CN112143716B - 硫醇还原酶类基因或其编码的蛋白在调控植物表皮毛性能方面的应用 - Google Patents

硫醇还原酶类基因或其编码的蛋白在调控植物表皮毛性能方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及纤维品质基因调控领域，具体而言，涉及硫醇还原酶类基因或其编码的蛋白在调控植物表皮毛性能方面的应用。本发明克隆了一个棉花硫醇还原酶编码基因，通过蛋白表达等生化研究手段证明其具有还原蛋白二硫键的生化功能；利用组成型35S启动子将其导入棉花中，过量表达了其转录本和蛋白，促进了棉纤维起始发育，并且纤维最终长度增加，说明其在棉纤维发育调控和棉花品质、产量改进中有重要作用，也说明了硫醇还原酶类具有调控植物表皮毛性能的作用，进而说明硫醇还原酶类与植物表皮毛性能的相关性。

Description

硫醇还原酶类基因或其编码的蛋白在调控植物表皮毛性能方 面的应用
技术领域
本发明涉及纤维品质基因调控领域，具体而言，涉及硫醇还原酶类基因或其编码的蛋白在调控植物表皮毛性能方面的应用。
背景技术
棉纤维是由受精胚珠的表皮细胞经特化、起始、伸长、加厚而成的种子表皮毛，不同于一般的韧皮纤维，它的主要组成物质是纤维素。纤维素是天然高分子化合物，化学结构式为(C6H10O5)n。正常成熟的棉纤维素含量约为94％。此外含有少量多缩戊糖、蜡质、蛋白质、脂肪、水溶性物质、灰分等伴生物。由于棉纤维具有许多优良经济性状，使之成为最主要的纺织工业原料。因此，棉纤维发育是棉花产业和科技发展中的重要问题，但对于调控纤维发育的关键基因和作用机制一直缺乏了解。
发现调控棉纤维发育的关键因子并建立起应用技术方案至关重要。有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明克隆了一个新的棉花硫醇还原酶编码基因，通过蛋白表达等生化研究手段证明其具有还原蛋白二硫键的生化功能；利用组成型35S启动子将其导入棉花中，过量表达了其转录本和蛋白，促进了棉纤维起始发育，并且纤维最终长度增加，说明其在棉纤维发育调控和棉花品质、产量改进中有重要作用，也说明了硫醇还原酶类具有调控植物表皮毛性能的作用，进而也说明了硫醇还原酶类与植物表皮毛性能的相关性。
本发明的第一方面提供了以下技术方案：
硫醇还原酶类基因或其编码的蛋白在调控植物表皮毛性能方面的应用。
进一步地，所述硫醇还原酶类基因包括棉花硫醇还原酶基因以及不同植物中含有的与棉花硫醇还原酶基因具有同源性的硫醇还原酶基因；
所述棉花硫醇还原酶基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
本发明利用棉花基因组和转录组数据库筛选纤维发育时期特异表达的基因，根据基因序列设计引物克隆目的基因(棉花硫醇还原酶基因)，利用qRT-PCR验证其转录表达情况，构建其原核蛋白表达载体，进行蛋白诱导表达、纯化和蛋白活性的检测验证，证明其具有还原蛋白二硫键的生化功能；同时构建其棉花转基因材料，分子检测转基因材料中目的基因表达情况，分析棉花中过量和组成性表达硫醇还原酶后纤维发育表型，证明了棉花硫醇还原酶促进了棉纤维起始发育，并且棉纤维最终长度增加，说明了棉花硫醇还原酶在棉纤维细胞发育中的重要作用。
棉纤维是单细胞组织，是棉花种子上的表皮毛，其发育分为纤维细胞起始、细胞伸长、细胞壁加厚和纤维成熟四个时期。其发育机理与拟南芥的表皮毛、根毛，以及其他植物如番茄、黄瓜等表皮毛发育具有一定的保守性。拟南芥表皮毛发育的机理研究相对比较深入，目前发现了一个MYB-bHLH-WD40多个因子组成的调控通路在拟南芥表皮毛发育中发挥重要作用，棉纤维发育的研究也初步揭示了此类似通路的重要性，一些相似的MYB类转录因子也显著影响棉纤维发育。因此，根据本发明的研究可知，在棉花中存在棉花硫醇还原酶基因影响棉纤维性能的情况下，可以推论得出：一方面，其他植物中也会存在硫醇还原酶类基因，这些植物除了棉花外，还包括拟南芥、苜蓿、玉米、花生、大豆、高粱、水稻、黄瓜、番茄等。也就是说，这些植物中存在硫醇还原酶类基因，通过硫醇还原酶类基因来影响自身的表皮毛性能，从而达到提高相应植物的产量或产品品质的作用。另一方面，这些植物也可以通过转入棉花硫醇还原酶基因或经过改造的棉花硫醇还原酶基因来影响这些植物的表皮毛性能。也就是，通过调控植物的表皮毛的功能来影响相应植物的组织性能。
