JP3347736B2

JP3347736B2 - 植物中で遺伝子を発現させるためのキメラ調節領域及び遺伝子カセット

Info

Publication number: JP3347736B2
Application number: JP51449995A
Authority: JP
Inventors: ジエルビン，スタントン・ビイ; ホウプトマン，ランドル; ニイ，ミン; クイ，デカイ
Original assignee: バイオテクノロジー・リサーチ・アンド・デイベロツプメント・コーポレイシヨン; パーデユー・リサーチ・フアウンデイシヨン
Priority date: 1993-11-19
Filing date: 1994-11-17
Publication date: 2002-11-20
Anticipated expiration: 2017-11-20
Also published as: JPH09505205A; AU1288595A; RU2142998C1; AU687961B2; EP0729514A1; EP0729514B1; ATE317445T1; WO1995014098A1; DE69434624D1; CA2174954A1; CN1061376C; CN1136825A; BR9408093A; US5955646A; DE69434624T2; KR960705939A; CA2174954C

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景本発明は、植物中の遺伝子発現の調節に有用なキメラ
調節領域に関する。該キメラ調節領域は、植物の病原菌
であるAgrobacterium tumefaciensのオパインシンター
ゼ遺伝子から誘導され得る。

Agrobacterium tumefaciensは、殆どの双子葉植物及
びある種の単子葉植物に感染するグラム陰性土壌細菌で
ある。Agrobacterium tumefaciensに感染すると、しば
しば感染した植物上にクラウンゴール腫瘍が形成され
る。

A.tumefaciens感染プロセスの間に、巨大腫瘍誘発
（「Ti」）プラスミドの規定DNAセグメント（「Ｔ−DN
A」）が感受性植物細胞に移り、植物の核ゲノムに組み
込まれてＴ−DNA遺伝子を発現する。ある種のＴ−DNA遺
伝子は、植物中で活性なホルモンの合成に係わる酵素を
コードする。これらのホルモンは感染した植物に腫瘍を
発生させ得る。他のＴ−DNA遺伝子は、オパインと称さ
れる独特のアミノ酸及び糖誘導体の合成及び分泌を誘発
させる。Agrobacterium tumefaciensは、これらのオパ
インを、炭素源として、また時に窒素源として利用し得
る。Gelvin,Plant Physiol.92:281−85（1990）;Gelvi
n,TRANSGENIC PLANTS（Academic Press 1993）;Ream,An
n.Rev.Phytopathol.27:583−618（1989）;Zambryski,An
n.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.43:465−90（199
2）を参照されたい。

Ｔ−DNA遺伝子は、植物環境において機能的であり且
つ植物調節領域と類似の領域を含んでいる。例えば、殆
どの植物プロモーターは、トランス作用因子に結合する
ことによりプロモーターの強度及び組織特異発現パター
ンを規定したり、又はそれらに影響を与えるシス作用要
素、例えば、上流活性化配列（「UAS」）（しばしば
「エンハンサー」とも称される）を含んでいる。Atchis
on,Annu.Rev.Cell Biol.4:127−53（1988）。所与のプ
ロモーターの全体的な強度、及びその発現パターンは、
シス作用要素の組合せ及び空間立体配置や該要素と相互
作用する核因子の存在により影響を受け得る。Dynan,Ce
ll 58:1−４（1989）。Ｔ−DNA遺伝子は、初期には原核
プラスミド上に常在しているが、植物中での転写に必要
な配列要素（プロモーター及びUAS）を全て保持してい
る。例えば、Ｔ−DNA遺伝子は、転写開始部位を設定す
るTATAボックスを含み、しばしば、転写開始部位から10
0bp以上離れた、転写レベルを調節する上流要素を含ん
でいる。Gelvin,TRANSGENIC PLANTS（Academic Press 1
993）を参照されたい。

上流活性化配列を保持する２つのＴ−DNA遺伝子は、
オクトピンシンターゼ（ocs）遺伝子及びマンノピンシ
ンターゼ（mas）遺伝子である。ocs遺伝子は、アルギニ
ンとピルビン酸を縮合してオクトピンを形成する産物を
コードする。Hack及びKemp,Plant Physiol.65:949−55
（1980）。ocs遺伝子の上流に位置する16塩基対のパリ
ンドロームは、過渡的な発現系において異種トウモロコ
シadh1プロモーターを活性化し得る。Ellisら,EMBO J.
6:11−16（1987）;Ellisら,EMBO J.6:3203−08（198
7）。このパリンドロームも、安定に形質転換されたtob
acco calliにおけるocsプロモーター活性に必須であ
る。Leisner及びGelvin,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 85:2
553−57（1988）;Leisner及びGelvin,Plant Cell 1:925
−36（1989）。

mas1′及び２′遺伝子は、二方向プロモーター及び47
9bpの遺伝子間領域を共有している。これらの遺伝子
は、マンノピンを合成するための２段階経路用酵素をコ
ードする。Ellisら,Mol.Gen.Genet.195:466−73（198
4）;Komroら,Plant Mol.Biol.4:253−63（1985）。mas
遺伝子の転写は放散的であり、遺伝子間領域は両遺伝子
の転写に必要な全てのシス作用要素を含んでいる。DiRi
ta及びGelvin,Mol.Gen.Genet.207:233−41（1987）;Fox
ら,Plant Mol.Biol.20:219−33（1992）;Leungら,Mol.G
el.Genet.230:463−74（1991）;Guevara−Garciaら,Pla
nt J.4:495−505（1993）。

ocs及びmas遺伝子プロモーターを用い、トランスジェ
ニック植物中で、結合した遺伝子の発現を誘発させた。
しかし、これらのプロモーターの適用は、トランスジェ
ニック植物の特定の組織では発現レベルが低いために限
定される。DiRita及びGelvin,前出;Harpsterら,Mol.Ge
l.Genet.212:182−90（1988）;Sangerら,Plant Mol.Bio
l.14:433−43（1990）。例えば、ocsプロモーターは、
トランスジェニックタバコ植物において顕著な細胞特異
発現パターンを誘発させる。Kononowiczら,Plant Cell
4:17−27（1992）。mas遺伝子は、葉や茎では発現力が
弱いが、根では発現力が強く、ある程度の傷害及びオー
キシン誘発性を示す。Langridgeら,Proc.Nat'l Acad.Sc
i 86:7890−94（1989）;Teeriら,EMBO J,8:343−50（19
89）;Saitoら,Planta 184:40−646（1991）;Guevara−G
arciaら（上記引用）。

プロモーター及び他の調節領域は異なる強度及び組織
特異性を有しているために、いくつかの組換え調節領域
が開発された。例えば、ある種のトランス作用因子に特
異的に結合するエンハンサー要素は、転写活性及び細胞
特異発現パターンを調節し得る。Bienz及びPelham,Cell
45:753−60（1986）。

ある種の構成プロモーター、例えば、カリフラワーモ
ザイクウイルス（CaMV）35S構築物の使用も公知であ
る。CaMV35Sプロモーターは、35Sプロモーターを発生的
且つ組織特異的に活性化するように機能し得る多重領域
を保持する活性化因子である。Benfeyら,EMBO J.8:2195
−2202（1989）;Benfeyら,EMBO J.9:1677−1684（199
0）;Benfeyら,EMBO J.9:1685−96を参照されたい。

KozielらのBio/Technology 11:194−199（1993）は概
して、異種遺伝子の組織特異的促進を得るためのプロモ
ーターのスタッキング構築に用いられるプロモーターに
関する。Kozielは、トウモロコシから誘導されたCaMV35
Sプロモーター又は２つの組織特異的プロモーター〔ホ
スホエノール−ピルビン酸カルボキシラーゼ（「PEP
C」）プロモーター及び花粉特異的プロモーター〕の組
み合わせに結合した、先端を欠くcry I A（ｂ）遺伝子
（用いた遺伝子フラグメントはBacillus thuringiensis
から誘導された1155アミノ酸殺虫タンパク質の最初の64
8アミノ酸をコードする）を含む遺伝子発現系の構築を
示している。Kozielは、上記両プロモーター構造からの
高レベルの発現を報告している。Kozielらはさらに、
（１）緑組織特異発現を生起することが知られているPE
PCプロモーター及び（２）トウモロコシ花粉特異的プロ
モーターも用いた。1500−4000ng/mgタンパク質の範囲
の殺虫タンパク質の発現が認められたが、これは極めて
高レベルの発現であると考えられる。さらに、PEPC/花
粉特異的プロモーターを用いることにより、組織特異発
現を得た。

他の技術を用いて組換え体発現を試みた人々がいる。
Bevanら,PCT/GB92/00566（1992）は概して単一のプロモ
ーターの非スタッキング適用に関し、該プロモーター
は、異種遺伝子の組織特異発現を得るためのKozielらの
プロモーターとは異なっている。該出願は明らかに組織
特異発現を得るためのマメのフェニルアラニンアンモニ
アリアーゼ（「PAL」）プロモーターの使用に関する。P
ALのゲノムクローン（即ち、コード配列の他に、PAL遺
伝子配列の一部である介在配列を含むクローン）の「推
定転写調節領域」及びアミノ末端PALタンパク質の68ア
ミノ酸からなるオープンリーディングフレーム（「OR
F」）と、β−グルクロニダーゼ（「GUS」）の全ORF及
びその後のノパリンシンターゼのポリアデニル化・転写
終結領域（後の２つの要素は効率的な発現を確実にする
ために典型的には殆どの真核性植物発現ベクター中で融
合される）とを融合したハイブリッド遺伝子を構築し
た。この初期の構築物はある種の植物では強力な活性を
示したが、その後、研究者らはハイブリッド遺伝子のPA
Lプロモーター領域に欠失を形成した。完全な発現に必
要な最小PALプロモーターは、PALの転写開始部位から25
3の塩基対であることが判明した。研究者らは、主とし
てこの最小領域内で欠失パターンを変化させることによ
り、組織特異発現をある程度調節し得ることを見いだし
た。

米国特許第5,034,322号は概して、リブロース−1,5−
ビス−ホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット
遺伝子を含むノパリンシンターゼプロモーターの使用に
関する。

