ES2227906T3 - Promotores de plantas constitutivos. - Google Patents
Promotores de plantas constitutivos.Info
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Abstract
Un promotor quimérico de plantas, en el que dicho promotor comprende un promotor mínimo y elementos activadores de la transcripción de un juego de promotores en el que un elemento activador de la transcripción de dicho juego de promotores proviene de un promotor que es específicamente activo en partes verdes de la planta y un elemento activador de la transcripción de dicho juego de promotores proviene de un promotor que es específicamente activo en partes subterráneas de la planta.
Description
Promotores de plantas constitutivos.
La invención se refiere a nuevos promotores de
plantas, más específicamente a aquellos promotores que se pueden
producir juntando partes de promotores que tienen una especificidad
complementaria.
La ingeniería genética de plantas ha sido posible
en virtud de dos descubrimientos: primero de todo la posibilidad de
transformación de la célula de la planta con material genético
heterólogo (que se realiza de la forma más eficaz mediante la
bacteria Agrobacterium tumefaciens o cepas relacionadas) y
en segundo lugar por la existencia de promotores de plantas que son
capaces de dirigir la expresión de dicho material genético
heterólogo.
Un promotor típico de plantas consiste en
elementos específicos. Una porción básica está formada por el
elemento promotor mínimo, que permite la iniciación de la
transcripción, acompañado a menudo por una secuencia, denominada
también caja TATA, que sirve como lugar de unión de los factores de
iniciación de la transcripción. En la mayor parte de los promotores,
la presencia de esta caja TATA es importante para una adecuada
iniciación de la transcripción. Está localizada típicamente de 35 a
25 pares de bases (pb) aguas arriba con respecto al sitio de
iniciación de la transcripción. Otra parte del promotor consiste en
elementos que son capaces de interaccionar con proteínas de unión
al DNA. Son conocidos los elementos de unión a cajas G que están
basados en un motivo hexanucleotídico CACGTG. Se ha demostrado que
estos elementos son capaces de interaccionar con proteínas bZIP de
unión al DNA que se unen como dímeros (Johnson y McKnight, Ann.
Rev. Biochem., 58, 799-839, 1989). Se han
descrito otros motivos relacionados con cajas G, tales como los
motivos Iwt y PA (WO 94/12015).
Se ha demostrado que estos motivos están
implicados en la expresión en plantas desde promotores específicos
de tejido. Por ejemplo, la presencia de tetrámeros Iwt confiere
expresión específica del estado embrionario, mientras que los
tetrámeros PA confieren un alto nivel de expresión en las raíces,
bajo nivel de expresión en las hojas y nada de expresión en las
semillas.
De forma parecida, están descritos sitios de
unión similares al de GT-1 (agrupados en base a una
secuencia de moderado consenso GGT^{A}/_{T}A). Tal sitio de
unión se encuentra aguas arriba lejos de la región del promotor de
la plastocianina de Arabidopsis y parece estar implicado en
la activación de la transcripción durante los períodos de luz
(Fisscher, U. et al., Plant Mol. Biol. 26,
873-886, 1994).
Otro fenómeno relacionado con las secuencias que
se encuentra a menudo en promotores de plantas es la presencia de
secuencias que permiten la formación de Z-DNA. El
Z-DNA es DNA plegado en una hélice a izquierdas que
está causado por repeticiones de dinucleótidos GC o AC. Se cree que
el plegamiento en la forma Z influye sobre la disponibilidad del
DNA para que se le aproximen moléculas de RNA polimerasa,
inhibiendo así la tasa de transcrip-
ción.
ción.
Una de las invenciones más tempranas e
importantes en el campo de la expresión de proteínas de plantas es
el uso de promotores de virus (de plantas) y derivados de
Agrobacterium que proporcionan una expresión potente y
constitutiva de genes heterólogos en plantas transgénicas. Se han
utilizado varios de estos promotores de forma intensiva en la
investigación sobre la genética de plantas y son todavía los
promotores de elección para estudios de expresión rápidos,
sencillos y de bajo riesgo. Los más famosos son los promotores 35S
y 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), al que se le
encontró utilización práctica en 1984
(EP-0.131.623), los promotores que se pueden
encontrar en el
T-DNA de Agrobacterium, como los promotores de la nopalina sintasa (nos), manopina sintasa (mas) y octopina sintasa (ocs) (EP-0.122.791, EP-0.126.546, EP-0.145.338). Un promotor derivado de plantas con características similares es el promotor de la ubiquitina (EP-0.342.926).
T-DNA de Agrobacterium, como los promotores de la nopalina sintasa (nos), manopina sintasa (mas) y octopina sintasa (ocs) (EP-0.122.791, EP-0.126.546, EP-0.145.338). Un promotor derivado de plantas con características similares es el promotor de la ubiquitina (EP-0.342.926).
Con el tiempo, se han hecho varios intentos para
incrementar el nivel de expresión de estos promotores. Ejemplos de
esto son el promotor 35S doblemente intensificado
(US-5.164.316) y, más recientemente, el
superpromotor, que incorpora partes de los promotores de
Agrobacterium (EP-729.514).
Sin embargo, en muchos casos estos promotores no
cumplen los criterios de un promotor ideal. Todos los promotores
descritos anteriormente muestran un claro patrón de expresión
específica de órgano o del estadio de desarrollo, y frecuentemente
el patrón de expresión hallado con estos promotores no es ideal
para algunas aplicaciones. Especialmente para las aplicaciones
biotecnológicas como la ingeniería de resistencia a hongos e
insectos, que requieren la expresión tanto en la ubicación correcta
así como en la fase correcta del desarrollo de plantas, hay una
necesidad de nuevos promotores constitutivos que sean capaces de dar
un alto nivel de expresión del transgén exactamente en el momento y
lugar correctos.
La invención proporciona nuevos promotores de
plantas, caracterizados porque comprenden 1) un promotor mínimo y
2) elementos activadores de la transcripción de un juego de
promotores, elementos que dirigen un patrón y un nivel de
transcripción complementarios en una planta.
Más específicamente, este promotor de plantas es
un promotor constitutivo en el que cada uno de los elementos
activadores de la transcripción no exhibe una especificidad de
tejido absoluta, pero media en la activación transcripcional en la
mayoría de las partes de la planta a un nivel \geq1% del nivel
alcanzado en la parte de la planta en la que la transcripción es más
activa. Un ejemplo de tales pares de promotores es un juego de
promotores en el que uno es más activo en las partes verdes de la
planta, mientras que el otro promotor es más activo en las partes
subterráneas de la planta. Más específicamente, el nuevo promotor
es una combinación del promotor de la ferredoxina y el de RolD.