本发明验证了通过控制硫醇还原酶类基因的过表达影响了植物表皮毛发育起始以及最终的性能。
比如，若是在棉花中，通过控制硫醇还原酶类基因的表达来影响棉纤维性能，影响棉纤维性能包括促进棉纤维起始发育和/或提高成熟的棉纤维长度。
进一步地，所述植物为棉花，通过控制所述棉花硫醇还原酶基因的过表达促进所述棉纤维的起始发育和/或增加棉纤维长度。
一般地，硫醇还原酶会涉及在硫代谢中影响半胱氨酸的合成，因此，本发明人推测本发明中的硫醇还原酶基因通过在硫代谢中影响半胱氨酸的合成而对表皮毛性能产生影响。
进一步地，所述应用包括在检测植物品种中的应用或在提高植物表皮毛品质育种中的应用。
硫醇还原酶类基因具有促进植物表皮毛起始发育和提升植物表皮毛性能的作用，因此，硫醇还原酶基因可以用于检测植物新品种，也可以用于提高植物表皮毛品质的育种中。
本发明的第二方面提供了一种棉花品种的检测方法，检测待测样品是否含有过表达的棉花硫醇还原酶基因或由过表达的棉花硫醇还原酶基因产生的产物；
若检测到，则判断待测样品具有优良棉纤维性能；
其中，所述棉花硫醇还原酶基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
由于过表达的棉花硫醇还原酶基因具有促进棉纤维起始发育和增加纤维长度的作用，而不同棉花品种中或者在育种中，若是想看一下是否含有过表达的棉花硫醇还原酶基因进而来判断其纤维性能，则需要通过检测待测样品中是否含有过表达的棉花硫醇还原酶基因。通过检测过表达的棉花硫醇还原酶基因来判断其纤维性能，方法简便易行。
进一步地，通过过表达棉花硫醇还原酶基因的元件设计的引物对或探针或芯片对待测样品进行检测。
进一步地，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
另外，检测由硫醇还原酶基因产生的产物可以通过多种手段进行，比如ELISA检测试剂盒等。
进一步地，所述待测样品包括适宜于有性繁殖、无性繁殖或可再生的细胞的组织培养的材料。
适宜于有性繁殖的材料，如选自花粉、子房、胚珠、胚囊等；
适宜于无性繁殖的材料如可以选自插枝、根、茎、原生质体等；
适宜于可再生的细胞的组织培养的材料如可以选自叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根、根端、花药、花、种子和茎等。
进一步地，所述待检测样本包括以下材料中的任一种：种子、叶、根、茎、胚根、胚芽。
本发明的第三方面提供了一种提高棉纤维性能的育种方法，将含有过表达的棉花硫醇还原酶基因的片段重组到棉花基因组中；
筛选得到含有过表达棉花硫醇还原酶基因元件的植株。
本发明中，将目的片段重组到棉花基因组中，该过程会涉及一些转化的手段，如常见的根癌农杆菌介导法、基因枪法、PEG法、激光微束穿刺法、显微注射法和花粉介导法等。这些方法按照本领域的技术步骤可完成。
筛选得到含有过表达棉花硫醇还原酶基因元件的植株，该处的植株既可以表示植物的繁殖材料，也可以为植株非繁殖用材料，即为基因转化后的植株自身的一部分材料，这些材料包括但不限于块茎、枝、根、原生质体、叶、胚、子叶、下胚轴、分生组织细胞、根端、花药、花、种子、花粉、子房、胚珠、胚囊。
筛选得到含有过表达棉花硫醇还原酶基因的植株可通过多种手段实现，如分子生物学手段，包括但不限于通过棉花硫醇还原酶基因的引物对或探针或芯片对待测样品进行检测。
如检测由过表达硫醇还原酶基因产生的产物，过表达载体上可设置一些表达可视的标记，如ELISA检测试剂盒可检测到的，或通过荧光在特定情况下显示来标记。
利用本发明的棉花硫醇还原酶基因辅助棉纤维优质性能育种，能够早期筛选目标棉花，节省时间，成本低廉。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括如下方面：
