CN1820581A - 辣椒核雄性不育两用系和核质雄性不育恢复系的选育方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物核雄性不育两用系和核质雄性不育恢复系的选育方法，具体涉及一种采用花药培养技术进行选育核不育两用系和筛选辣椒核质不育恢复系的方法。本发明将花药离体培养技术用于辣椒核不育两用系的选育和核质雄性不育恢复系的选择。即用两用系杂交种花培当代的可育株和不育株测交，F1自交，后代系内相似的不育株和可育株测交，连续选择两代获得新选育的两用系；用三系杂交种的花培当代中的可育株和不育株以及已有的不育系进行测交，筛选育性恢复率在100％，而且育性稳定的F1，其对应的可育株即为恢复株，其自交后代品系即为恢复系。

Description

辣椒核雄性不育两用系和核质雄性不育恢复系的选育方法

技术领域

本发明属于植物杂交种的育种方法技术领域，具体涉及一种采用花药培养技术选育辣椒的雄性不育系及筛选雄性不育恢复系的育种方法。

背景技术

目前国内外广泛应用的辣椒杂交种育种技术为常规育种技术，一般包括以下几个步骤：首先选育成数个辣椒自交系(品系)，再以两个自交系人工去雄配对授粉的方法配成杂交组合，其后再经过一系列选育种过程，育成可在生产中推广应用的杂交种；常规的利用雄性不育的技术方法就是在辣椒自然群体中发现雄性不育株，再利用群体中的大量的可育株进行测交，筛选保持系和恢复系，利用保持系来繁殖不育系，利用恢复系配制杂交种。

辣椒的雄性不育根据育性的遗传方式可分为细胞核雄性不育型(GMS)和核质互作型雄性不育(CMS)两种类型。

辣椒核雄性不育系在生产上用两用系制种，即育成的雄性不育两用系的种子播种后，其花期育性表现为雄性可育株与雄性不育株的比例符合1∶1的分离规律，可育株与不育株各占50％，其中50％的不育株用来作为母本配制一代杂交种，起到雄性不育系的作用；若以不育株作母本，可育株作父本进行兄妹交，再从不育株上采收种子，其后代仍保持育性为1∶1的育性分离。这样可育株起到了半保持系的作用。

这种不育株和正常可育材料的杂交后代均为可育，所以其恢复源和恢复系类型较多。但是利用常规的回交选育两用系的方法，选育时间长，一般按回交三代计算，约需8-9代才能育成两用系。本研究首次采用花药培养的方法进行了两用系的选育，通过3年6代，获得了与原转育父本相似的新的两用系材料。

核质互作雄性不育包括雄性不育系A，保持系B，和恢复系C，控制育性的基因为N(MsMs)和S(msms)。辣椒不育系的不育性由核不育基因和细胞质不育因子互作控制，属核质雄性不育(CMS)，只有核不育基因与细胞质不育因子共同存在时，才能引起雄性不育，这种类型的不育系既能筛选到保持系，又能找到恢复系，可以实现三系配套。

目前辣椒的恢复系资源较少，恢复基因较多地存在于一些非栽培的野生种或变种中，在栽培种和甜椒中，恢复基因资源少。恢复系全称为雄性不育恢复系是指能够使雄性不育系的后代恢复可育性的品种。

所以，在辣椒雄性不育的研究中，优良恢复系的选育是目前限制不育系在杂种优势利用中应用的主要障碍。

花药培养技术是二十世纪60年代发展起来的育种技术，目前已成为现代生物技术的重要组成部分。该技术的要点是将杂交种的花药离体培养，诱导花粉分化为单倍体植株，经染色体人工加倍后形成二倍体植株。这种二倍体植株是纯合的、且可以稳定传递其遗传信息。其优点是育种速度快，提高了育种效率，因而花药培养技术被广泛应用到育种领域，但目前，在蔬菜作物中，用花药培养的方法选育辣椒的核不育两用系和胞质不育系，以及筛选恢复系的研究还未见报道。