＋65〜−301のmas領域及び−90〜−941の35Sエンハン
サー領域を含む「Mac」と称されるキメラプロモーター
が、トランスジェニックタバコ植物において二重CaMV35
Sプロモーターの数倍のレベルのGUS活性を示すことも報
告された。Comaiら,Plant Mol.Biol.15:373−81（199
0）。

上記構築物は、発現効率及び制御性の点でいくつかの
限界を示した。例えば、従来の方法では、強力な発現が
望まし状況で構成的に強力な発現を得ることができなか
った。

発明の要旨従って、本発明の目的は植物中で改良された遺伝子発
現を得るためのキメラ調節領域を提供することである。

本発明の別の目的は、Agrobacterium tumefaciensか
ら誘導されたプロモーター及び上流活性化配列を含むキ
メラ調節領域を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、Agrobacterium tumefaci
ensから誘導されたプロモーター及び上流活性化配列を
含むキメラ調節領域の制御下に発現させるべき遺伝子を
含む遺伝子カセットを提供することである。

本発明のさらに別の目的は、植物中での外来遺伝子の
誘発性発現を提供することである。

本発明のさらなる目的は、遺伝子カセットを含むプラ
スミド及びトランスジェニック植物を提供することであ
る。

上記及び他の目的を達成するために、本発明の１つの
態様により、植物中で遺伝子を発現させるためのキメラ
調節領域が提供され、該領域は、第１のAgrobacterium
tumefaciensオパインシンターゼ遺伝子から誘導された
上流活性化配列を含み、該配列は、第１のAgrobacteriu
m tumefaciensオパインシンターゼ遺伝子とは異なる第
２のAgrobacterium tumefaciensオパインシンターゼ遺
伝子から誘導されたプロモーターに作動可能に結合して
いる。第１及び第２のAgrobacterium tumefaciensオパ
インシンターゼ遺伝子は、マンノピンシンターゼ遺伝子
又はオクトピンシンターゼ遺伝子であるのが好ましい。

本発明の別の態様により、植物中で遺伝子を発現させ
るためのキメラ調節領域が提供され、該領域は、Agroba
cterium tumefaciensオパインシンターゼプロモーター
に作動可能に結合した少なくとも２つのAgrobacterium
tumefaciensオパインシンターゼ上流活性化配列を含ん
でいる。該上流活性化配列は、同一又は異なるAgrobact
erium tumefaciensオパインシンターゼ遺伝子、例え
ば、マンノピンシンターゼ及びオクトピンシンターゼ由
来であってよい。さらに、該上流活性化配列の一方又は
両方及びプロモーターは、同一のAgrobacterium tumefa
ciensオパインシンターゼ遺伝子由来であってもよい。

本発明の別の態様により、上記のようなキメラ調節領
域に作動可能に結合した発現されるべき遺伝子を含む遺
伝子カセットが提供される。遺伝子カセットはさらに、
転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナル、例え
ば、ノパリンシンターゼポリアデニル化シグナルを含ん
でいてよい。

本発明の別の態様により、外来遺伝子の誘発性発現用
カセットが提供され、該カセットは、Agrobacterium tu
mefaciensのマンノピンシンターゼ遺伝子から誘導され
たプロモーター及び上流活性化配列を含む調節領域に作
動可能に結合した外来遺伝子からなる。該調節領域はさ
らに、Agrobacterium tumefaciensのオクトピンシンタ
ーゼ遺伝子から誘導された上流活性化配列を含んでいて
よい。

本発明のさらに別の態様により、植物中で遺伝子を発
現させる方法が提供され、該方法は、遺伝子を本発明の
キメラ調節領域に結合する段階；該遺伝子及びキメラ調
節領域を植物に挿入する段階；及び植物に遺伝子を発現
させる段階からなる。

本発明のさらに別の態様により、本発明のキメラ調節
領域及び遺伝子カセットを含むプラスミド及びトランス
ジェニック植物が提供される。

本発明のさらに別の態様により、Agrobacterium tume
faciensのマンノピンシンターゼ遺伝子から誘導された
プロモーターに作動可能に結合した、Agrobacterium tu
mefaciensのオクトピンシンターゼ遺伝子から誘導され
た少なくとも３つの上流活性化配列を含む、植物中で遺
伝子を発現するためのキメラ調節領域および該キメラ調
節領域に作動可能に結合した発現されるべき遺伝子を含
む遺伝子発現用カセットが提供される。

本発明の他の目的、特徴及び利点は、本明細書に含ま
れている論考、データ及び図面を参照すれば明らかにな
るであろう。

図面の簡単な説明図１は、キメラmas及びocsベース調節領域の構造を概
略的に示している。矢印はmas又はocsプロモーターに対
する上流活性化配列の配向を示している。数字は転写開
始部位に対するヌクレオチドの位置を示している。ocs
上流活性化配列のトリマーを構築物３及び４に用いた。
ocs上流活性化配列のモノマー又はトリマーを構築物５
及び６に用いた。

図２は、タバコの一次形質転換体抽出物におけるmas
プロモーターベース構築物のGUS活性を示している。葉
（グラフＡ）、茎（グラフＢ）又は根（グラフＣ）組織
から調製した全タンパク質を用いてGUS活性を検定し
た。各棒は個々の形質転換体の活性を表している。構築
物の種類はグラフの一番下に示されている。各構築物に
ついて検定した個々のトランスジェニック植物の数は
「ｎ」で表されている。各構築物の平均GUS活性は
「」で表されている。Ａ＝活性化配列;P＝プロモータ
ー；（Aocs）_３＝ocs活性化配列のトリマー。

図３は、タバコの一次形質転換体抽出物におけるmas
プロモーター＋活性化配列ベース構築物のGUS活性を示
している。葉（グラフＡ）、茎（グラフＢ）又は根（グ
ラフＣ）組織から調製した全タンパク質を用いてGUS活
性を検定した。各棒は個々の形質転換体の活性を表して
いる。各構築物について検定した個々のトランスジェニ
ック植物の数は「ｎ」で表されている。構築物の種類は
グラフの一番下に示されている。各構築物の平均GUS活
性は、「」で表されている。Ａ＝活性化配列;P＝プロ
モーター;AocsAmasPmas＝mas活性化配列＋プロモーター
に結合したocs活性化配列のモノマー；（Aocs）₃AmasPm
as＝mas活性化配列＋プロモーターに結合したocs活性化
配列のトリマー。

図４は、タバコの一次形質転換体抽出物におけるocs
プロモーターベース構築物のGUS活性を示している。葉
（グラフＡ）、茎（グラフＢ）又は根（グラフＣ）組織
から調製した全タンパク質を用いてGUS活性を検定し
た。各棒は個々の形質転換体の活性を表している。構築
物の種類はグラフの一番下に示されている。各構築物に
ついて検定した個々のトランスジェニック植物の数は
「ｎ」で表されている。各構築物の平均GUS活性は
「」で表されている。Ａ＝活性化配列;P＝プロモータ
ー;Amas′＝mas領域−213〜−318;Amas″＝mas領域−11
1〜−318。

図５は、タバコの一次形質転換体の抽出物におけるoc
sプロモーター＋活性化配列ベース構築物のGUS活性を示
している。葉（グラフＡ）、茎（グラフＢ）又は根（グ
ラフＣ）組織から調製した全タンパク質を用いてGUS活
性を検定した。各棒は個々の形質転換体の活性を表して
いる。構築物の種類はグラフの一番下に示されている。
各構築物について検定した個々のトランスジェニック植
物の数は「ｎ」で表されている。各構築物の平均GUS活
性は「」で表されている。Ａ＝活性化配列;P＝プロモ
ーター;Amas′＝mas領域−213〜−318;Amas″＝mas領域
−111〜−318。

図６は、数種のトランスジェニックタバコ植物の葉
（二重35SL、MacL）、茎（二重35SS、MacS）及び根（二
重35SR、MacR）における二重CaMV35S及びMacプロモータ
ーのGUS活性のおおよその発現レベルを示している。

図７は、誘発性発現実験に用いた構築物を概略的に示
している。「UAS」＝上流活性化配列；「pmas」＝masプ
ロモーター；「GUS」＝β−グルクロニダーゼ遺伝子；
及び「NOS」＝ノパリンシンターゼポリアデニル化シグ
ナル。

図８は、精製された成熟線虫卵におけるGUS活性レベ
ルを示している。細菌又は動物のGUS活性を調べるため
にアッセイをpH5.5及び7.5で行った。

図９は、種々のトランスジェニック植物における線虫
誘発GUS活性を示している。パネルＡは、Pmasプロモー
ターを有するが活性化配列を欠くトランスジェニック植
物の場合、パネルＢは、AmasPmasプロモーターを有する
トランスジェニック植物の場合、パネルＣは、AocsAmas
Pmasプロモーターを有するトランスジェニック植物の場
合である。

好ましい実施態様の詳細な説明本発明は、外来遺伝子の発現の調節に有用なAgrobact
erium tumefaciensオパインシンターゼ遺伝子から誘導
された種々の上流活性化配列及びプロモーターを含むキ
メラ調節領域に関する。外来遺伝子には、トランスジェ
ニック植物中での発現が求められる任意のDNAが含まれ
る。この場合、いずれの由来のものであってもよい遺伝
子を植物のゲノムに挿入するが、該遺伝子は、形質転換
すべき植物から誘導された遺伝子であっても、挿入位置
の点で該植物に対して異種である。本発明の構築物は、
1993年11月19日出願の米国特許出願第08/155,067号にも
開示されており、該出願明細書は、本明細書に参照とし
て組み込むものとする。

