通过该体系进行定向育种，或者抗虫性强的小麦新品种和种质。

3、依据基因序列，可以建立含α-淀粉酶抑制因子编码基因的酵母表达载体，在酵母中表达，获得α-淀粉酶抑制因子，作为植物缘杀虫剂添加到普通杀虫剂中。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的详细描述，但并非对本发明的限制，儿依照本发明公开内容所作的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1：

1.基因组DNA提取：

采用CTAB法提取基因组DNA。取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65℃的2×CTAB提取液(2％CTAB；1.4M NaCl，0.1MTris-HCl，PH8.0，0.1MEDTA，PH8.0，临用前加2％β-巯基乙醇)15ml，混匀。

65℃水浴30-45min，其间轻摇混匀

冷却至室温后加等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000rpm离心10min

取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴沉淀DNA

勾出DNA，用70％酒精洗2次，无水乙醇洗一次气干DNA，溶于适量pH8.0的TE溶液中。加入RNA酶至终浓度100μg/μl

琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度及质量

2.引物设计：

根据EST数据库中相关序列的保守区域设计了以下引物：

F：5’-ATGCTCGTGGCGACACCCAT-3’

R：5’-CTAGGCATCCGGGTATGCGG-3’

3.基因扩增：

PCR反应体系为5μL10×PCR buffer、1.5U Ex TaqTM DNA聚合酶、2mmol/LMgCl2、0.2mmol/L dNTP、引物各150ng、100ng模板DNA、双蒸水加至总量为50μl。PCR反应程序为94℃预变性4min；94℃变性45s、60℃退火45s、72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸5min。PCR反应在PTC-220型PCR仪(MJ Research，U.S.A.)中进行。扩增产物在1％琼脂糖凝胶上分离，85W恒定功率下电泳。

4.PCR产物回收、纯化

(1)在紫外灯下小心割下含DNA的琼脂糖块，放入1.5ml的离心管中。

(2)按每100mg琼脂糖/300μl溶胶液的比例加入溶胶buffer，50℃水浴10min，使琼脂糖全部溶化，每2min颠倒一次。

(3)将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，10000rpm离心30s，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。

(4)在吸附柱中加入500μl洗涤液，静置1min后10000rpm离心15s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中。

(5)重复第4步的操作。

(6)10000rpm离心1min。

(7)将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央加入30μl洗脱液，静置1min后，10000rpm离心1min。

(8)将回收产物经琼脂糖凝胶电泳检测后贮存在-20℃的冰箱中待用。

5.连接并转化：

扩增产物回收并纯化后连接到T载体反应体系如下：

T载体                          1μl(约50ng)

10×连接酶缓冲液               2μl

T4DNA连接酶                    350U

回收PCR产物                    加至终反应体积20μl

16℃连接过夜

转化大肠杆菌DH10B

感受态细胞的制备

(1)取在无抗生素平板上生长良好的单个DH10B菌落，接种于2μl LB液体培养基中，37℃振荡过夜培养。

(2)取500μl活化过夜的菌液于50ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.3

(3)将菌液倒入50ml离心管中，冰浴放置10min。

(4)在预冷至4℃的离心机中，4000rpm离心10min后去掉上清液，收集菌体。

(5)加入20ml冰冷的0.1M CaCl2于离心管中，均匀悬浮菌体后，冰浴中30min。

(6)4℃下，4000rpm离心10min后去掉上清液，收集菌体，加入2ml冰冷的0.1M CaCl2溶液均匀悬浮菌体后，放入冰中待用。

热击转化和兰白斑筛选

(1)将连接产物加入200μl感受态细胞中，充分混匀置于冰上30min。

(2)42℃热击2min 30s，冰浴1min后加入预热至37℃的LB液体培养基400μl。

(3)37℃低速(100rpm)振荡培养40min。

(4)在每个含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB固体培养基平板上加200μl菌液，0.1M IPTG 4μl和20mg/ml的X-gal 40μl均匀涂于平板上。

(5)37℃培养箱中过夜培养。

6.阳性克隆筛选：

挑取培养过夜的培养平板上生长良好的白色、兰色单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/ml)的LB固体培养基平板上划线，扩大培养(37℃培养过夜)。