Preferiblemente en esta construcción el elemento promotor mínimo
deriva del promotor de la ferredoxina y el promotor de la
ferredoxina deriva de Arabidopsis thaliana. El promotor de
rolD deriva de Agrobacterium rhizogenes.
También es parte de la invención un promotor de
plantas que es una combinación del promotor de la plastocianina y
de la
S-adenosil-metionina-1,
en donde preferiblemente el elemento promotor mínimo deriva del
promotor de la
S-adenosil-metionina-1
y tanto el promotor de la plastocianina como el de la
S-adenosil-metionina-1
derivan de Arabidopsis thaliana.
Además son parte de la invención construcciones
génicas quiméricas para la expresión de genes en plantas que
comprenden los promotores anteriormente descritos.
Figura 1: Representación esquemática de pMOG410 y
pMOG1059
Figura 2: Distribución de la expresión de GUS en
líneas de patata transformadas con las construcciones pMOG1059 y
pMOG410. La tinción de GUS se juzgó visualmente y se establecieron
clases de expresión, relativas a la expresión más elevada de GUS
medida en el laboratorio de los autores (fijada en 4). Un valor de
cero indica ausencia de expresión visible.
Figura 3: Representación gráfica de la expresión
media de la enzima GUS en transformantes primarios de tomate, colza
y patata. La expresión de GUS se determinó visualmente y se comparó
con una planta de tabaco transgénica con 35S-GUS
que mostraba un alto nivel de expresión a la que se le asignó un
valor de 4. La desviación típica de los valores medidos se indica
sobre cada una de las barras.
Figura 4: Representación gráfica de la
distribución de plantas de patata con diversos niveles de expresión
de GUS que contienen construcciones
SAM-1-GUS,
Pc-35S-GUS y
PcSAM1-GUS. Se valoró la expresión en mesófilo de
hojas, sistema vascular de hojas, tallo y raíz.
Para el propósito de esta memoria descriptiva son
válidas las siguientes definiciones:
Un promotor consiste en un sitio de unión
a la RNA polimerasa sobre el DNA, que forma un sitio funcional de
comienzo de iniciación de la transcripción. Un promotor consiste
habitualmente en al menos una caja TATA y posiblemente otras
secuencias rodeando el sitio de iniciación de la transcripción
(iniciador) y que pueden utilizarse o aisladas (promotor mínimo) o
unidas a sitios de unión de elementos activadores de la
transcripción, silenciadores o intensificadores que pueden
intensificar o reducir las tasas de iniciación de la transcripción,
y que pueden funcionar en relación con el estadio de desarrollo, o
con estímulos externos o internos.
El sitio de iniciación es la posición que
rodea al primer nucleótido que es parte de la secuencia transcrita,
lo que se define también como la posición +1. Todas las demás
secuencias del gen y sus regiones de control se numeran con
respecto a este sitio. Las secuencias situadas aguas abajo (es decir
las secuencias adicionales codificantes de la proteína en la
dirección 3') se denominan positivas, mientras que las secuencias
situadas aguas arriba (la mayor parte de las regiones de control en
la dirección 5') se denominan negativas.
Un promotor mínimo es un promotor que
consiste sólo en todos los elementos basales necesarios para la
iniciación de la transcripción, tales como una caja TATA y/o un
iniciador.
Una secuencia intensificadora es un
elemento de DNA que, cuando está presente en la proximidad de un
promotor, es capaz de incrementar la tasa de iniciación de la
transcripción.
Un promotor es constitutivo cuando es
capaz de expresar el gen que controla en todos o casi todos los
tejidos de la planta durante todos o casi todos los estadios del
desarrollo de la planta.
La expresión específica es la expresión de
productos de genes que se limita a uno o a unos pocos tejidos de la
planta (limitación espacial) y/o a uno o a unos pocos estadios del
desarrollo de la planta (limitación temporal). Se sabe que apenas
existe una especificidad verdadera: los promotores parecen
activarse preferiblemente en algunos tejidos, mientras que en otros
tejidos puede no haber ninguna o haber solamente poca actividad.
Este fenómeno se conoce como expresión de goteo. Sin
embargo, con expresión específica en esta invención se alude a la
expresión preferible en uno o unos pocos tejidos de la planta.
El patrón de expresión de un promotor (con
o sin secuencia intensificadora) es el patrón de los niveles de
expresión que muestra en qué lugar de la planta y en qué estadio
del desarrollo se inicia la transcripción mediante ese
promotor.
Se dice que los patrones de expresión de un juego
de promotores son complementarios cuando el patrón de expresión de
un promotor muestra poco solapamiento con el patrón de expresión
del otro promotor.
El nivel de expresión de un promotor se puede
determinar midiendo la concentración en el "estadio
estacionario" de un mRNA indicador patrón transcrito. Esta
medida es indirecta, puesto que la concentración del mRNA indicador
es dependiente no sólo de su velocidad de síntesis, sino también de
la velocidad con la que se degrada el mRNA. Por ello el nivel del
estado estacionario es el producto de las velocidades de síntesis y
de degradación. Se puede considerar, sin embargo, que la velocidad
de degradación se produce con un valor fijo cuando las secuencias
transcritas son idénticas, y así este valor puede servir como una
medida de las velocidades de síntesis. Cuando se comparan los
promotores de esta manera son técnicas disponibles para los
expertos en la técnica el análisis por hibridación con utilización
de RNasa S1, las transferencias tipo Northern y la PCR en tiempo
real (RT-PCR) competitiva. Esta lista de técnicas
no representa en modo alguno todas las técnicas disponibles, sino
que más bien describe procedimientos utilizados habitualmente para
analizar la actividad transcripcional y los niveles de expresión de
mRNA.
Una de las dificultades técnicas que se
encuentran en tal análisis es que los resultados cuantitativamente
mejores sólo se pueden obtener fusionando partes activadoras de la
transcripción con la molécula del RNA indicador, de tal manera que
sólo se transcriban las secuencias del indicador. Esto requiere la
determinación exacta del inicio de la síntesis del RNA, y unir en
ese punto las secuencias del mRNA indicador.
Esto es importante por un número de razones.
Primero, el análisis de los puntos de inicio de la transcripción en
prácticamente todos los promotores ha revelado que habitualmente no
hay una única base en la que comience la transcripción, sino más
bien un juego de sitios de iniciación más o menos agrupados, cada
uno de los cuales corresponde a algunos puntos de inicio del mRNA.