本発明にはいずれの型の遺伝子コード産物を用いても
よい。本発明によりトランスジェニック植物中で発現さ
れるべき外来遺伝子には、β−グルクロニダーゼ；殺虫
及び殺菌タンパク質毒素をコードする遺伝子；耐病原菌
化合物；過敏応答化合物、例えば、ペルオキシダーゼ、
グルカナーゼ及びキチナーゼ、並びにフィトアレキシ
ン；農薬、除草剤及び殺菌剤耐性遺伝子；植物酵素、例
えば、タンパク質、スターチ、糖及び脂肪含量に関連し
たもの；植物酵素阻害剤、例えば、プロテアーゼ及びア
ミラーゼ阻害剤；植物ホルモン；昆虫ホルモン及びフェ
ロモン；医薬及び栄養化合物、例えば、β−カロテン；
ビタミン、及び抗体のフラグメント及び単鎖誘導体を含
む抗体；並びに植物中に存在するヌクレオチド配列に干
渉するアンチセンス転写物質が含まれるがそれらには限
定されない。例えば、Kung及びWu,TRANSGENIC PLANT,第
１巻（Academic Press 1993）を参照されたい。

一般に、天然マンノピンシンターゼプロモーター＋活
性化配列、又は天然オクトピンシンターゼプロモーター
＋活性化配列は、トランスジェニックタバコ植物の組織
中では比較的弱い（結合したgusAリポーター遺伝子由来
のGUS活性は数百〜数千単位のGUS活性である）。本発明
により、プロモーター＋活性化配列上にこれらの遺伝子
から誘導されたUASをスタッキングすると、結合したgus
A遺伝子から誘導されたGUS活性が最高２オーダーまで著
しく増大し、それによって数十万単位に至るGUS活性が
得られる。これら本発明のプロモーターgusA融合遺伝子
を発現するトランスジェニックタバコ植物の組織を組織
化学的に調べてみると、本発明の新規なプロモーターと
活性化配列の組合せが殆どの植物細胞型において機能す
ることがわかる。従って、これらの組合せ（キメラ調節
領域）は、当該分野において既に公知のプロモーターよ
りはるかに構成的であり得る。

本発明は、遺伝子の発現を強力且つ連続的に促進し得
る改良型植物調節領域に関する。さらに、組織非特異的
及び／又は組織増強発現を得ることができる。本発明の
活性化配列及びプロモーターを選択することにより、所
望の型の発現が得られる。

本発明のキメラ調節領域は、タバコにおいて他のいず
れの公知調節領域より強力な発現特性を示した。タバコ
は恐らく植物の形質転換に広く用いられているモデルで
ある。さらに、本発明の調節領域は、従来技術の調節領
域に比べてほぼ構成的（constitutive）（永続的作動
性）であり、大多数の植物組織において潜在的に有用で
あり得る。

本発明は、植物中で遺伝子を発現させるためのキメラ
調節領域に関し、該領域は、第１のAgrobacterium tume
faciensオパインシンターゼ遺伝子から誘導された上流
活性化配列を含み得、該配列は、第２のAgrobacterium
tumefaciensオパインシンターゼ遺伝子から誘導された
プロモーター配列、又は第２のAgrobacterium tumefaci
ensオパインシンターゼ遺伝子から誘導された上流活性
化及びプロモーター配列に作動可能に結合している。

本発明のキメラ調節領域は、外来遺伝子配列に作動可
能に結合し得、該配列は、植物機能性ターミネーター配
列、次いで植物機能性ポリアデニル化シグナル配列に作
動可能に結合し得る。本発明の１つの態様によるキメラ
調節領域は多くの場合高構成的である。

上流活性化配列は、天然状態では通常、天然転写開始
部位の前の少なくとも100個の塩基対であり、発現に影
響を及ぼし得る配列である。オクトピン及びマンノピン
シンターゼ遺伝子のUASはこの点で特に有用である。さ
らにこれらのUASは、異なるAgrobacterium tumefaciens
オパインシンターゼ遺伝子から誘導されたプロモーター
配列、又は上流活性化配列及びプロモーター配列に作動
可能に結合し得る。

「誘導された」という用語は、プロモーター及び上流
活性化配列のようなDNA領域に関して用いられる場合、
「誘導された」DNA領域が天然のDNA領域又は他の源のDN
A領域から又は該領域をベースとして得られる状態を指
す。「誘導された」DNA領域は、通常、計画的な突然変
異による、天然のDNA領域又は他の源のDNA領域とは異な
り得る。

「作動可能に結合した」という用語は、第１の配列
が、第２の配列又は領域に対して第２の配列の制御下に
影響を及ぼし得るに十分な程第２の配列の近傍に位置し
ていることを指す。例えば、UASがプロモーターに作動
可能に結合することによって、UASはプロモーターの転
写力を増進し得る。この場合、UASは典型的にはプロモ
ーターに対して５′の位置に存在する。今度は、UASと
プロモーターが遺伝子に作動可能に結合し、それによっ
て遺伝子がUAS/プロモーター組合せの制御下に発現する
が、該組合わせは典型的には遺伝子に対して５′の位置
に存在する。通常、プロモーターは、転写開始部位から
約30〜50塩基対の範囲内、翻訳開始部位からは数百塩基
対の範囲内に存在する。活性化配列は通常、プロモータ
ーの数百塩基対の範囲内に存在する。例えば、殆どの活
性化配列は、増強されたプロモーターの約300〜400塩基
対の範囲内に存在する。１つ以上の活性化配列を用いる
本発明の実施態様において、活性化配列は通常互いから
約100〜200塩基対の範囲内に存在する。

起源オパインシンターゼ遺伝子が互いに異なる本発明
のキメラ調節領域を構築することが可能であり、該領域
は、マンノピン、オクトピン、ノパリン及びアグロピン
シンターゼ遺伝子からなるオパインシンターゼ遺伝子群
から選択するのが好ましい。

天然mas及びocsプロモーター＋活性化配列により誘発
されるGUS活性の発現は特定の細胞型に限定される。ocs
活性化配列をmasプロモーター＋活性化配列に作動可能
に結合し、同様にmas活性化配列をocsプロモーター＋活
性化配列に作動可能に結合すると、天然の構築物に比べ
て調節された発現パターンが示された。従って、本発明
の別の態様により、木部道管及び葉の表皮細胞を含む多
数の細胞型でGUS発現並びに他の遺伝子を得ることがで
きる。他方、本発明の別の態様により、限定された発現
パターンを得ることもできる。ocsUASとmas最小プロモ
ーターを作動可能に結合するキメラ調節領域により、葉
の維管組織における発現が低下し、茎の発現は師部組織
に集中する。

本発明は、外来ポリペプチドをコードする組換え体遺
伝子カセットにも関する。組換え体遺伝子カセットは、
第１のAgrobacterium tumefaciensオパインシンターゼ
遺伝子から誘導された上流活性化配列と、別の第２のAg
robacterium tumefaciensオパインシンターゼ遺伝子か
ら誘導されたプロモーター配列又は上流活性化及びプロ
モーター配列とを含み得、これらの配列は全て外来遺伝
子配列に作動可能に結合される。構築物の外来遺伝子配
列は、植物機能性ターミネーター配列及び／又は植物機
能性ポリアデニル化シグナル配列に作動可能に結合し
得、それによってターミネーター配列及びポリアデニル
化シグナルは遺伝子又は遺伝子の転写に影響を及ぼし得
る。ターミネーター配列及びポリアデニル化シグナルは
遺伝子に対して３′の位置に存在する。

本発明の別の態様は、障害又は害虫を送り込むことに
より誘発され得るプロモーターと上流活性化配列の組合
せ（調節領域）に関する。開発された１つの組合せ（Am
asPmas）は優先的に根組織で発現し、病原菌の攻撃によ
り誘発されるのに対し、別の組合せ（AocsAmasPmas）は
より全体的に発現されるが、害虫の攻撃によりさらに誘
発される。これらの発現系は、根の害虫、例えば、線虫
又は菌類を標的とする遺伝子に有用であるばかりか、昆
虫害虫及び葉の病原菌に対しても適用される。例えば、
線虫増殖サイクルを妨害する殺線虫毒素及びタンパク質
をコードする遺伝子を本発明に用いることができる。

上記のように、mas又はocs活性化配列と共にマンノピ
ンシンターゼプロモーターを用い、病原菌感染によりキ
メラ調節領域を誘発させる。病原菌耐性を得るのに有用
な種々の遺伝子は、Keen,Plant Molec.Biol.19:109−22
（1992）に記載されている。

オパインシンターゼ遺伝子の転写要素、例えば、プロ
モーター及び上流活性化配列は、入手可能な配列情報に
基づいて容易に得ることができる。例えば、オクトピン
シンターゼ遺伝子用の転写要素は、Leisnerら,Proc.Na
t'l Acad.Sci USA 85:2553−57（1988）;Leisnerら,Pla
nt Cell 1:925−36（1989）に記載されている。マンノ
ピンシンターゼ遺伝子用の転写要素は、DiRita及びGelv
in,同上,Foxら,Plant Molec.Biol.20:219−33（1992）;
Leungら,Mol.Gen.Genet.230:463−74（1991）;Langridg
eら,Proc.Nat'l Acad.Sci USA 86:3219−23（1989）に
記載されている。ノパリンシンターゼ遺伝子用の転写要
素は、Haら,Nucl.Acids Res.17:215−23（1989）;Mitra
ら,Mol.Gen.Genet.215:294−99（1989）;Ebertら,Proc.
Nat'l Acad.Sci USA 84:5745−49（1987）;Anら,Mol.Ge
n.Genet.203:245−50（1986）に記載されている。アグ
ロピンシンターゼ遺伝子用の転写調節要素は、Bandyopa
dhyayら,J.Biol.Chem.264:19399−406（1989）に記載さ
れている。さらに、Ｔ−DNAの全配列は、Barkerら,Plan
t Molec.Biol.2:335−50（1983）に開示されている。

本明細書に含まれている教示に従って種々の発現レベ
ル及びパターンを得ることができる。所与の実施態様に
より得られる発現の量及びパターンは、マーカー系、例
えば、本明細書に記載のgusAにより評価し得る。