挑取少量白班菌落进行PCR扩增，扩增所用引物同2.2.2，PCR反应总体积为25μl，其中含10×ExTaq PCR buffer 2.5μl，1.5mmol/LMgCl2，4种dNTP各200μmol/L，引物各150ng，1U ExTaq酶，少许白斑菌体。

7.序列分析：

利用NCBI网址中的blast等分析软件以及DNAman4.0进行DNA序列拼接、核苷酸与氨基酸序列分析。研究基因间的同源性与差异，并分析由核酸序列推导的氨基酸序列，分析了由核酸突变引起的氨基酸变化情况。

序列表

<110>四川农业大学

<120>野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的核酸序列及其应用

<130>061129

<160>6

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>426

<212>DNA

<213>小麦属(Triticum L.)

<400>1

atgctcgtgg cgacacccat agcggccgag tacgacgcat ggagcgttaa cagtggtccc     60

tggatgtgct atccagggta tgcctttaag gtgccagcgc tccctggctg tcgtccagtg    120

ctgaagctcc agtgcaatgg cagccaggtg cccgaggctg tcctaaggga ctgctgccag    180

cagctcgccg acatcagcga gtggtgcagg tgcggtgccc tctacagcat gttggacagc    240

atgtataagg agcatggcgt gcaggaggga caggcgggga caggcgcgtt cccaagctgc    300

cggagggagg tggtgaagct gacggcggcg agcatcacgg cggtctgcaa gctacccatc    360

gtcattgatg cgtctggaga tggagcgtat gtctgcaagg gtgtggccgc atacccggac    420

gcctag                                                               426

<210>2

<211>141

<212>PRT

<213>小麦属(Triticum L.)

<400>2

Met Leu Val Ala Thr Pro Ile Ala Ala Glu Tyr Asp Ala Trp Ser Val

1               5                   10                  15

Asn Ser Gly Pro Trp Met Cys Tyr Pro Gly Tyr Ala Phe Lys Val Pro

            20                  25                  30

Ala Leu Pro Gly Cys Arg Pro Val Leu Lys Leu Gln Cys Asn Gly Ser

        35                  40                  45

Gln Val Pro Glu Ala Val Leu Arg Asp Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asp

    50                  55                  60

Ile Ser Glu Trp Cys Arg Cys Gly Ala Leu Tyr Ser Met Leu Asp Ser

65                  70                  75                  80

Met Tyr Lys Glu His Gly Val Gln Glu Gly Gln Ala Gly Thr Gly Ala

                85                  90                  95

Phe Pro Ser Cys Arg Arg Glu Val Val Lys Leu Thr Ala Ala Ser Ile

            100                 105                 110

Thr Ala Val Cys Lys Leu Pro Ile Val Ile Asp Ala Ser Gly Asp Gly

        115                 120                 125

Ala Tyr Val Cys Lys Gly Val Ala Ala Tyr Pro Asp Ala

    130                 135                 140

<210>3

<211>426

<212>DNA

<213>小麦属(Triticum L.)

<400>3

atgctcgtgg cgacacccgt agcggctaag tacgatgcat ggagcgataa cagtggtcct     60

tggatgtgct atccagggta tgccttccag gtgcccgcgc tccctggctg tcgtccactg    120

ctgaagctcc agtgcaatgg cagccaggtg cccgaggctg tcgtaaggga ctgctgccag    180

cagctcgcca acatcagcga gtggtgcagg tgcgatgccc tctacaacat gttggatagc    240

atgtataagg agcatggcgc gcaggaggga caggcgggga caggagagtt cccacgctgc    300

cggagggagg tggtgaagct gacggcggcg agcatcacgg cggtctgcaa gctacccatc    360

gtcattgatg cgtcgggagg tagagcgtat atctgcaagg atgtggccac ataccgggac    420

gcctag                                                               426

<210>4

<211>141

<212>PRT

<213>小麦属(Triticum L.)