(1)本发明利用组成型35S启动子将棉花硫醇还原酶基因导入棉花中，过量表达了其转录本和蛋白，促进了棉纤维起始发育，并且棉纤维最终长度增加，说明其在棉纤维发育调控和棉花品质、产量改进中有重要作用。
(2)棉花硫醇还原酶基因可用于检测棉花品种以及提高棉纤维品质育种。
(3)本发明还提供了硫醇还原酶类基因或其编码的蛋白在调控植物表皮毛性能方面的应用，以提高其他植物的表皮毛性能；并有望在其他植物发现与棉花硫醇还原酶基因类似作用的基因。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为SDS-PAGE分析大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组GhOSH1蛋白电泳图；
图2为用来检测GhOSH1硫醇还原酶活性的电泳图；
图3为棉花硫醇还原酶蛋白的亚细胞定位结果图；
图4为超表达GhOSH1的转基因棉花植株的分子检测电泳图；
图5为9株阳性植株的5DPA胚珠中GhOSH1表达量检测柱形图；
图6为选取GhOSH1表达量上调最多、上调中等以及上调较少的GhOSH1-11、-6、-45三个株系5DPA胚珠蛋白的GhOSH1蛋白水平检测图；
图7为GhOSH1-11、-6、-45三个株系以及ZM24植株的-1、0、1DPA胚珠纤维起始阶段的扫描电镜图；
图8为GhOSH1-11、6、45三个株系与CK在10DPA和成熟时的纤维对照情况图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
1、棉花硫醇还原酶编码基因(GhOSH1)的克隆
GhOSH1 cDNA是以中棉所24(ZM24)棉花5DPA胚珠总cDNA为模板，以5′-CACCATGGGTTATCTTCAACAATTTATC-3′(sense)和5′-TCCCAAGTTTGCAATTTCACTAGC-3′(antisense)为引物PCR扩增获得765bp基因序列。利用gateway构建pENTR-GhOSH1入门克隆并进行测序验证。
2、GhOSH1蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化和酶活验证
利用Infusion技术和pColdTF表达载体，扩增GhOSH1特异PCR产物使其5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列(BamHI/ECORI双酶切线性化)，通过参照
Figure BDA0002710408530000071
Ultra One Step Cloning Kit(Vazyme,Cat.#115-02)无缝克隆方法获得pColdTF-GhOSH1重组质粒并包含有6×His-Tag标签。pColdTF-GhOSH1重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。转化细胞在含有50μg/ml氨苄霉素的Luria–Bertani(LB)培养基中活化、培养。当细胞密度在600nm光密度(OD600)达到0.4-0.6时，向LB培养基中添加终浓度为0.5mM的异丙基-1-硫-丙二醇-D-半乳糖苷(IPTG)。16℃培养过夜后4℃5000g离心10mins，沉淀细胞重悬在binding buffer(50mM Tris–HCl，150mM NaCl，pH 7.5)。超声波处理悬浮液，裂解物4℃12000g离心10mins。参考Ni SepharoseTM 6 Fast Flow(GEHealthcare；Cat.#11-0008-87)纯化方法，将上清液加在带镍的his结合柱上，收集穿柱液后分别用包含30mM、50mM以及100mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液。SDS-PAGE检测纯化效果，BCA测定试剂盒检测纯化蛋白含量。
结果如图1所示。
