JPH09327293A

JPH09327293A - アブラナ科植物ａｆｔタンパク及びその使用

Info

Publication number: JPH09327293A
Application number: JP7180699A
Authority: JP
Inventors: Hong Zhang; チャンホン; Howard M Goodman; エム．グッドマンホワード
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1994-06-23
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 1997-12-22
Also published as: EP0693554A1; CA2152426A1; US5859346A; AU2036495A; NZ272266A; AU699431B2; US5623054A; ZA955225B

Abstract

(57)【要約】【構成】アブラナ科植物の転写活性化因子であるＡＦ
Ｔ１タンパク質をコードする精製されたＤＮＡ及び該Ｄ
ＮＡがコードするタンパク質が提供された。該タンパク
質また、病原体から植物を防御することに関わるタンパ
ク質と相互作用をすることによって、植物の防御機構に
も関与していることが判明した。【効果】本発明のＤＮＡ断片等を用いて、植物の遺伝
子発現の制御が可能となった。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は植物の核酸及びポリペプ
チドに関する。

【０００２】

【従来の技術】植物の遺伝子発現を操作する進歩的な方
法が、様々な工業的、農業的あるいは商業的な食物への
利用において望まれている。新たな多品種の植物を産生
するには、問題のある作物または植物を遺伝学的に構造
変化させる必要がある。好ましい遺伝子はその問題の作
物又は植物に取込ませ、一方、好ましくない遺伝子は削
除又は置換する必要がある。すなわち、それは、農業的
な需要にあった植物を遺伝学的に構築する必要があると
いうことである。従って、作物及び植物の遺伝学的技術
として、重要であり有用な遺伝子を同定する方法、また
は、改良が望まれる作物へ遺伝子を導入する方法が必要
とされている。

【０００３】本発明者らは、アブラナ科［アラビドプシ
スサリアナ(Arabidopsis thaliana)］植物より、新た
に植物の転写活性化因子を同定した。転写活性化として
の役割に加えて、さらに、我々はこの因子が、タンパク
質、例えば、病原体から植物を防御することに関与する
3-O-メチルトランスフェラーゼやアスコルビン酸過酸化
酵素と相互作用することにより、植物の防衛機構に役割
を果たすことをもまた明かにした。我々は、このタンパ
ク質が広く存在する14-3-3ファミリーと相同な配列であ
ったため、ＡＦＴ１（アラビドプシス 14-3-3 １）と名
付けた。

【０００４】ＡＦＴ１タンパク質は、例えば、転写活性
化因子又キメラ転写活性化因子として、植物の遺伝子発
現を上昇、制御、修飾又は変化させる方法や、又は、植
物細胞のシグナル伝達過程における反応、例えば、酵
母、線虫、昆虫、細菌そしてウイルスのような病原体に
対する植物の防御反応に関わるシグナル伝達反応を調節
する際に利用される。植物界において発見されている他
のＡＦＴ１タンパク質に対応する核酸配列のみならず、
植物のシグナル伝達経路、例えば、病原体に対する植物
の反応において働く経路においてＡＦＴ１と相互作用す
るタンパク質に対応する核酸配列もまた、遺伝子工学に
おける応用、特に、農業的生物工学に関する応用に非常
に重要である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、一般的には、
組換えＡＦＴ１ポリペプチドを提供することを特徴と
し、好ましくは、前記ＡＦＴ１ポリペプチドは、図１
（配列番号１）に示す核酸配列と実質的に同一な核酸配
列を含んでいる。本発明はまた、転写を活性化するドメ
イン、例えば、ＡＦＴ１（３４−２４８）又はＡＦＴ１
（１２２−２４８）を含むＡＦＴ１ポリペプチドの断片
又は類似体を含む組換えＡＦＴ１ポリペプチドを提供す
ることを特徴とする。転写活性化は、例えば、本明細書
に記載の方法に従い、解析することができる。

【０００６】種々の好適な態様において、前記ポリペプ
チドは、植物（例えば、単子葉植物または双子葉植
物）、好ましくは、アラビドプシスのようなアブラナ科
植物由来である。

【０００７】第二の観点においては、本発明は、ＤＮＡ
結合ポリペプチドと融合させたＡＦＴ１ポリペプチドを
含むキメラＡＦＴ１転写活性化タンパク質を特徴とす
る。好適な態様は、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、これに
限定されないが、Ｇａｌ４またはＬｅｘＡを含む。

【０００８】第三の観点においては、本発明は、ＡＦＴ
１タンパク質が、構成的な（例えば、３５ＳＣａＭＶ
プロモーター）、制御可能な、もしくは、誘導可能なプ
ロモーター（例えば、ｒｂｃＳプロモーター）と作用的
に連結することから構成されているトランス遺伝子を有
するトランスジェニック植物を特徴とする。他の関連し
た観点において、本発明はキメラ転写活性化タンパク質
を含むトランス遺伝子を有したトランスジェニック植物
を提供することを特徴とする。さらに、他の関連した観
点においては、本発明は、ＡＦＴ１タンパク質、その断
片又はその類似体もしくは、キメラ転写活性化タンパク
質を含むトランス遺伝子を有したトランスジェニック植
物由来の種子又は細胞を特徴とする。

【０００９】第四の観点においては、本発明は、所望の
ポリペプチドを発現するトランスジェニック植物を特徴
とする。ここで所望のポリペプチドは、（ａ）キメラＡ
ＦＴ１転写活性化タンパク質をコードする核酸配列、及
び（ｂ）発現可能な遺伝子構築物中に所望のポリペプチ
ドをコードする核酸配列であり、キメラタンパク質が結
合することにより、所望のポリペプチドの発現が調節さ
れる。好適な態様では、所望のポリペプチドが、これに
限定されないが、貯蔵タンパク質、例えば、ナピン、レ
グミン又はファセオリン，または、農業的に重要な他の
あらゆるタンパク質である。

【００１０】第五の観点においては、本発明は、ＡＦＴ
１タンパク質をコードする実質的に純粋なＤＮＡ（例え
ば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡ）を提供
することを特徴とする。従って、本発明は、図１（配列
番号１）に示す核酸配列と実質的に同一な核酸配列を有
するＤＮＡを提供することを特徴とする。関連した観点
においては、本発明は、図１に示されたＡＦＴ１ポリペ
プチド（配列番号２）と実質的に同一なアミノ酸配列を
含む組換えポリペプチドをコードする実質的に純粋なＤ
ＮＡを特徴とする。望ましくは、このようなＤＮＡが本
明細書の記載に従い、構成的な、制御可能な、もしく
は、誘導可能なプロモーターと作用可能に結合されてい
てもよい。好適な態様では、前記ＤＮＡ配列は、アブラ
ナ科植物（例えば、アラビドプシス）由来である。関連
する側面として、本発明は、実質的に純粋なＡＦＴ１Ｄ
ＮＡを含むベクター、細胞（例えば、植物細胞）、そし
て、トランスジェニック植物又はその種子を提供するこ
とを特徴とする。様々な好適な態様においては、細胞が
原核生物の細胞、例えば、大腸菌またはアグロバクテリ
ウム、または、さらに好ましくは、真核生物の細胞、例
えば、トランスジェニック植物の細胞由来の形質転換植
物細胞である。

【００１１】第六の観点においては、本発明は、植物の
防御機構に関与するタンパク質と相互作用することが可
能なドメインを含むＡＦＴ１ポリペプチド（配列番号
２）類似体である組換えポリペプチドをコードするＤＮ
Ａを特徴とする。好ましくは、ポリペプチドはＡＦＴ１
（３３−１９４アミノ酸残基）である。関連した側面に
おいては、本発明は、ＡＦＴ１ポリペプチドの断片又は
類似体をコードしている実質的に純粋なＤＮＡ、好まし
くは、図１に示されたＤＮＡ配列（配列番号１）と実質
的に同一なＤＮＡを提供することを特徴とする。他の観
点としては、ＤＮＡが、構成的、制御可能な、もしく
は、誘導可能なプロモーターと作用可能に連結されてい
る。

【００１２】「アブラナ科植物」（crucifer）は、例え
ば、「Gray's Manual of Botany、American Book C
ompany社、米国ニューヨーク州、1950年」「Hortus 第
3版、A Concise Dictionary of Plants Cultivate
d in the U.S.and Canada、Macmillan、1976年」ま
たは「Simmons,N.W.、Evolution of Crop Plant、19
86年」に通常記載されているアブラナ科中に分類されて
いるいずれの植物をも意味する。アブラナ科植物には、
ブロッコリー、キャベツ、芽キャベツ、菜種、ケール、
チャイニーズケール、カリフラワー、セイヨウワサビお
よびアラビドプシスを含む農業作物の多くが含まれる。

【００１３】「ＡＦＴ１」とは、転写活性化または植物
の防御に関与するポリペプチドとの相互作用に影響を与
えるアブラナ科植物のポリペプチドを意味する。このよ
うなＡＦＴ１ポリペプチドは、一般に、図１に示される
配列（配列番号２）を有している。

【００１４】「タンパク質」及び「ポリペプチド」と
は、アミノ酸の長さおよび転写後修飾（例えば、グリコ
シル化またはリン酸化）にかかわらず、いずれのアミノ
酸鎖をも意味する。

【００１５】「実質的に同一」とは、基準アミノ酸また
は核酸配列と少なくとも９０％、好適には９３％、さら
に好適には９５％、最も好適には９７％の相同性を示す
ポリペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドの場
合、比較配列の長さは一般的に少なくとも１６個のアミ
ノ酸、好適には少なくとも２０個のアミノ酸、さらに好
適には少なくとも２５個のアミノ酸、最も好適には３５
個のアミノ酸である。核酸の場合、比較配列の長さは一
般的に少なくとも５０個のヌクレオチド、好適には少な
くとも６０個のヌクレオチド、さらに好適には少なくと
も７５個のヌクレオチド、最も好適には１１０個のヌク
レオチドである。

【００１６】相同性は一般に配列解析ソフトウェア（例
えば「ジェネティックス・コンピューター・グループの
配列解析ソフトウェアパッケージ、米国、ウィスコンシ
ン州５３７０５、マディソン、ユニバーシティ・アベニ
ュー１７１０、ウィスコンシン大学バイオテクノロジー
・センター」）を使用して測定される。この種のソフト
ウェアは、類似の配列を対応させて、欠失体、置換体お
よび他の修飾体を含む種々の置換体に対する相同性の程
度を決定する。保存的な置換は、典型的には、以下の各
グループ、即ち、「グリシン、アラニン」「バリン、イ
ソロイシン、ロイシン」「アスパラギン酸、グルタミン
酸、アスパラギン、グルタミン」「セリン、スレオニ
ン」「リジン、アルギニン」および「フェニールアラニ
ン、チロシン」同士の置換を意味する。

【００１７】「実質的に純粋なポリペプチド」とは、自
然状態においてＡＦＴ１と混在する成分から分離された
ＡＦＴ１ポリペプチドを意味する。典型的には、そのポ
リペプチドは、自然状態において混在しているタンパク
質および自然に存在する有機分子が除去された状態で、
少なくとも重量として６０％であるとき、実質的に純粋
であると定義する。好適には、調製物は少なくとも７５
重量％、さらに好適には少なくとも９０重量％、最も好
適には少なくとも９９重量％のＡＦＴ１ポリペプチドで
ある。実質的に純粋なＡＦＴ１ポリペプチドは、たとえ
ば天然源（たとえば、植物細胞）からの抽出によって、
ＡＦＴ１ポリペプチドをコードしている組換えＤＮＡの
発現によって、または上記タンパク質を化学的に合成す
ることより得られる。純度は適切な方法、例えば、カラ
ムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動に関して記載されている方法により、またはＨＰＬＣ
分析により測定することができる。

【００１８】タンパク質は、天然状態においてそれに付
随する混在物から分離された場合、天然の混在成分を実
質的に含まないものになる。さらに、化学的に合成され
たタンパク質、または、天然において本来由来する細胞
とは異なる細胞系で生産されたタンパク質は、その天然
の混在成分を実質的に含有しない。従って、実質的に純
粋なポリペプチドには、真核生物由来のものも含まれ、
大腸菌または他の原核細胞で合成されたものも含まれ
る。

【００１９】「実質的に純粋なＤＮＡ」とは、本発明の
ＤＮＡが由来する生物の天然に存在するゲノムにおい
て、その遺伝子の近傍に存在する遺伝子を含まないＤＮ
Ａを意味する。それため、この用語には、例えば、ベク
ター、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスま
たは原核細胞もしくは真核細胞のゲノムＤＮＡ中に組込
まれた組換えＤＮＡや、または、他の配列から独立分離
された分子（たとえば、ｃＤＮＡまたはＰＣＲまたは制
限エンドヌクレアーゼ消化によって産生するゲノム断片
もしくはｃＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡが
含まれる。さらに、それは、付加されたポリペプチド配
列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換え
ＤＮＡを含む。

【００２０】「形質転換細胞」とは、ＡＦＴ１タンパク
質又はキメラＡＦＴ１転写活性化因子ををコードしてい
るＤＮＡ分子（本明細書で使用されているものと同様も
の）が組換えＤＮＡ技術により導入されている細胞（ま
たは導入された祖先細胞より由来する細胞）を意味す
る。

【００２１】「プロモーター」とは、転写を誘導するの
に十分なＤＮＡ配列を意味する。この様な配列要素は、
遺伝子の５´又は３´領域に配置することができる。ま
た、「構成的な」プロモーターとは、非調節下で遺伝子
の発現が可能であるプロモーター、即ち、常に転写を活
性化するプロモーターを意味する。「制御的な又は誘導
的な」とは、発生上の信号（例えば、細胞特異的、組織
特異的、及び、器官特異的なプロモーター）、環境的な
信号、及び、ホルモンによる信号に対し応答して、遺伝
子の発現ができるプロモーターを意味し、これには、本
明細書に記載のｒｂｃＳ、ｗｕｎＩ、クロロフィルａ／
ｂあるいはＥ２プロモーター等のプロモーターが含まれ
るが、これに限定されるものではない。