Puesto que esta distribución varía de promotor a promotor, las
secuencias del mRNA indicador de cada una de las poblaciones
diferirían unas de otras. Puesto que cada especie de mRNA es más o
menos proclive a la degradación, no se pueden esperar una única
velocidad de degradación para diferentes mRNA indicadores. En
segundo lugar, se ha demostrado en diversas secuencias promotoras
eucarióticas que la secuencia que rodea el sitio de iniciación
("iniciador") juega un papel importante en la determinación del
nivel de expresión del RNA dirigida por ese promotor específico.
Esto incluye también parte de las secuencias transcritas. La fusión
directa del promotor con las secuencias del indicador conduciría
por ello a niveles de transcripción mucho más subóptimos.
Dejar estas secuencias transcritas permite
determinar las velocidades de transcripción pero, potencialmente,
altera la estabilidad del mRNA indicador e influye sobre las
velocidades de iniciación de la traducción de un posible marco
abierto de lectura.
El papel de este análisis, sin embargo, es la
determinación del nivel relativo de expresión constitutiva de una
proteína heteróloga, puesto que es la aplicación más frecuente
utilizada en biotecnología. Por ello, el parámetro más importante
es la capacidad de las secuencias analizadas para dirigir un alto
nivel de expresión de una proteína indicadora heteróloga.
Esto implicaría acoplar las secuencias
codificantes de una proteína indicadora a la parte activadora de la
transcripción, el promotor y la secuencia no traducida de 5' del
gen en el que se están analizando sus propiedades. De esta manera,
un complejo juego de efectos (que combinan velocidades de
transcripción, estabilidad del mRNA (y con ello las velocidades de
degradación del mRNA) y las velocidades de iniciación de la
traducción) se reduce hasta un valor que es un valor muy útil para
determinar la utilidad de los elementos génicos analizados para
aplicaciones biotecnológicas.
No hay ninguna palabra o frase actuales para
describir este valor. En el transcurso de esta solicitud se
utilizan junto con el término "valor de la expresión"
los términos "nivel de expresión" y "actividad
transcripcional". Los autores son conscientes de que esto puede
causar alguna confusión. En todos los casos se indica con estos y
otros términos relacionados el valor recién mencionado. Un
procedimiento utilizado habitualmente para analizar patrones y
niveles de expresión es entonces a través de la determinación del
nivel en el "estado estacionario" de la acumulación de
proteína en una célula. Candidatos utilizados habitualmente como gen
indicador, conocidos por los expertos en la técnica, son la
\beta-glucuronidasa (GUS), cloramfenicol
acetiltransferasa (CAT) y proteínas con propiedades fluorescentes,
tales como la proteína fluorescente verde (GFP) de Aequora
victoria. En principio, sin embargo, son adecuadas para este
propósito muchas más proteínas, siempre y cuando la proteína no
interfiera con funciones esenciales de la planta. Para la
cuantificación y la determinación de la ubicación son adecuadas
numerosas herramientas. Se pueden crear fácilmente o están
disponibles sistemas de detección que están basados en, por
ejemplo, la detección y cuantificación inmunoquímicas, enzimáticas,
fluorescentes. Los niveles de proteína se pueden determinar en
extractos de tejidos de la planta o en tejidos intactos utilizando
análisis in situ de la expresión de la proteína.
Generalmente, los niveles de expresión del gen
indicador variarán entre las líneas individuales transformadas con
una construcción quimérica promotor-indicador.
También se observa frecuentemente el fenómeno de que tales
transformantes no expresen ningún producto detectable (RNA o
proteína). La variabilidad en la expresión se adscribe
habitualmente a "efectos posicionales" aunque los mecanismos
moleculares que subyacen bajo esta inactividad habitualmente no
están claros.
La expresión expresión media se utiliza
aquí como el nivel medio de expresión encontrado en todas las
líneas que expresan cantidades detectables de gen indicador,
dejando así fuera del análisis plantas que no expresan nada
detectable de mRNA o proteína del indicador.
El nivel de expresión en la raíz indica el
nivel de expresión hallado en extractos proteicos de raíces
completas de la planta. De manera parecida, los "niveles de
expresión en las hojas" o "en el tallo" se determinan
utilizando extractos completos de hojas y tallos. Se sabe, sin
embargo, que dentro de cada una de las partes de la planta recién
descritas, pueden existir células con funciones variables, en las
que puede variar la actividad del promotor.
En el caso de los promotores descritos en esta
solicitud, los niveles de expresión se miden en las partes grandes
de la planta. Sin embargo, análisis más detallados pueden
contribuir a la construcción de un promotor que es incluso "más
constitutivo", teniendo en cuenta que dentro de una parte de una
planta se tienen en cuenta más tipos celulares.
Como patrón para juzgar los niveles de expresión,
el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor es un patrón
conveniente y ampliamente extendido. El nivel medio de expresión de
este promotor se puede clasificar como medio alto.
La invención muestra que es posible combinar
elementos de un promotor que son responsables de una expresión
específica con elementos de otro promotor que son responsables de
un patrón de expresión complementario para formar un promotor que -
como resultado - muestra expresión en los tejidos y estadios del
desarrollo que forman parte del patrón de expresión de ambos
promotores. Si la complementación da como resultado actividad en
(casi) todas las células de la planta, tal complementación dará
lugar a un promotor constitutivo. Parece ser necesario, sin
embargo, que ambos promotores tengan un valor bajo de la expresión
en los tejidos y estadios del desarrollo que son específicos del
otro promotor. Se ha establecido que, para que sean adecuados, la
actividad transcripcional en las partes de la planta donde la
expresión es baja debería ser preferiblemente \geq1% del nivel de
transcripción que se alcanza en las partes de la planta donde la
actividad transcripcional es alta.
Esto limita la disponibilidad de promotores y
elementos de promotores a partir de los cuales construir un nuevo
promotor constitutivo. Un par adecuado de promotores que cumple los
criterios anteriormente mencionados es:
- el promotor de la ferredoxina en combinación
con el promotor rolD
- el promotor de la
S-adenosil-metionina en combinación
con el promotor de la plastocianina
También se pueden aplicar otros pares de
promotores que son complementarios y que muestran al menos alguna
expresión en los tejidos y estadios del desarrollo que son
específicos del otro promotor.