以下の実施例により本発明をさらに説明する。これら
の実施例は、本発明を例示するものであって、いずれの
点においても本発明を限定するものではない。

実施例１ mas又はocsプロモーター及び活性化配列にoc
s又はmas上流活性化配列を付加するとGUS発現が強力に
増大する mas及びocsプロモーターと上流活性化配列の新規な組
合せを図１に示すように作製した。過去の欠失分析によ
り、転写開始部位の上流の138塩基内の配列がヒマワリ
クラウンゴール組織におけるmas2′/npt II融合遺伝子
の正確な転写開始に十分であることが示されているの
で、masUASの種々のサブドメインをテストした。しか
し、−138と−318の間の配列もmas2′プロモーター活性
の定量レベルの調節に関与している可能性がある。DiRi
ta及びGelvin,Mol.Gen.Genet.207:233−41（1987）。テ
ストしたmasUASは：（ｉ）UAS＝−318〜−138;（ii）UA
S′＝−318〜−213;及び（iii）UAS′′＝−318〜−111
であった。図１を参照されたい。

第１グループのキメラ調節領域を構築し、転写開始部
位からのmasプロモーター−318と−138塩基対の欠失体
を用いて転写融合体としてuidA（gusA）遺伝子に付加し
た（図１の構築物１〜６）。第１セットのキメラ調節領
域は、（いずれかの配向で）−138masプロモーター欠失
の上流にocs活性化配列（−116〜−333）のモノマー又
はトリマーを含んでいる（図１の構築物３及び４）。第
２セットのキメラ調節領域は、−318masプロモーター欠
失の上流に類似のocs活性化配列モノマー又はトリマー
を含んでいる（図１の構築物５及び６）。このocs領域
は、安定に植物ゲノムに組み込まれた場合にはtobacco
calli及び植物のocsプロモーターの活性化に重要な16塩
基対パリンドローム並びに５′及び３′モジュレーター
配列を含んでいる。Leisner及びGelvin,1988及び1989,
前出;Kononowiczら,Plant Cell 4:17−27（1992）。

転写開始部位から−333及び−116の位置での２つのoc
s欠失をベースとするuidA遺伝子との転写融合体として
第２グループのキメラ調節領域を構築した（図１の構築
物８〜16）。２つのmas上流活性化配列領域を作製し
た。−213〜−318の配列を含む短いmas領域を図１の構
築物９〜12に用いた。−111〜−318の配列を含む長いma
s領域を図１の構築物13〜16に用いた。短いmas領域又は
長いmas領域を２つのocs欠失部の上流に付加した。

以下のようにしてキメラ構築物を調製した。全ての構
築物のベースは、ClontechからのバイナリーベクターpB
I101.2であった。プラスミドpBI101.2は、レプリコンpR
K290をベースとする。プラスミドpBI101.2は、Ｔ−DNA
ボーダー、植物中でカナマイシンを選択するためのnos
−npt IIキメラ遺伝子、及びポリアデニル化シグナルが
後に続くプロモーターの無いGUS遺伝子を含む。EcoR V
−Xba Iフラグメントからmasプロモーター領域を得た。
該領域は、pKan2−138由来の転写開始部位に関して−13
8〜＋65（塩基対20128〜20343）にある領域を含む。Bar
kerら,Plant Mol.Biol.2:335−50（1983）;DiRita及びG
elvin,前出。先ず、pKan2−318由来の転写開始部位に関
して−318〜＋65（塩基対20128〜20513）のmas活性化配
列及びプロモーター領域をCUp31（pUC13バックボーンを
有するがHind III、Pst I、Sst I、Sma I、BamH1、Xba
Iとして５′→３′を読みとるポリリンカーを含むpUC13
誘導体）のSma I−Xba I部位にクローン化した。次い
で、CUp31から得られたHind III−Xba I制限エンドヌク
レアーゼフラグメントをpBI101.2のマルチリンカーのHi
nd III−Xba I部位に再クローン化して、プラスミドpNi
1及びpNi2（それぞれ構築物１及び２）を得た。

プラスミドpENΔ１からのocsエンハンサーフラグメン
ト〔Leisner及びGelvin（1988），前出〕はHind IIIリ
ンカーを有していた。該フラグメントは転写開始部位に
関して−333〜−116（塩基対13774〜13991,Barkerら，
前出）に存在し、両配向でmasプロモーターの上流のpNi
1のHind III部位にトリマーとしてクローン化し、図１
の構築物３及び４を得た。構築物５及び６を作製するた
めに、同じocs活性化配列フラグメントをトリマー又は
モノマーとしてmas活性化配列＋プロモーターの上流のp
Ni2のHind III部位にクローン化した。

転写開始部位に関して−116〜＋296（塩基対13774〜1
3362）にあるocs構造遺伝子の一部を含むocsプロモータ
ー領域と、pEN1（Leisner及びGelvin,1988,前出）由来
の転写開始部位に関して−333〜＋296（塩基対13991〜1
3362）であるocs活性化配列及びプロモーター領域とを
含むBamH I−EcoR Iフラグメントを、pBluescript II S
K⁺（Stratagene）のそれぞれBamH I−EcoR I及びXba I
−EcoR I部位にクローン化した。次いで、得られたpBlu
escript誘導体からのXba I−EcoR VフラグメントをpBI1
01.2のXba I−Sma I部位にクローン化し、プラスミドpL
H3（構築物７）及びpNi3（構築物８）でGUS翻訳融合体
を作製した。pKan2−318由来の転写開始部位に関して−
318〜−213（塩基対20513〜20407）の「短い」mas活性
化配列を含むXho I−Hae IIIフラグメントを、pUX13（p
UC13バックボーンを含むがSma I部位がXho I部位に変換
されているpUC13誘導体）のXho I−Hinc II部位にクロ
ーン化した。クレノウフラグメントを用い、得られたXh
o I−Hind IIフラグメントを平滑末端化し、Xba Iリン
カーを付加し、該フラグメントを両配向でpLH3（構築物
９及び10を産生する）及びpNi3（構築物11及び12）のXb
a I部位にクローン化した。同じようにして、クレノウ
フラグメントを用い、pKan2−318由来の転写開始部位に
関して−318〜−111（塩基対20513〜20305）の長いXho
I−Mn1Imas活性化配列フラグメントをブラントにした。
Xba I用のリンカーを付加し、該フラグメントを両配向
でpLH3（構築物13及び14を産生する）及びpNi3（構築物
15及び16を産生する）のXba I部位にクローン化した。

次いで、上記構築物をそれぞれ、カナマイシンを含む
LB培地中37℃で増殖させたE.coli DH5αに形質転換し
た。制限マッピングにより挿入物の配向を検証した。Ca
MV35Sプロモーターと共に800bpのHind III−BamH Iフラ
グメントを含むプラスミドpBI121（Clontech）を対照と
して用い、キメラ調節領域の相対強度を比較した。

移動性プラスミドpRK2013を宿すE.coli MM294を用
い、三親交配法により、挿入物を含む組換え体プラスミ
ドをA.tumefaciens LBA4404に移入した。Hoekemaら,Nat
ure 303:179−80（1983）;Dittaら,Proc.Nat'l Acad.Sc
i.77:7347−51（1980）。LBA4404において、組換え体プ
ラスミドは、独立したレプリコン（「バイナリーベクタ
ー」）のままであり、該レプリコンは、植物に導入した
後で植物の該DNAに組込むことができる。他の方法、例
えば電気穿孔法を用いてプラスミドによりA.tumefacien
s細胞を形質転換してもよい。

0.5％グルコース、10μg/mlのリファンピシン及び50
μg/mlのカナマイシンを含むAB最少培地プレート上でAg
robacerium tumefaciensトランス接合体を選択した。Li
chtenstein及びDraper,DNA CLONING:A PRACTICAL APPRO
ACH（Glover版,Oxford−IRL Press 1986）。移入プラス
ミドのA.tumefaciens受容株への導入をDNAブロット分析
により検証した。

Nicotiana tabacum var.Wisconsin 38の６週齢滅菌苗
条頂端からの葉盤（leaf disk）を、葉盤形質転換法を
用い、構築物を含むA.tumefaciensを介して形質転換し
た。Horschら,Science 227:1229−31（1985）。感染し
た葉盤を抗生物質の不在下にMS3⁺培地上で３日間増殖さ
せた。次いで葉盤を、1250mg/lのカルベニシリン及び20
0mg/lのカナマイシンを含む新鮮な苗条芽誘発培地に移
した。Kononowiczら,Plant Cell 4:17−27（1992）。４
〜５週間後、各葉盤当たり１つの苗条を、500mg/lのカ
ルベニシリン及び50mg/lのカナマイシンを含む根誘発培
地に移した。２週間後、苗条頂端を、50mg/lのカナマイ
シンを含むBGS培地（1mg/lの葉酸、10mg/lのインドール
酢酸及び30mg/lのカイネチンを含むMS培地）に移して、
各系の試験管内苗条頂端培養を維持した。

これらの構築物の各々を含む再生トランスジェニック
タバコ植物をGUS活性について調べた。植物が10〜12葉
段階のときに、第４及び第５の完全に広がった葉の茎の
近くから、及び活発に生育する若い根から、タバコ組織
の小片を採取した。組織を200μｌ抽出緩衝液中で粉砕
し、−70℃で貯蔵した。Jefferson及びWilson,PLANT MO
LECULAR BIOLOGY（Gelvin ＆ Schilperoot編,Kluwer Ac
ad.Press 1991）。基質として10μｌの抽出物（約20〜3
0μｇのタンパク質）及びMUG（４−メチルウンベリフェ
リル−β−Ｄ−グルクロニド）を用い、Jefferson及びW
ilsonに従ってGUS活性を検定した。Patterson,Analyt.B
iochem.83:346−56（1977）に従ってタンパク質濃度を
測定した。

同一の構築物を含む個々のトランスジェニック植物
は、多様なGUS活性（図２〜図５参照）を示したが、同
一構築物を含む多くの植物のGUS活性を測定することに
より、各キメラ調節領域の相対強度を予測することがで
きた。活性化配列要素を対向配向でクローン化した構築
物を用いたGUS活性には全く差が検出されなかったの
で、各２員構築物のサブグループからのデータをプール
した（３と４、５と６、９と10、11と12、13と14及び15
と16）。