【００２２】「作用可能に結合した」とは、適切な分子
（たとえば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合
している場合、遺伝子発現を可能にするように遺伝子と
調節配列（例えば、プロモーター）とが連結しているこ
とを意味する。

【００２３】「植物細胞」とは、半透膜によって区切ら
れ、プラスチドを含有するいかなる自己増殖性細胞をも
意味する。さらなる増殖性が望まれる場合には、この種
の細胞は細胞壁を必要とする。本明細書において用いら
れているように、植物細胞には、藻類、シアノバクテリ
ア、種子、懸濁培養組織、胚芽、分裂領域、カルス組
織、葉、根、芽、配偶体、胞子体、花粉および小胞子が
含まれるが、これらに限定はされない。

【００２４】「トランス遺伝子」とは、導入技術により
細胞中に挿入され、その細胞から発生する生物のゲノム
の一部となるあらゆるＤＮＡの断片を意味する。この種
のトランス遺伝子は、トランスジェニック生物にとっ
て、部分的にまたは完全に異種である（すなわち、外来
の）遺伝子を含むことがあり、またはその生物の内在性
遺伝子に対して相同性を有する遺伝子であってもよい。

【００２５】「トランスジェニック」とは、導入技術に
より細胞中に挿入され、その細胞から発生した生物のゲ
ノムの一部となるＤＮＡ配列を含むいずれの細胞をも意
味する。本明細書で用いられるように、トランスジェニ
ック生物は一般的にトランスジェニック植物であり、そ
のＤＮＡ（トランス遺伝子）は技術により核または色素
体ゲノム中に挿入される。

【００２６】「植物の防御に関与するタンパク質」と
は、植物における有害生物（例えば、細菌、昆虫、線
虫、カビ及びウイルス）に対する防御又は抵抗に関与す
るいかなるタンパク質をも意味する。この種のタンパク
質は、これらに限定されないが、３−Ｏ−メチルトラン
スフェラーゼ、アスコルビン酸過酸化酵素、カルコン合
成酵素、ヒドロキシプロリンに富んだ糖タンパク質、グ
ルカナーゼ、チタナーゼ、タンパク質分解酵素阻害剤が
含まれる。

【００２７】本発明の他の特徴及び利点は、以下の好適
な態様の記載および各請求項から明らかである。

【００２８】

【実施例】本発明によるポリペプチド本発明に関するポリペプチドは、完全なアラビドプシス
ＡＦＴ１タンパク質（図１、配列番号２）を含む。この
ペプチドは、例えば、転写レベルにおいて植物の遺伝子
発現を操作する（前述）目的、または、真菌、昆虫、線
虫、細菌及びウイルスのような病原体に対し抵抗力を有
する植物を提供するために、植物のシグナル伝達経路を
操作する目的に使用できる。本発明のポリペプチドは、
宿主植物における転写活性化を可能とするいかなるアラ
ビドプシスＡＦＴ１タンパク質の類似体及び断片をも含
む。ＡＦＴ１類似体または断片が転写を活性化する効率
は、転写複合体との相互作用する能力に依存している。
このような相互作用は、数多くの標準的な生体内におけ
る（インビボ）方法、例えば、以下に述べるインターラ
クショントラップシステムを用いて容易に解析すること
ができる。同様に、本発明のポリペプチドは、ある特異
的な遺伝子の転写を選択的に活性化する能力を有したキ
メラＡＦＴ１転写活性化タンパク質を含んでいる。

【００２９】特に重要なＡＦＴ１類似体は、保存的なア
ミノ酸置換（例えばあるアミノ酸を他の同じ分類のアミ
ノ酸へ置換、例えば、グリシンからバリン、リジンから
アルギニンなど）をした部分のみ異なるアミノ酸配列を
含んでいる、または、ＡＦＴ１の有する転写活性化作用
を（以下の解析系において）破壊しない位置のアミノ酸
配列において、一つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失
又は挿入を有するアミノ酸配列を含んでいる、完全長又
は部分的なＡＦＴ１タンパク質である。

【００３０】特に重要なＡＦＴ１断片は、ＡＦＴ１リガ
ンド（例えば、多くの転写複合体又は３−Ｏ−メチルト
ランスフェラーゼやアスコルビン酸過酸化酵素のような
植物の防衛機構に関するタンパク質）との相互作用が可
能なＡＦＴ１タンパク質のいずれの部位も含む。このよ
うなリガンドの同定は、数ある標準的な生体内における
方法、例えば、以下に述べるインターラクショントラッ
プシステムのいずれかを用い、容易に解析することがで
きる。

【００３１】本発明の有用なアラビドプシスＡＦＴをコ
ードするｃＤＮＡのクローニング及び性質、転写活性化
作用に対する特性、そして、タンパク質の相互作用にお
ける特性について、次に述べる。本実施例は、本発明の
説明するためであり限定する目的で記載するものではな
い。ＡＦＴ１タンパク質をコードするアラビドプシス遺伝子
の単離アラビドプシスＡＦＴ１遺伝子は、以下の通り単離され
た。酵母インターラクショントラップシステム（Zervos
ら，Cell 72:223-232, 1993; Gyuris ら, Cell75:791-8
03, 1993）を改変したシステムが、アラビドプシスＡＦ
Ｔタンパク質の単離において用いられた。二つの高い親
和性ＣｏｌＥ１ＬｅｘＡオペレータからのGal1-LacZ
遺伝子の発現を誘導するプラスミドｐＪＫ１０３を含む
酵母ＥＧＹ４８株（MATa trp1 ura3 his3 LEU2::plexAo
p6-LEU2)が、前記インターラクショントラップシステム
において使用された。ＤＮＡ結合タンパク質と融合させ
た”えさ”（ＬｅｘＡ／ＡＫＲ１−２６１、即ち、ＡＫ
ＲＰ（アラビドプシスアンクリルリピートタンパク質）
の１−２６１残基）が、前記酵母株に導入された後、ア
ラビドプシスｃＤＮＡ発現ライブラリーが、導入された
（Zhangら、PlantCell 4:1575-1588,1992参照）。選択
は、先ず、ロイシン非含有プレート上で行い、次いで、
Ｌｅｕ⁺コロニーをＸ−ｇａｌプレート上で解析した。
ＬｅｘＡタンパク質又はＬｅｘＡタンパク質と融合した
誘導体の存在下ではレポーター遺伝子の転写は活性化さ
れるが、一方、非存在下では活性化されないクローンが
単離された。４週令のアラビドプシスの葉由来のｍＲ
ＮＡよりオリゴ（ｄＴ）プライミングにより合成したタ
グ付きｃＤＮＡ発現ライブラリーをベクターｐＪＧ４−
５用いて作成した。酵母株ＥＧＹ４８、ベクタープラス
ミドｐＪＧ４−５及びｐＥＧ２０２、そして、プラスミ
ドｐＨＭ１−１、ｐＨＭ７−３、ｐＨＭ１２、ｐＨＭφ
及びｐＳＨ１８−３４は、Roger Brent博士より分与し
ていただいた。後にｐＥＧ２０２へサブクローンされる
所望のＡＫＲ断片の増幅に用いたオリゴヌクレオチドを
下記に示す。ＯＡＢ−９：GCGGAATTCA TGAGGCCCAT TAAAATT （配列番号:3）ＯＡＢ−１０：GTAGGATCCG GTCGGATTTC TTGTCGC （配列番号:4）ＯＡＢ−１１：CGCGAATTCA ATAGCGACAA GTACGAT （配列番号:5）ＯＡＢ−１２：GTAGGATCCG TCTCTCTTCC AAGGTAGA （配列番号:6）ＯＡＢ−２０：GATCCTAGAA TTCAAGAAGA ATCGGCGTGG C （配列番号:7）それぞれの融合タンパク質に使用されるオリゴヌクレオ
チドの組合わせは、ＯＡＢ−９とＯＡＢ−１０（Ｌｅｘ
Ａ／ＡＫＲ１−２６１融合タンパク質）、ＯＡＢ−１１
とＯＡＢ−１２（ＬｅｘＡ／ＡＫＲ２４９−４３３融合
タンパク質）、ＯＡＢ−２０とＯＡＢ−１２（ＬｅｘＡ
／ＡＫＲ１１４−４３４融合タンパク質）である。通
常、この方法によって、転写活性化ドメイン（Ｂ４２）
と融合させたｃＤＮＡコードタンパク質を発現するライ
ブラリーが、特異的な酵母株に導入される。この株には
“えさ”（特定のタンパク質と融合させたＬｅｘＡ）と
呼ぶ転写が不活性なＬｅｘＡ融合タンパク質と二つのリ
ポーター遺伝子との構成的な産生を誘導するプラスミド
を保持している。ｃＤＮＡコードタンパク質が”えさ”
と複合体を形成している場合、これら二つのリポーター
遺伝子の転写は、活性化される。一方のリポーター遺伝
子ＬＥＵ２は、ロイシン非存在下においても酵母を生育
可能とする。もう一方のリポーター遺伝子ＬａｃＺは、
β−ガラクトシダーゼをコードしている。

【００３２】アラビドプシスｃＤＮＡによりコードされ
ている多くのタンパク質は、ＬｅｘＡタンパク質単独ま
たは多種の”えさ”と共に転写を活性化することが見い
だされた。しかしながら、これらタンパク質全てには、
ＬｅｘＡ結合ドメインが必要とされる。しかし、“えさ
“と相互作用をするパートナー以外のｃＤＮＡクローン
を単離した場合は、これら“疑陽性“株を所望のパート
ナークローンから分離するためにさらなる解析が必要と
される。ＬｅｘＡ存在下に生じるＡＦＴ１による活性化
の例を図１に示す。このような活性化を深く理解するた
めに、前記リポーター遺伝子の発現を活性化する能力を
有するタンパク質をコードした８１のｃＤＮＡクローン
の性質を調べた。配列決定されたｃＤＮＡの内、３６ク
ローンが、１４−３−３様タンパク質をコードする同一
の遺伝子由来であった。この遺伝子をＡＦＴ１（アラビ
ドプシス１４−３−３）と名付け、また、ＡＦＴ１のコ
ードするタンパク質をＡＦＴ１と名付けた。ＡＦＴ１
は、分子量約２８ｋＤを有する２４８アミノ酸を含んで
いる。ＡＦＴ１による転写活性化酵母インターラクショントラップシステムにおいて、転
写活性化に必要となるＡＦＴ１配列を決定するために一
連の実験がなされた。それは、欠失のシリーズを作成
し、以下の既知の技術における方法に従って解析した。
Ｂ４２／ＡＦＴ１融合タンパク質による活性化を調べる
ために、プラスミドｐＪＧ４−５内のＢ４２と融合させ
たＡＦＴ１誘導体のシリーズを構築した。これらプラス
ミドは、ＬｅｘＡタンパク質を構成的に産生するプラス
ミドｐＥＧ２０２とＬｅｘＡｏｐ−ＬａｃＺリポーター
遺伝子を含むプラスミドｐＳＨ１８−３４とを保持した
ＥＧＹ４８株へ、導入された。ＬｅｘＡ／ＡＦＴ１融合
タンパク質による活性化を調べるために、プラスミドｐ
ＥＧ２０２内のＬｅｘＡと融合させたＡＦＴ１誘導体の
シリーズを構築し、次いで、これらはプラスミドｐＳＨ
１８−３４を保持したＥＧＹ４８株へ導入した。ＡＦＴ
１及びその誘導体による転写活性化は、ロイシン非含有
プレート上の酵母の生育及びβ−ガラクトシダーゼ活性
により測定される。β−ガラクトシダーゼに対する解析
は、Zervosらによる記載（前述）に従った。以下に示す
オリゴヌクレオチドにより、所望のＡＦＴ１断片を増幅
し、次いで、増幅断片をｐＪＧ４−５及びｐＥＧ２０２
にサブクローンした。ＪＷ−５：CTGACTGAAT TCATGGCGGC GACATTAGG （配列番号:8）ＪＷ−６：GACTGAGTCG ACCCTTCATC TAGATCCTC （配列番号:9）ＪＷ−７：GACTGACTCG AGCCTTCATC TAGATCCTCA （配列番号:10）ＪＷ−８：CTGACTGAAT TCGAGTCTAA GGTCTTTAC （配列番号:11）ＪＷ−９：GACTGACTCG AGACTCGCTC CAGCAGATGG （配列番号:12）ＪＷ−１０：GACTGACTCG AGTGAAGAAT TGAGAATCTC （配列番号:13）ＪＷ−１１：GACTGAGTCG ACACTCGCTC CAGCAGATGG （配列番号:14）ＪＷ−１２：GACTGAGTCG ACTGAAGAAT TGAGAATCTC （配列番号:15）ＪＷ−１３：CTGACTGAAT TCGTTACAGG CGCTACTCCA G （配列番号:16）融合タンパク質作成に用いられるオリゴヌクレオチドの
組合わせは、ＪＷ−５とＪＷ−６（ＬｅｘＡ／１−２４
８融合タンパク質）、ＪＷ−５とＪＷ−１２（ＬｅｘＡ
／１−１９４融合タンパク質）、ＪＷ−５とＪＷ−１１
（ＬｅｘＡ／１−１２１融合タンパク質）、ＪＷ−１３
とＪＷ−６（ＬｅｘＡ／３４−２４８融合タンパク
質）、ＪＷ−８とＪＷ−６（ＬｅｘＡ／１２２−２４８
融合タンパク質）、ＪＷ−５とＪＷ−７（Ｂ４２／１−
２４８融合タンパク質）、ＪＷ−５とＪＷ−９（Ｂ４２
／１−１２１融合タンパク質）、ＪＷ−１３とＪＷ−７
（Ｂ４２／３４−２４８融合タンパク質）、ＪＷ−８と
ＪＷ−７（Ｂ４２／１２２−２４８融合タンパク質）及
びＪＷ−１３とＪＷ−１０（Ｂ４２／３４−１９４融合
タンパク質）がある。

