CN107354160B - 一种植物启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物启动子及其应用。本发明首先的CNUSMXY172启动子，为如下序列表中序列1所示的DNA分子。本发明提供的启动子可以驱动外源基因在植物中组成型表达。本发明还保护一种DNA分子，包括目的基因和位于目的基因上游启动其表达的CNUSMXY172启动子。本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：将所述DNA分子导入出发植物，得到组成型表达所述目的基因的转基因植物。本发明有助于促进人们对拟南芥发育生长的研究，且为植物的遗传改造提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

一种植物启动子及其应用

技术领域

本发明涉及一种植物启动子及其应用，具体涉及一种可以驱动基因在植物中(根、叶和花)组成型表达的启动子。

背景技术

拟南芥(Arabidopsis thaliana)是一种被广泛应用于植物学研究的模式生物，是第一个全基因组序列被测序完成的植物物种，具有生长周期短，易培养、繁殖种子多等特点，被广泛应用于植物遗传学、分子生物学、生物信息学、生理学和发育生物学等研究。

启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子是基因(gene)的一个组成部分启动子(Promoters)就像“开关”，决定基因的活动，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物启动子及其应用。

本发明首先提供了一种具有启动子功能的DNA分子(DNA分子甲)，获自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，命名为CNUSMXY172启动子，为如下1)或2)或3)：

1)序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有启动子功能的DNA分子。

上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，65℃下杂交后，用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

本发明还保护所述DNA分子甲作为启动子的应用。

本发明还保护所述DNA分子甲作为启动子在启动目的基因表达中的应用。所述目的基因具体可为GUS基因。

本发明还保护所述DNA分子甲作为启动子在启动目的基因在植物中组成型表达中的应用。所述目的基因具体可为GUS基因。所述植物为单子叶植物或双子叶植物，具体可为十字花科植物，更具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明还保护一种DNA分子(DNA分子乙)，包括目的基因和位于目的基因上游启动其表达的特异启动子；所述特异启动子为所述DNA分子甲。所述目的基因具体可为GUS基因。

含有所述DNA分子乙的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组表达载体具体可为在pBI 121载体的多克隆位点(例如HindIII和XbaI酶切位点之间)插入序列表的序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。

本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：将所述DNA分子乙导入出发植物，得到表达所述目的基因的转基因植物。所述目的基因具体可为GUS基因。所述DNA分子乙具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出发植物。所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，具体可为十字花科植物，更具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：将所述DNA分子乙导入出发植物，得到组成型表达所述目的基因的转基因植物。所述目的基因具体可为GUS基因。所述DNA分子乙具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出发植物。所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，具体可为十字花科植物，更具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明还保护一种在植物中表达目的基因的方法，是将所述DNA分子乙导入出发植物，从而在植物中表达目的基因。所述目的基因具体可为GUS基因。所述DNA分子乙具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出发植物。所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，具体可为十字花科植物，更具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明还保护一种在植物中表达目的基因的方法，是将所述DNA分子乙导入出发植物，从而在植物中组成型表达目的基因。所述目的基因具体可为GUS基因。所述DNA分子乙具体可通过以上任一所述重组表达载体导入所述出发植物。所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物，具体可为十字花科植物，更具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明提供的启动子可以驱动外源基因在植物中(根、叶和花)组成型表达。本发明有助于促进人们对拟南芥发育生长的研究，且为植物(特别是十字花科的蔬菜花卉)的遗传改造提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为重组质粒pBI121-CNUSMXY172-GUS的部分元件示意图。

图2为某一转基因植株GUS染色后的照片；A为全植株，B为花序，C为花器官，D为花粉，E为萌发的花粉。

图3为某一哥伦比亚生态型拟南芥植株GUS染色后的照片；A为全植株，B为花序，C为花器官，D为花粉，E为萌发的花粉。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

哥伦比亚生态型拟南芥(Columbia-0)：Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC),编号为CS6673。

pBI121载体：Clonetech公司。

培养基质：将草炭土和蛭石等体积混合。

经过大量序列分析、预实验和功能验证，从哥伦比亚生态型拟南芥中发现一个新的启动子，命名为CNUSMXY172启动子，如序列表的序列1所示。

实施例1、CNUSMXY172启动子的功能验证

一、构建重组质粒

1、取哥伦比亚生态型拟南芥的叶片，提取基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

F1：5’-CCCAAGCTTGATCAAGATGACTAATTTAAC-3’；

R1：5’-CTAGTCTAGATCTACATTAACAAAACAAATCTG-3’。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶HindIII和XbaI进行双酶切，回收酶切产物。

