CN103202154B

CN103202154B - 一种施用菌根真菌控制蚕豆枯萎病的方法

Info

Publication number: CN103202154B
Application number: CN201210595874.7A
Authority: CN
Inventors: 董艳; 董坤; 郑毅; 汤利; 胡国彬; 肖靖秀; 赵平; 杨智仙
Original assignee: Yunnan Agricultural University
Current assignee: Yunnan Agricultural University
Priority date: 2012-12-25
Filing date: 2012-12-25
Publication date: 2015-04-22
Anticipated expiration: 2032-12-25
Also published as: CN103202154A

Abstract

本发明公开了一种控制蚕豆枯萎病的菌根真菌施用方法：菌根真菌菌剂的施用时间：于蚕豆播种时同时施用AM真菌；菌根真菌菌剂的施用方法：AM菌剂施用于土壤5cm深处，施用量为17g AM菌剂/株蚕豆；菌根真菌菌剂的种类：摩西球囊霉(Glomusmosseae，菌种编号：BGCGZ01A)，幼套球囊霉(Glomus etunicatum，菌种编号：BGCG03C)。通过施用AM真菌菌剂能改善蚕豆的生长，使蚕豆地上部生物量增加7％-93％，使地下部生物量增加21％-47％，最终减轻蚕豆枯萎病的发生危害，可以降低蚕豆枯萎病发病率50％-70％，降低病情60％-90％。

Description

一种施用菌根真菌控制蚕豆枯萎病的方法

技术领域

本发明涉及一种施用菌根真菌控制蚕豆枯萎病的方法，具体地说是通过向长年连作发生土传枯萎病的蚕豆根际施用菌根真菌菌剂来控制蚕豆枯萎病的方法。

背景技术

蚕豆是世界上重要的豆科作物，因具粮食、蔬菜、饲料和绿肥兼用等特点，且适应性广而具有较高的固氮量，在世界范围内种植的国家超过70个，种植面积高达260万公顷。中国的蚕豆种植面积和产量居世界首位，蚕豆种植面积达105万公顷，占世界种植面积的59％，总产占世界蚕豆总产的61％。中国蚕豆种植情况和生产水平影响和决定世界的蚕豆生产。

蚕豆是典型的忌连作作物，近年来随着蚕豆生产的不断发展，加之种植习惯和环境条件等原因，主产区的连作障碍现象非常普遍且日益严重，连作土传病害已成为制约我国蚕豆生产的重要因素，其中枯萎病是蚕豆连作障碍的主要病害之一。该病在德国、埃及、日本、英国等均有报道，在我国蚕豆主产区发病非常严重。蚕豆枯萎病在蚕豆整个生育期都有发生，造成根系腐烂、茎基部坏死直至植株萎蔫死亡，一般田块枯死率30％，重病田块发病率高达90％，是制约蚕豆生产的最严重病害。尽管引起连作土传病害的原因较多，但主要原因来自土壤，如土壤理化性状变劣导致养分亏缺，但最根本的原因还是土壤微生物区系和多样性失调，最终导致土壤中病原菌激增而引发土传病害。目前蚕豆枯萎病的防治方法主要有如选育抗病品种和化学防治等，但这些方法都有其局限性，如抗枯萎病的蚕豆品种较少，化学防治农药剂型单一，污染环境、有害生物产生抗药性及农药残留等。

菌根是土壤中一类真菌与植物根系所建立的互惠共生体，将与作物根际形成菌根的真菌叫作菌根真菌。80％以上的菌根是丛枝菌根(AM菌根)，是分布最广泛，作用最大的菌根，其寄主范围十分广泛，占土壤微生物总量的5-50％，可能是土壤中生物量最大的一类真菌。AM真菌与宿主植物形成菌根后，能改善植物的养分状况和水分代谢，保护植物免受土传病原菌侵害，菌根分泌物显著降低土壤中病原菌的游动孢子囊和游动孢子数量。越来越多的证据证明，AM真菌能够促进植物生长，改善植物健康状况，增强作物对生物和非生物胁迫的抗性，在保持土壤与植物健康方面发挥关键作用。通过接种菌根真菌防治连作土传病害是近年来的研究热点之一。其作用机制是土壤中AM真菌群体对作物体内相关防御酶体系的激活，改变作物根际微生物数量与多样性，抑制病原菌的生长，最终减轻连作土传病害的发生，改善作物生长。采用菌根真菌接种技术控制土传病害措施可大幅度减少化学农药的使用，减轻环境污染，提高农产品品质，实现农业的可持续发展。发明人从基础研究出发，在国家自然科学基金(31060277)和云南省自然科学基金(2009CD059)的资助下，发现采用菌根真菌接种能较好的控制连作土传蚕豆枯萎病的发生和危害。