发明内容

针对采用常规回交选育两用系的方法选育时间长的问题，为解决目前辣椒雄性不育的研究中，优良恢复系资源较少的问题，本发明公开了利用辣椒的两用系和三系杂交种来筛选不育两用系和核质互作雄性不育恢复系的方法。

本发明所述的方法，包括以下步骤：

1、播种已知双亲为三系和两用系杂交的辣椒杂交种(即接种原材料)的种子，在植株现蕾期开始取蕾做花药培养；通过花药培养获得单倍体植株，经染色体加倍后获得原辣椒杂交种的双单倍体植株。本发明中采用的是甜辣椒花药单倍体育种技术，选择适期花蕾的花药，配制适合花药培养的SPD固体培养基，SPD固体培养基的组分和配比以及配制方式在公开号为CN 1418537A的专利中进行了公开，花药培养时在接种的最初3-10天内温度维持在35℃高温，之后可维持28℃～30℃的恒温状态；花药培养时的光照条件可安排为1500勒克斯条件下每天光照10小时。

当在培养基上生长的甜椒单倍体幼苗长至4-7片叶并且根、茎、叶和生长点均正常的时候，取下幼苗冲洗干净后，移植到经消毒的土壤上，待移栽后的幼苗再长出2-3片新叶时，将其移植到园田土上。当幼苗从培养基移植到净土后长到8至10片叶且生长正常健壮时，即可进行染色体加倍。染色体加倍使用0.1％～0.2％浓度的秋水仙碱和2.0％二甲基亚砜的混合加倍液，用脱脂棉球压在幼苗的生长点部位，向棉球滴加混合加倍液连续24～48小时，然后将棉球取下用蒸馏水冲洗生长点，获得了双单倍体植株；

步骤2：在获得的双单倍体植株中，通过肉眼观察和显微镜检查辅助观察挑选出雄性不育株和可育株并挂牌标记。不育株肉眼看花药干瘪，无花粉或有少量花粉，镜检无花粉粒或无着色花粉粒。

步骤3：选育两用系和核质不育系及恢复系的方法：

在两用系的花培后代中用花培当代的可育株给不育株授粉测交，在测交组合中选择与转育父本果实性状相似的植株自交留种，后代系内相似的不育株和可育株测交，以此方法连续选择两代，所得后代中可育株与不育株的比例为1∶1的群体即为新选育的两用系。

三系杂交种的花培后代：用可育株和已有的不育系，以及花培当代中的不育株进行测交，筛选育性恢复率在100％，而且育性稳定的F1，其对应的可育株即为恢复株，其自交后代品系即为恢复系。

本发明中步骤1中关于植物花蕾期的花药培养的内容已在中国国家知识产权局2005年5月21日的公开号为CN 1418537A中公开了。

在步骤2中，在花培当代中观察各植株的育性，选择植株生长健壮的不育株挂牌标记，同时选择果实商品性状较好的可育株自交留种。

在步骤3中三系杂交种的花培后代：用花培当代中的可育株做父本与已有的不育系以及花培当代中的不育株进行测交，筛选恢复系材料。

由于本发明的方法采用花药培养技术，通过接种两用系和三系杂交种，可快速获得不育材料，同时筛选出大量的恢复材料，因此根据本发明的方法可以快速选育辣椒的两用系；同时解决目前在辣椒三系育种过程中恢复源少的问题，创新恢复系的资源，三系或两用系杂交种的育成，不但会降低制种成本，而且会增加种子的纯度。

附图说明

图1辣椒雄性不育两用系的选育图；

图2辣椒雄性不育恢复系的筛选图。

图中的标号：①花药培养；②选择果实性状植株形态和原接种材料相似的F1自交；③选择和转育父本相似的不育株与可育株测交；

具体实施方式

下面以一个引进的两用系和三系杂交种为例，具体说明选育新两用系和筛选恢复系的方法，其中花药培养的内容在CN1418537A的专利文件中公开了。下述实施例内容不是对本发明的限制。