【００３３】このような実験結果においては、ＡＦＴ１
のＣ末端の半分を欠失したタンパク質（Ｂ４２／１−１
２１）において、ＡＦＴ１の活性化作用が完全に消失
し、一方、Ｎ末端から３３または１２１残基が欠失した
タンパク質（Ｂ４２／３４−２４８及びＢ４２／１２２
−２４８）では、活性が上昇した（図３Ａ）。この活性
の上昇の理由は明らかでないが、これら二つの融合タン
パク質（Ｂ４２／３４−２４８及びＢ４２／１２２−２
４８）の三次元構造、即ち、転写機構とのより強い相互
作用の結果によるものと考えられる。従って、ＡＦＴ１
をＢ４２に融合させた際、例えば、ＡＦＴ１の３４−２
４８残基（配列番号２）及び１２２−２４８残基（配列
番号２）において観察された活性化の役割を担うのは、
ＡＦＴ１のＣ末端の半分である。しかしながら、Ｂ４２
が活性化ドメインであるとすれば、観察された転写活性
化は、ＡＦＴ１とＬｅｘＡとの直接的な相互作用と同時
に、リポーター遺伝子のプロモーターの近傍にＢ４２が
誘導されることにより生じる可能性がある。別の可能性
は、ＡＦＴ１の酸性（当電点ｐＩ＝４．６）の性質によ
り示されている。それは、多くの転写活性化因子が、酸
性の特性を有することから、ＡＦＴ１自身が転写活性化
因子であることが考えられる。

【００３４】ＡＦＴ１を、直接ＬｅｘＡと融合させて、
ＡＦＴ１が転写を活性化することができるか否かを調べ
た。この結果を図３Ｂに示したが、ＡＦＴ１自身では転
写を活性化しなかった。前記一部のＡＦＴ１が活性化に
重要であるかを判定するために、ＡＦＴのＣ末端より５
４アミノ酸を欠失させた（ＬｅｘＡ／１−１９４）。こ
の欠失によりＡＦＴ１は完全に活性能力を失ったが、一
方、Ｎ末端から３３アミノ酸の欠失（ＬｅｘＡ／３３ー
２４８）によっても、約７５％まで活性が減少した。図
３のパネルＢに示す通り、ＡＦＴ１のＮ末端半分を欠失
（ＬｅｘＡ／１２２−２４８）することにより、活性化
は基準値に急激に減少した。以上より、Ｃ末端の半分は
活性化に重要であり、また、Ｎ末端の半分よりもより酸
性であるが、Ｎ末端の半分もまた活性化において役割を
果たしていることが判明した。ＡＦＴ１のコピー数ＡＦＴ１遺伝子のコピー数は、ゲノミックＤＮＡサザン
ブロット分析により決定した。染色体ＤＮＡは、Dellap
ortaら（Plant Mol.Biol.Rep.4:19-21,1983）の方法に
従って準備した。それは、制限酵素による消化、電気泳
動（５μｇ／レーン）、バイオトランス（登録商標）ナ
イロンメンブレンにブロット、そして、標識したＡＦＴ
１ｃＤＮＡクローンとハイブリダイズさせるものであ
る。ハイブリダイゼーションは、Church及びGilbert（P
roc.Natl.Acad.Sci.USA81:1991-1995,1984）の方法に従
って実行された。この方法は、ランダムプライミングに
より標識したプローブを使用する。洗浄の条件は、以下
に記載の通りである。0.5% BSA,1mM EDTA, 40mM リン酸
ナトリウム緩衝液(pH 7.2), 1% SDS 溶液中、６３℃、
１０分を２回、それから1mM EDTA, 40mM リン酸ナトリ
ウム緩衝液(pH 7.2), 5% SDS 溶液中、６３℃、５分を
４回行う。フィルターから脱プローブをする条件は、以
下の通りである。2mM Tris (pH 8.2),2mM EDTA (pH 8.
0), 0.1% SDS 溶液を用い、ＤＮＡブロットの場合は７
０度、ＲＮＡブロットに場合は８０℃で行う。

【００３５】図４に示したように、アラビドプシスＤＮ
Ａの２種の生態系（コロンビアとランズバーグ）を制限
酵素、ＢｇｌＩＩとＨｉｎｄＩＩＩにより消化後、その
ＤＮＡブロットを標識ＡＦＴ１ｃＤＮＡ配列により標識
化すると、２本のバンドが生じた。この結果は、ＡＦＴ
１ｃＤＮＡ内に制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ
認識部位が各々一か所存在することから、アラビドプシ
スの両生態系にはＡＦＴ１が１コピーのみ存在すること
を示す。アラビドプシスにおけるＡＦＴ１遺伝子の発生上の発現
パターンＡＦＴ１発現の光調節と同様に、ＡＦＴ１の発生上及び
器官特異的発現は、ＲＮＡ（ノーザンブロット）解析に
より研究された。全ＲＮＡは、Logemannらの方法（Ana
l.Biochem.163:16-20,1987）に従って単離した。その方
法は、電気泳動（１５μｇ／レーン）による分離、バイ
オトランス（登録商標）ナイロンメンブレンにブロッ
ト、そして、標識したＡＦＴ１ｃＤＮＡクローンおよび
アラビドプシスＬｈｃａ２ｃＤＮＡクローンとハイブリ
ッドを形成させるものである。ハイブリダイゼーション
の洗浄の条件は、上記染色体サザン解析の場合と同様で
ある。ＲＮＡは、温室（２５±５度、１６時間、明／８
時間、暗）又は組織培養室（２０±２度、１６時間、明
／８時間、暗）にてアガロースプレート上のいずれかで
栽培したアラビドプシスより抽出された。温室栽培植物
は発生上の発現解析に使用した。ＲＮＡの回収のため
に、葉を一週間毎に摘んだ。温室栽培植物は、光誘導実
験にも使用された。４週目、植物は暗いチャンバーへ３
日間移し、その後、明りの下へ戻した。それから、葉を
２時間毎に摘んだ。組織培養室栽培植物は、器官特異的
発現を解析するために使用した。葉、根および茎のｍＲ
ＮＡは、１％シュクロース添加ＭＳ培地を含有したアガ
ロースプレート上で３５日間培養した植物より単離し
た。又、花および長角果ｍＲＮＡは、温室にて３５日間
栽培した植物より単離した。前記ＭＳ培地は、Sigma
（カタログ番号M-0153）より購入した。図５パネルＡお
よび表Ｉに示すように、１から５週目の植物の葉より単
離した全ＲＮＡを標識ＡＦＴ１ｃＤＮＡとハイブリダイ
ズさせた際、ＡＦＴ１の定常状態のｍＲＮＡ発現レベル
は、５週通して、ほとんど変化が見られなかった。

【００３６】異なった器官より単離したＲＮＡを解析し
たところ、長角果における定常状態のｍＲＮＡレベル
は、花のｍＲＮＡレベルの約１／５であり、一方、葉、
根および茎のｍＲＮＡは、ほぼ同じ（図５パネルＢ；表
Ｉ）であることを発見した。花および長角果由来のｍＲ
ＮＡレベルは、葉、根および茎由来のｍＲＮＡレベル
（図５パネルＢ）と直接比較することができないことを
注意が必要である。それは、これらが異なった条件下
（前掲）において栽培された材料由来であるためであ
る。しかしながら、花および長角果の定常状態のｍＲＮ
Ａレベルは、図５パネルＡに示した５週目の葉のｍＲＮ
Ａレベルとは、比較することができる。定量的なデータ
は、葉のＡＦＴ１ｍＲＮＡレベルが、花のｍＲＮＡレベ
ルよりも２倍高く、長角果のｍＲＮＡレベルよりも９倍
高いこと（表Ｉ、後掲）を示した。温室栽培植物は、プ
レート栽培植物よりも３倍高いＡＦＴ１ｍＲＮＡを含ん
でいた（図５パネルＡ及びＢ；表Ｉ、後掲）ことから、
栽培の条件により、定常状態のｍＲＮＡレベルに影響を
与えることができる。これらデータは、ＡＦＴ１の発現
が恐らくアラビドプシスの生活環の多くを通して要求さ
れているが、定常状態のｍＲＮＡレベルは器官特異的に
調節されていることを、示している。さらに、暗さに適
合した植物は、明るい中で栽培された植物よりも少なく
とも２倍の定常状態のｍＲＮＡレベルを有している（図
５パネルＣ；表Ｉ）。このことは、光がＡＦＴ１発現の
負の調節（ダウンレギュレーション）に役割を果たして
いることを示唆している。図５ＡからＣのデータにおけ
るＡＦＴ１ｍＲＮＡの相対的な強度を、以下の表１に示
した。相対的強度のデータをブロットアナライザーによ
りＲＮＡゲルブロットのβスキャンニングにより収集
し、１８ｓＲＮＡバンドの強度を用いて標準化した。

【００３７】

【表１】我々は、アラビドプシスのＡＦＴ１遺伝子は酵母の転写
を活性化することのできる新たな蛋白質をコードしてい
ることを示した。従って、我々は、ＡＦＴ１が転写活性
化因子として機能すると判定した。標的化された転写活性化因子としてのキメラＡＦＴ１タ
ンパク質植物遺伝子発現が、異なる細胞種の発生段階により又は
異なる環境因子やホルモン信号に対する反応により様々
であることから、本発明のタンパク質（遺伝子の制御配
列を含む）は、種々の農業的又は商業的に重要な植物を
改良又は操作を目的とした応用に非常に有用である。

【００３８】従って、本発明はまた、ある特定の遺伝
子、例えばナピン（Napin）のようなアブラナ科植物の
貯蔵タンパク質、の転写を選択的に活性化可能な新たな
キメラＡＦＴ１タンパク質の構築及びその使用に関す
る。ある特定の遺伝子の転写を選択的に活性化する作用
を有した転写活性化因子と、５´上流の制御領域、例え
ば、転写開始部位の近傍に結合可能なＤＮＡ結合ドメイ
ンと、を融合させて導入することにより、その遺伝子の
標的転写が行える。この様なキメラタンパク質は、二つ
の部分を有している。それらは、一つはＡＦＴ１転写活
性化領域（前掲）と、もう一つは所望の転写開始領域へ
誘導される又はその領域に特異的であるＤＮＡ結合ドメ
インとである。例えば、キメラＡＦＴ１転写活性化タン
パク質は、先行技術（例えば、Sandowskiら、Nature 33
5:563-564,1988参照）に記載された方法に従って、ＡＦ
Ｔ１の転写活性化部位にＧａｌ４ＤＮＡ結合領域（Ma
ら、Nature,344:631-633,1988；Maら,Cell,48:847-853,
1988）を融合させることにより生成される。

【００３９】重要なのは、ＡＦＴ１キメラ活性化因子の
制御下に置かれた所望の遺伝子、例えば、ナピン貯蔵タ
ンパク質遺伝子が、その５´上流領域に正確なＤＮＡ認
識配列を含んでいることである。例えば、Ｇａｌ４−Ａ
ＦＴ１タンパク質によるナピン遺伝子発現を活性化する
ために、ナピン遺伝子は、Ｇａｌ４の５´側上流の活性
化配列（ＵＡＳ）を有している必要がある。この種のク
ローンの構築は、公知技術であり、以下に記載されてい
る。さらに、当業者は、キメラ活性化タンパク質のＤＮ
Ａ結合ドメイン構成要素がいかなる適当な真核生物又は
原核生物源由来であってよいことを、容易に認識するで
あろう。したがって、キメラＡＦＴ１転写活性化タンパ
ク質をコードした融合遺伝子は、任意のＤＮＡ結合ドメ
インとＡＦＴ１転写活性化因子とを実質的に含むように
構築されていればよい。ここで、ＡＦＴ１転写活性化因
子は、遺伝子が、前記活性化因子の結合を促進させる必
須のＤＮＡ制御配列を含むＡＦＴ１キメラ活性化因子の
転写調節下に配置されるような形で用いられる。この種
のキメラＡＦＴ１転写活性化タンパク質は、トランスジ
ェニック植物において効率的に転写の活性化をすること
ができる。（プラスミドの構築は後述する。）さらに、
この種のキメラＡＦＴ１転写活性化タンパク質、例え
ば、ＡＦＴ１／Ｇａｌ４を発現している細胞では、所望
の遺伝子産物を特異的に活性化及び過剰発現させること
が可能である。

【００４０】生体内または試験管内において、効率的な
キメラＡＦＴ１転写活性化タンパク質を同定するために
は、機能的な解析が行われる。このような解析は、一時
的に形質転換された植物細胞または適切なトランス遺伝
子、例えば、ＡＦＴ１／Ｇａｌ４転写活性化因子や必須
のＧａｌ４結合配列を含む貯蔵タンパク質プロモーター
領域を保持したトランスジェニック植物を用いて、標準
的な方法（例えば、Gelvinら（前述）を参照）に従い行
われる。