Aunque los elementos reguladores de la
transcripción, especialmente en eucariotas, pueden estar presentes
a grandes distancias del promotor/sitio de iniciación de la
transcripción, y ubicados tanto aguas abajo como aguas arriba con
respecto al sitio de iniciación, muchos genes de plantas tienen la
mayor parte de sus elementos reguladores en la zona situada
directamente aguas arriba con respecto al promotor. Para
identificar los principales elementos activadores de la
transcripción de los promotores es un procedimiento habitual unir
partes de las zonas no transcritas que se encuentran aguas arriba
(y aguas abajo) con respecto al promotor a un gen indicador, para
analizar la capacidad de cada uno de los elementos truncados de DNA
para dirigir la expresión de ese indicador. Para la caracterización
de más secuencias promotoras-proximales implicadas
en la regulación de la transcripción, lo más común es acoplar al
promotor fragmentos de las secuencias intensificadoras, que pueden
derivar del gen en el cual se estudia la regulación de la
transcripción. Alternativamente, se puede utilizar un promotor
heterólogo tal como las secuencias del promotor 35S de -46 a +4,
con respecto al inicio de la transcripción, que está acoplado de
forma funcional a un gen indicador como los descritos
anteriormente.
De esta manera es posible caracterizar los
elementos activadores de la transcripción de la mayoría de los
genes, un proceso que es bien conocido para los expertos en la
técnica.
Se ha analizado de esa manera un gran número de
elementos reguladores de la transcripción de genes, y a través de
las publicaciones científicas están disponibles directamente para
los expertos en la técnica datos relevantes de este análisis.
Los elementos activadores de la transcripción que
como media pueden dirigir la expresión a aproximadamente el nivel
medio del promotor 35S (al menos 50% de este nivel) en al menos
algunas de las partes de la planta, y que son capaces también de
dirigir al menos 0,5% (del nivel del 35S) de la transcripción en
otras partes de la planta se seleccionan entonces para su uso
adicional.
El elemento promotor mínimo deriva típicamente de
uno de los promotores del par de promotores, aunque no
necesariamente. Se puede considerar que tal elemento mínimo derive
de un tercer promotor o incluso se prepare sintéticamente.
Basándose en los resultados del análisis
anteriormente descritos, se seleccionan partes activadoras de la
transcripción con actividades complementarias. Es decir, por
ejemplo, un promotor con expresión por toda la planta, fragmentos
de DNA activadores de la transcripción que dirijan un alto nivel de
expresión en la raíz y con niveles de expresión más bajos en las
hojas y el tallo, se combinan con elementos que dirigen la
expresión principalmente en la hoja y el tallo, pero a menor nivel
en la raíz. Otras combinaciones de partes complementarias
activadoras de la transcripción son obvias.
Preferentemente, el nivel de expresión en las
partes donde la expresión es más baja no cae hasta por debajo del
1% del nivel obtenido en la parte más alta. Se prefiere más la
situación donde la relación entre la expresión más baja y la
expresión más elevada entre partes de la planta es mayor que 5%.
La forma más fácil de poder realizar este
acoplamiento es mediante técnicas conocidas de ingeniería genética.
El gen que ha de expresar mediante el nuevo promotor constitutivo
se puede clonar detrás del promotor. Es aconsejable construir en un
único sitio de clonación NcoI en la zona de enlazamiento de la
secuencia no transcrita de 5' unida al promotor para permitir la
unión precisa del marco abierto de lectura (ORF) y el extremo 3'
del promotor en el que se puede insertar el gen de interés.
Una de las combinaciones preferidas de la
presente invención en un promotor constitutivo de plantas que
comprende elementos tanto del promotor de la ferredoxina como del
promotor de rolD. Preferiblemente el promotor de la ferredoxina se
obtiene de Arabidopsis thaliana, donde dirige la expresión
del gen de la ferredoxina A, un gen que está implicado en la
fotosíntesis. Se ha informado sobre la expresión de este gen y la
capacidad de respuesta de su promotor a la luz (Vorst, O. et
al., Plant Mol. Biol. 14, 491-499, 1990; Vorst,
O. et al., The Plant J. 3(6), 793-803,
1993; Dickey, L.F. et al., The Plant Cell 6,
1171-1176, 1994). Dado que el gen de la ferredoxina
está implicado en la fotosíntesis, el promotor es más activo en el
tejido verde. Se demostró que los niveles de mRNA eran elevados en
órganos que contenían cloroplastos tales como tallo, hojas y
brácteas, pero también en los tejidos jóvenes en crecimiento, tales
como flores completas y plántulas. De forma interesante, hay una
expresión menor, pero significativa en las zonas de la planta
sostenidas por el suelo. La secuencia del promotor contiene una
región que contiene tanto una caja G como una caja I. También se
halla en la posición -182 una secuencia de DNA que induce el
plegamiento en forma Z.
Se ha informado de que el promotor de rolD tiene
una fuerte expresión en las raíces y se puede obtener de
Agrobacterium rhizogenes. Aunque el organismo de origen es
una bacteria, el promotor es muy adecuado para la expresión en
plantas porque la bacteria es un fitopatógeno que causa en las
plantas la enfermedad de la raíz pilosa. Con tal propósito se
transfiere DNA a la planta entre el cual el gen rolD es responsable
del alargamiento de la raíz. Para poder ser expresado en plantas
este gen necesitó un promotor fuerte funcional en plantas, el
promotor de rolD. Los estudios con GUS han demostrado que la
expresión bajo el control del promotor de rolD da lugar
principalmente a especificidad con respecto a la raíz (Leach, F. y
Aoyagi, K., Plant Sci. 79, 69-76, 1991). También,
se observó algo de expresión en las hojas.
Se puede obtener una combinación del promotor de
la ferredoxina y de rolD de dos maneras, dependiendo de qué
promotor se tomen el elemento promotor mínimo y las secuencias no
traducidas de 5'. En los ejemplos de los autores se ha utilizado el
elemento promotor mínimo del promotor de la ferredoxina, pero
obtenerlo como derivado del promotor de rolD es igualmente
perfectamente posible.
Se puede obtener otro promotor favorable a partir
de una combinación del promotor de la
S-adenosil-metionina sintetasa (SAM)
y partes específicas del promotor de la plastocianina.
Preferiblemente, ambos promotores se obtienen de Arabidopsis
thaliana.
El promotor SAM regula la expresión de la
S-adenosil-metionina sintetasa, que
es una enzima activa en la síntesis de poliaminas y etileno. Los
estudios del promotor mostraron una fuerte expresión en tejidos
vasculares, en el tejido de callos, esclerénquima y alguna
actividad en el córtex radicular (Peleman, J. et al., The
Plant Cell 1, 81-93, 1989) que se explicó que se
debía a la implicación de la enzima en la lignificación.