4、取pBI121载体，用限制性内切酶HindIII和XbaI进行双酶切，回收约13.9kb的载体骨架。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pBI121-CNUSMXY172-GUS。

根据测序结果，对重组质粒pBI121-CNUSMXY172-GUS进行结构描述如下：在pBI121载体的HindIII和XbaI酶切位点之间插入了序列表的序列1所示的DNA分子。

重组质粒pBI121-CNUSMXY172-GUS的部分元件示意图见图1。

二、转基因植株的获得

1、将重组质粒pBI121-CNUSMXY172-GUS导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。

2、取步骤1得到的重组农杆菌，采用蘸花法对哥伦比亚生态型拟南芥进行遗传转化，然后培养植株(T0代植株)，收获种子，即为T0代植株的种子。

3、将T0代植株的种子播种于含50mg/L卡那霉素的MS培养基平板上，可以萌发并正常生长的植株为30株。

4、步骤3的植株生长至4-6片叶子时，移栽到培养基质中培养45天(培养条件：24℃，16小时光照/8小时黑暗)。

5、完成步骤4后，分别取30株植株的叶片，提取基因组DNA，采用F1和R2组成的引物对进行PCR鉴定。

F1：5’-CCCAAGCTTGATCAAGATGACTAATTTAAC-3’；

R2：5’-cacgggttggggtttctacag-3’。

R2对应载体骨架上的GUS基因。

如果得到约3057bp的扩增产物，鉴定结果为阳性，该植株为转基因植株。

结果表明，步骤3中正常生长的30株植株均为转基因植株。

三、野生型拟南芥的培养

哥伦比亚拟南芥生长至4-6片叶子时，移栽到培养基质中培养45天(培养条件：24℃，16小时光照/8小时黑暗)。

四、GUS染色分析

待测植株为：步骤二的4中在培养基质上培养45天的转基因植株，步骤三中在培养基质上培养45天的哥伦比亚生态型拟南芥植株。

取待测植株全植株，进行GUS染色。

30株转基因植株的全植株(包括根、叶片和花)均为GUS染色阳性，显示为蓝色，其中某一植株的染色后照片见图2。20株哥伦比亚生态型拟南芥的全植株(包括根、叶片和花)均为GUS染色阴性，其中某一植株的染色后照片见图3。

结果表明，CNUSMXY172启动子确实可以作为组成型启动子驱动GUS基因在全植株(包括根、叶片和花)中表达。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都师范大学