【００４１】特に有用な組合わせ、即ち、キメラＡＦＴ
１活性化因子とそれと同様の性質の遺伝子の同定には、
プラスミドを構築し、植物細胞における一時的な解析法
または生体内の解析法のいずれかにより解析される。キ
メラトランス遺伝子の構築は標準的な方法により行われ
る（例えば、Ausubelら（前掲）参照）。制御配列およ
び適切なＤＮＡ結合配列、例えば、Ｇａｌ４、を含む特
異的な遺伝子（例えば、アブラナ科ナピン貯蔵タンパク
質）の野生型のプロモーターは、リポーター遺伝子、例
えば、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）と植物の
発現ベクター内で融合させ（例えば、Jefferson,Plant.
Mol.Biol.Rep.316:387,1987参照）、その後、同様の性
質のＡＦＴ１キメラ転写活性化因子発現構築体と共に、
いずれかの確立された方法により宿主細胞へ導入され
る。レポーター遺伝子とは、発現が分析可能である遺伝
子を意味し、この種の遺伝子には、これらに限られるも
のではないが、β−グルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵ
Ｓ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールトランス
アセチレース（ＣＡＴ）及びβ−ガラクトシダーゼが含
まれる。特に注目すべき態様は、発現ベクターによって
アグロバクテリウムを形質転換し、続いて、植物材料、
例えば、リーフ（葉の）ディスク（例えば、Gelvinら
（前掲）を参照）を形質転換する。再生した新芽は、例
えばカナマイシンを含有する培地上で選択される。植物
が根付いた後、トランスジェニック植物は土壌へ植え継
ぎ、培養室で成育させる。

【００４２】第一の形質転換体は、その後、キメラＡＦ
Ｔ１誘導性ＧＵＳ活性をＧＵＳ活性の定量、もしくは、
下記の通りの組織化学的な染色のいずれかにより分析さ
れる。非形質転換植物は対照として用いられる。

【００４３】ＧＵＳ活性の蛍光分析は、標準的な方法に
従い、植物細胞のプロトプラスト又はトランスジェニッ
ク植物において施行された。別の方法として、植物抽出
液の粗製標品を、公知の方法、例えば、Jefferson（前
掲）の通り、タンパク質濃度を標準化した抽出液を用い
て分析してもよい（Bradford,Anal.Biochem.72:248,197
6）。個々の植物組織のＧＵＳレベルは、４−メチルウ
ンベル酸グルクロニドの４−メチルウンベリフェロンへ
の酵素変換を蛍光分析機（例えば、Perkin-Elmer LS 2
B、米国、コネチカット州、ノーワーク）により分析す
る。典型的には、蛍光分析機を、４５５ｎｍ発光と３６
５ｎｍ吸光波長にセットする。ＧＵＳ活性の単位は、一
般的に、ピコモル／タンパク質１ミリグラム／分として
表現する（例えば、Jefferson、前掲）。

【００４４】あるいは、ＧＵＳ活性は、下記の通り、組
織内（in situ）組織化学的染色により解析してもよ
い。トランスジェニック植物由来の前組織と切片、及
び、非形質転換対照植物の組織は、Jeffersonら（EMBO
J6;3910,1987）及びGallagher（GUS Protocls,1992）に
記載の通り、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル
ベータ−Ｄ−グルクロン酸（Ｘ−ｇｌｕｃ）（Research
Organic社、米国、オハイオ州、クリーブランド）と反
応させることにより染色される。各組織を、３７℃にお
いて２ｍＭＸ−ｇｌｕｃ含有０．１Ｍリン酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）中培養し、切片とする。形質
転換植物のＧＵＳ活性は、リポーター遺伝子を発現して
いる細胞内のインディゴブルー沈殿の存在として、容易
に同定される。染色された細胞は、明視野及び暗視野レ
ンズを用いた顕微鏡により視覚的に確かめられる。ＡＦＴ１相互作用タンパク質ＡＦＴ１タンパク質の他の側面は、上記のインターラク
ショントラップシステムの変形により探索することがで
きる。例えば、ＡＦＴ１と相互作用するタンパク質は、
単離、同定することができる。この目的には、“えさ
“としてＬｅｘＡと部分的なＡＦＴ１との融合タンパク
質（ＬｅｘＡ／ＡＦＴ１３３−１９４、即ち、ＡＦＴ
１の３３−１９４アミノ酸残基とＬｅｘＡとの融合体）
使用し、ＡＦＴ１と相互作用可能なタンパク質を検索す
る。我々は、数種の植物遺伝子と相同な配列を有する５
つの新規のｃＤＮＡを同定した。これら数種の植物遺伝
子には、植物の防御に関与する遺伝子産物、例えば、３
−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（例えば、Poeydomeng
eら、Plant Physiol.105:749-750,1994；Jaekら、Mol.P
lant-Microbe Interactions5:294-300,1992、参照）及
びアスコルビン酸過酸化酵素（Mittlerら、Plant J.5:3
97-405,1994；Mehdy,Plant Physiol.105:467-472,199
4、参照）、プロテオソーム遺伝子産物（例えば、Hafft
erら、Nucleic Acids Res.19:5075,1991）アンクライン
（ankryin）繰り返しタンパク質遺伝子産物、ＡＫＲ₂が
含まれる。これらｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、図６
（配列番号１７）、図８（配列番号１９）、図１０（配
列番号２１）、図１２（配列番号２３）そして図１４
（配列番号２５）に示されている。これらｃＤＮＡより
コードされた推定アミノ酸配列は、図７（配列番号１
８）、図９（配列番号２０）、図１１（配列番号２
２）、図１３（配列番号２４）そして図１５（配列番号
２６）に示されている。ＡＦＴ１ポリペプチドの発現本発明によるポリペプチドは、完全な又は部分的なＡＦ
Ｔ１ｃＤＮＡ（例えば、上記のｃＤＮＡ）を挿入された
適切な発現媒介体、又は、キメラＡＦＴ１転写活性化タ
ンパク質（前掲）を発現するように構築されたプラスミ
ドにより適切な宿主細胞を形質転換することによって生
成することができる。

【００４５】分子生物学の分野の当業者は極めて多種類
の発現系のいずれかを使用して組換えタンパク質を提供
することができることを理解している。使用される宿主
細胞は本発明に重要なことではない。ＡＦＴ１ポリペプ
チド又はキメラ活性化タンパク質は、原核生物宿主たと
えば大腸菌、真核生物宿主たとえばサカロマイセス・セ
レビシエ、哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ１またはＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞）、または、多くの植物細胞、以下に限定
されないが、たとえば藻類、樹木種、観賞種、温帯果実
種、熱帯果実種、野菜種、マメ種、単子葉植物、双子葉
植物又は商業的もしくは農業的に重要ないかなる植物、
これらいずれかの中で生産することができる。適した植
物宿主の特定の実施例には、クラミドモナス、球果植
物、ペチュニア、トマト、ジャガイモ、タバコ、アラビ
ドプシス、レタス、ヒマワリ、脂肪種子セイヨウアブラ
ナ、アマ、ワタ、サトウダイコン、セロリ、ダイズ、ア
ルファルファ、ウマゴヤシ、ハス、ササゲ、キュウリ、
ニンジン、ナス、カリフラワー、セイヨウワサビ、ヒル
ガオ、ポプラ、クルミ、リンゴ、アスパラガス、イネ、
トウモロコシ、キビ、タマネギ、オオムギ、カモガヤ、
カラスムギ、ライムギおよびコムギが含まれる。

【００４６】この種の細胞は、The American Type C
ulture Collection（米国、メリーランド州、ロックラ
ンド）又はChlamydomonas Culture Collection（Duke
University）（米国、ノースキャロライナ州、ダーラ
ム）を含む広範囲の供給源から、または多くの種子会
社、例えば、W.Atlee Burpee Seed社（米国、ペンシ
ルバニア州、ワーミンスター）、Park Seed社（米国、
サウスキャロライナ州、グリーンウッド）、Johnny Se
ed社（米国、メイン州、アルビオン）またはNorthrup
King Seeds（米国、サウスキャロライナ、ハーツビ
ル）より入手可能である。有用な宿主細胞についての解
説と供給源は、Vasil I.K.による「Cell Culture an
d Somatic Cell Genetics of Plants、第Ｉ、Ｉ
Ｉ、ＩＩＩ巻、Laboratory Procedures and Their
Application、米国、ニューヨーク州、Academic Press
社、1984年」、Dixon,R.A.による「Plant Cell Cultu
re-A Practical Approach、IRL Press社、Oxford U
niversity、1985年」、Green等による「Plant Tissue
and Cell Culture、米国、ニューヨーク州、Academi
cPress社、1987年」またはGasserおよびFraleyによる
「Science、244:1293、1989」に記載されている。

【００４７】原核細胞内の発現の場合、本発明のＡＦＴ
１ポリペプチドをコードするＤＮＡは、原核細胞宿主中
での発現を実行し得る調節シグナルと作用可能に結合さ
せてベクターにつながれる。所望に応じて、コード配列
はその５′末端に、宿主細胞の周辺腔中に発現タンパク
質を分泌し、前記タンパク質の回収およびその後の精製
を容易にすることができる既知のシグナル配列のいずれ
かをコードする配列を挿入してもよい。最も頻繁に使用
される原核生物は大腸菌の種々の菌株であるが、他の微
生物株も使用することができる。複製開始点、選択性マ
ーカーおよび使用する微生物宿主と適合性のある種より
由来する調節配列を含有するプラスミドベクターを使用
することができる。この種のベクターの実例は、「Pouw
elsら（前掲）」または「Ausubelら（前掲）」に説明さ
れている。通常使用される原核生物調節配列（「制御要
素」とも呼称される）は、本明細書では、場合によって
オペレーターと共に、リボソーム結合部位配列と共に転
写開始のプロモーターを含むと定義される。タンパク質
発現を誘導する通常使用されるプロモーターには、β−
ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース（ｌａ
ｃ）（Changら、Nature、198:1056、1977）、トリプトフ
ァン（Ｔｒｐ）（Goeddelら、Nucl.Acids Res.、8:405
7、1980）およびｔａｃプロモーター系、並びにλファー
ジ由来ＰＬプロモーターおよびＮ−遺伝子リボソーム結
合部位（Simatakeら、Nature、292:128、1981）が含まれ
る。

【００４８】真核生物内の発現の場合、トランスフォー
メーション（形質転換）またはトランスフェクション
（形質移入）の方法およびＡＦＴ１ポリペプチドの発現
に用いる媒介体の選択は、選択された宿主系に依存す
る。トランスフォーメーションおよびトランスフェクシ
ョンを行う方法は、例えば「Ausubelら（前掲）」、Wei
ssbach及びWeissbachによる「Methods for Plant Mo
lecular Biology,Academic Press社,1989」、Gelvin
らによる「Plant Molecular Biology Manual、Kluwer
Acadic Publishers社,1990」、「Kindle,K.、Proc.Na
tl.Acad.Sci.,USA、87:1228、1990」、Potrykus,I.による
「Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biology、42:20
5、1991」および「BioRad社（米国、カリフォルニア州、
ハークル）Techical Bulletin #1687(Biolistic Par
ticle Delivery Systems)」に記載されている。発現
媒介体は、例えば、「Cloning Vectors:A Laboratory
Manual、（P.H.Pouwelら、1985、補遺、1987）」、
「Gasser及びFraley（前掲）」、「Clontech社分子生物
学カタログ（カタログ１９９２／９３分子生物学者のた
めの道具、米国、カリフォルニア州、ポロアルト）」お
よび上記の文献中において提供されたものから選択する
ことができる。

【００４９】１つの好適な真核生物発現系はｐＭＡＭｎ
ｅｏ発現ベクター（Clontech社、米国、カリフォルニア
州、ポロアルト）によりトランスフェクション（形質移
入）されたマウス３Ｔ３線維芽細胞宿主細胞である。ｐ
ＭＡＭｎｅｏは、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶ−ＬＴ
Ｒプロモーター、哺乳類系における複製を可能にするＳ
Ｖ４０複製起点、選択可能なネオマイシン遺伝子および
ＳＶ４０スプライシングとポリアデニル化部位を提供す
る。ＡＦＴ１ポリペプチドをコードするＤＮＡは、発現
を可能にするように選定された方向によりｐＭＡＭｎｅ
ｏベクター中に挿入される。この組換えＡＦＴ１タンパ
ク質は下記の通り単離される。ｐＭＡＭｎｅｏ発現媒介
体と組合わせて使用することができる他の好適な宿主細
胞には、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞（それぞれ、ＡＴ
ＣＣ受託番号、ＣＲＬ１６５０およびＣＣＬ６１）が含
まれる。

【００５０】その他、ＡＦＴ１ポリペプチドは、安定し
て形質移入された哺乳動物細胞株により、産生される。
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションに適切な多
くのベクターは、一般に入手可能であり、例えば「Pouw
ellら（前掲）」を参照されたい。その種の細胞株を構
築する方法も一般に、例えば「Ausubelら（前掲）」を
利用することができる。１つの実施例では、ＡＦＴ１ポ
リペプチドをコードするｃＤＮＡは、ジヒドロ葉酸還元
酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含む発現ベクター内にクロー
ンされる。プラスミドおよびそれに伴うＡＦＴ１コード
遺伝子の宿主細胞染色体中への組込みは、０．０１−３
００μＭメトトレキセート含有細胞培養液により、選択
される（「Ausubelら（前掲）」に記載）。この優性選
択は多くの細胞型中で行うことができる。組換えタンパ
ク質の発現は形質移入遺伝子のＤＨＦＲ介在する増幅に
よって増加させることができる。遺伝子増幅をもつ細胞
株を選択する方法は「Ausubelら（前掲）」に記載され
ている。この種の方法は、一般的に、段階的に増加する
レベルのメトトレキセート量を含有する培地での大量培
養に関する。この目的のために通常使用されるＤＨＦＲ
含有発現ベクターには、ｐＣＶＳＥＩＩ−ＤＨＲＦおよ
びｐＡｄＤ２６ＳＶ（Ａ）（「Ausubelら（前掲）」に
記載）が含まれる。上記の宿主細胞のいずれかまたは好
適にはＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株（たとえば、ＣＨＯ
ＤＨＦＲ−細胞、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ９０９６）
は、安定に形質移入された細胞株またはＤＨＦＲ介在遺
伝子増幅のＤＨＦＲ選択に好適な宿主細胞の中に含まれ
る。