发明内容

针对蚕豆连作而导致枯萎病严重发生而目前生产中无有效防治措施的现状，本发明提供一种控制蚕豆枯萎病的菌根真菌施用方法，以达到有效控制蚕豆枯萎病的目的。

为实现上述目的，本发明提供一种控制蚕豆枯萎病的菌根真菌施用方法，将能侵染蚕豆根系的菌根真菌施用到蚕豆根际，可充分发挥菌根真菌根际微生物-根系病原菌的互作而改善连作蚕豆的根际微生态环境，抑制镰刀菌的生长及侵染，并提高蚕豆自身的抗性，从而减轻蚕豆枯萎病的发生。

一种控制蚕豆枯萎病的菌根真菌施用方法：菌根真菌菌剂的施用时间：于蚕豆播种时同时施用AM真菌；菌根真菌菌剂的施用方法：AM菌剂施用于土壤5cm深处，施用量为17g AM菌剂/株蚕豆；菌根真菌菌剂的种类：摩西球囊霉(Glomus mosseae，菌种编号：BGCGZ01A)，幼套球囊霉(Glomus etunicatum，菌种编号：BGCG03C)。

病害调查时间：于蚕豆播种70天后进行蚕豆枯萎病调查，计算发病率和病情指数，评价AM真菌菌剂的控病效果。

蚕豆枯萎病分级方法：田间发病程度分为5级。

“0级”：茎基部及根无病斑，表观无症状；

“1级”：茎基部或根的局部(除主根外)稍显病斑或稍变色；

“2级”：茎基部或主侧根有病斑，但不连片；

“3级”：1/3-1/2的茎基部或根部出现病斑、变色或腐烂，侧根明显减少；

“4级”：茎基部被病斑环绕或根系大部分变色腐烂；

“5级”：植株枯萎死亡。

发病率(％)＝(发病株数/调查株总数)×100

病情指数(％)＝∑(各级病株数×相应级值)/(最高级值×调查总株数)×100

本发明适用于连作蚕豆种植过程中枯萎病的控制。有益效果是：通过施用AM真菌菌剂能改善蚕豆的生长，使蚕豆地上部生物量增加7％-93％，使地下部生物量增加21％-47％。增加根际细菌和放线菌的数量，增加了根际微生物的活性(AWCD)、多样性(H)和丰富度(S)，改变了微生物群落功能多样性；减少蚕豆根际病原菌74％-95％，使蚕豆根系中的丙二醛(MDA)含量降低45％-55％，使过氧化物酶(POD)活性提高33％-300％。最终减轻蚕豆枯萎病的发生危害，可以降低蚕豆枯萎病发病率50％-70％，降低病情60％90％。

附图说明

图1为施用菌根真菌菌剂对蚕豆生物量的影响；

图2为施用菌根真菌菌剂后蚕豆枯萎病发病率(2-1)和病情指数(2-2)的变化；

图3为施用AM菌剂对蚕豆根际细菌(3-1)、真菌(3-2)和放线菌(3-3)数量的影响；

图4为施用菌根真菌菌剂后蚕豆根际微生物群落功能多样性的变化；包括微生物活性(4-1)、多样性指数(4-2)、丰富度指数(4-3)和群落特征(4-4为施用AM菌剂后蚕豆根际微生物群落变化特征的主成分图谱；

图5为施用菌根真菌菌剂后蚕豆根际镰刀菌数量的变化；

图6施用菌根真菌菌剂后蚕豆根系中过氧化物酶活性POD(6-1)和丙二醛MDA(6-2)含量的变化。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

本发明将通过实例更加具体的说明施用AM真菌菌剂抑制蚕豆枯萎病危害的方法，但所述实例仅用于说明本发明而非限制本发明，对本发明方法或条件所作的修改，均属于本发明的范围。