El promotor de la plastocianina, como el promotor
de la ferredoxina, es también un promotor que es activo en la ruta
fotosintética. Los niveles de mRNA son altos en las estructuras
verdes, que contienen cloroplastos, tales como hojas, hojas
caulinares, tallo y plántula completa. El promotor también es muy
activo en flores. Es detectable poca expresión en silicua, semilla y
raíz (Vorst, O. et al., The Plant J. 4(6),
933-945, 1993). Combinando estas especificidades es
posible crear un promotor quimérico que dirige una buena expresión
tanto en las zonas fotosintéticas de la hoja y el tallo, como en
las zonas no implicadas en la fotosíntesis, tales como las células
que forman y rodean el sistema vascular en hojas y tallos.
Los ejemplos dados anteriormente de pares de
promotores muestran en ambos casos la presencia de un promotor que
es activo durante la fotosíntesis. Se considera que otros
promotores que son reguladores de la expresión de un gen necesario
para la actividad fotosintética puedan ser adecuados para una
combinación o con el promotor de rolD o con otros promotores
preferentemente radiculares.
En la construcción de un promotor que dirija la
expresión por toda la planta: si uno de los componentes es un
promotor que es más o menos específico para las partes verdes, esto
automáticamente quiere decir que el otro promotor del par debería
expresarse predominantemente (pero no exclusivamente) en las raíces
y otros órganos no fotosintetizadores.
En la construcción de un promotor que dirija la
expresión en todas las partes de hojas y tallos, la combinación se
puede hacer utilizando un promotor que es más o menos específico
para las partes verdes y un promotor que dirige la expresión
principalmente en el sistema vascular.
Sin embargo, la invención no se limita a la
combinación de un promotor preferencialmente radicular y un promotor
preferencialmente de las partes verdes, y una combinación de
promotores preferencialmente de las partes verdes y
preferencialmente del sistema vascular. Se pueden utilizar todas las
combinaciones de promotores siempre y cuando los patrones de
expresión de los promotores individuales sean complementarios.
También es posible que los elementos de los que
está compuesto por ejemplo un nuevo promotor constitutivo deriven
de un juego de más de dos promotores. También debería existir
entonces la complementariedad anteriormente discutida.
Se aisló por digestión con HincII y NcoI un
fragmento de 512 pb del promotor de la ferredoxina de
Arabidopsis thaliana (O. Vorst et al., 1990, PMB 14,
491-499) que abarcaba de la posición -512 a la +4
(relativas al codón de iniciación ATG del marco abierto de lectura
de la ferredoxina). Este fragmento contiene la mayor parte de las
secuencias reguladoras de la transcripción del promotor de la
ferredoxina, las secuencias promotoras y la secuencia líder del
transcrito de la ferredoxina. Se introdujo un sitio XbaI, por
razones de clonación, en las posiciones -5 a -10 relativas al ATG
(O. Vorst et al., 1990, PMB 14, 491-499).
Esto cambia la secuencia original del clon en este punto de ACAAAA
a TCTAGA (SEQ ID NO: 1).
Parte de las secuencias situadas aguas arriba del
rolD de Agrobacterium rhizogenes (SEQ ID NO: 2) (Leach et
al., 1991, Plant Sci. 79, 69-76) se fusionaron
con las secuencias del promotor de la ferredoxina anteriormente
descritas. Se clonó un fragmento HindIII-RsaI, que
comprendía los nucleótidos -385 a -86 relativos al codón de
iniciación, junto al fragmento de la ferredoxina, uniendo los
sitios RsaI de éste con el sitio HincII de aquél. Este elemento
quimérico, que contenía el promotor y algunas de las secuencias
activadoras del gen de la ferredoxina, y secuencias activadoras
situadas aguas arriba del gen rolD, se utilizó en estudios
posteriores de acuerdo con sus propiedades estimuladoras de la
transcripción (SEQ ID NO: 3).
El promotor/activador quimérico
Fd-rolD se acopló al gen GUS, modificado por
ingeniería genética para contener un gen con un intrón (Jefferson
et al., (1987) EMBO J 6: 3901-3907). Se
utilizó el sitio de restricción NcoI del codón de iniciación ATG
para unir el promotor al marco abierto de lectura (ORF) del gen
GUS, acoplado al fragmento de 265 pb que contenía las secuencias de
3' sin traducir y de terminación de la transcripción del Inhibidor
de la Proteinasa II (Thornburg et al., 1987, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84, 744-748; An et
al., Plant Cell 1, 115-122).
El casete completo de expresión, que contenía el
promotor, el gen GUS y las secuencias de 3' del
PI-II, se extrajo para clonarlo utilizando BamHI y
EcoRI y se introdujo en el vector binario pMOG800 (depositado en el
Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Baarn, Países Bajos, como
CBS 414.93, el 12 de agosto de 1993) digerido con las mismas
enzimas. La construcción preparada a continuación (pMOG1059) se
utilizó en experimentos de transformación con diversas plantas.
Como control se utilizó una construcción del promotor 35S del CaMV
- GUS. Ésta es la construcción pMOG410. Una representación
esquemática de ambas construcciones se encuentra en la figura
1.
Primero, se prepararon transformantes de
Arabidopsis thaliana con ambas construcciones y se siguió en
el tiempo la expresión de GUS durante el procedimiento de
transformación.
Los niveles de expresión de GUS se determinaron
visualmente, en una escala de 0 a 5, donde 0 es la expresión no
detectable y 5 es el nivel más alto de GUS que han observado los
autores en hojas de una planta transgénica, de una rara planta del
tabaco, transgénica respecto a la construcción
35S-GUS (línea 96306). En todos los experimentos se
incluyeron como referencia interna muestras de hojas de esta
planta.
En la tabla 1 se indica la expresión relativa de
GUS en explantes de Arabidopsis thaliana, en diversos
momentos después del cocultivo con Agrobacterium tumefaciens
(DDC: días después del cocultivo)
| Construcción: | pMOG1059 | pMOG410 | |
| Tiempo de ensayo | |||
| DDC 0 | 2 | 3 | |
| DDC 2 | 3 | 3 | |
| DDC 5 | 3 | 3 | |
| DDC 7 | 4 | 3 | |
| DDC 9 | 4 | 3 | |
| DDC 12 | 4 | 3 |
\vskip1.000000\baselineskip
Como se puede ver a partir de esta comparación,
la expresión de GUS dirigida por el promotor quimérico comienza
ligeramente más tarde después del cocultivo pero, a partir del día
7 en adelante, excede el nivel de expresión obtenido con el
promotor 35S de referencia.
Se obtuvieron datos muy similares cuando se
valoró la expresión de GUS en explantes de Brassica napus. En
el día 5 después del cocultivo el promotor 35S es ligeramente más
elevado, pero la situación se revierte en el día 20 después del
cocultivo. También se obtuvieron datos similares para el tomate.