【００５１】最も好適には、ＡＦＴ１ポリペプチド又は
ＡＦＴ１キメラ転写活性因子は安定に形質移入された植
物細胞株により、または、トランスジェニック植物によ
り生産される。植物細胞の安定な形質移入またはトラン
スジェニック植物の樹立に適した多くのベクターは一般
に入手可能である。この種のベクターは「Pouwelsら
（前掲）」「WeissbachおよびWeissbach（前掲）」およ
び「Gelvinら（前掲）」に記載されている。この種の細
胞株を構築する方法は、たとえば「WeissbachおよびWei
ssbach（前掲）」または「Gelvinら（前掲）」に記載さ
れている。典型的には、植物発現ベクターには、（１）
５′および３′調節配列の転写制御下にあるクローンさ
れた植物遺伝子、および（２）優性選択マーカーが含ま
れる。この種の植物発現ベクターはまた、所望に応じ
て、プロモーター調節領域（たとえば、誘導性もしくは
定常性の、または環境的にもしくは発生的に調節され
た、または細胞もしくは組織特異的発現を与えるも
の）、転写開始部位、リボゾーム結合部位、ＲＮＡプロ
セッシングシグナル、転写終結部位、および／またはポ
リアデニル化シグナルを含有することがある。所望の
ＡＦＴ１核酸配列が得られれば、当業者において公知の
種々の方法により、この配列を操作することは可能であ
る。例えば、前記配列が非コードの近傍領域の場合で
も、その近傍領域も変異導入の対象になるであろう。

【００５２】本発明のＡＦＴ１ＤＮＡ配列は、所望によ
り、種々の方法により他のＤＮＡ配列と組合わせること
ができる。本発明のＡＦＴ１ＤＮＡ配列は，ＡＦＴ１タ
ンパク質と通常関連する遺伝子の全てあるいは一部であ
ってもよい。ＡＦＴ１タンパク質をコードするＤＮＡ配
列の部分的な要素において、宿主細胞における転写およ
び翻訳を指示可能な転写開始調節領域を有するＤＮＡ構
築体と組合わせることができる。

【００５３】一般に、前記構築体は、植物において機能
する制御領域に関与していることがある。前記制御領域
は、上記の通り、ＡＦＴ１タンパク質またはキメラＡＦ
Ｔ１タンパク質の産生に影響を与える。そのため、ＡＦ
Ｔ１タンパク質または機能的な断片をコードするオープ
ンリーディングフレームは、転写開始調節領域をフレー
ムの５´末端に結合させ、天然に見られるような転写開
始調節領域がＡＦＴ１構造遺伝子の５´上流領域となる
ようにする。多くの他の転写開始領域には、構成的ある
いは誘導可能な調節を提供するものが入手可能である。
発生上の、ホルモン性の、あるいは環境的な発現が要求
される応用には、適切な５´上流非コード領域が他の遺
伝子、例えば、種子の発生、胚芽の発生あるいは葉の発
生において調節される遺伝子より得られる。

【００５４】調節的な転写終結領域はまた、同様に本発
明のＤＮＡ構築体に適用される。転写終結領域は、ＡＦ
Ｔ１タンパク質をコードするＤＮＡ配列により、また
は、異なる遺伝子由来の有用な転写終結領域、特に転写
開始領域と通常関連している転写終結領域より提供され
る。転写終結領域は、好適には少なくとも１ｋｂ、公的
には終結領域が由来した構造遺伝子の３´の配列を約３
ｋｂ有しているのがよい。そのため、発現させたいＤＮ
Ａ配列としてＡＦＴ１を有する植物の発現構築体は、広
範囲の種々の植物生活、特に種子の貯蔵タンパク質また
は貯蔵脂質の生産に関与する有用な植物生活に、また
は、工業的あるいは農業的な応用に利用することができ
る。重要なのは、この発明は、双子葉植物および単子葉
植物に応用可能であり、いかなる新たなあるいは改良さ
れた形質転換または再生方法に容易に応用することがで
きることである。

【００５５】本発明による有用な植物プロモーターの１
つの実施例はカラリモウイルスたとえばカリフラワーモ
ザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーターである。これ
らのプロモーターは多くの植物組織中で高いレベルの発
現を導き、これらのプロモーターの活性はウイルスによ
ってコードされたタンパク質には依存しない。ＣａＭＶ
は３５Ｓおよび１９Ｓプロモーター両方の供給源であ
る。トランスジェニック植物の多くの組織中では、Ｃａ
ＭＶ３５Ｓプロモーターは強力なプロモーターである
（たとえば、Odellら、Nature、313:810、1985参照）。Ｃ
ａＭＶプロモーターはまた単子葉植物中においても高い
活性がある（たとえば「Dekeyserら、Plant Cell、2:59
1、1990」または「Terada及びShimamoto、Mol.Gen.Gene
t.、220:389、1990」参照）。さらに、このプロモーター
の活性は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの重複によって
さらに増加（すなわち、２〜１０倍）させることができ
る（たとえば「Kayら、Science、236:1299、1987」「Ow
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84:4870、1987」または「F
angら、Plant Cell、1:141、1989参照）。

【００５６】他の有用な植物プロモーターには、これら
に限定はされないが、ノパリンシンターゼプロモーター
（Anら、Plant Physiol.、88:547、1988）およびオクト
ピンシンターゼプロモーター（Frommら、Plant Cell、
1:977、1989）が含まれる。

【００５７】ある種の用途の場合には、適切な組織中
で、適切なレベルで、適切な発生時期にＡＦＴ１遺伝子
産物を生産することが望ましいことがある。それ自体の
明確な特性がその調節配列中に包含され、環境、ホルモ
ンおよび／または発生の信号に応答して調節されること
が示されている一群の遺伝子プロモーターがある。これ
らには、（１）熱調節遺伝子発現（たとえば、Callis
ら、Plant Physiol.、88:965、1988）、（２）光調節遺
伝子発現（たとえば「Kuhlemeierら、Plant Cell、1:47
1、1989」に記載のエンドウｒｂｃＳ−３Ａ、「Schaffne
r及びSheen、Plant Cell、3:997、1991」に記載のトウモ
ロコシｒｂｃＳプロモーターまたは「Simpsonら、EMBO
J.、4:2723、1985」に記載のエンドウ中の葉緑素ａ／ｂ
結合タンパク質）、（３）ホルモン制御遺伝子発現（た
とえば「Marcotteら、Plant Cell、1:969、1989」に記載
のコムギのＥｍ遺伝子からのアブシジン酸応答性配
列）、（４）創傷誘導遺伝子発現（たとえば、「Sieber
tzら、Plant Cell、1:961、1989」に記載のｗｕｎＩ）、
または（５）器官特異性遺伝子発現（たとえば、「Ro
shalら、EMBO J.、6:1155、1987」に記載の塊茎特異性貯
蔵タンパク質遺伝子」、「Schernthanerら、EMBO J.、
7:1249、1988」に記載のトウモロコシ由来の２３−ｋＤ
ａゼイン遺伝子または「Bustosら、Plant Cell、1:839、
1989」に記載のインゲンマメβファセオリン遺伝子）の
原因である遺伝子プロモーターが含まれる。

【００５８】植物発現ベクターもまた場合によっては、
効率的なＲＮＡ合成および蓄積のために重要であること
が示されているＲＮＡプロセッシングシグナル、たとえ
ばイントロンを含むことがある（Callisら、Genes and
Dev.、1:1183、1987）。ＲＮＡスプライス配列の位置は
植物中のトランス遺伝子の発現のレベルに劇的に影響す
ることがある。この事実のために、イントロンはトラン
ス遺伝子中でＡＦＴ１ポリペプチドコード配列の上流ま
たは下流に配置して、遺伝子発現を調節することができ
る。

【００５９】前記の５′制御調節配列の他に、発現ベク
ターはまた、一般的に植物遺伝子の３′領域中に存在す
る制御調節領域を含むことがある（Thornburgら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA、84:744,1987；Anら、Plant Cell、
1:115、1989）。たとえば、３′終結領域は発現ベクター
中に含まれて、ｍＲＮＡの安定性を増加することができ
る。この種の終結領域の１つは、ジャガイモのＰＩ−Ｉ
Ｉ終結領域から誘導することができる。さらに、他の通
常使用される終結配列はオクトピンまたはノパリンシン
ターゼシグナルから由来であってもよい。

【００６０】植物発現ベクターはまた典型的には、形質
転換されるこれら細胞を同定するのに使用される優性選
択マーカー遺伝子を含有する。植物系に有用な選択マー
カー遺伝子には、抗生物質耐性遺伝子、たとえばハイグ
ロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、Ｇ４１
８、ストレプトマイシン又はスペクチノマイシンに対す
る耐性遺伝子をコードするものが含まれる。光合成に必
要な遺伝子もまた、光合成欠損株中の選択マーカーとし
て使用することができる。最後に、除草剤耐性をコード
する遺伝子は選択マーカーとして使用することができ
る。有用な除草剤耐性遺伝子には、酵素ホスフィノスリ
シンアセチルトランスフェラーゼをコードしかつ広範囲
な除草剤「Ｂａｓｔａ（登録商標）（Hoechst AG社、
ドイツ、フランクフルト）」に対する耐性を与えるｂａ
ｒ遺伝子が含まれる。

【００６１】選択マーカーは、特定の選択剤に対する植
物細胞の感受性を決定すること、および、形質転換細胞
の全部でないにしても大部分を効果的に死滅させる薬剤
の濃度を決定することによってより効率的に利用され
る。タバコ形質転換のための抗生物質の有用な濃度は、
たとえば、７５−１００μｇ／ｍｌ（カナマイシン）、
２０−５０μｇ／ｍｌ（ハイグロマイシン）、または５
−１０μｇ／ｍｌ（ブレオマイシン）を含む。除草剤耐
性のための形質転換体を選択する有用な方策はたとえば
「Vasilら（前掲）」において記載されている。

【００６２】遺伝子発現のレベルが、プロモーター、Ｒ
ＮＡプロセッシングシグナルおよびターミネーター要素
との組合せのみならず、これらの要素が選択マーカー遺
伝子発現のレベルを増加するのに使用される方法にも依
存しているということは分子生物学特に植物分子生物学
の分野の当業者には十分明白である。植物の形質転換植物発現ベクターが構築されると、トランスジェニック
植物を産り出すために、組換え遺伝子物質を宿主植物中
に導入する数種の標準方法が利用できる。これらの方法
には、（１）アグロバクテリウム仲介形質転換（A.tume
faciens及びA.rhizogenes）（たとえば、「Lichtenstei
n and Fuller、Genetic Engineering、第6巻、PWJ Ri
gby編、London、Academic Press、1987年」および「Licht
enstein,C.P.and Draper,J.、DNA Cloning、第ＩＩ巻、
D.M.Glover編、Oxford、IRI Press、1985年」参照）、
（２）粒子輸送システム（たとえば、「Gordon-Kammら、
PlantCell、2:603、1990」または「BioRad Technical B
ulletin 1687（前掲）」参照）、（３）マイクロイン
ジェクションプロトコル（たとえば、「Greenら（前
掲）」参照）、（４）ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）操作法（たとえば、「Draperら、Plant Cell Phy
siol.、23:451、1982」または「Zhang及びWu、Theor.Appl.
Genet.、76:835、1988」参照）、（５）リポソーム仲介Ｄ
ＮＡ摂取（たとえば、「Freemanら、Plant Cell Physi
ol.、25:1353、1984」参照）、（６）エレクトロポレーシ
ョンプロトコル（たとえば、「Gelvinら（前掲）」「De
keyser等（前掲）」または「Fromm等、Nature、319:791、
1986」参照）、および（７）攪拌法（たとえば、「Kind
le（前掲）」参照）が含まれる。形質転換の方法は、本
発明においては重要ではない。植物形質転換の種々の方
法が現在利用可能である（前掲）。より新しい方法は、
穀物の形質転換あるいは直接応用される他の宿主細胞の
形質転換に利用可能である。従って、広範囲の種々の方
法は、植物宿主の遺伝子中にあるＤＮＡ配列を挿入し
て、双子葉および単子葉の両方において、表現型の変化
に影響する配列における転写あるいは転写産物及び翻訳
を行わせるように発展している。さらに、ＤＮＡ構築体
を植物宿主へ導入する方法は、本発明に重要ではない。
そのため、形質転換を効率的に行わせる方法のいずれを
用いてもよい。

【００６３】次のものはアグロバクテリウム仲介植物形
質転換を概説する一例である。植物細胞のゲノム中に導
入される遺伝子を操作する一般法は２つの段階で実施さ
れる。第一段階では、すべてのクローニングおよびＤＮ
Ａ修飾工程は大腸菌中で行い、所望の遺伝子構築物を含
有するプラスミドを接合によってアグロバクテリウム中
に導入される。第二段階では、結果として得られたアグ
ロバクテリウム株を使用して植物細胞を形質転換する。
したがって、一般的な植物発現ベクターの場合、そのプ
ラスミドはアグロバクテリウム中で複製を可能にする複
製起点、および大腸菌中で機能し高コピー数をもたらす
起点を含有している。このことによって、アグロバクテ
リウムへの導入およびその後の植物中への導入の前に、
大腸菌中でのトランス遺伝子の円滑な生産および試験が
可能となる。複数の耐性遺伝子をベクターに持たせるこ
とができる。１つはバクテリアの選択のためのものたと
えばストレプトマイシン、および他は植物中で発現する
ものたとえばカナマイシン耐性をコードする遺伝子また
は除草剤耐性遺伝子である。指向性Ｔ−ＤＮＡボーダー
配列に作用可能に結合している１つまたはそれ以上のト
ランス遺伝子を付加するための制限酵素部位も存在す
る。この指向性Ｔ−ＤＮＡボーダー配列は、適切な調節
配列およびアグロバクテリウムの転移機能によって認識
され、植物に転移する領域の範囲を定める。