实施例1：辣椒雄性不育两用系的选育

1.辣椒雄性不育两用系的选育过程

1998年从东北引进了一个羊角椒的两用系材料，其果实为小羊角，果短，果色深绿，果面有皱褶，系内整齐性不好，编号为98-807，以此为核雄性不育源进行选育工作。

QB-18，是多年的自交系，果实粗羊角，果色黄绿，果面光滑，是羊角椒杂交种的骨干亲本材料。以此为雄性不育两用系的转育父本。

在98-807中选择了一个不育单株与QB-18进行杂交，即98-807-9×QB-18。参照图1辣椒雄性不育两用系的选育图，1999年种植F1的种子，苗期取花蕾进行接种，共接种花药851个，得到胚状体240个，胚状体诱导频率28.2％，获得双单倍体苗130棵，分化频率54.2％。

2000年花培当代的观察和杂交：在花培当代的130棵苗中，分别对可育株和不育株进行挂牌标记，根据植株的形态和长势，用可育株上的花粉给不育株进行授粉，共获得杂交组合32个，盛果期间选留不育株上果实性状和可育株及转育父本近似的单果，其中从两用系花培当代中选出不育株编号有甜9557、甜8918，与可育株相似的不育株编号：甜8719、甜9223、甜8458。从以上32个组合种选出的性状近似的不育株和可育株所做的杂交组合有：甜9557×甜8719、甜8919×甜9223、甜9557×甜8458，共3对组合。

杂交组合的观察和自交：2000年冬季在温室内进行加代观察，在3份杂交组合中，选留了1份果实性状最接近转育父本的组合甜9557×甜8719，并进行自交留种。

2001年，春季大棚内种植自交后代62棵，苗期调查育性，统计不育株和可育株数，其中不育株14棵，可育株48棵，卡方测验符合3∶1的遗传规律，继续用系内可育株给不育株授粉，坐果后选留不育株上果实与可育株以及转育父本的果实最接近的单果，当年共选出6对较为接近的杂交单果。

2001年下半年，种植以上6个杂交单果，开花后观察每一份材料的育性情况，分别统计了其无粉株和有粉株的株数，卡方测验不育株和可育株的比例。详见表1。

                   表1选育第三代自交后代育性分离情况

原编号	有粉株	无粉株	总株数	不育可育比例
					[(甜9557×8719)-1]-III-9×IV-4[(甜9557×8719)-1]-III-9×II-2[(甜9557×8719)-I]-III-9×IV-3[(甜9557×8719)-1]-III-9×I-1[(甜9557×8719)-1]-III-9×IV-10[(甜9557×8719)-1]-III-9×III-14	65229131146	1238239140	189052222546	3∶13∶13∶13∶1不符合3∶1的比例淘汰

注：X² _0.05＝3.84

在以上6个育性分离的群体内，有1份材料表现为全可育，淘汰这个组合；有1份材料育性分离不符3∶1育性分离比例，其他4份材料育性分离比例为3∶1，综合观察这4份材料的植物学特性，第二个组合即：[(甜9557×8719)-1]-III-9×II-2系内的果实性状和植株形态最接近转育父本，继续在其系内选择相似的可育株和不育株继续进行姊妹交，座果后，观察并选留父母本果实性状和植株形态均较为接近的组合3个，其果实羊角，果色浅绿，与原转育父本较为相似。

2002年上半年，继续播种以上3个组合，苗期统计不育与可育的苗数，如表2，

                             表2：选育第四代的育性分离情况

田间编号	组合	苗数	不育株	可育株	可育株和不育株比例
						02-70202-70402-706	{〔(甜9557×8719)-1-III-9×II-2〕}-I-18×I-28{〔(甜9557×8719)-1-III-9×II-2〕}-I-1×I-22{〔(甜9557×8719)-1-III-9×II-2〕}-I-23×I-5	267660	113640	154020	1∶11∶1不符合

由表2可以看出，02-706系内不育株的比例较高，虽不育和可育的比例不符合1∶1的比例，但是田间观察，02-706系内植株整齐，果实黄绿色，最接近转育父本。所以继续在系内进行相似可育株和不育株的姊妹交，选择了3对组合。