<120> 一种植物启动子及其应用

<130> GNCYX171541

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2990

<212> DNA

<213> 拟南芥（Arabidopsis thaliana）

<400> 1

gatcaagatg actaatttaa ctaattacaa gctattttta aatttacaca gtttttgcaa 60

ttagttcaaa ctaattctct aaatttattc acattaaact atctcttagt tttatgatat 120

tgttaagatt tgtttcttga agttaagaaa gtttatcaaa taaattcaaa tatatatatt 180

tgattaatta tatattatat caacaagagg atttctggat ttgagataat atatcaagtc 240

ggtgtttatt tatttatatt aaatagtaaa tataattttg ttttcatata tgtgcacgta 300

cacaagaaca aatgtatgag tatgacatat tatagttgat agatcattta ttttttcaat 360

ttgttttcat gttttaattt atggtatgtt tacaaatttt aacaaagcat atgttaatcc 420

ccaaaagtta cagctgtatc tggtattgtg tttaaagata agtaaaaatg aactcggaac 480

atgatattta atgtaatata acgagaatag gaatgacgaa aaaggaacga catagaagga 540

gccaacacgg gataaaaaca tagcttttag attacaacaa gttacaattt aagcaaatta 600

acgtttgcaa tcaaatatgt aacatgtgtt ttcaatttat acagcataaa aatgctcaaa 660

ataataaatg ttattatagt atgctttata atagttaaaa tttaaaaata aacaaatgta 720

atttaatatt tatgaacaaa atattaaaca ataagaagaa agaagtcaat taattttgta 780

atatttttat tatatcatat catataaaaa tatacatgaa ttatatttgt gtttgtccca 840

aacaggatat agagaatttt tgcttccatc acgttctgtt tctaatcgga atacaaattt 900

tttctcatat tagaaatgca ttctcttatg agaaataaat tggagaacga gtaagatata 960

atggaacatg ataaaattga atgagaatta cgcctatctc taaatattta tatttctcgc 1020

aaacgtattt aatcatttta atggttttat atacggtttg atagtttaca agtttaataa 1080

aaatctacct gaccattaac tcgaatcagt ttgatctcgg ttcgaccgtt tgattgttat 1140

gaactttaaa atactactaa aatcattatt atttcaaata tttcaaccaa ctaatatagt 1200

ttaggttata tatatactat aactatataa ataattttta acatcaatct aacttatatt 1260

atattttaat ttaagatttt tttttctaat ttactcttca gtttcaaact ccaaaaatgg 1320

acttatggtt gctcttatgt cataaacaaa cataaataat attttatatt tttatgtgta 1380

cattataatt attcaataca gtatatatca ctaaaataac aaaataatta tatatttaat 1440

aaaaatttat tacaacacat ttcttaatat atgaagatgt actattattt gcaaatacaa 1500

aatatgttaa atagtgtttt agttaattag aaaataacaa aaattaaagt aatttttctc 1560

aaaataataa ttatttaaag attaattgct taattatttg aattttataa gaatttcctt 1620

ttaatgtgta ttatatatat gtatgaataa gactaattga aaaatctgta ataatctagt 1680

aaaatttgga caattattta aatggattag aatcacaaca tgacggtttc gttaataaca 1740

cgccaatata aatattttat taaaaaaact tctcaattaa tatatagaat atacatatat 1800

ttattattta caaatatttt tatatattga agctagaaaa taaaaaaatt atgaaattgt 1860

ttggtgcacc aataaagaaa atatttagtt tttttttttt tctaaactaa aacatttctt 1920

attatctatc taaatacgat tcaacaaata gtaaaaataa tatgcataat ataaatcatc 1980

aaacctaata aaaagtaata aatcttctat aaaatctcct attttctaaa aaactctcta 2040

caaaagaagt attaattttt tttttcgaag gattttatta gttataaaat aaatttaaca 2100

gaaagaggca caaataccaa taggagttgg aaaactaaaa caacgagtgg tgttgctctc 2160

tccatcttcc tcttcatctt cttctgttct ctctctataa atacaagttt actcttcctc 2220

ttcctcaaat ctctgactct tctctgcatt atctcttcga tctctccaac tctccaaaac 2280

cttcctcagg taaaagatcc aatcttcctt acaattccac taatctaggg ttttaaaatc 2340

ccagattcct gaatcaaaac ttctctgaga tccgaatttc gcaattctgt gtttttggct 2400

aatttacgcc tcgcaatttt gtgtttttcg ctaacttacg ccgaatccaa tgcatcctct 2460

gtcaaaactc tctaaatccc aaatcttttt acagaaattt atcacaaatt aggattccac 2520

agtgatttct agctttcgca tgagagatct tattgtgttt aacatatttc tttgcaattt 2580

tgtgtgtttt tggctaactt aagcgtcgca attttgtgtg ttttcactaa cttacaccga 2640

atccaatgca ttctctgtca aaactctcta aatcccaaat ctttttacag aaattaatca 2700

caaattagga ttctacagtg atttctagct tttgcatgag agatcttatt gtgtttaaca 2760

gatttgtttt gcaattttgt gtgtttttgg ctaacttacg cctcgcagtt ttgtgttttt 2820

cgctaactta cgccggaatc caatgcatca ataatcttac ctctgtcaaa actctctaaa 2880

tcccaaatct tttttataga aatttatcac aaattaggac tctacagtga tgtctagctt 2940

ttgcatgaga gatcttattg tttttaacag atttgttttg ttaatgtaga 2990

Claims (10)

1.一种DNA分子，为序列表中序列1所示的DNA分子。

2.权利要求1所述DNA分子作为启动子的应用。

3.权利要求1所述DNA分子作为启动子在启动目的基因表达中的应用。

4.权利要求1所述DNA分子作为启动子在启动目的基因在植物中组成型表达中的应用。

5.一种DNA分子，包括目的基因和位于目的基因上游启动其表达的特异启动子；所述特异启动子为权利要求1所述DNA分子。

6.含有权利要求5所述DNA分子的重组表达载体、转基因细胞系或重组菌。

7.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求5所述DNA分子导入出发植物，得到表达所述目的基因的转基因植物。

8.一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：将权利要求5所述DNA分子导入出发植物，得到组成型表达所述目的基因的转基因植物。

9.一种在植物中表达目的基因的方法，是将权利要求5所述DNA分子导入出发植物，从而在植物中表达目的基因。

10.一种在植物中表达目的基因的方法，是将权利要求5所述DNA分子导入出发植物，从而在植物中组成型表达目的基因。

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