検査した全ての組織において、mas−138欠失体により
誘発された発現は、GUS活性のバックグラウンドレベル
が最小であった（図２、構築物１）。天然のmas活性化
配列を最小masプロモーターに付加して構築物２を得た
が、該構築物は、葉と茎の組織において、平均して約10
00単位という低レベルのGUS活性を誘発させた（図２、
グラフＡ及びＢ）。該構築物について平均して約12,000
単位という比較的強力なGUS活性が根組織に認められた
（図２、グラフＣ）。これらの結果は、このmasプロモ
ーター及び活性化領域が上記のmas2′プロモーターの根
優先発現を生起させることを示唆している。mas活性化
配列を、−138mas欠失の上流の異種ocs活性化配列（ト
リマーとして）と交換しても、葉と茎の両方の組織にお
ける同種mas活性化配列とプロモーターの組合せに対す
るGUS活性レベルは実質的に変わらなかった（図２、グ
ラフＡ及びＢ）。ocs活性化配列及びプロモーターの発
現が葉よりも根で実質的に高くはないことを示すデータ
を考え合わせると、該データは、masプロモーターの根
優先発現が、mas転写開始部位の138bp範囲内の要素によ
り与えられることを示唆している。この組織特異的パタ
ーンの量的発現レベルは、ocs活性化配列又はmas活性化
配列によってさらに高めることができる。

−66位のmasプロモーター領域におけるAS−１タンデ
ムリピートモチーフ〔Lamら,Proc.Nat'l Acad.Sci USA
86:7890−94（1989）〕の相同体が同定された。この要
素は、CaMV 35Sプロモーター中に見いだされると、トラ
ンス作用因子（transacting factor）ASF−１（Lamら，
上記引用）と相互作用し、根において高活性で組織特異
的発現パターンを誘発させたと記載されている（Benfey
ら，前出）。

キメラ構築物により誘発されたGUS活性をCaMV 35Sプ
ロモーター（pBI121の−800）により得られた活性と比
較した。大多数の35S−GUS形質転換体は、mas活性化配
列及びプロモーター構築物を含む植物と同等又はそれ以
下のGUS活性を示した（図２）。Lamら，前出により報告
されているように、35Sプロモーターの根優先発現パタ
ーンが認められた。

結果は、ocs及びmasプロモーターが組織特異的に転写
を誘発するシス要素を含んでいることを示している。Ko
nonowiczら,Plant Cell 4:17−27（1992）;Leungら,Mo
l.Gen.Genet.230:463−74（1991）。これらの結果に鑑
みて、異種活性化配列の組合せをテストし、ある組合せ
がocs又はmasプロモーターのみによって誘発させる筈の
発現パターンを変え、それによって特定の植物組織にお
けるプロモーターの活性を増減させ得るかどうかを決定
した。この仮定をテストするために、mas活性化配列及
びプロモーターの上流に位置するocs活性化配列のトリ
マー又はモノマーを含む図１に示す構築物５及び６をタ
バコに導入し、種々の組織におけるGUS活性を測定した
（図３参照）。ocs活性化配列のモノマーを含む新規な
キメラ領域により、mas2′プロモーター及び活性化配列
に比べて、葉（6.6倍）、茎（3.0倍）及び根（3.4倍）
におけるGUS活性の発現が増大した（図２及び図３参
照）。ocs活性化配列のトリマーを含む構築物により、
余分のocs活性化配列を欠くmas2′プロモーター及び活
性化配列（図１及び図２の構築物２）に比べて、葉（22
倍）、茎（1.7倍）及び根（９倍）におけるGUS活性の発
現が強く増大した。これらの結果は、少なくとも葉や根
の組織においては、ocs活性化配列の多重コピーを付加
すると、mas2′プロモーター及び活性化配列の相対活性
に及ぼす増幅作用が驚異的に増強されたことを示してい
る。

アッセイにより、トランスジェニック植物の葉におけ
るCaMV35Sプロモーター（平均して200pmol/分/mgタンパ
ク質）の活性が、Comaiら,Plant Mol.Biol.15:373−81
（1990）のデータに匹敵するものであることが示され
た。35Sエンハンサーを二重にすると、葉のGUS活性が２
倍に増大した。Comaiら，前出からのデータを本発明の
構築物から得られたデータと比較すると、構築物５及び
６のキメラ領域は、葉におけるGUS発現を、35Sプロモー
ター及び増強された二重35Sプロモーターのそれぞれ156
倍及び26倍も強めた。

二重35S−GUS又はMac−GUS構築物を含むT2世代のタバ
コ植物の種子もテストした。これらのトランスジェニッ
ク植物の葉におけるGUS活性を測定して、上記のプロモ
ーターの相対強度を確認した。以下の表Ｉは、種々のプ
ロモーター−uidA融合体を保有するトランスジェニック
タバコ植物の葉における平均GUS活性を示している。

以下の表IIは、種々のプロモーター−uidA融合体を保
有するF1世代トランスジェニックタバコ植物の葉に認め
られた平均GUS活性を示す。

ocs最小プロモーター（−116〜＋296）をベースとす
る一連のキメラ構築物をテストして、組織特異発現の強
度及びパターンを評価した。図４に示されているよう
に、ocs活性化配列及びプロモーター（図１の構築物
８）は、トランスジェニックタバコ植物の葉、茎及び根
組織において、低く且つ比較的均一なGUS活性レベル
（平均して200〜400pmol/分/mgタンパク質）を誘発させ
た。ocs活性化配列を短いmas活性化配列（−213〜−31
8;構築物９及び10）と取り換えると、検査した全ての組
織において低レベルのGUS活性しか誘発させないキメラ
構築物が得られた。

最小ocsプロモーターの上流の長いmas活性化配列（−
111〜−318）（構築物13及び14）もテストした。これら
の構築物は、根の組織のみで、わずかに増大レベルのGU
S活性を誘発させた。−66で認められたAS−１相同体の
他に、AS−１要素と類似の配列も−290位に存在する。
この配列は短いmas活性化配列にも存在するが、−213〜
−103にわたる他の配列は根優先発現の誘発に必要であ
ることが明らかである。

次いで、短いmas活性化配列（−318〜−213;構築物11
及び12）をocs活性化配列＋プロモーターの上流に挿入
した。これらの構築物は、ocs活性化配列＋プロモータ
ーのみを含む構築物（構築物８）に比べて、葉、茎及び
根組織におけるGUS活性を、それぞれ、６倍、2.5倍及び
15倍増大させた（図５参照）。これらの構築物の発現は
わずかに根優先的であったが、これは、AS−１様要素と
ocs活性化配列とが相互作用し得ることを示唆してい
る。興味深いことには、長いmasUASを含む構築物（ocs
活性化配列及びプロモーターに付加したもの；構築物15
及び16）は、短いmas活性化配列を含む構築物（11及び1
2）よりわずかに低いレベルのGUS活性を誘発させた（図
５参照）。しかし、ocs及びmas活性化配列５′をmasプ
ロモーターに「積み重ねる（stacking）」と、ocs活性
化配列及びプロモーターだけのもよりプロモーター強度
が大きく増大した。

実施例２トランスジェニックタバコ植物におけるＴ−
DNAコピー数とGUS活性との相関関係Ｔ−DNAコピー数とGUS活性との間の関係を決定するた
めに、構築物５又は構築物11を含む16種のトランスジェ
ニック植物からのゲノムDNAを分析した。先ず、植物組
織からゲノムDNAを抽出し、Hind IIIで完全に消化し
た。Rogers及びBendich,PLANT MOLECULAR BIOLOGY（Gel
vin及びSchilperoot編,Kluwer Acad.Pub.,1992）。10マ
イクログラムのDNAをHind IIIで消化し、フラグメント
を1.0％のアガロースゲルを通した電気泳動により分離
し、毛管移動手順を用いてDNAをナイロン膜上に溶出し
た。Maniatisら,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANU
AL（Cold Spring Harbor 1982）。真空下に80℃で２時
間加熱処理して核酸を膜に固定した。1.5×SSC（１×SS
Cは0.15MのNaCl、0.015Mのクエン酸ナトリウムであ
る）、1.0％のSDS、0.5％のBlotto及び0.5mg/mlの剪断
されたサケ精子DNA中、65℃で２〜４時間予備ハイブリ
ダイゼーションを行った。

³²P−dCTPで標識した、GUSコード領域配列（pBI101.2
からのXba I−Sst I制限ヌクレアーゼフラグメント）を
含むプローブを用いて、新鮮な溶液中65℃で一晩ハイブ
リダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション完
了後、膜を以下の溶液で15分間室温で連続的に洗浄し
た:2×SSC/0.1％SDS、0.5×SSC/0.1％SDS、0.1×SSC/0.
1％SDS。0.1×SSC/1.0％SDSで30分間50℃で最終洗浄を
した。

この制限エンドヌクレアーゼとハイブリダイゼーショ
ンプローブの組合せを用い、雑種形成バンドの数及び強
度に基づいてＴ−DNAコピー数を予測することができ
た。組込まれたコピーの数は個々の形質転換体で１個〜
数個の変動があった。GUS活性は組込まれたuidA遺伝子
の数とは相関していなかった。例えば、ある場合に、単
一の組込みuidA遺伝子を含む植物は、葉におけるGUS活
性が多重組込みuidA遺伝子コピーを含む植物よりかなり
高かった。

実施例３トランスジェニックタバコ植物におけるGUS
活性とuidA mRNAの相関関係発現強度の尺度としてGUS活性を用いたので、この活
性がuidA mRNAの定常状態レベルを反映していることを
立証する必要があった。この相関関係は特に重要であ
る。というのは、mas2′プロモーター及びuidAリポータ
ー遺伝子を用いたときに、GUS活性がuidA mRNAの存在量
とは相関関係がなかったという報告があるからである。
Hensgensら,Plant Mol.Biol.20:921−38（1992）。

従って、４種の異なる構築物（構築物２、５、８及び
11）を含む個々のトランスジェニック植物の葉から定常
状態レベルのuidA mRNAを分離した。先ず、Vriesら,PLA
NT MOLECULAR BIOLOGY（Gelvin及びSchilperoot編,Kluw
er Acad.Pub.,1992）の手順に従って、全RNAを分離し
た。MOPS/EDTA緩衝液（50mMのMOPS、1mMの/EDTA、pH7.
0）中1.2％のアガロースゲルを通したホルムアルデヒド
ゲル電気泳動、次いでナイロン膜上へのブロットによ
り、５ミリグラムの試料を分画した。アガロースゲル電
気泳動及び臭化エチジウム染色によりRNAの組込みを調
べた。核酸の蛍光は、等量のRNAが各レーンに装入され
たことを確認するのにも役立った。ハイブリダイゼーシ
ョン条件は、ゲノムDNA分析についての先の記載の通り
であった。