2002年下半年，在以上3份组合中选出了一对农艺性状最接近原转育父本的组合，田间编号QB-18AB。系内不育株和可育株比例卡方测验符合1∶1的分离比例。

                         表3：选育第五代两用系育性分离情况

两用系田间编号	两用系系谱	苗数	不育株	可育株	可育株和不育株比例
						QB-18AB	{〔(甜9557×8719)-1-III-9×II-2〕}-I-23×I-5	126	59	67	1∶1

由表3可以看出，两用系QB-18AB初步育成，其不育株和可育株的比例为1∶1。两用系在以后的繁制过程中可继续选择。

1.2选育结果：

经过3年6代的选育，新两用系育成。在2003年继续选育过程中，新两用系群体中总株数70棵，不育株34棵，可育株与不育株比例1∶1，而且系内植物学特性整齐如表4所示。并且果形和植株特性接近原转育父本。

                  表4新两用系内不育株与可育株以及原转育父本(QB-18)的性状比较

编号	果长	果宽	果型指数	果实性状和植株形态
					不育株可育株QB-18	17.016.516.3	3.02.84.2	5.675.893.89	果实浅绿，羊角，果面光滑，始花节位8-10。果实浅绿，羊角，果面光滑，始花节位8-9果实浅黄绿，粗羊角，果面光滑。始花节位8-9

实施例2：辣椒核质雄性不育恢复系的筛选

2000年分别在碧玉和农大23号的花培后代中，选择部分可育株与当代中不育株进行测交，同时用可育株给已有的不育系进行测交授粉。在冬季温室和春季露地中连续观察F1育性情况，筛选育性恢复率在100％，而且育性稳定的F1，其对应的可育株即为恢复株，其自交后代品系即为恢复系。

1、辣椒胞质雄性不育恢复系的筛选过程

1.1三系杂交种的花药培养

1999年接种三系杂交种“碧玉”和“农大23号”的花药，接种花药数分别为589个和1478个，得到胚状体216个、349个，胚状体诱导频率36.7％和23.6％，获得双单倍体苗170棵、144棵，分化频率78.7％和41.3％。

分别对花培当代中不育株和可育株进行挂牌标记。

1.2辣椒雄性不育恢复系的筛选

2000年分别在“碧玉”和“农大23号”的花培后代中，选择不育单株。来源于“农大23号”的不育单株有：甜8446、甜8935、甜9256、甜10326、甜8696、甜8637、甜8639、甜9256、甜8451、甜9378、甜9403、甜10367。来源于碧玉的不育单株有：甜8626、甜8469。共14个不育单株。

选择部分可育株有：甜10377、甜9029、甜9045、甜9642、甜9293、甜9033、甜9299、甜8950、甜8819、甜8427、甜8755、甜8754、甜8466、甜8814、甜8830。

用当代中可育株与不育株进行测交，同时用可育株与已有的不育系P-1，P-4，P-6进行测交授粉，筛选恢复系。共获得测交组合35个。选出的可育株同时自交留种，

在冬季温室和春季露地中连续两次观察F1育性表现，筛选育性恢复率在100％，而且育性稳定的F1，其对应的可育株即为恢复株，可育株的自交后代品系即为恢复系。

(1)用花培当代中的可育株和不育株进行测交筛选恢复系

用从两个三系杂交种T-5(农大23号)和T-17(碧玉)的花培当代中选择的有粉株分别给花培当代中选出的无粉株授粉，观察育性恢复情况。

                表5花培当代中的可育株和不育株测交后代群体育性表现

编号

苗数

2000年冬季育性观察

苗数

2001年春季育性观察

来源

8935×89508639×89508446×89508637×89509256×96428639×881910326×90338696×84278755×103778451×103779378×90298935×84668469×87548935×96428626×90338935×88148935×92999032×89508469×84278830×96428830×8950

2016430232813313193564332

全部花药饱满，有大量花粉。全部花药饱满有花粉花药饱满，有大量花粉。全部花药饱满，有大量花粉。全部花药饱满，有大量花粉。全部花药饱满，有大量花粉。全部花药饱满，有花粉。花药饱满，有大量花粉。花药饱满，有花粉。花药饱满，大量花粉，。花药饱满，有大量花粉。花药饱满，有大量花粉。花药饱满，有大量花粉。全部花药饱满，大量花粉。花药饱满，有大量花粉。