图1示出了大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组GhOSH1蛋白的SDS-PAGE图。Lane1表示IPTG诱导前pColdTF-GhOSH1转化细菌的细胞裂解物。Lane 2表示IPTG诱导下pColdTF-GhOSH1转化细菌的细胞裂解物。Lane 3表示IPTG诱导下pColdTF-GhOSH1转化细菌的细胞裂解物上清。Lane 4表示IPTG诱导下pColdTF-GhOSH1转化细菌的细胞裂解物沉淀。Lane 5显示了纯化的GhOSH1。Lane 6显示了纯化的pColdTF空载蛋白。Lane 7显示了使用GhOSH1抗体对纯化GhOSH1的Western blot分析。↑代表IPTG诱导下的GhOSH1蛋白。
3、酶活检测
在此基础上，我们又进一步测定了GhOSH1的硫醇还原酶活性，方法具体如下：用0.2％的SDS将人免疫球蛋白G(IgG)煮沸5mins使其变性。变性后的IgG用50mM NaCl、0.1％Triton X-10溶液稀释。纯化的GhOSH1添加到酸性缓冲液中(0.1％Triton X-100，100mMNaCl，50mM醋酸钠，25mM二硫代苏糖醇(DTT)pH 4.5)，37℃反应10mins，预激活GhOSH1。随后，吸取10μL变性稀释后的IgG与100μL GhOSH1纯化蛋白37℃温浴3h。同时，以10mM DTT处理的IgG为阳性对照，溶菌酶处理的IgG为阴性对照。最后，SDS-PAGE凝胶用来检测GhOSH1硫醇还原酶活性结果。结果图2所示。
图2A示出GhOSH1在体外表现出的硫醇还原酶活性情况。其中，M蛋白标记；Lane1代表变性后的人IgG蛋白；Lane 2表示阴性对照溶菌酶蛋白；lane 3表示GhOSH1纯化蛋白；Lane 4表示在pH＝7反应液中溶菌酶处理后的IgG；Lane 5表示在pH＝7反应液中GhOSH1纯化蛋白处理后的IgG；Lane 6代表在pH＝4.5反应液中溶菌酶处理后的IgG；Lane 7在pH＝4.5反应液中GhOSH1纯化蛋白处理后的IgG；Lane 8代表阳性对照10mM DTT与人IgG在pH＝7反应后的结果。图2B为图2A使用GhOSH1自身抗体Western blot结果。
4、GhOSH1蛋白亚细胞定位分析
载体pCAMBIA2300-GhOSH1:YFP的构建，GhOSH1CDS PCR产物用Kpn1/Asc1酶切位点克隆进入YFP(黄色荧光蛋白)基因上游，使之产生GhOSH1:YFP融合蛋白，然后转入GV3101农杆菌后通过Floral-dip方法得到35S:GhOSH1:YFP超表达转基因拟南芥。
以生长4Days的拟南芥阳性幼苗以及WT的根进行FM4-64染色后，用LSM 510激光共聚焦扫描显微观察GhOSH1:YFP(绿色)荧光信号和FM4-64(红色)荧光信号。为了确定GhOSH1:YFP细胞壁或者细胞膜的具体定位，幼苗根用0.4M NaCl处理20mins，发生质壁分离后进一步观察。
研究结果如图3所示，GhOSH1蛋白位于细胞膜与细胞核中。
实施例2
一、试验步骤
1、GhOSH1转基因棉花构建与转基因植株的表型分析和分子检测
利用pENTR-GhOSH1和Gateway LR反应，GhOSH1 cDNA片段克隆进入目的载体pGWB2(CaMV 35S启动子)。pGWB2-GhOSH1 Ti质粒转入根癌农杆菌菌株LBA4404，以7天的ZM24无菌棉花幼苗(暗处理5天光照2天)下胚轴为外植体进行浸染培育，从而获取超表达转基因棉花。
2、DNA提取和GhOSH1表达量检测
用植物基因组DNA提取试剂盒(百泰克，Cat#DP3112)提取所有组培获得的拟转基因以及ZM24棉花的嫩叶基因组DNA，以DNA为模板，引物如下：
CaMV 35S-F:5′-AACACGGGGGACTCTAGA-3′(sense)；
GhOSH1-R:5′TCCCAAGTTTGCAATTTCACT-3′(antisense)；
进行PCR扩增，凝胶检测有835bp片段的植株则进一步检测其表达量。