Aquí incluso en el estadio más temprano del análisis la expresión de
los transgénicos con pMOG1059 excedió la de los transgénicos con
pMOG410.
Cuando las plantas se dejan crecer más, las
diferencias entre estos promotores se vuelven incluso más claras.
Se analizó la expresión de GUS en muestras de hojas de plantas
regeneradas por completo. Se obtuvieron las medias de
11-48 plantas, dependiendo de la construcción.
En el caso de Arabidopsis thaliana que se
hizo crecer solamente in vitro, no se observó gran
diferencia entre la expresión de GUS en las plantas transgénicas
con pMOG1059 y con pMOG410.
| Construcción: | pMOG1059 | pMOG410 | |
| Cultivo: | |||
| Patata | 4,0 | 2,1 | |
| Brassica napus | 3,7 | 2,8 | |
| Arabidopsis | 4,0 | 4,1 | |
| Tomate | 2,2 | 2,1 |
Lo que está claro a partir de los datos
presentados en la figura 2 es que un número significativo de líneas
transgénicas con 35S-GUS (aproximadamente un 50% se
encontró repetidamente en los experimentos de los autores) no
expresan GUS a un nivel que sea visible. Así no sólo las
expresiones máxima y media son más altas en las plantas
transgénicas con Fd-rolD-GUS,
también la frecuencia con la que las plantas transgénicas expresan
GUS se intensifica con fuerza. En aproximadamente 50 plantas
transgénicas de patata que portaban la construcción
Fd-rolD-GUS, los autores no
encontraron ninguna que se expresara débilmente, lo que sugiere una
alta expresión repetitiva en al menos 98% de las líneas
obtenidas.
Las construcciones pMOG410
(35S-GUS) y pMOG1059
(Fd-rolD-GUS) se introdujeron
también en colza y tomate para una comparación adicional de la
eficacia del promotor. También se incluyen aquí los datos
correspondientes a patata.
Como se muestra en la Figura 3A, en el tomate el
nivel global de expresión del promotor Fd-rolD es
más elevado tanto en el último estadio del crecimiento in
vitro como en las hojas de las plantas de 4 y 7 semanas de edad.
Esto sigue siendo cierto en los tallos de 7 semanas, sin embargo,
en el caso de las raíces, se observa una expresión media más débil
con el promotor Fd-rolD que en el caso del promotor
35S.
También se obtuvieron resultados similares en
colza y patata, con la notable excepción de que en las raíces de
patata el nivel de expresión mediante el promotor
Fd-rolD excede el del promotor 35S. Como se muestra
en las figuras 3B y 3C la expresión media del promotor
Fd-rolD es más elevada y también la variación en la
expresión es significativamente más baja. En conclusión se puede
decir que se ha creado un promotor que resiste la comparación con el
promotor 35S fácilmente en tres cultivos importantes.
Para comprobar también las posibilidades de uso
del promotor Fd-rolD para otros propósitos, se ligó
el promotor al gen nptII, la expresión de cuyo correspondiente
producto del gen confiere resistencia en plantas al antibiótico
kanamicina. Este elemento se situó entre los extremos izquierdo y
derecho del T-DNA, permitiendo la transferencia a
plantas mediada por Agrobacterium tumefaciens. Como control,
se utilizaron construcciones similares en las que la expresión del
gen nptII estaba bajo el control del promotor nos.
La resistencia a la kanamicina se manifiesta en
las plantas transgénicas de patata por el desarrollo de callos
transgénicos y se dispara durante un procedimiento normalizado de
transformación, en el que se utiliza kanamicina en el medio del
cultivo.
Como media, para las construcciones con el casete
de selección nos-nptII, la frecuencia de
transformación en patata es 45%, para las construcciones con el
casete de selección Fd-rolD-nptII la
frecuencia es como media 61%. Aunque los autores no saben en este
momento lo relevante que es para esta construcción el incremento en
la frecuencia de transformación, ello indica que el promotor
Fd-rolD es al menos tan adecuado para dirigir un gen
heterólogo tal como nptII, como los promotores constitutivos
utilizados habitualmente tales como nos.
Del análisis de la expresión de GUS basado en 1)
análisis histoquímico y evaluación de un control interno y 2) de un
análisis cuantitativo de la actividad enzimática de GUS, los
autores han aprendido que ambos dan lugar a una figura cuantitativa
reproducible. Un análisis minucioso de ambas evaluaciones en hojas
y raíces de tomate y colza, lleva a la conclusión de que la escala
de 3, que es la más comparable a la del 35S, equivale a
aproximadamente 2000 pmol de MU/minuto.mg obtenidos en el análisis
cuantitativo. En la escala de 1 y 2, las medias son 1000 y 1500,
respectivamente, que marcan el valor del 50% del 35S.
Aproximadamente 1% de la expresión de ese nivel equivale a 100 pmol
MU/minuto.mg, que está frecuentemente por debajo del nivel de
detección de la detección histoquímica, aunque es detectable
algunas veces como una tinción azul muy tenue debida a la expresión
de GUS. Por ello se puede utilizar la tinción histoquímica como
marcador de la eficacia del promotor, midiendo el nivel de tinción
azul, y usando estos datos para seleccionar elementos del promotor
con utilidad.