实施例1

施用AM菌剂，评价AM菌剂对蚕豆生长的影响。

实施地点：云南农业大学土地资源系大棚。

供试AM菌剂来源：购买自北京市农林科学院植物营养与资源研究所。

供试AM菌种信息及购买途径：北京市农林科学院植物营养与资源研究所学科情报服务平台中“丛枝菌根真菌种质资源库”(BGC)。

供试AM菌剂种类：AM菌种1(摩西球囊霉，Glomus mosseae，菌种编号：BGCGZ01A，记为Gm)，AM菌种2(扭形球囊霉，Glomus tortuosum，菌种编号：BGCNM03A，记为Gt)，AM菌种3(根内球囊霉，Glomus intraradices，菌种编号：BGCBJ09，记为Gi)，AM菌种4(幼套球囊霉，Glomus etunica tum，菌种编号：BGCG03C，记为Ge)

AM菌剂施用方法及时间：AM菌剂施用于土壤5cm深处，施用量为17g AM菌剂/株蚕豆。播种蚕豆前先将AM真菌施入。

试验设计：设5个处理，分别为施用AM菌剂1和接种镰刀菌，施用AM菌剂2和接种镰刀菌，施用AM菌剂3和接种镰刀菌，施用AM菌剂4和接种镰刀菌，不施用AM菌剂但接种镰刀菌的对照(CK)，每个处理重复3次。

挑选大小、饱满度一致，种皮完整的种子，用10％的H₂O₂浸泡30min，用去离子水清洗干净，将蚕豆放在垫有滤纸的托盘中于恒温培养箱25℃催芽，出芽后播种。

土壤处理：试验用土在125℃下灭菌，每盆装土1.8Kg。

镰刀菌接种时间：于蚕豆3叶期接种15ml尖孢镰刀菌孢子悬浮液，约4×10⁵cfu，与土壤混合均匀。

施肥量：N：150mg/Kg，P2O5：100mg/kg，K2O：100mg/kg。试验所用的肥料种类：氮肥：尿素(N46.4％，云天化股份有限公司提供)，钾肥：硫酸钾(K₂O：52％)，磷肥：普通过磷酸钙(P₂O₅：16％)。

蚕豆每盆播种4棵，生长期间定期浇；水分保持在最大持水量的50％-70％，自然光照。整个生育期不使用杀虫剂、杀菌剂和除草剂，定期调换盆的位置。

施用AM菌剂对蚕豆生长的影响：

参考图1，与不施用菌根真菌的对照相比，施用摩西球囊霉(Gm)、扭形球囊霉(Gt)，根内球囊霉(Gi)，幼套球囊霉(Ge)分别使蚕豆地上部生物量增加93.2％、7.0％、57.0％和44.6％，以Gm的增幅最大。

施用摩西球囊霉(Gm)、扭形球囊霉(Gt)，根内球囊霉(Gi)，幼套球囊霉(Ge)分别使蚕豆地下部生物量47.5％、24.8％、40.7％和21.2％，以Gm的效果最好。

实施例2

施用AM菌剂，评价AM菌剂控制枯萎病发生的效果。

实施地点：云南农业大学土地资源系大棚。

供试AM菌剂、试验设计、AM菌剂施用方法、镰刀菌接种时间、蚕豆种植规格与施肥同实例1。

施用AM菌剂控病效果：

参考图2，图2-1为蚕豆枯萎病发病率、图2-2为蚕豆枯萎病发病指数，与不施用AM菌剂的对照相比，施用摩西球囊霉(Gm)、扭形球囊霉(Gt)，根内球囊霉(Gi)，幼套球囊霉(Ge)分别使蚕豆枯萎病发病率下降70％、50％、0％和70％，以Gm和Ge发病率的降幅最大，而Gi对发病率无影响。

施用摩西球囊霉(Gm)、扭形球囊霉(Gt)，根内球囊霉(Gi)，幼套球囊霉(Ge)分别使蚕豆枯萎病病情指数下降94％、60％、64％和94％，同样以Gm和Ge的效果最好，同时对发病率无影响的Gi处理同样能显著降低枯萎病的病情指数。

实施例3

施用AM菌剂改变蚕豆根际微生物区系(土壤细菌、真菌和放线菌数量)