1086110303994186333811

花药饱满，有花粉。花药饱满，有花粉。花药饱满，有花粉。花药饱满，紫色，有花粉花药浅蓝色，饱满，大量花粉。花药紫色，有大量花粉。花药正常，有大量花粉。花药不饱满，长柱头，花粉量较正常花粉量少，其中有3棵花粉量较多花药饱满，有大量花粉。花药不太饱满，较正常花粉量少，盛开时花粉量较多。花药淡蓝色，大而饱满，有2棵花粉量较少，其余有大量花粉花药饱满，有大量花粉。

T-5HP×T-5HPT-5HP×T-5HPT-5HP×T-5HPT-5HP×T-5HPT-5HP×T-17HPT-5HP×T-17HPT-5HP×T-17HPT-5HP×T-17HPT-5HP×T-17HPT-5HP×T-17HPT-5HP×T-17HPT-5HP×T-17HPT-17HP×T-17HPT-5HP×T-17HPT-17HP×T-5HPT-5HP×T-17HPT-5HP×T-5HPT-5HP×T-5HPT-17HP×T-17HPT-5HP×T-17HPT-5HP×T-5HP

注：T-5HP为来源于农大23号的花培当代单株，T-17HP为来源于碧玉辣椒的花培当代单株

由表5中13个花培当代可育单株与14个不育株所获得的21个测交组合冬春两季的观察结果可以看出：有3个组合即出现育性分离，其余的18个组合中花培当代中的可育株对不育株的育性均是恢复的，而且碧玉辣椒中的可育株对衣大23号的不育株也都是恢复的。对不育株恢复的18个测交组合中对应的可育株有9个：甜8950、甜9642、甜8819、甜9033、甜8427、甜10377、甜8466、甜8754、甜9299。

(2)用花培当代中可育株与引进的不育系测交筛选恢复系

P-4、P-6、P-1是从韩国引进的不育系材料，果实小羊角，果长5-8cm左右。用花培当代中的可育株甜8466、甜8814、甜8795、甜9132、甜9222、甜10377、甜9029、甜9293、甜8528、甜9033、甜9045、甜9299、甜9642与引进的不育系进行测交。

                       表6用花培当代中可育株与原有的不育系测交群体育性表现

编号	株数	2000年冬季育性观察	株数	2001年春季露地观察
					P-4×8466P-4×8814P-4×8795P-4×10377P-4×9132P-4×9029P-4×9222P-4×9293P-6×8466P-4×8528P-4×9033P-1×9045P-1×9299	75693147632769580	花药干瘪，无花粉，其中II-3有一朵花中3个花药能挑出花粉。花药浅紫色干瘪，无花粉。蕾期挑不出花粉，盛开时少量花粉，长柱头花药小。灰白色花药，有大量花粉。花药瘦小，干瘪，无花粉。花药灰白色，饱满，大量花粉。花药瘦小，干瘪，无花粉，有2棵，蕾期有少量花粉，盛开时有粉。花药正常，有大量花粉。花药瘦小，干瘪，无花粉。全部有粉	4261414530354012620161876	无粉，花药瘦小，紧扣柱头和子房，紫色。有一棵有少量花粉。有花粉。花药淡白色，似正常花药，无花粉，有一棵有粉。花药淡兰色，有大量花粉。无粉，有一棵有粉。花药白色，有大量花粉，长柱头。花药类似正常，除一棵有粉外，其余无粉。花药正常，乳白色，有大量花粉。花药瘦小，紧扣子房和柱头，淡紫色。花药白色饱满，有大量花粉。花药饱满，有大量花粉花药饱满，有大量花粉花药饱满，有大量花粉