【００６４】別の例では、植物細胞は、クローンＤＮＡ
が沈殿しているタングステンマイクロプロジェクタイル
を細胞中に射ち込むことによって形質転換することがで
きる。射ち込みに使用されるBiolistic Apparatus（Bi
o-rad、米国、カリフォルニア州、ハークル）では、充
填火薬（２２口径動力ピストンツールチャージ）または
空気噴射が、銃身を介してプラスチックマイクロプロジ
ェクタイルを発射する。ＤＮＡが沈殿しているタングス
テン粒子の懸濁液の一定量をプラスチックマイクロプロ
ジェクタイルの前方に置く。後者は、マイクロプロジェ
クタイルが通過するには小さすぎる貫通孔を有するアク
リルの停止板に発射される。結果として、プラスチック
マイクロプロジェクタイルは停止板に激突し、タングス
テンマイクロプロジェクタイルは停止板中の孔を通過し
てその標的に進み続ける。本発明の場合、標的は植物細
胞、組織、種子、または胚芽とすることができる。細胞
中に導入された、マイクロプロジェクタイル上のＤＮＡ
は核または葉緑体中のいずれかに組込まれる。

【００６５】トランス遺伝子の植物細胞中への導入と発
現は当事者にとって現在は日常的な操作である。それは
遺伝子発現の研究を実行し、農業上または商業上の利益
のある改良植物変種を得る試みの主要な手段となってい
る。トランスジェニック植物の再生植物発現ベクターで形質転換された植物細胞は、たとえ
ば単独の細胞、カルス組織または葉ディスクから標準植
物組織培養法にしたがって再生することができる。殆ど
すべての植物からの種々の細胞、組織および器官を培養
して、完全な植物に再生することができることは当業者
では公知である。この種の技術はたとえば「Vasil（前
掲）」「Greenら（前掲）」「Weissbach及びWeissbach
（前掲）」「Gelvinら（前掲）」に記載されている。

【００６６】１つの特定の実例では、３５ＳＣａＭＶ
プロモーターとノパリンシンターゼターミネーターの制
御下にありかつ選択マーカー（たとえば、カナマイシン
耐性）を持つクローン化ＡＦＴ１ポリペプチドはアグロ
バクテリウム中に形質転換される。葉ディスク（たとえ
ば、タバコリーフディスク）のベクター含有アグロバク
テリウムによる形質転換はHorsch等（Science、227:122
9、1985）に記載のように実施する。推定形質転換体がカ
ナマイシン含有植物組織培養基（たとえば１００μｇ／
ｍｌ）上に数週間（たとえば、３から５週間）後に選択
される。次いで、カナマイシン耐性の新芽を根を発生さ
せるためのホルモンのない植物組織培地上に置く。カナ
マイシン耐性植物を温室栽培用に選択する。所望に応じ
て、自家稔性のトランスジェニック植物からの種子を土
壌のない培地に播種し、温室中で栽培することができ
る。表面を滅菌した種子をホルモンを含まないカナマイ
シン含有培地に播種して、カナマイシン耐性の子孫を選
択する。トランス遺伝子の組込みについての分析は標準
法で実施する（たとえば、「Ausubelら（前掲）」「Gel
vinら（前掲）」参照）。

【００６７】次いで、選択マーカーを発現するトランス
ジェニック植物をトランスジェニックＤＮＡの転送につ
いてイムノブロットおよびＤＮＡ検出法によってスクリ
ーニングする。各陽性のトランスジェニック植物および
そのトランスジェニック子孫は、同一のトランス遺伝子
で確立された他のトランスジェニック植物と比較して特
有である。トランス遺伝子ＤＮＡの植物ゲノムＤＮＡへ
の組込みは多くの場合無作為であり、組込みの部位はト
ランス遺伝子発現のレベルおよび組織と発生パターンに
大きく影響することがある。その結果、通常多くのトラ
ンスジェニック株が各トランス遺伝子についてスクリー
ニングされ、最も適切な発現プロフィールを持つ植物を
同定し選択する。

【００６８】トランスジェニック株はトランス遺伝子発
現のレベルで評価される。ＲＮＡレベルでの発現が最初
に決定され、発現陽性植物を同定し定量する。その際
は、ＲＮＡ分析の標準法を使用し、それにはトランス遺
伝子ＲＮＡ鋳型のみを増幅するように設計されたオリゴ
ヌクレオチドプライマーを使用するＰＣＲ増幅検定法お
よびトランス遺伝子特異的プローブを使用する溶液ハイ
ブリダイゼーション解析法が含まれる（たとえば「Ausu
belら（前掲）」参照）。次いで、ＲＮＡ陽性植物をタ
ンパク質発現についてＡＦＴ１特異性抗体を使用するウ
エスタンイムノブロット分析法によって分析する（たと
えば「Ausubelら（前掲）」参照）。さらに、標準プロ
トコールによるインサイチュ（細胞内）ハイブリダイゼ
ーションおよび免疫細胞化学を夫々トランス遺伝子特異
的ヌクレオチドプローブおよび抗体を使用して行い、ト
ランスジェニック組織中において発現が極在している部
位を決定することができる。

【００６９】組換えＡＦＴ１ポリペプチドがいずれかの
細胞中またはトランスジェニック植物中で発現されると
（たとえば、上記のように）、それはたとえばアフィニ
ティークロマトグラフィ法を使用して単離することがで
きる。１つの例としては、抗ＡＦＴ１抗原（たとえば
「Ausubelら（前掲）」に記載のようにまたは標準法に
よって生産される）をカラムに結合させ、このポリペプ
チドを単離するのに用いることができる。アフィニティ
ークロマトグラフィ法の前のＡＦＴ１産生細胞の溶解お
よび分画は標準法（たとえば「Ausubelら（前掲）」参
照）で実施することができる。組換えタンパク質は単離
されると、所望に応じて、さらに高性能の液体クロマト
グラフィ法（ＨＰＬＣ）（たとえば「Fisher、Laborator
y Techniques In Biochemistry And Molecular、Wo
rk and Burdon編、Elsevier、1980」参照）により精製す
ることができる。

【００７０】これらのポリペプチドの発現および精製の
一般技術もまた有用なＡＦＴ断片および類似物の生産お
よび単離に使用することができる。

【００７１】しかし、他の用途において、植物細胞また
はトランスジェニック植物中のトランス遺伝子の発現は
望ましい結果とすることができる。これらには、植物の
防御に関するタンパク、例えば、３−Ｏ−メチルトラン
スフェラーゼ又はアスコルビン酸過酸化酵素、又は、植
物の正常な発生を変えるような用途が含まれる。用途ＡＦＴ１またはキメラＡＦＴ１転写活性化因子を形質転
換植物細胞に導入することによって、発生を容易に操作
することができる。例えば、本発明のトランスジェニッ
ク植物によるＡＦＴ１またはＡＦＴ１キメラ転写活性化
因子の発現が、植物遺伝子の発現を変化、単純化及び安
価にし、あるいは調節するために使用することができ
る。これは、例えば、植物の防御メカニズム、植物の貯
蔵タンパク質成分の発現、あるいは、他の多くの植物発
生に関する現象に使用することできる。他の態様本発明にはまた、アブラナ科植物のＡＦＴ１タンパク質
の生物学的に活性な断片または類似体のいずれも含まれ
る。「生物学的に活性な」とは、第１図（配列番号２）
に示したアブラナ科植物のＡＦＴ１ポリペプチドの特徴
である生体内（in vivo）または試験管内（in vitro）
のいずれかの活性を有することを意味する。アブラナ科
植物のＡＦＴ１タンパク質はある範囲の生理学的特性を
示し、且つ、この種の特性がアブラナ科植物のＡＦＴ１
タンパク質分子の異なる部分に起因するため、有用なＡ
ＦＴ１断片またはＡＦＴ１類似体とは、ＡＦＴ１の転写
活性化または結合活性を調べるためのいずれの生物学的
な解析法、例えば、上記の解析法において生物学的活性
を示すものを指す。このようなＡＦＴ１断片またはＡＦ
Ｔ１類似体は、異なる細胞型の発生段階に従って、そし
て、種々の環境因子やホルモンによる信号に応答して、
あるいは、特有のシグナル伝達経路に反応して、機能す
る可能性がある。

【００７２】好適な類似体には、その配列が、野生型の
配列から、保存的なアミノ酸置換、例えばあるアミノ酸
を同様な特性を持つアミノ酸へ置換すること（例えば、
グリシンをバリンへ、リジンをアルギニンへ等）により
変更された、または、そのポリペプチドの生物学的活性
を破壊しない１つ以上の非保存的なアミノ酸置換、欠
失、もしくは挿入により変更された、異なるＡＦＴ１ポ
リペプチド（またはその生物学的活性な断片）が含まれ
る。

【００７３】類似体は天然に存在するＡＦＴ１タンパク
質とアミノ酸配列において異なる可能性があり、または
配列とは関係しない方法による修飾体である可能性、ま
たは、その両方である可能性とがある。本発明において
は、一般的に、天然に存在するＡＦＴ１ポリペプチド配
列の２０個のアミノ酸残基から成る断片と、好適には４
０個のアミノ酸残基から成る断片とまたはさらに好適に
は全配列と、少なくとも７０％、好適には８０％、さら
に好適には９０％、最も好適には９５％、同様に９９％
の相同性を示す。

【００７４】一次配列の改変には、遺伝的変種、天然的
および誘導的の両方が含まれる。天然に存在するＬ−ア
ミノ酸以外の残基、たとえばＤ−アミノ酸、非天然産ま
たは合成アミノ酸例えばβもしくはγアミノ酸を含む類
似体もまた含まれる。その他、安定性の向上はペプチド
分子の環状化によって行うことができる。アセチル化、
メチル化、リン酸化、カルボキシル化またはグリコシル
化を含むポリペプチドの生体内もしくは試験管内の化学
誘導体形成によって修飾されたクルーシファＡＦＴ１ポ
リペプチドも本発明に含まれる。

【００７５】実質的に完全長のポリペプチドの外に、本
発明はそのポリペプチドの生物学的活性な断片も含む。
本明細書において用いられているように、ポリペプチド
に適用されている用語「断片」は、通常少なくとも２０
個の残基、さらに典型的には少なくとも４０個の残基、
好適には少なくとも６０個の残基の全長である。アブラ
ナ科植物のＡＦＴ１タンパク質の断片は当業者に公知の
方法で作製することができる。候補断片がＡＦＴ１の生
物学的活性を示す能力は、本明細書に記載の方法によっ
て評価することができる。このペプチドの生物学的活性
に必要でない残基、たとえば別のｍＲＮＡスプライシン
グや別のタンパク質プロセッシングにより付加される残
基を含有するＡＦＴ１ポリペプチドも本発明に含まれ
る。