实施地点：云南农业大学土地资源系大棚。

于蚕豆蚕豆播种后70天进行蚕豆枯萎病调查并采集相应的蚕豆根际土壤样品，带回实验室置4℃冰箱内保存，一周内完成分析测定。测定时称取10.0g土壤，用90ml无菌水稀释，振荡20分钟，此为10^-1稀释度的微生物溶液，然后再稀释成不同浓度梯度的微生物悬浊液，细菌的接种浓度为10^-5，真菌的接种浓度为10^-3，放线菌的接种浓度为10^-4，接种量为0.2ml。

细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基培养：牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaC15.0g、琼脂20g、水1000mL、pH7.4～7.6；

真菌采用马丁氏培养基培养：KH₂PO₄1g、MgSO₄7H₂O0.5g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、琼脂15-20g、水1000mL，此培养液1000mL加1％孟加拉红1％水溶液3.3mL，临用时每100mL培养基中加入1％链霉素液0.3mL；

放线菌采用高氏一号培养基进行培养：可溶性淀粉20g、KNO₃1g、NaCl0.5g、K₂HPO₄3H₂O0.5g、MgSO₄7H₂O0.5g、FeSO₄7H₂O0.01g、琼脂20g、水1000mL、pH7.4～7.6。2-7天后开始观察平板中菌落长势，数出菌落数并记录。

施用AM菌剂改变蚕豆根际微生物数量的效果：

参考图3，图3-1为蚕根际细菌数量、3-2为蚕豆根际真菌数量、33为蚕豆根际放线菌数量，施用摩西球囊霉(Gm)、扭形球囊霉(Gt)，根内球囊霉(Gi)，幼套球囊霉(Ge)分别使蚕豆根际细菌数量增加800.2％、686.5％、397.7％和350.3％；使蚕豆根际真菌数量分别下降69.6％、92.2％、74.8％和77.0％；使蚕豆根际放线菌数量分别增加213.9％、266.5％、154.4％和346.1％。微生物数量的变化与枯萎病的病情变化一致，即施用AM菌剂增加了蚕豆根际的细菌和放线菌数量，降低根际真菌数量，降低了蚕豆枯萎病的发病率和病情指数。

实施例4

施用AM菌剂后蚕豆根际微生物代谢功能多样性变化。

实施地点：云南农业大学土地资源系大棚。

蚕豆蚕豆播种后70天采集蚕豆根际土壤测定微生物代谢功能多样性。

微生物代谢多样性采用Biolog方法进行分析，即将Biolog ECO平板从冰箱内取出，预热到25℃。称取10.0g土壤加90mL无菌的0.85％的NaCl溶液中，于摇床上振荡30min，然后将土壤样品稀释至10^-3，用8道加样枪吸取150uL稀释液至ECO板的微孔中，最后将接种好的板置于25℃的恒温培养箱中暗室培养，每隔24h在Biolog E_max ^TM自动读盘机上用Biolog Reader4.2软件(Biolog，Hayward，CA，USA)读取590nm波长的光密度值，培养时间为168h。以31个孔平均吸光度值(AWCD)作为微生物活性的有效指数。采用72h时的光密度值来计算土壤微生物功能多样性指数。

平均吸光度值(AWCD)的计算如公式：

AWCD＝∑(C-R)/n

其中：C为每一个微孔的光密度值，R为ECO板空白微孔的光密度值，n为ECO板上碳源的种类，n＝31。

微生物多样性指数(H)采用Shannon-Wiener指数法计算，h的计算如公式：

H＝∑(Pi×logPi)

式中，Pi＝(C-R)/∑(C-R)

微生物多样性指数(H)采用Shannon-Wiener指数法计算，H＝∑(Pi×logPi)，式中Pi＝(C-R)/∑(C-R)

丰富度指数(S)：微生物群落利用碳源种类的数目，即颜色变化孔数。

施用AM菌剂改变蚕豆根际微生物活性和多样性效果：

参考图4，图4-1为蚕豆根际微生物的活性，4-2为蚕豆根际微生物的香农多样性指数，4-3为蚕豆根际微生物的丰富度指数，4-4为蚕豆根际微生物群落变化特征的主成分图谱，与不施用菌根真菌的对照相比，施用摩西球囊霉(Gm)、扭形球囊霉(Gt)，根内球囊霉(Gi)，幼套球囊霉(Ge)后蚕豆根际微生物对碳源的利用能力(AWCD)分别提高34.4％、31.5％、-15.2％和50.8％；根际微生物多样性指数(H)分别增加2.7％、0.9％、3.2％和4.6％；丰富度指数(S)分别提高11.9％、10.2％、10.2％和23.7％。施用Gm、Gt、Gi和Ge在主成分1和主成分2构成的向量空间中均有较好的分离，表明施用Gm、Gt、Gi和Ge明显改变了蚕豆根际的微生物代谢功能多样性。