Para la construcción del promotor SAM1 se aisló
DNA genómico (SEQ ID NO: 4) de hojas de Arabidopsis thaliana
Landsberg erecta utilizando un procedimiento de extracción con
CTAB. Los cebadores se diseñaron basándose en la secuencia
publicada del gen SAM1 de Arabidopsis thaliana K85 (Peleman
et al., (1989) Gene 84, 359-369). En una PCR
(30 ciclos de 45 segundos a 95ºC, 45 segundos a 50ºC y 1' a 72ºC;
el mismo programa se utilizó en todas las otras PCR descritas en
esta parte) se amplificó el elemento del promotor utilizando los
cebadores FR-Psam-143 5' AGA TTT GTA
TTG CAG CGA TTT CAT TTT AG 3' (SEQ ID NO: 5) y
FR-Psam-216 5' ATC TGG TCA CAG AGC
TTG TC 3' (SEQ ID NO: 6) dando lugar a un fragmento de
aproximadamente 550 pb. El fragmento de DNA se aisló de un gel de
agarosa y se clonó en el vector pGEM-T (Promega
Corp., Madison WI, EE.UU.). Este clon se utilizó como molde para
introducir el sitio NcoI junto al inicio de la traducción mediante
PCR utilizando los cebadores
FR-Psam-144 5' GTC TCC ATG GTG CTA
CAA AGA ATA G 3' (SEQ ID NO: 7) y
FR-Psam-143. El fragmento resultante
de 500 pb se clonó en el vector pGEM-T. Los sitios
EcoRI y HindIII localizados en la región del promotor se
eliminaron mediante PCR en dos etapas utilizando este clon como
molde. En esta PCR se introdujo un sitio BamHI aguas arriba con
respecto al promotor SAM1 y se introdujo un sitio HindIII en el
sitio 3' del promotor. En la primera etapa de PCR se generaron tres
fragmentos del promotor. El primer fragmento (1) contendrá el sitio
BamHI de 5' y el sitio EcoRI mutado utilizando los cebadores
FR-Psam-248 5' CGG GAT CCT GCA GCG
ATT TCA TTT TAG 3' (SEQ ID NO: 8) y
FR-Psam-249 5' ACA TGA ACG AAT GCA
AAA TCT C 3' (SEQ ID NO: 9). El fragmento intermedio (2) se obtiene
con los cebadores FR-Psam-250 5'
AGA TTT TGC ATT CGT TCA TGT G 3' (SEQ ID NO: 10) y
FR-Psam-251 5' TGT AAG CAT TTC TTA
GAT TCT C 3' (SEQ ID NO: 11). Este fragmento tiene un solapamiento
parcial con el fragmento 1 y 3 y tiene sitios mutados EcoRI y
HindIII. El tercer fragmento de PCR (3) contendrá el sitio interno
HindIII mutado e introduce un sitio HindIII en el extremo 3' del
promotor que contiene el sitio NcoI en el inicio de la traducción y
se genera utilizando los cebadores
FR-Psam-252 5' AAG AAA TGC TTA CAG
GAT ATG G 3' (SEQ ID NO: 12) y
FR-Psam-253 5' GAC AAG CTT GAT CCC
ATG GTG CTA CAA AGA ATA G 3' (SEQ ID NO: 13). En una segunda PCR se
mezclaron en un tubo los 3 fragmentos 1, 2 y 3 y se amplificaron
con los cebadores FR-Psam-248 y
FR-Psam-253. Debido al solapamiento
entre los fragmentos 1 y 2, y 2 y 3, esta PCR da lugar al promotor
mutado completo. Después de la digestión con BamHI y HindIII el
promotor SAM1 resultante se clonó en un vector pBSK+. El promotor
SAM1 se clonó luego en un vector que contenía el casete indicador
GUSintrón-TPI-II intercambiando la
región situada aguas arriba utilizando los sitios de restricción
BamHI y NcoI. Esto se hizo mediante la digestión del clon con SAM1
con BamHI y NcoI y el aislamiento del fragmento de promotor de un
gel de agarosa. El vector con GUS se digirió con las mismas enzimas
y luego se aisló el vector de un gel de agarosa, descartando así el
promotor que contenía aguas arriba las secuencias originales.
El casete indicador del promotor
SAM1-GUSintrón-TPI-II
se extrajo luego del vector cortándolo mediante digestión con BamHI
y EcoRI, después de lo cual se aisló el casete indicador de un gel
de agarosa y se clonó en el vector binario pMOG800 digerido con
BamHI y EcoRI. El vector binario resultante pMOG1402 se introdujo
en la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens para
transformar con él patatas.
Se obtuvo por PCR la secuencia intensificadora de
la plastocianina (Pc) de Arabidopsis thaliana
Col-0. Por ello se desarrollaron el cebador
FR-Pc-146 (5' agt ggt acc atc ata
ata ctc atc ctc ctt ca 3') (SEQ ID NO: 14) y el cebador
FR-Pc-247 (5' cga agc ttt aca aat
cta att tca tca cta aat cgg a 3') (SEQ ID NO: 15) introduciendo un
sitio de restricción KpnI aguas arriba con respecto a la secuencia
intensificadora y un sitio de restricción HindIII aguas abajo con
respecto a la secuencia intensificadora de la plastocianina. Se
llevó a cabo la PCR utilizando DNA-polimerasa Pfu
clonada (Stratagene) durante 30 ciclos de 1' a 95ºC, 1' a 50ºC, 4'
a 72ºC y 1 ciclo de 1' a 95ºC, 1' a 50ºC, 10' a 72ºC. El fragmento
de PCR resultante se ligó a un vector de clonación de alto número de
copias utilizando KpnI y HindIII, dando como resultado la
construcción pPM15.1.
Este clon se utilizó como molde para una PCR (30
ciclos de 1' a 95ºC, 1' a 50ºC y 2' a 72ºC) utilizando los cebadores
FR-Pc-145 5' GCT GCA ATA CAA ATC TAA
TTT CAT CAC TAA ATC GG 3' (SEQ ID NO: 16) y
FR-Pc-146 5' AGT GGT ACC ATC ATA ATA
CTC ATC CTC CTT C 3' (SEQ ID NO: 14). La PCR genera un fragmento de
aproximadamente 850 pb que incluye la secuencia intensificadora de
la Pc (SEQ ID NO: 17), que contiene un sitio Kpn I aguas
arriba y solapa con el lado 5' del promotor SAM1 (véase el Ejemplo
8). El fragmento de PCR se mezcló entonces con un fragmento de PCR
del promotor SAM1 generado con los cebadores
FR-Psam-143 y
FR-Psam-144 utilizando el clon pBKS+
que contenía el promotor SAM1 ajustado descrito en el ejemplo 8. En
una PCR en esta mezcla se generó el promotor quimérico PcSAM
utilizando los cebadores FR-Psam-144
y FR-Pc-146. El fragmento de
promotor resultante de aproximadamente 1,3 kb (SEQ ID NO: 18) se
aisló de un gel de agarosa después de la digestión con KpnI y NcoI
y luego se clonó en un vector de clonación de alto número de copias
(pUC28) digerido con las mismas enzimas. Entonces se extrajo de
este vector el fragmento de promotor cortándolo mediante la
digestión con BamHI y NcoI y se clonó delante del gen GUSintrón como
se describió anteriormente en el Ejemplo 8. Después se clonó el
casete indicador completo
Pc-SAM-GUS-TPI-II
en pMOG800 como se describió para el casete indicador
SAM1-GUS-TPI-II en
el Ejemplo 8. El vector binario resultante pMOG14000 se introdujo
en la cepa EHA105 de Agrobacterium tumefaciens para
transformar con él patatas.
\newpage
Se obtuvo por PCR la secuencia intensificadora de
la plastocianina (Pc) de Arabidopsis thaliana
Col-0 (véase anteriormente).