为确定GhOSH1在转基因和野生型棉花植株中的表达水平，于上午8:00-9:00采集转基因GhOSH1和野生型ZM24棉花5DPA胚珠，液氮浸泡后置于-80℃冰箱保存，或者立即研磨后按照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(Tiangen,Cat.#DP441)说明书从所有样本中分离出RNA。使用反转录酶(Invitrogen,Cat.#18080-093)对大约1μg总RNA进行了反转录得到cDNA。
qRT-PCR以GhUBQ7(DQ116441)为内参基因，引物如下：
5′-AGAGGTCGAGTCTTCGGACA-3′(sense)；
5′-GCTTGATCTTCTTGGGCTTG-3′(antisense)。
将-80℃保存的转基因与野生型棉花的5DPA胚珠取出在液氮中研磨成粉后加入蛋白提取液(150mM NaCl；1M Tris-HCl,pH＝7.5；0.1％NP40；0.1％TritonX-100)。充分混匀后冰上静置30mins，12000g，4℃高速离心10mins，取上清。GhOSH1多克隆抗体由上海友科公司制作。Western blotting实验按照之前的报道进行。
二、结果
1、转基因检测结果
获取转化超表达GhOSH1棉花植株共128株，提取所有拟转基因以及WT植株DNA，以CaMV35S 5′-AACACGGGGGACTCTAGA-3′(sense)和GhOSH15′-TCCCAAGTTTGCAATTTCACT-3′(antisense)为引物扩增检测DNA。共23株超表达转基因GhOSH1棉花植株出现条带，凝胶检测产物为835bp，如图4所示。
通过对其中9株植株的5DPA胚珠中GhOSH1表达量检测后发现，与阴性对照WT相比，所有转基因植株表达量均上调，其中GhOSH1-11、14、27达到极显著水平(图5)。
进一步选取GhOSH1表达量上调最多、上调中等以及上调较少的GhOSH1-11、6、45三个株系检测5DPA胚珠蛋白，以GhOSH1自身蛋白抗体来进行western blot检测后发现，与WT相比三个株系GhOSH1蛋白水平也上调(图6)，进一步证明我们所获取的三个株系属实为转基因GhOSH1超表达植株。
2、性能影响
通过对三个转基因株系以及ZM24(CK)植株的-1、0、1DPA胚珠纤维起始阶段进行扫描电镜观察，发现超表达GhOSH1转基因植株GhOSH1-11、-6、-45不同程度的促进棉纤维的起始(图7)，其中，GhOSH1-11、-6更显著地促进棉纤维的起始。
同样，10DPA纤维长度统计发现超表达GhOSH1后也不同程度的促进了纤维伸长(图8)。
对其成熟纤维的长度进行了检测，结果发现对照成熟纤维平均长度为23.7833mm，过表达材料GhOSH1-45、-6、-11的平均长度分别为26mm，26.7mm以及26.3833mm，长度增加了11％左右(图8)。
说明了超表达GhOSH1促进了棉纤维的起始以及棉纤维最终的长度。
其中，DPA为days post anthesis的缩写，含义为开花后天数。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 硫醇还原酶类基因或其编码的蛋白在调控植物表皮毛性能方面的应用
<130> 2020
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 768
<212> DNA
<213> Gossypium hirsutum
<400> 1
atgggttatc ttcaacaatt tatcttcttt attctggttg ctcagccatt catgtttatt 60
tctctaactc attcctcttt agctaatggt aaggttaata tattgcctcc taccaataca 120
agtgataagg tcactttggc cctgtactat gaaactttat gcccatattg tgccgacttt 180