ハイブリダイゼーション完了後、以下の溶液中で15分
間室温で膜を連続的に洗浄した:2×SSC/0.1％SDS、0.5
×SSC/0.1％SDS、0.1×SSC/0.1％SDS。0.1×SSC/1.0％S
DSで30分間60℃で最終洗浄を行った。

GUSコード配列から誘導されたハイブリダイゼーショ
ンプローブを用いたRNAブロット分析により、予測した
サイズ（約2300ヌクレオチド）の転写体があったことが
明らかになった。GUS活性と定常状態レベルのuidA mRNA
との間には緊密な相関関係があったが、これはHensgens
らの報告に反するものである。

実施例４ ocs及びmasプロモーターと活性化配列の種々
の組合せによる細胞特異的GUS発現パターンの調節 GUS活性の細胞特異的パターンを決定するためのトラ
ンスジェニックタバコ組織の組織学的実験。これらの発
現パターンは、植物組織の薄片をＸ−glucで組織化学的
に染色することにより現れた。

これらの組織化学的研究をJefferson及びWilson,前出
に従って行った。簡潔に言えば、植物材料を、0.1〜0.3
％のホルムアルデヒド、0.1MのTriton X−100、0.1Mの
リン酸緩衝液（pH7.0）で20〜40分間予備定着させ、0.1
Mのリン酸緩衝液でリンスし、１〜2mMのＸ−gluc（0.1M
のTriton X−100、0.1MのETDA、0.1Mのリン酸緩衝液
中）で２〜14時間染色した。0.1Mのリン酸緩衝液中３〜
５％のホルムアルデヒドを用いて２時間再定着させた
後、70％エタノールを用いて試料を透明化し、パラフィ
ン中に包埋し、回転式ミクロトームを用いて切片（12〜
18mm）を作製した。1.0％の過ヨウ素酸−0.5％のシッフ
試薬（「PAS」）で組織切片を逆染色した。

masプロモーターを含むが活性化配列を欠く（構築物
１）植物由来の検査したいずれの細胞型の葉組織にも検
出可能なGUS活性は認められなかった。天然mas活性化配
列＋プロモーター（構築物２）の制御下にキメラuidA遺
伝子を含む植物は、葉の葉肉（さく状およびスポンジ状
柔組織を含む）細胞及び孔辺細胞に中等度のGUS活性を
示したが、表皮細胞にはGUS活性は全く検出されなかっ
た。葉の維管組織では、木部仮道管細胞に中等度の染色
が認められたが、師部及び放射状柔組織細胞には比較的
弱い染色しか見られなかった。同様なGUS活性パターン
がocs活性化配列のトリマー及びmasプロモーター（構築
物３及び４）を有する葉身に認められた。しかし、葉の
維管組織におけるGUS活性は、全ての細胞型で大きく減
少した。mas活性化配列＋プロモーター上にocs活性化配
列のトリマーを「積み重ねる」（構築物５及び６）と、
葉の葉肉及び孔辺細胞のみならず表皮細胞にも強力なGU
S活性が得られた。この結果は、遠位と近位の同種活性
化配列が相互作用して、発現パターンを調節することを
示している。葉の維管組織における発現パターンは、oc
s活性化配列のトリマーがmas活性化配列＋プロモーター
に結合しているか否かに拘わらず同様であった。

最小ocsプロモーター（構築物７）を含む葉組織にはG
US活性は全く検出されなかった。ocs活性化配列＋プロ
モーター（構築物８）によって誘発されたGUS活性の発
現は、葉身の断面のmas活性化配列＋プロモーターのも
のと同様であった。このGUS活性パターンは、uidA遺伝
子が短いmas活性化配列及びocs活性化配列＋プロモータ
ー（構築物11及び12）からなるキメラプロモーターの制
御下にある植物の葉身にも認められた。葉の分枝維管組
織においては、ocs活性化配列＋プロモーターもGUS発現
を誘発させたが、これは、仮道管細胞においてのみであ
った。mas活性化配列＋プロモーターとは対照的に、ocs
活性化配列＋プロモーターは、放射組織及び師部細胞に
おいて中等度レベルのGUS活性の発現を誘発させたが、
葉の主維管組織においては、柔組織及び木部仮道管細胞
に極く弱い発現を誘発させただけであった。葉の維管組
織では、短いmas活性化配列がocs活性配列＋プロモータ
ーに付加されたか否かに拘わらず、同じ様なGUS活性パ
ターンが認められた。しかし、活性は、柔組織、放射組
織及び師部細胞で大きく増大した。ocsプロモーターに
結合したmas活性化配列（構築物９及び10）を含む植物
ではGUS活性は検出不能であった。

mas活性化配列＋プロモーター（構築物２）は、腺状
突起の柄には弱いGUS活性の発現を、頭花には強力な発
現を誘発させた。ocs活性化配列のトリマーをmas活性化
配列＋プロモーター（構築物５及び６）に作動可能に結
合すると、同様な発現パターンが得られたが、GUS活性
の相対レベルは、柄細胞において大きく上昇した。ocs
活性化配列＋プロモーターに結合した短いmas活性化配
列を含む構築物（構築物11及び12）によって誘発された
毛状突起におけるGUS活性の発現は、腺状突起の頭花で
は強力であったが、柄細胞では弱かった。

トランスジェニック植物の茎では、mas活性化配列＋
プロモーター（構築物２）が皮層細胞において弱いGUS
活性の発現を誘発させた。強力なGUS活性が、放射組織
及び柔組織細胞で認められたが、木部仮道管細胞におけ
る発現は比較的弱かった。このパターンは、mas活性化
配列＋プロモーターの上流にクローン化されたocs活性
化配列のトリマー（構築物５及び６）が存在した場合で
も変わらなかった。mas活性化配列をocs活性化配列のト
リマー（構築物３及び４）に取り換えると、異なるパタ
ーンが認められた。GUS活性の発現は、柔組織細胞では
依然として強力であったが、放射組織及び木部仮道管細
胞では弱くなった。ocs活性化配列＋プロモーター（構
築物８）は、mas活性化配列＋プロモーターとは対照的
に、放射組織及び柔組織細胞では比較的弱い発現しか誘
発させなかったが、仮道管細胞では強力な発現を誘発さ
せた。ocs活性化配列＋プロモーターの上流に短いmasプ
ロモーターを加えた（構築物11）場合、パターンは実質
的に同じに保たれた。

根組織において、mas活性化配列＋プロモーター（構
築物２）により誘発されたGUS活性は幾分可変的であっ
た。実際、根冠細胞、表皮細胞及び根毛、並びに根皮
層、師部、及び根の成熟帯域の木部細胞でGUS活性を検
出することができた再生植物があった。しかし、根の伸
長帯域ではGUS活性は殆ど検出されなかった。ocs活性化
配列のトリマーをmas活性化配列＋プロモーターに加え
る（構築物５及び６）と、必ずではないがしばしば、根
の成熟帯域の全ての細胞型でGUS活性が検出された。mas
活性化配列をocs活性化配列のトリマー（構築物３及び
４）に取り換えると、根の周辺皮層及び根の伸長帯域の
内皮細胞においてのみGUS活性が得られた。同様なGUS活
性パターンが、ocsプロモーター及び活性化配列（構築
物８）又は短いmas活性化配列＋ocs活性化配列及びプロ
モーター（構築物11及び12）によりuidA遺伝子の発現が
誘発されたときに認められた。

実施例５本発明のキメラ調節領域と他の調節領域との
比較 mas活性化配列＋プロモーターの活性は根組織におい
て最大である。ocs活性化配列のトリマーをmas活性配列
＋プロモーターに付加すると、GUS活性のレベルが２倍
〜３倍増大した。この活性の増大は、葉組織において最
大であるが、茎及び根の組織にも見られる。ocs活性化
配列＋プロモーターの活性は、トランスジェニックタバ
コ植物の葉、茎及び根においてほぼ同等である。「短
い」mas活性化配列をocs活性化配列＋プロモーターに付
加すると、GUS発現レベルが２倍〜20倍増大した。この
活性の増大は葉組織において最大であった。ocs活性化
配列の多重コピーとmas活性化配列＋プロモーターを合
わせると、葉において35Sプロモーターより約156倍も強
力であり、「増進された」二重CaMV 35Sプロモーターよ
り26倍も強力で、Comaiら,Plant Mol.Biol.15:373−81
（1990）に記載の「Mac」及び「Big Mac」プロモーター
より4.2倍も強力な転写調節要素が得られた（図２及び
図３並びに表Ｉ参照）。葉（「Ｌ」）、茎（「Ｓ」）及
び根（「Ｒ」）の場合の二重35S及びMacプロモーターに
関するデータを図６に示す。二重CaMV 35S、Mac及びBig
Macプロモーターに関して、構築物５及び６によって示
されたキメラプロモーターの強力な活性は最少推定値で
あることに留意されたい。さらに、これらの構築物を有
するトランスジェニック植物の細胞を組織化学的に分析
することにより、これらの「積み重ねられた」活性化配
列が殆ど全ての細胞型においてGUS活性の発現を誘発さ
せたことが明らかになった。例えば、GUS活性の強力な
発現は、木部及び葉の表皮細胞、並びに葉の葉肉、孔
辺、毛状突起及び師部細胞に検出することができた。茎
においては、師部、皮層及び柔組織細胞に活性が検出さ
れた。根においては、根の頂端及び根毛、並びに根の成
熟部分の殆どの細胞に、GUS活性が存在していた。