Este clon se utilizó como molde para una PCR (30
ciclos de 1' a 95ºC, 1' a 50ºC y 2' a 72ºC; todas las demás
reacciones de PCR descritas en esta parte se llevaron a cabo con el
mismo programa) utilizando los cebadores
FR-Pc-291 5' GTC TTG TAC AAA TCT
AAT TTC ATC ACT AAA TCG G 3' (SEQ ID NO: 19) Y
FR-Pc-146 5' AGT GGT ACC ATC ATA ATA
CTC ATC CTC CTT C 3' (SEQ ID NO: 14). La PCR genera un fragmento de
aproximadamente 850 pb que incluye la secuencia intensificadora de
la Pc, que contiene un sitio KpnI aguas arriba y solapa con el lado
5' del promotor 35S mínimo. El promotor 35S mínimo se obtuvo en una
PCR utilizando pMOG971 como molde (que contiene el promotor 35S y
una UTR de 5' en omega) y los cebadores
FR-35S-292 5' TTA GAT TTG TAC AAG
ACC CTT CCT CTA TAT AAG G 3' (SEQ ID NO: 20) Y 1s19 (SEQ ID NO:
21). El fragmento resultante tiene un solapamiento con la secuencia
intensificadora de la Pc y contiene un sitio NcoI interno en el
inicio de la traducción. Se mezclaron entonces los dos fragmentos de
PCR y se llevó a cabo una reacción de PCR utilizando los cebadores
FR-Pc-146 y 1s19. El fragmento
resultante se digirió entonces con KpnI y NcoI, se aisló de un gel
de agarosa y se clonó en pUC28 digerido con las mismas enzimas. A
continuación, se digirió el clon resultante con BamHI y NcoI, y se
aisló el fragmento de promotor (SEQ ID NO: 22) de un gel de agarosa
y se clonó aguas arriba respecto al gen GUS como se describió en el
Ejemplo 7. Entonces se introdujo el casete indicador completo en el
vector binario pMOG800 como se describió en el Ejemplo 7. El vector
binario resultante pMOG1401 se introdujo en la cepa EHA105 de
Agrobacterium tumefaciens para transformar con él
patatas.
Se hicieron crecer plantas transformadas, y se
analizó la expresión de GUS en muestras de hojas de plantas
completamente regeneradas. En la figura 4 se indica el análisis de
la expresión en mesófilo de hojas, sistema vascular de hojas,
tallos y raíces. Se observó un nivel muy bajo de tinción de GUS en
la parte del mesófilo de hojas de plantas transgénicas con SAM1
aunque la valoración indica un nivel de expresión de GUS de 0.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Formulario pasa a página
siguiente)
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Zeneca MOGEN
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Einsteinweg 97
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Leiden
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Países Bajos
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (CP): 2333 CB
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: (31) 71-5258282
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: (31) 71-5221471
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos promotores constitutivos de plantas
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 22
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE PARA EL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Salida del PatentIn 1.0, Versión 91.25 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS PREVIOS DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: EP 97203912.7
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 12-DIC-1997
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 520 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 300 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 840 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 477 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Arabidopsis thaliana
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGATTTGTAT TGCAGCGATT TCATTTTAG
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipATCTGGTCAC AGAGCTTGTC
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTCCATGG TGCTACAAAG AATAG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGATCCTG CAGCGATTTC ATTTTAG
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACATGAACGA ATGCAAAATC TC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGATTTTGCA TTCGTTCATG TG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TYPE: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTAAGCATT TCTTAGATTC TC
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAGAAATGCT TACAGGATAT GG
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACAAGCTTG ATCCCATGGT GCTACAAAGA ATAG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGTGGTACCA TCATAATACT CATCCTCCTT C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGAAGCTTTA CAAATCTAAT TTCATCACTA AATCGGA
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTGCAATAC AAATCTAATT TCATCACTAA ATCGG
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 876 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Arabidopsis thaliana
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1357 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCTTGTACA AATCTAATTT CATCACTAAA TCGG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTAGATTTGT ACAAGACCCT TCCTCTATAT AAGG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCCCAGTCA CGACGTTGT
\hfill19
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1006 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
Claims (15)
1. Un promotor quimérico de plantas, en el que
dicho promotor comprende un promotor mínimo y elementos activadores
de la transcripción de un juego de promotores en el que un elemento
activador de la transcripción de dicho juego de promotores proviene
de un promotor que es específicamente activo en partes verdes de la
planta y un elemento activador de la transcripción de dicho juego
de promotores proviene de un promotor que es específicamente activo
en partes subterráneas de la planta.
2. Un promotor quimérico de acuerdo con la
reivindicación 1, que es constitutivo y una combinación del promotor
de la ferrodoxina y el promotor de RolD.
3. Un promotor quimérico de plantas de la
reivindicación 2, en el que el elemento promotor mínimo deriva del
promotor de la ferredoxina.
4. Un promotor quimérico de plantas de acuerdo
con la reivindicación 2 ó 3, en el que el promotor de la
ferredoxina deriva de Arabidopsis thaliana.
5. Un promotor quimérico de plantas de acuerdo
con la reivindicación 4, que comprende las secuencias de SEQ ID NO:1
y SEQ ID NO:2.
6. Un promotor quimérico de acuerdo con la
reivindicación 5, que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3.
7. Un promotor quimérico constitutivo de plantas,
que es una combinación del promotor de la plastocianina y de la
S-adenosil-metionina-1
8. Un promotor quimérico de plantas de acuerdo
con la reivindicación 7, en el que el elemento promotor mínimo
deriva del promotor de la
S-adenosil-metionina-1.
9. Un promotor quimérico de plantas de acuerdo
con la reivindicación 7 u 8, en el que el promotor de la
plastocianina deriva de Arabidopsis thaliana.
10. Un promotor quimérico de plantas de acuerdo
con la reivindicación 7, 8 ó 9, en el que el promotor de la
S-adenosil-metionina-1 deriva de Arabidopsis thaliana.
S-adenosil-metionina-1 deriva de Arabidopsis thaliana.
11. Un promotor quimérico de plantas de acuerdo
con la reivindicación 10, que comprende las secuencias de SEQ ID NO:
4 y SEQ ID NO:17.
12. Un promotor quimérico de plantas de acuerdo
con la reivindicación 11, que comprende la secuencia de SEQ ID NO:
21.
13. Una construcción génica quimérica para la
expresión de genes en plantas que comprende el promotor quimérico de
plantas de cualquiera de las reivindicaciones
1-12.
14. Una planta que comprende un promotor
quimérico de plantas de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12 o una construcción de acuerdo con la
reivindicación 13.
15. Una planta de acuerdo con la reivindicación
14, que se selecciona del grupo que consiste en tomate; Brassica
napus y patata.
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|---|---|---|---|
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| EP97203912 | 1997-12-12 |
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