实施例5

施用AM菌剂后减少了蚕豆根际土壤中病原菌-镰刀菌的数量。

实施地点：云南农业大学土地资源系大棚。

AM菌剂施用方法、镰刀菌接种方法、蚕豆种植规格与施肥同实例1。

于蚕豆蚕豆播种后70天采集蚕豆根际土壤测定镰刀菌的数量。

测定方法采用稀释平板法进行，所用培养基为尖孢镰刀菌的选择性培养基，具体配方为：KH₂PO₄1.0g，KCl0.5g，MgSO₄.7H₂O0.5g Fe-Na-EDTA0.01g L-天门冬氨酸2.0g，D-半乳糖20.0g，蒸馏水1000mL(121℃灭菌、20min)。灭菌后加入物质：二硝基苯(75％WP)1.0g，牛胆汁0.5g，Na₂B₄O₇.10H₂O1.0g、硫酸链霉素0.3g(培养基用10％磷酸调节pH至3.8±0.2)。

施用AM菌剂减少蚕豆根际镰刀菌数量的效果：

参考图5，与不施用菌根真菌的对照相比，施用摩西球囊霉(Gm)、扭形球囊霉(Gt)，根内球囊霉(Gi)，幼套球囊霉(Ge)后蚕豆根际镰刀菌数量分别降低95.2％、74.3％、77.8％和90.4％。

实施例6

施用AM菌剂后蚕豆根系中防御酶活性的变化。

实施地点：云南农业大学土地资源系大棚。

根系中过氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量的测定方法：

POD活性测定采用愈创木酚氧化法：取根2.00g，剪碎，放入研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液，6ml蒸馏水，0.4gPVP，研磨成浆，4000r/min离心10min，上清液即为酶提取液。在5mL的反应体系中，加入2.9mL0.05mol/L磷酸缓冲液，1.0mL2％H₂O₂，1.0ml0.05mol/L愈创木酚和0.1mL酶液。用加热煮沸5min的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于37℃水浴中保温3min，然后迅速转入冰浴中，并加入2.0mL20％三氯乙酸终止反应。记录470nm波长处的OD降低速度，以每分钟内A₄₇₀变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(u)。

MDA含量的测定：取0.5g蚕豆根，加5％TCA5mL，研磨后所得匀浆在4000r/min下离心10min。取上清波2mL，加0.67％TBA2mL.混合后在100℃水浴上煮沸30min，

冷却后再离心一次。分别测定上清液在450nm、532nm和600nm处的吸光度值，并按公式C/umol/L＝6.45(A₅₃₂A₆₀₀)-0.56A₄₅₀算出MDA浓度，最终算出单位鲜量组织中的MDA含量(umol/L)。

施用AM菌剂改变蚕豆根系POD活性和MDA含量的效果：

参考图6，图6-1为蚕豆根系中过氧化物酶(POD)活性，6-2为蚕豆根系中丙二醛(MDA)含量。与不施用菌根真菌的对照相比，施用摩西球囊霉(Gm)、扭形球囊霉(Gt)，根内球囊霉(Gi)，幼套球囊霉(Ge)后蚕豆根系中POD酶活性分别提高183.3％、300.0％、133.3％和33.3％。施用Gm、Gt、Gi和Ge后使蚕豆根系中MDA含量分别降低55.7％，55.2％，45.6％和45.4％。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种控制蚕豆枯萎病的菌根真菌施用方法，其特征在于，菌根真菌菌剂的施用时间：于蚕豆播种时同时施用AM真菌；菌根真菌菌剂的施用方法：AM菌剂施用于土壤5cm深处，施用量为17gAM菌剂/株蚕豆；菌根真菌菌剂的种类：摩西球囊霉Glomus mosseae，菌种编号：BGCGZ01A，幼套球囊霉Glomus etunicatum，菌种编号：BGCG03C。