種々のキメラプロモーター−udiA構築物に対して植物
生育条件が及ぼし得る影響を考慮しなければならなかっ
た。Hensgensら,Plant Mol.Biol.20:921−38（1992）
は、試験管内で生育した（滅菌寒天に根付かせた）植物
のGUS活性は、温室内の土壌中で生育した植物に比べて
３〜10倍も高いと報告した。さらに、環境的に制御され
た条件下に土壌中で生育した植物の葉は、試験管内で生
育した植物より低いレベルのGUS活性を発現することが
知見された。しかし、種々の調節領域により誘発された
GUS活性の相対レベルは、植物の生育条件に拘わらずほ
ぼ同一であった（表２、前出）。さらに、自己増殖した
トランスジェニックタバコ植物のF1子孫の葉における種
々のキメラ調節領域の相対強度は、最初の形質転換再生
植物のものと同様であった（表２）。

特定の植物の定常状態レベルのmRNAとGUS活性の間に
は緊密な相関関係が認められた。この結果は、発現強度
の尺度としてGUS活性アッセイを用いることの信頼性を
実証している。しかしこの知見は、Hensgensら，前出の
ものに反する。これらのHensgensらの反対の知見は、彼
等がRNAブロット分析に変性条件を用いなかったことに
よるものであり得る。

Comaiら，前出は、植物を土壌中で生育させると、本
発明に用いたものより短い（−318に比べて、−301）ma
s2′活性化配列及びプロモーター領域が、CaMV 35Sプロ
モーターによって誘発されたGUS活性のわずか10％を誘
発させたに過ぎないことを見いだした。−301の上流の
配列を含めると、相対GUS活性が35Sプロモーターの場合
の40％にまで上昇した。Comaiらは、上流ではあるが−3
00の近傍の領域が完全なmas2′プロモーター活性に必要
であると結論した。本明細書に記載の実験に用いたmas
2′プロモーター（−318）の活性は、35Sプロモーター
により誘発されたものよりわずかに高かった。

Langridgeら，前出は、mas2′−lux融合遺伝子の活性
が、ホルモンによって数倍も誘発され得ることを示し
た。初期のアッセイは、ホルモンの存在下に試験管内で
生育した植物に関して行われたが、これらの生育条件は
結果にさして影響を与えず、これは、土壌中で生育した
植物で示された同様な相対GUS活性レベルにより示され
る。

Langridgeらは、トランスジェニックタバコの茎にお
いては、mas2′プロモーター活性が維管組織で最大に発
現されたことも示したが、Saitoら、前出は、タバコの
根の根冠で強力な染色を、師部細胞で弱い染色を示し
た。本明細書に開示されているデータは、これらの先行
報告と良く相関している。しかし、Saitoらは、葉の葉
脈ではGUS活性を検出したが、葉肉細胞では検出しなか
った。本明細書に記載の実験では、GUS活性は明らかにm
as2′−uidAキメラ遺伝子を有するトランスジェニック
植物の葉の葉肉細胞中で検出された。本明細書に記載の
結果の多くは、トランスジェニックタバコ植物の種々の
組織におけるmas2′プロモーターの発現に関するLeung
らのものとも相関している。しかし、Leungらは、彼等
の構築物を含む茎の維管細胞ではGUS活性を検出しなか
った。異種ocs又はmas活性化配列とmas又はocs活性化配
列＋プロモーターとを合わせると、検査した全てのタバ
コ組織において、GUS活性レベルが大きく上昇した。こ
れらのデータは、これらのキメラ調節領域の発現の上昇
が、該キメラ調節領域において認められた正の調節要素
間の単なる付加効果よりむしろ、協力的且つ相乗的相互
作用の結果であることを示している。

実施例６誘発性発現におけるキメラ調節領域の使用本発明の別の態様は、傷害を与えるか又は害虫を送り
込むことにより誘発され得るプロモーターと上流活性化
配列の組合せに関する。開発された１つの組合せ（Amas
Pmas）は、根の組織で優先的に発現し、病原菌の攻撃に
より誘発されるが、別の組合わせ（AocsAmasPmas）は、
より全体的に発現し、害虫の攻撃によりさらに誘発され
る。これらの発現系は、根の害虫、例えば、線虫類又は
菌類を標的とする遺伝子に有用であり、昆虫害虫及び他
の葉の病原菌に対して適用される。

−138を欠失したコアマンノピンシンターゼプロモー
ター領域を用いてキメラ調節領域を構築した。このコア
プロモーターをGUSコード配列に融合し、ノパリンシン
ターゼ（「NOS」）ポリアデニル化シグナルで終結し
た。図７、構築物１を参照されたい。

マンノピンシンターゼプロモーターの−318〜−138ま
でのUASをマンノピンシンターゼコアプロモーターと共
に用いて、図７の構築物２を作製した。図７の構築物５
及び６は、オクトピンシンターゼ遺伝子の−333〜−116
から誘導されたトリマーを両配向で含んでいた。これら
の構築物をAgrobacterium tumefaciens形質転換を用い
てタバコにトランスフェクトした。GUS活性を、多数の
個別のトランスジェニック植物の葉、茎及び根で測定し
た。masプロモーター及び活性化配列（図７、構築物
２）の活性は、根で最大であり、葉や茎ではかなり弱
い。mas活性化配列及びプロモーターにocs活性化配列を
付加する（図７、構築物５及び６）と、GUS活性が、構
築物２に比べて、根では10倍、茎及び葉では50〜100倍
に増大した。ocs活性化配列の配向は何ら影響を与えな
かった。

masプロモーター＋活性化配列の傷害誘発性は、トラ
ンスジェニックタバコ植物の、葉では30倍、茎では17
倍、根では３倍誘発し得る。

病原菌の攻撃による種々のキメラ調節領域の誘発性を
テストするために、構築物１、２、５及び６を含む個々
のトランスジェニック植物を線虫に感染させ、GUS活性
の誘発をモニターした。線虫におけるGUS活性の内在発
現がなかったことを確認するために、開発された線虫卵
の精製標本を分析した。用いた線虫の種は、トマトの根
から分離したMeloidogyne incognita種３であった。10
％クロロックス（chlorox）溶液中に感染した根を入
れ、４分間連続的に攪拌して、成熟卵を分離した。次い
で、200メッシュのスクリーンを通して溶液を洗浄し
て、根の破片を除去し、500メッシュのスクリーン上で
卵を回収した。卵を洗浄し、Nematode Counting Slide
（Olympic Equine Products）を用いて数を測定した。
次いで、対照として、線虫の内在GUS活性の存在をテス
トするために、卵をpH5.5及びpH7.5で分析した。pH5.5
でのGUS活性は、バックグラウンド活性と考えられる遺
伝子の動物形態から誘導された内在発現によるものであ
る。pH7.5でのGUS活性は細菌遺伝子の発現によるもので
ある。成熟線虫卵におけるGUS活性は、どちらのpHレベ
ルでも最小であることが判明した（図８）。従って、Me
loidogyne incognitaは、線虫卵の存在に起因するアッ
セイにおける重大なバックグラウンド活性問題を引き起
こす細菌や動物のGUS活性を含んではいない。

トランスジェニック植物に10,000個の精製された線虫
卵を感染させ、温室条件下に数ヶ月間砂土中で生育し
た。成熟植物から根を収穫し、線虫感染部位を視覚的に
同定した。Meloidogyne incognita感染部位は、線虫及
び卵袋を含む根のこぶが形成されたことにより視覚的に
同定し得るのに対し、非感染部位は正常な外観を有して
いる。根のこぶは感染領域のGUS活性の測定に用い、正
常な根領域は非感染対照として用いた。感染していない
根と感染した根との比較は全て同一植物に基づいて行
い、従って、遺伝子発現における位置効果及び植物ごと
の変動はない。植物番号７（１−７）を用い、pH5.5及
び7.5で、構築物１におけるGUS活性の誘発を測定した
（図９、パネルＡ）。

発現レベルは、構築物２、５、６を含むトランスジェ
ニック植物に比べて低く、これは、Pmasプロモーターの
みでは、基底活性レベルを発現するに過ぎず、線虫感染
により誘発され得ないことを示唆している。

Pmasプロモーターがmas活性化配列、Amas（構築物
２）を含んでいる場合、GUS活性の発現は高く、線虫感
染によって誘発され得る（図９、パネルＢ）。ocsプロ
モーター（Aocs）のUASを付加すると、線虫感染により
同様な誘発が得られた（図９、パネルＣ）。１種の植物
（５−５）は誘発性発現を示さなかった。これは、用い
た根の齢又は染色体中の一定の場所に遺伝子を挿入する
ことにより、別の形質転換体（５−２）が誘発応答を与
えたために、発現に変化が起こったことによる可能性が
ある。

これらの結果は、病原菌感染により、mas又はocs活性
化配列と共にマンノピンシンターゼプロモーターを用い
たキメラ調節領域が誘発されることを示している。該領
域は、線虫の送り込み及び増殖を妨害する殺線虫毒素又
はホルモン性化合物のための遺伝子の発現に用い得る。
例えば、Bacillus thuringiensis（「Bt毒素」）から誘
導されたある種の毒素は、線虫に有効であることが見い
だされた。Adangら,Plant Molec.Biol.21:1131−45（19
93）を参照されたい。これらの毒素及び該毒素をコード
する遺伝子のヌクレオチド配列は、米国特許第5,281,53
0号；同第5,322,932号;PCT特許公開WO92/04453号；及び
欧州特許出願公開第0517367A1号に記載されている。

これらの誘発性調節領域の使用は、殺線虫剤への適用
に限定されない。該調節領域は、傷害を引き起こす他の
病原菌に対しても等しく有効である。

実施例７殺虫剤毒素の発現を調節するキメラ調節領域本発明のキメラ調節領域を用いて、トランスジェニッ
ク植物における殺虫剤毒素の発現を調節することができ
る。好ましい実施態様において、Bt毒素を本発明の調節
領域の制御下に置くことができる。