<400>4

Met Leu Val Ala Thr Pro Val Ala Ala Lys Tyr Asp Ala Trp Ser Asp

1               5                   10                  15

Asn Ser Gly Pro Trp Met Cys Tyr Pro Gly Tyr Ala Phe Gln Val Pro

            20                  25                  30

Ala Leu Pro Gly Cys Arg Pro Leu Leu Lys Leu Gln Cys Asn Gly Ser

        35                  40                  45

Gln Val Pro Glu Ala Val Val Arg Asp Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asn

    50                  55                  60

Ile Ser Glu Trp Cys Arg Cys Asp Ala Leu Tyr Asn Met Leu Asp Ser

65                  70                  75                  80

Met Tyr Lys Glu His Gly Ala Gln Glu Gly Gln Ala Gly Thr Gly Glu

                85                  90                  95

Phe Pro Arg Cys Arg Arg Glu Val Val Lys Leu Thr Ala Ala Ser Ile

            100                 105                 110

Thr Ala Val Cys Lys Leu Pro Ile Val Ile Asp Ala Ser Gly Gly Arg

        115                 120                 125

Ala Tyr Ile Cys Lys Asp Val Ala Thr Tyr Arg Asp Ala

    130                 135                 140

<210>5

<211>426

<212>DNA

<213>小麦属(Triticum L.)

<400>5

atgctcgtgg cgacacccat agcgtccgag tacggcgcat ggagctataa cagtggtccc     60

tggatgtgct atccggggca ggccttccag gtgcccgcgc tccctggctg tcgtccattg    120

ctgaagctcc agtgcaatgg cagccaggtg cccgaggctg tcctaaggga ctgctgccag    180

cagctcgccg atatcagtga gtggtgcagg tgcggtgccc tctacagcat gttggatagc    240

atgtataagg agcatggcgt gtcggaggga caggcgggga caggcgcatt cccaagctgc    300

cggagggagg tggtgaagct gacggcggcg agcatcacgg cggtctgcag gc tacccatc   360

gtcgttgatg cgtccggaga tggagcgtat gtctgcaagg atgtggccgc atacccggat    420

gcctag                                                               426

<210>6

<211>141

<212>PRT

<213>小麦属(Triticum L.)

<400>6

Met Leu Val Ala Thr Pro Ile Ala Ser Glu Tyr Gly Ala Trp Ser Tyr

1               5                   10                  15

Asn Ser Gly Pro Trp Met Cys Tyr Pro Gly Gln Ala Phe Gln Val Pro

            20                  25                  30

Ala Leu Pro Gly Cys Arg Pro Leu Leu Lys Leu Gln Cys Asn Gly Ser

        35                  40                  45

Gln Val Pro Glu Ala Val Leu Arg Asp Cys Cys Gln Gln Leu Ala Asp

    50                  55                  60

Ile Ser Glu Trp Cys Arg Cys Gly Ala Leu Tyr Ser Met Leu Asp Ser

65                  70                  75                  80

Met Tyr Lys Glu His Gly Val Ser Glu Gly Gln Ala Gly Thr Gly Ala

                85                  90                  95

Phe Pro Ser Cys Arg Arg Glu Val Val Lys Leu Thr Ala Ala Ser Ile

            100                 105                 110

Thr Ala Val Cys Arg Leu Pro Ile Val Val Asp Ala Ser Gly Asp Gly

        115                 120                 125

Ala Tyr Val Cys Lys Asp Val Ala Ala Tyr Pro Asp Ala

    130                 135                 140

Claims (5)

1、野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列，其特征在于，所述基因序列为序列表中SEQ ID No.1或SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示的核酸序列。

2、野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列为序列表中SEQ ID No.2或SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。

3、野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列的衍生序列，其特征在于，该衍生序列为权利要求1所述的基因序列的一个或几个碱基的置换、插入或缺失获得的该基因序列的变构体。

4、野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的氨基酸序列的衍生序列，其特征在于，该衍生序列与权利要求3所述的野生二粒小麦α-淀粉酶抑制因子的编码基因序列的衍生序列相对应，为在相应蛋白质的氨基酸序列基础上经过一个或几个氨基酸的一个或几个碱基的置换、插入或缺失获得的该基因序列的变构体。

5、一种表达载体，其特征在于，它是由权利要求1或3所述的核苷酸序列与质粒、病毒或运载体表达载体所构建的重组载体。