atcacaaatg accttgtaaa ggtattcctc agcgatctgt ttaccattgt caatctaaag 240
ttagtccctt ggggcaatgc tgacattctt ggcgatgaac cccattgcca gcatggagaa 300
gatgaatgct acttaaatac catacatagc tgtgtcatct accactggcc tgatgtgaaa 360
aagcactttg atttcattcg ctgcacagag caacaaagct caaagaaacc gctggtcaag 420
aacagagcag caatgtggaa acaatgcagt gaaaagctgg gaatgagtgc tcacagaatc 480
aacaaatgct atacttctgg atatggactt aagcttctgc tacaatatgc taatgagact 540
gcaaagctaa agccacctca tgagtatgtg ccatgggtgg tggtggataa tcagccactc 600
aaagatgact ttgaaaattt tgtgaaatat gtctgtgaag cttataaagg tgacaataaa 660
ccagaagcat gcaaaacaca agtagccaat gtcagctcaa cccatgataa gatggcaaac 720
agaatacatc caggatgcta tgctagtgaa attgcaaact tgggatag 768
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
aacacggggg actctaga 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
tcccaagttt gcaatttcac t 21

Claims (9)

1.硫醇还原酶类基因或其编码的蛋白在调控植物表皮毛性能方面的应用；
所述硫醇还原酶类基因为棉花硫醇还原酶基因；
所述棉花硫醇还原酶基因如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
所述植物为棉花。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过控制所述棉花硫醇还原酶基因的过表达促进所述棉纤维的起始发育和增加棉纤维长度。
3.根据权利要求1-2任一项所述的应用，其特征在于，所述应用包括在检测植物品种中的应用或在提高植物表皮毛品质育种中的应用。
4.一种棉花品种的检测方法，其特征在于，检测待测样品是否含有过表达的棉花硫醇还原酶基因；
若检测到，则判断待测样品具有优良棉纤维性能；
其中，所述棉花硫醇还原酶基因如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的棉花品种的检测方法，其特征在于，通过过表达棉花硫醇还原酶基因的元件设计的引物对或探针或芯片对待测样品进行检测。
6.根据权利要求5所述的棉花品种的检测方法，其特征在于，所述引物对的核酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
7.根据权利要求4-6任一项所述的棉花品种的检测方法，其特征在于，所述待测样品包括适宜于有性繁殖、无性繁殖或可再生的细胞的组织培养的材料。
8.根据权利要求7所述的棉花品种的检测方法，其特征在于，所述待测样品包括以下材料中的任一种：种子、叶、根、茎、胚根、胚芽。
9.一种提高棉纤维性能的育种方法，其特征在于，将含有过表达的棉花硫醇还原酶基因的片段重组到棉花基因组中；
筛选得到含有过表达棉花硫醇还原酶基因元件的植株；
所述棉花硫醇还原酶基因如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
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