トランスジェニック植物における発現レベルを改良す
るために、Bt毒素をコードする改変遺伝子が開発され
た。Perlakら,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 88:3324−28
（1991）は、cry I A遺伝子を改変して植物中では好ま
しくない配列と取り換えることを開示している。これら
の改変により、活性Cry I A毒素のレベルが増大するこ
とが知見された。同様に、Adangら，前出は、発現を改
良するためのcry III A遺伝子に対する改変を開示して
いる。Bt毒素ファミリーの他のメンバーも改変並びに本
発明での使用に利用し得る。過敏応答に関連する遺伝子
を用いてもよい。Kenn,前出を参照されたい。しかし本
発明は、特定のタイプの毒素又は化合物に限定されな
い。遺伝子によりコードされるか、又は遺伝子によりコ
ードされる酵素若しくは他の物質により産生されるあら
ゆるタイプの毒素又は抗昆虫化合物を本発明に用いるこ
とができる。

実施例８除草剤耐性を得るための遺伝子発現を調節す
るキメラ調節領域本発明のキメラ調節領域は、トランスジェニック植物
における除草剤耐性を賦与する遺伝子の発現に用い得
る。除草剤耐性は、３種の主方法、即ち：（ｉ）除草剤
の植物媒介解毒；（ii）除草剤標的の増大発現；及び
（iii）除草剤結合部位の突然変異により賦与され得
る。Schulzら,Crit.Rev.Plant Sci.9:1−15（1990）を
参照されたい。本発明には上記方法のいずれをも用いて
もよいが、本発明には最初の２つの方法が適する。

多くの慣用除草剤を解毒し得る数種の酵素が公知であ
る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
は、ｓ−トリアジン及びクロルアセトアミド除草剤耐性
を賦与する。例えば、Schulzら，前出;Shahら,Plant Mo
lec.Biol.6:203−11（1986）;Weigandら,Plant Molec.B
iol.7:235−43（1986）を参照されたい。ホスフィノト
リシンは、Streptomyces hygroscopicusからの遺伝子を
用いて失活した。De Blockら,EMBO J.6:2513−18（198
7）;Thompsonら,EMBO J.6:2519−23（1987）。ブロモキ
シニルを解毒し得るニトリラーゼ遺伝子が見いだされ
た。Stalkerら,Science 242:419−23（1988）。他の解
毒酵素を本発明に用いてもよい。

他の主たる耐性法は、除草剤の標的の増大発現に基づ
いている。例えば、グリオホスフェートは、５−エノー
ル−ピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ
（「EPSPシンターゼ」）の競合的阻害剤である。グリオ
ホスフェート耐性は、EPSPシンターゼの増大発現により
賦与され得る。EPSPシンターゼの増大発現は、本発明の
強力な構成性プロモーターを用いてEPSPシンターゼ配列
の発現を調節することにより得ることができる。さら
に、より高いレベルの発現を得るために、本発明のプロ
モーターと共にEPSPシンターゼ配列の多重コピーをトラ
ンスジェニック植物内に挿入してもよい。種々の源由来
のEPSPシンターゼをコードする配列は公知である。Dunc
anら,FEBS Lett.170:59（1984）;Stalkerら,J.Biol.Che
m.260:4724−28（1985）;Shahら,Science 233:478−81
（1986）を参照されたい。

最後に、除草剤耐性を賦与するために除草剤の結合部
位を変える方法を用いてもよい。Stalkerら及びShahら
は、EPSPシンターゼにおけるアミノ酸の変化がグリオホ
スフェート耐性を賦与し得ることを見いだした。同様
に、アセトヒドロキシ酸シンターゼにおける変化はスル
ホニル尿素及びイミダゾリノン耐性を賦与し得る。Shul
zら，前出、並びにWekら,Nucl.Acid.Res.13:3995−4010
（1985）を参照されたい。

実施例９ウイルス耐性を得るための遺伝子の発現を調
節するキメラ調節領域ウイルス遺伝子又はウイルス遺伝子のアンチセンス相
補体を発現させて植物にウイルス耐性を賦与することが
できる。ウイルス耐性を付与するための主方法は、
（ｉ）通常、コートタンパク質であるタンパク質媒介耐
性、及び（ii）アンチセンスRNA媒介耐性によるもので
ある。Beachyら,Ann.Rev.Phytopathol.28:451−74（199
0）は、上記の両方法を記載している。アンチセンスRNA
よりもウイルス性コートタンパク質を発現するトランス
ジェニック植物は、より強力なウイルス耐性を示す傾向
がある。Beachyら，前出;Cuozzoら,Bio/technology 6:5
49−57（1988）。

本発明の調節領域は、トランスジェニック植物にウイ
ルス耐性を賦与するいずれの遺伝子の発現にも用い得
る。例えば、多くの植物ウイルスコートタンパク質のア
ミノ酸配列が公知であり、該配列により、ヌクレオチド
配列の推定が可能になる。さらに、ウイルスコートタン
パク質をコードする遺伝子のヌクレオチド配列が公知で
あり、該配列から正確なアンチセンスRNA配列を合成し
得る。耐性を得るために、これらの配列をトランスジェ
ニック植物中で発現させ得る。

Cuozzoら，前出は、キュウリモザイクウイルスのコー
トタンパク質配列を開示している。他のウイルス配列を
含むトランスジェニック植物が構築された。例えば、An
dersonら,Phytopath.79:1284−90は、タバコモザイクウ
イルス及びアルファルファモザイクウイルスのコートタ
ンパク質を発現するトランスジェニック植物を開示して
いる。Hemenwayら,EMBO J.7:1273−80（1988）は、ジャ
ガイモウイルスＸのコートタンパク質及びアンチセンス
RNAを発現するトランスジェニック植物を開示してい
る。Huismanら,J.Gen.Biol.69:1789−98（1988）は、こ
のウイルスの配列を開示している。Gerlachら,Nature 3
28:802−05（1987）は、タバコ輪紋病ウイルスのサテラ
イトRNAを発現するトランスジェニック植物を開示して
いる。該サテライトRNAは、輪紋病ウイルスの病徴を改
善する。Eggenbergerら,J.Gen.Virol.70:1853−60は、
ダイズのモザイクウイルスからの配列を開示している。
しかし、本発明の使用は特定のウイルス型には限定され
ない。いずれの型のウイルスからの配列を本発明に用い
てもよい。

好ましい実施態様を示す記載、各実施例、図面及びデ
ータは、図示、例示のためであり、本発明を限定するも
のではないことを理解されたい。当業者には、本明細書
に含まれている記載及び開示から、本発明の範囲内の種
々の変更及び修正が明らかになるであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 999999999 パーデユー・リサーチ・フアウンデイシヨンアメリカ合衆国、インデイアナ・47907 ―1650、ウエスト・ラフアイエツト、エンジニアリング・アドミニストレーシヨン・ビルデイング・1650、オフイス・オブ・テクノロジー・トランスフアー、ルーム・328 (72)発明者ジエルビン，スタントン・ビイアメリカ合衆国、インデイアナ・47906、ウエスト・ラフアイエツト、ムーアズ・ベイ・ロード・5251 (72)発明者ホウプトマン，ランドルアメリカ合衆国、イリノイ・60504、オーロラ、ブルツク・レーン・2480 (72)発明者ニイ，ミンアメリカ合衆国、カリフオルニア・ 94710、オールバニー、エイス・ストリート・1114、ナンバー・21・エフ (72)発明者クイ，デカイ中華人民共和国、シヤンドン・271018、タイアン・シテイ、ダイゾン・アベニユー・86 (56)参考文献ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ，Ｖｏｌ．１，Ｐ．925−936（1989) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．84，Ｐ．5745− 5749（1987) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 A01H 5/00 C12N 5/10 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】植物中で遺伝子を発現するためのキメラ調
節領域であって、 Agrobacterium tumefaciensのマンノピン合成遺伝子に
由来するプロモーターと作動可能に連結された、Agroba
cterium tumefaciensのオクトピン合成遺伝子に由来す
る少なくとも３つの上流活性化配列を含む、前記キメラ
調節領域。
【請求項２】植物中で遺伝子を発現するためのキメラ調
節領域であって、オクトピン合成遺伝子かまたはマンノピン合成遺伝子か
ら選択される、Agrobacterium tumefaciensのオパイン
合成遺伝子に由来するプロモーターと作動可能に連結さ
れた、オクトピン合成遺伝子かまたはマンノピン合成遺
伝子から選択される、Agrobacterium tumefaciensのオ
パイン合成遺伝子に由来する、少なくとも２つの上流活
性化配列であって、該上流活性化配列のうち少なくとも
一つが該プロモーターのオパイン合成遺伝子と異なる遺
伝子に由来するものを含む、前記キメラ調節領域。
【請求項３】外来遺伝子の誘発性発現のためのカセット
であって、ヌクレオチド位置−138までを欠失するAgrobacterium
tumefaciensのマンノピン合成遺伝子に由来するプロモ
ーターと、Agrobacterium tumefaciensのオクトピン合
成遺伝子に由来する少なくとも２つの上流活性化配列と
を含む調節領域と作動可能に連結された該外来遺伝子を
含む、前記カセット。
【請求項４】植物中で遺伝子を発現させる方法であっ
て、該遺伝子を、Agrobacterium tumefaciensのマンノピン
合成遺伝子に由来するプロモーターと作動可能に連結さ
れた、Agrobacterium tumefaciensのオクトピン合成遺
伝子に由来する少なくとも３つの上流活性化配列を含む
キメラ調節領域に連結し、該遺伝子と該キメラ調節領域を植物に挿入し、該植物中で該遺伝子を発現する段階を含む、前記方法。
【請求項５】植物中で遺伝子を発現する方法であって、オクトピン合成遺伝子かまたはマンノピン合成遺伝子か
ら選択される、Agrobacterium tumefaciensのオパイン
合成遺伝子に由来するプロモーターと作動可能に連結さ
れた、オクトピン合成遺伝子かまたはマンノピン合成遺
伝子から選択されるAgrobacterium tumefaciensのオパ
イン合成遺伝子に由来する、少なくとも２つの上流活性
化配列であって、該上流活性化配列のうち少なくとも一
つが該プロモーターのオパイン合成遺伝子と異なる遺伝
子に由来するものを含む、キメラ調節領域に該遺伝子に
連結し、該遺伝子と該キメラ調節領域を植物中に挿入し、該遺伝子を植物中で発現する段階を含む、前記方法。