【００７６】

【配列表】

配列番号:1 配列の長さ:845 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: AAAAAAAAAT CAAATCTCTC TCTTTCTCTC TCTAATGGCG GCGACATTAG GCAGAGACCA 60 GTATGTGTAC ATGGCGAAGC TCGCCGAGCA GGCGGAGCGT TACGAAGAGA TGGTTCAATT 120 CATGGAACAG CTCGTTACAG GCGCTACTCC AGCGGAAGAG CTCACCGTTG AAGAGAGGAA 180 TCTCCTCTCT GTTGCTTACA AGAACGTGAT CGGATCTCTA CGCGCCGCCT GGAGGATCGT 240 GTCTTCGATT GAGCAGAAGG AAGAGAGTAG GAAGAACGAC GAGCACGTGT CGCTTGTCAA 300 GGATTACAGA TCTAAAGTTG AGTCTGAGCT TTCTTCTGTT TGCTCTGGAA TCCTTAAGCT 360 CCTTGACTCG CATCTGATCC CATCTGCTGG AGCGAGTGAG TCTAAGGTCT TTTACTTGAA 420 GATGAAAGGT GATTATCATC GGTACATGGC TGAGTTTAAG TCTGGTGATG AGAGGAAAAC 480 TGCTGCTGAA GATACCATGC TCGCTTACAA AGCAGCTCAG GATATCGCAG CTGCGGATAT 540 GGCACCTACT CATCCGATAA GGCTTGGTCT GGCCCTGAAT TTCTCAGTGT TCTACTATGA 600 GATTCTCAAT TCTTCAGACA AAGCTTGTAA CATGGCCAAA CAGGCTTTTG AGGAGGCCAT 660 AGCTGAGCTT GACACTCTGG GAGAGGAATC CTACAAAGAC AGCACTCTCA TAATGCAGTT 720 GCTGAGGGAC AATTTAACCC TTTGGACCTC CGATATGCAG GAGCAGATGG ACGAGGCCTG 780 AGGATCTAGA TGAAGGGGGG GAGGGTTGTT ACGCGATGTT TCTGCCACCA AATCGATCTC 840 AAAAT 845 配列番号:2 配列の長さ:248 配列の型:アミノ酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: Met Ala Ala Thr Leu Gly Arg Asp Gln Tyr Val Tyr Met Ala Lys Leu 1 5 10 15 Ala Glu Gln Ala Glu Arg Tyr Glu Glu Met Val Gln Phe Met Glu Gln 20 25 30 Leu Val Thr Gly Ala Thr Pro Ala Glu Glu Leu Thr Val Glu Glu Arg 35 40 45 Asn Leu Leu Ser Val Ala Tyr Lys Asn Val Ile Gly Ser Leu Arg Ala 50 55 60 Ala Trp Arg Ile Val Ser Ser Ile Glu Gln Lys Glu Glu Ser Arg Lys 65 70 75 80 Asn Asp Glu His Val Ser Leu Val Lys Asp Tyr Arg Ser Lys Val Glu 85 90 95 Ser Glu Leu Ser Ser Val Cys Ser Gly Ile Leu Lys Leu Leu Asp Ser 100 105 110 His Leu Ile Pro Ser Ala Gly Ala Ser Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu 115 120 125 Lys Met Lys Gly Asp Tyr His Arg Tyr Met Ala Glu Phe Lys Ser Gly 130 135 140 Asp Glu Arg Lys Thr Ala Ala Glu Asp Thr Met Leu Ala Tyr Lys Ala 145 150 155 160 Ala Gln Asp Ile Ala Ala Ala Asp Met Ala Pro Thr His Pro Ile Arg 165 170 175 Leu Gly Leu Ala Leu Asn Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Leu Asn 180 185 190 Ser Ser Asp Lys Ala Cys Asn Met Ala Lys Gln Ala Phe Glu Glu Ala 195 200 205 Ile Ala Glu Leu Asp Thr Leu Gly Glu Glu Ser Tyr Lys Asp Ser Thr 210 215 220 Leu Ile Met Gln Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp 225 230 235 240 Met Gln Glu Gln Met Asp Glu Ala 245 配列番号:3 配列の長さ:27 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: GCGGAATTCA TGAGGCCCAT TAAAATT 27 配列番号:4 配列の長さ:27 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: GTAGGATCCG GTCGGATTTC TTGTCGC 27 配列番号:5 配列の長さ:27 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: CGCGAATTCA ATAGCGACAA GTACGAT 27 配列番号:6 配列の長さ:28 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: GTAGGATCCG TCTCTCTTCC AAGGTAGA 28 配列番号:7 配列の長さ:31 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー: 直鎖状配列: GATCCTAGAA TTCAAGAAGA ATCGGCGTGG C 31 配列番号:8 配列の長さ:29 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: CTGACTGAAT TCATGGCGGC GACATTAGG 29 配列番号:9 配列の長さ:29 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: GACTGAGTCG ACCCTTCATC TAGATCCTC 29 配列番号:10 配列の長さ:30 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: GACTGACTCG AGCCTTCATC TAGATCCTCA 30 配列番号:11 配列の長さ:29 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: CTGACTGAAT TCGAGTCTAA GGTCTTTAC 29 配列番号:12 配列の長さ:30 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: GACTGACTCG AGACTCGCTC CAGCAGATGG 30 配列番号:13 配列の長さ:30 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: GACTGACTCG AGTGAAGAAT TGAGAATCTC 30 配列番号:14 配列の長さ:30 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: GACTGAGTCG ACACTCGCTC CAGCAGATGG 30 配列番号:15 配列の長さ:30 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: GACTGAGTCG ACTGAAGAAT TGAGAATCTC 30 配列番号:16 配列の長さ:31 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: CTGACTGAAT TCGTTACAGG CGCTACTCCA G 31 配列番号:17 配列の長さ:567 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: TCACCCAGAG AGGTCAGGCT TTGATGGACC ATGGACCCAA GAGCCGCTGA AGTTTGACAA 60 CTCCTACTTC GTGGAACTGC TGAAAGGAGA ATCAGAGGGC TTGTTGAAAC TTCCAACTGA 120 CAAGACCTTA TTGGAAGACC CGGAGTTCCG TCGTCTTGTT GAGCTTTATG CAAAGGATGA 180 AGATGCATTC TTCAGAGACT ACGCGGAATC GCACAAGAAA CTCTCTGAGC TTGGTTTCAA 240 CCCAAACTCC TCAGCAGGCA AAGCAGTTGC AGACAGCACG ATTCTGGCAC AGAGTGCGTT 300 CGGGGTTGCA GTTGCTGCTG CGGTTGTGGC ATTTGGTTAC TTTTACGAGA TTCGGAAGAG 360 GATGAAGTAA ACGAAATAGG AAGGAAAACA CGAAGCAACG ATGCTCTTAT TTGGGTATTA 420 AAGAAACTAT TAATCGTCTA TCGAATCTAT TTTGCTGCTA CAAGATTCTA AACTCTTTGA 480 ATCCACGATT CCACTGTTTA GTAGTAAAAA AGTTAAAAAG TCAATATTTT GGGTCCGTGA 540 TTCATTTTTG CGATAAA 557 配列番号:18 配列の長さ:122 配列の型:アミノ酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: His Pro Glu Arg Ser Gly Phe Asp Gly Pro Trp Thr Gln Glu Pro Leu 1 5 10 15 Lys Phe Asp Asn Ser Tyr Phe Val Glu Leu Leu Lys Gly Glu Ser Glu 20 25 30 Gly Leu Leu Lys Leu Pro Thr Asp Lys Thr Leu Leu Glu Asp Pro Glu 35 40 45 Phe Arg Arg Leu Val Glu Leu Tyr Ala Lys Asp Glu Asp Ala Phe Phe 50 55 60 Arg Asp Tyr Ala Glu Ser His Lys Lys Leu Ser Glu Leu Gly Phe Asn 65 70 75 80 Pro Asn Ser Ser Ala Gly Lys Ala Val Ala Asp Ser Thr Ile Leu Ala 85 90 95 Gln Ser Ala Phe Gly Val Ala Val Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Gly 100 105 110 Tyr Phe Tyr Glu Ile Arg Lys Arg Met Lys 115 120 配列番号:19 配列の長さ:478 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: GAGTGACGAA CATTGCGTGA AATTCTTGAA GAACTGCTAC GAGTCACTTC CAGAGGATGG 60 AAAAGTGATA TTAGCAGAGT GTATTCTTCC AGAGACACCA GACTCAAGCC TCTCAACCAA 120 ACAAGTAGTC CATGTCGATT GCATTATGTT GGCTCACAAT CCCGGAGGCA AAGAACGAAC 180 CGAGAAAGAG TTTGAGGCAT TAGCCAAAGC ATCAGGCTTC AAGGGCATCA AAGTTGTCTG 240 CGACGCTTTT GGTGTTAACC TTATTGAGTT ACTCAAGAAG CTCTAAAAAC AAACAATGTT 300 CCTATGAAGA TGATTTATAT GTAAACATTA TCTCATATCT CCTTCCACGG TTCCAAAACT 360 ATGCTGTTTA ATAATGGTTT TTACAAGAAT TTGATTATGA GTTTGTATTT TTGTTTGTTT 420 GGAACAAAAT TATGTGATTA TAGGGAAAAA TAAAATGAGC TATTATTGAA GAAAAAAA 478 配列番号:20 配列の長さ:94 配列の型:アミノ酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: Ser Asp Glu His Cys Val Lys Phe Leu Lys Asn Cys Tyr Glu Ser Leu 1 5 10 15 Pro Glu Asp Gly Lys Val Ile Leu Ala Glu Cys Ile Leu Pro Glu Thr 20 25 30 Pro Asp Ser Ser Leu Ser Thr Lys Gln Val Val His Val Asp Cys Ile 35 40 45 Met Leu Ala His Asn Pro Gly Gly Lys Glu Arg Thr Glu Lys Glu Phe 50 55 60 Glu Ala Leu Ala Lys Ala Ser Gly Phe Lys Gly Ile Lys Val Val Cys 65 70 75 80 Asp Ala Phe Gly Val Asn Leu Ile Glu Leu Leu Lys Lys Leu 85 90 配列番号:21 配列の長さ:1357 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: CCAGATTATC CCTCCCCCGA ATTCGGCACG AGGAAAAATC CTCTTCTTTC AGATGAGAAA 60 CCCAAATCGA CGGAGGAGAA TAAGAGTTCT AAGCCGGAAT CAGCTTCTGG GAGTTCAACT 120 TCATCAGCTA TGCCTGGCTT GAATTTCAAT GCTTTTGATT TCTCTAATAT GGCTAGTATT 180 CTCAACGATC CTAGCATCAG AGAAATGGCT GAGCAAATAG CTAAAGATCC TGCCTTTAAC 240 CAATTGGCTG AGCAGCTTCA GAGATCTATT CCTAACGCTG GCCAGGAAGG TGGTTTCCCT 300 AACTTTGATC CTCAACAGTA TGTCAATACA ATGCAACAGG TTATGCATAA CCCTGAGTTT 360 AAGACAATGG CCGAGAAACT TGGTACCGCC TTAGTTCAGG ATCCACAAAT GTCTCCTTTT 420 TTGGATGCTT TCTCGAATCC TGAAACAGCA GAACACTTTA CTGAGCGTAT GGCGCGGATG 480 AAAGAAGATC CAGAGTTGAA ACCTATACTA GATGAGATTG ATGCTGGTGG TCCTTCTGCC 540 ATGATGAAGT ACTGGAATGA TCCAGAAGTG CTGAAAAAGC TGGGTGAAGC AATGGGTATG 600 CCTGTTGCTG GCTTACCAGA CCAGACTGTT TCAGCTGAAC CTGAGGTAGC AGAAGAAGGT 660 GAAGAAGAAG AGTCTATTGT TCACCAAACT GCCAGTCTTG GTGATGTTGA GGGTTTGAAA 720 GCTGCCTTGG CATCTGGTGG TAACAAAGAT GAAGAAGATT CTGAAGGAAG GACAGCATTG 780 CATTTTGCTT GTGGATACGG CGAGTTGAAA TGTGCTCAAG TTCTTATCGA TGCTGGAGCA 840 AGTGTTAATG CGGTTGACAA AAACAAGAAC ACACCTCTGC ATTATGCTGC TGGTTACGGG 900 AGGAAAGAGA GTGTAAGCCT TCTCCTGGAG AATGGTGCTG CAGTCACTCT GCAAAACCTA 960 GACGAGAAGA CGCCAATTGA TGTAGCGAAG CTCAACAGCC AGCTGGAGGT GGTGAAGCTG 1020 CTTGAGAAGG ATGCTTTCCT TTGAGCTCTG CTGGTTAAAG GAAAGCTCTA AGCTCATATT 1080 GTCTTTGAGG CATTTGTCTT GTGTGTGTCC TGAACCAGTT TCACAGGCTT TTTGTGTACA 1140 CTTTTTATTA GTTCCTCTCT TCTTCTAAAT TTGTCTCTTA TGTTGTTTTA AAAGTCAATA 1200 AAGAAAGAAA TAGCAATCAA TGATTTAATT TATGATTATA TTCTTTATTT CGTCGACCTC 1260 TACAGAATGA TTCAATTTGG AAGAATCATT CTGGTTTGGA GGATATGTAA GAAAAACTAC 1320 TTGATCTCCA AGTTATTCCA TTCTTCTGTT GAAAAAA 1357 配列番号:22 配列の長さ: 339 配列の型: アミノ酸鎖の数: 一本鎖トポロジー: 直鎖状配列: Gly Thr Arg Lys Asn Pro Leu Leu Ser Asp Glu Lys Pro Lys Ser Thr 1 5 10 15 Glu Glu Asn Lys Ser Ser Lys Pro Glu Ser Ala Ser Gly Ser Ser Thr 20 25 30 Ser Ser Ala Met Pro Gly Leu Asn Phe Asn Ala Phe Asp Phe Ser Asn 35 40 45 Met Ala Ser Ile Leu Asn Asp Pro Ser Ile Arg Glu Met Ala Glu Gln 50 55 60 Ile Ala Lys Asp Pro Ala Phe Asn Gln Leu Ala Glu Gln Leu Gln Arg 65 70 75 80 Ser Ile Pro Asn Ala Gly Gln Glu Gly Gly Phe Pro Asn Phe Asp Pro 85 90 95 Gln Gln Tyr Val Asn Thr Met Gln Gln Val Met His Asn Pro Glu Phe 100 105 110 Lys Thr Met Ala Glu Lys Leu Gly Thr Ala Leu Val Gln Asp Pro Gln 115 120 125 Met Ser Pro Phe Leu Asp Ala Phe Ser Asn Pro Glu Thr Ala Glu His 130 135 140 Phe Thr Glu Arg Met Ala Arg Met Lys Glu Asp Pro Glu Leu Lys Pro 145 150 155 160 Ile Leu Asp Glu Ile Asp Ala Gly Gly Pro Ser Ala Met Met Lys Tyr 165 170 175 Trp Asn Asp Pro Glu Val Leu Lys Lys Leu Gly Glu Ala Met Gly Met 180 185 190 Pro Val Ala Gly Leu Pro Asp Gln Thr Val Ser Ala Glu Pro Glu Val 195 200 205 Ala Glu Glu Gly Glu Glu Glu Glu Ser Ile Val His Gln Thr Ala Ser 210 215 220 Leu Gly Asp Val Glu Gly Leu Lys Ala Ala Leu Ala Ser Gly Gly Asn 225 230 235 240 Lys Asp Glu Glu Asp Ser Glu Gly Arg Thr Ala Leu His Phe Ala Cys 245 250 255 Gly Tyr Gly Glu Leu Lys Cys Ala Gln Val Leu Ile Asp Ala Gly Ala 260 265 270 Ser Val Asn Ala Val Asp Lys Asn Lys Asn Thr Pro Leu His Tyr Ala 275 280 285 Ala Gly Tyr Gly Arg Lys Glu Ser Val Ser Leu Leu Leu Glu Asn Gly 290 295 300 Ala Ala Val Thr Leu Gln Asn Leu Asp Glu Lys Thr Pro Ile Asp Val 305 310 315 320 Ala Lys Leu Asn Ser Gln Leu Glu Val Val Lys Leu Leu Glu Lys Asp 325 330 335 Ala Phe Leu 配列番号:23 配列の長さ:663 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: TTTTAAAAAA TTTTGCCATC AACCGTAGAT GTTCCGCCAA AGGGTGGGTT TAGCTTCGAT 60 CTGTGTAAGA GAAATGATAT TCTTACACAA AAGGGTCTTA AAGCTCCGTC TTTTTTGAAG 120 ACTGGAACAA CCATTGTTGG TTTGATTTTC AAGGATGGTG TGATACAAGG GGCAGATACC 180 CGAGCAACTG AGGGGCCAAT TGTTGCTGAT AAGAACTGTG AGAAGATTCA CTATATGGCA 240 CCAAACATAT ATTGCTGTGG TGCAGGAACT CGGGCTGATA CTGAAGCAGT CACTGATATG 300 GTCAGCTCAC AGCTGCGATT GCATCGTTAC CAGACTGGTC GAGACTCTCG GGTCATTACT 360 GCTTTGACCC TTCTCAAAAA ACATTTTTTC AGCTACCAAG GTCATGTCTC TGCTGCTCTT 420 GTACTCGGTG GAGTTGATAT CACTGGTCCA CATCTGCATA CTATATACCC ACACGGTTCA 480 ACTGACACTC TTCCATTCGC CACAATGGGT TCGGGTTCTC TTGCTGCTAT GTCTGTGTTT 540 GAGGCAAAGT ATAAAGAAGG CCTAACTAGG GATGAAGGAA TTAAGCTGGT CGCTGAATCC 600 ATATGCTCGG GTATATCCAA TGACCTGGGT AGTGGTAGCA ACGTGGACAT CTGCGTGATC 660 ACA 663 配列番号:24 配列の長さ:219 配列の型:アミノ酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: Lys Ile Leu Pro Ser Thr Val Asp Val Pro Pro Lys Gly Gly Phe Ser 1 5 10 15 Phe Asp Leu Cys Lys Arg Asn Asp Ile Leu Thr Gln Lys Gly Leu Lys 20 25 30 Ala Pro Ser Phe Leu Lys Thr Gly Thr Thr Ile Val Gly Leu Ile Phe 35 40 45 Lys Asp Gly Val Ile Gln Gly Ala Asp Thr Arg Ala Thr Glu Gly Pro 50 55 60 Ile Val Ala Asp Lys Asn Cys Glu Lys Ile His Tyr Met Ala Pro Asn 65 70 75 80 Ile Tyr Cys Cys Gly Ala Gly Thr Arg Ala Asp Thr Glu Ala Val Thr 85 90 95 Asp Met Val Ser Ser Gln Leu Arg Leu His Arg Tyr Gln Thr Gly Arg 100 105 110 Asp Ser Arg Val Ile Thr Ala Leu Thr Leu Leu Lys Lys His Phe Phe 115 120 125 Ser Tyr Gln Gly His Val Ser Ala Ala Leu Val Leu Gly Gly Val Asp 130 135 140 Ile Thr Gly Pro His Leu His Thr Ile Tyr Pro His Gly Ser Thr Asp 145 150 155 160 Thr Leu Pro Phe Ala Thr Met Gly Ser Gly Ser Leu Ala Ala Met Ser 165 170 175 Val Phe Glu Ala Lys Tyr Lys Glu Gly Leu Thr Arg Asp Glu Gly Ile 180 185 190 Lys Leu Val Ala Glu Ser Ile Cys Ser Gly Ile Ser Asn Asp Leu Gly 195 200 205 Ser Gly Ser Asn Val Asp Ile Cys Val Ile Thr 210 215 配列番号:25 配列の長さ:976 配列の型:核酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: ACGAGAGGCC CTGAGACGCG GCAGATATCA GGTCCTGCGA CTTCAACACA GATCAGGAAC 60 TTCACATTAT GTCAGCATCT GCAAGGAATC CACACACATA TCTCATCCAT GGTAGCGGAC 120 CTTCCCAGTA TTGCTACTGA TGTATTGTCT CCTTATCTGG CTGCAATCTA TAATGCGGCA 180 TGTGAGCCAG TTACACCTTT GTTTAAAGCA ATGCGAGACA AGCTCGAGTC ATGCATTCTT 240 CAAATCCATG ATCAAAACTT TGGTGCTGAT GACGCTGACA TGGACAACAA CGCTTCCTCA 300 TACATGGAGG AGTTGCAGAG ATCGATTCTT CACTTCCGCA AGGAGTTCCT ATCTAGACTA 360 TTGCCTTCCG CAGCAAATGC TAACACTGCA GGAACAGAAT CGATCTGCAC AAGACTCACA 420 AGACAAATGG CGTCAAGGGT TTTGATCTTC TACATCAGAC ATGCATCCCT TGTGCGACCA 480 CTTTCAGAAT GGGGAAAACT CAGAATGGCC AAAGACATGG CCGAGCTGGA ACTAGCAGTG 540 GGACAGAATC TATTTCCCGT GGAACAACTC GGAGCACCGT ACAGAGCTCT TAGAGCGTTT 600 AGGCCTTTGG TTTTCCTGGA AACATCTCAA ATGGGATCAT CTCCTCTCAT CAATGATCTA 660 CCACCGAGCA TCGTCCTACA TCATCTCTAC ACAAGAGGCC CAGACGAGTT AGAGTCACCG 720 ATGCAGAAGA ACAGACTAAG TCCTAAACAG TACTCACTGT GGCTTGATAA CCAAAGAGAG 780 GATCAGATCT GGAAAGGGAT AAAAGCAACT TTGGATGATT ATGCAGTGAA GATCAGATCG 840 AGAGGGGACA AAGAGTTTAG TCCAGGTTAT CCTCTAATGC TTCAAATTGG TTCATCTTTA 900 ACACAAGAAA ACTTATAAGC TGTGCTTTGT TACCGAATCA ATATTCTTCT ATTGCGAACT 960 TTTTTGTCTC AAAAAA 976 配列番号26 配列の長さ:305 配列の型:アミノ酸鎖の数:一本鎖トポロジー:直鎖状配列: Thr Arg Gly Pro Glu Thr Arg Gln Ile Ser Gly Pro Ala Thr Ser Thr 1 5 10 15 Gln Ile Arg Asn Phe Thr Leu Cys Gln His Leu Gln Gly Ile His Thr 20 25 30 His Ile Ser Ser Met Val Ala Asp Leu Pro Ser Ile Ala Thr Asp Val 35 40 45 Leu Ser Pro Tyr Leu Ala Ala Ile Tyr Asn Ala Ala Cys Glu Pro Val 50 55 60 Thr Pro Leu Phe Lys Ala Met Arg Asp Lys Leu Glu Ser Cys Ile Leu 65 70 75 80 Gln Ile His Asp Gln Asn Phe Gly Ala Asp Asp Ala Asp Met Asp Asn 85 90 95 Asn Ala Ser Ser Tyr Met Glu Glu Leu Gln Arg Ser Ile Leu His Phe 100 105 110 Arg Lys Glu Phe Leu Ser Arg Leu Leu Pro Ser Ala Ala Asn Ala Asn 115 120 125 Thr Ala Gly Thr Glu Ser Ile Cys Thr Arg Leu Thr Arg Gln Met Ala 130 135 140 Ser Arg Val Leu Ile Phe Tyr Ile Arg His Ala Ser Leu Val Arg Pro 145 150 155 160 Leu Ser Glu Trp Gly Lys Leu Arg Met Ala Lys Asp Met Ala Glu Leu 165 170 175 Glu Leu Ala Val Gly Gln Asn Leu Phe Pro Val Glu Gln Leu Gly Ala 180 185 190 Pro Tyr Arg Ala Leu Arg Ala Phe Arg Pro Leu Val Phe Leu Glu Thr 195 200 205 Ser Gln Met Gly Ser Ser Pro Leu Ile Asn Asp Leu Pro Pro Ser Ile 210 215 220 Val Leu His His Leu Tyr Thr Arg Gly Pro Asp Glu Leu Glu Ser Pro 225 230 235 240 Met Gln Lys Asn Arg Leu Ser Pro Lys Gln Tyr Ser Leu Trp Leu Asp 245 250 255 Asn Gln Arg Glu Asp Gln Ile Trp Lys Gly Ile Lys Ala Thr Leu Asp 260 265 270 Asp Tyr Ala Val Lys Ile Arg Ser Arg Gly Asp Lys Glu Phe Ser Pro 275 280 285 Gly Tyr Pro Leu Met Leu Gln Ile Gly Ser Ser Leu Thr Gln Glu Asn 290 295 300 Leu 305