P-1×9642

33

花药饱满，有大量花粉

由上表可以看出：在以上3个引进的不育系与13个可育株所获得的14个测交组合中，有8个组合表现全可育，其对应的可育单株有8个，为甜10377、甜9029、甜9293、甜8528、甜9033、甜9045、甜9299、甜9642，花培当代不育株与可育株测交组合中所选的对不育株恢复的可育株，对引进的不育系并不全恢复，如甜8466。综合两年的育性观察结果，以及可育株自交后代品系果实及植物学特性的观察结果，选出对花培当代中不育株和引进不育系都恢复的优良的株系8份，其对不育系的恢复株率均为100％。

                            表7恢复系材料的植物学特性

田间编号	原编号	来源	果实特性及座果情况
				02-16602-165(03-360)02-16402-161(03-362)02-14602-14202-14302-140(03-358)	甜10377甜9029甜9045甜9642甜9293甜9033甜9299甜8950	碧玉碧玉碧玉碧玉农大23号农大23号农大23号农大23号	果实小方灯笼形，果极皱，座果率高，果果实小方灯笼形，果色绿，果面光滑有光泽，果味甜，果率高。果实小方灯笼，果色绿，果面光滑有光泽，果率高果实小方灯笼，果色绿，果面光滑，果率高。深绿小羊角，果面光滑，果率高线椒，深绿，果率高。线椒，浅绿色，果率高。线椒，深绿色，果率高。

1.3恢复系恢复性能及稳定性

2002年田间种植恢复株的自交后代，观察其果实性状和座果特性，结果见表7，同时用恢复系与正在选育的不育系M-22A(田间编号为02-712)测交。进一步验证恢复系的恢复性能以及稳定性，测交组合分别于2002年冬季种植在加温温室内，2003年春季种植在露地，连续观察其育性情况，见表8。

                             表8恢复系恢复性能及其稳定性观察

测配组合	株数(棵)	育性观察(2002年10月9日、11月19日、11月27日)	株数(棵)	2003年春季露地观察
					02-712×02-14602-712×02-16402-712×02-16502-712×02-16102-712×02-14202-712×02-14302-712×02-16002-712×02-140	138605634461624	花药白紫色，饱满，有大量花粉，长柱头，全部为有粉株，可育株率100％；后期观察，花药饱满。有大量花粉，果实深绿，细羊角，座果率高。花药粉白色，有大量花粉，可育株率100％；后期观察，花药饱满，有大量花粉，果实粗牛角，深绿，果面略皱。全部花药白紫色，有大量花粉，可育株率100％；后期稳定，果实深绿，短牛角。花药饱满，有大量花粉。全部花药饱满有花粉花药饱满，有大量花粉全部有大量花粉，花药正常。	28263256	全部有大量花粉果实深绿，细羊角，光滑顺直。全部有大量花粉，果实短牛角，秧矮，座果率高。全部有大量花粉，果实短羊角，果皱，座果率高全部有大量花粉，秧矮，整齐，果实短牛角，果率较高，系内整齐一致。

由上表可以看出，已选出的恢复系恢复性能好，对不育系的恢复株率均为100％，而且恢复性能稳定，在冬季温室和春季露地均未出现光敏和温敏现象。

Claims (1)

1、一种选育和筛选辣椒核不育两用系和核质不育恢复系的方法，它包含以下步骤：

(1)播种已知双亲的三系和两用系辣椒杂交种种子；

(2)植株现蕾期开始取花蕾做花药培养，获得单倍体植株，经染色体加倍后得到原辣椒杂交种的双单倍体植株；

(3)在获得的双单倍体植株中，选出雄性不育株和可育株；

(4)在两用系的花培后代中用花培当代的可育株给不育株授粉测交，在测交组合中选择与转育父本果实性状相似的植株自交留种，后代系内相似的不育株和可育株测交，以此方法连续选择两代，所得后代中可育株与不育株的比例为1∶1的群体即为新转育的两用系；

(5)在三系杂交种的花培后代中用花培当代中的可育株做父本与已有的不育系以及花培当代中的不育株进行测交，筛选育性恢复率在100％，而且育性稳定的F1，其对应的可育株即为恢复株，其自交后代品系即为恢复系。