【図面の簡単な説明】

【図１】配列番号１の核酸配列及びアラビドプシスＡ
ＦＴ１の推定されたアミノ酸配列（配列番号２）であ
る。

【図２】ＡＦＴ１によるＬＥＵ２発現のＬｅｘＡ依存
活性化を示す図である。活性化は、ロイシン非含有培地
上の酵母の生育をモニターすることにより行う。ｐＪＧ
４−５ベクターを用いて作成したＡＦＴ１／Ｂ４２融合
タンパク質の産生を導くＡＦＴ１クローンは、既に複数
の異種プラスミドが導入された酵母株ＥＧＹ４８に導入
された。別のＬｅｘＡ融合タンパク質または非ＬｅｘＡ
タンパク質のいずれかの産生を誘導する前記プラスミド
は、ｐＥＧ２０２（ＬｅｘＡのみ、ａ）、ｐＨＭ１−１
（ＬｅｘＡ／Ｂｉｏｃｏｉｄ、ｂ）、ｐＨＭ１２（Ｌｅ
ｘＡ／Ｃｄｃ２、ｃ）、ｐＨＭ７−３（ＬｅｘＡ／Ｆｔ
ｚ、ホメオドメイン、ｄ）、ｐＡＫＲ１−２６１（Ｌｅ
ｘＡ／ＡＫＲ１−２６１、ｅ）、ｐＡＫＲ２４９−４３
４（ＬｅｘＡ／ＡＫＲ２４９−４３４、ｆ）、ｐＡＫＲ
１１４−４３４（ＬｅｘＡ／ＡＫＲ１１４−４３４、
ｇ）ｐＨＭ（非ＬｅｘＡ、ｈ）である。

【図３】図３Ａ及びＢは、ＡＦＴ１による転写活性化を
示す概略図である。種々の融合タンパク質の影響は、ロ
イシン非存在下、酵母の生育によりモニターされ、β−
ガラクトシダーゼ活性を測定することにより定量化され
る。パネルＡは、ＡＦＴ１または及び転写活性化ドメイ
ンＢ４２を融合させたＡＦＴ１誘導体を酵母株ＥＧＹ４
８へ導入した際の転写活性化を示している。ＥＧＹ４８
株は、ＬｅｘＡタンパク質を構成的に産生しているプラ
スミドｐＥＧ２０２と、ＬｅｘＡｏｐ−ＬａｃＺリポー
ター遺伝子を含むｐＳＨ１８−３４とを予め保持させて
ある。パネルＢは、ＡＦＴ１または及び転写活性化ドメ
インＢ４２を融合させたＡＦＴ１誘導体を、ｐＳＨ１８
−３４のみを予め保持させた酵母株ＥＧＹ４８へ導入し
た際の転写活性化を示している。

【図４】ゲノムのサザンブロット解析を示す図である。
プローブとしてラベルされたＡＦＴ１ｃＤＮＡクロー
ンを用いた。Ｃと表記されたレーンにはコロンビアＤＮ
Ａを、ＬにはリンズバークＤＮＡを乗せている。解析に
用いた制限酵素は、各レーンの上に示した。λファージ
ゲノムのＨｉｎｄIII切断産物であるサイズマーカー
は、一番左のレーンに示されている。

【図５】５Ａ、Ｂ及びＣは、ＡＦＴ１発現のＲＮＡ（ノ
ーザン）ブロット解析を示す図である。パネル（Ａ）
は、植物の発達と共に上昇するＡＦＴ１の発現を示す図
である。ＲＮＡは、温室栽培植物より抽出した。パネル
（Ｂ）は、ＡＦＴ１の組織特異的発現を示す図である。
葉、根及び茎由来のＲＮＡは、プレート栽培植物より抽
出した。そして、花及び長角果由来のＲＮＡは、温室栽
培植物より抽出した。パネル（Ｃ）は、Ｌｈｃａ２及び
ＡＦＴ１の発現における光の効果を示す図である。ＲＮ
Ａは、温室栽培植物より抽出した。

【図６】アスコルビン酸過酸化酵素をコードするＡＦ
Ｔ１相互作用タンパク質であることが判明した、単離し
たｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号１７）を示す図であ
る。

【図７】単離したｃＤＮＡ（配列番号１７）から推定
されるアスコルビン酸過酸化酵素の部分アミノ酸配列
（配列番号１８）を示す図である。

【図８】３−Ｏ−メチルトランスフェラーゼをコード
するＡＦＴ１相互作用タンパク質であることが判明し
た、ｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号１９）を示す図で
ある。

【図９】単離したｃＤＮＡ（配列番号１９）から推定
される３−Ｏメチルトランスフェラーゼの部分アミノ酸
配列（配列番号２０）を示す図である。

【図１０】アラビドプシスアンクラインリピーテ
ィングタンパク質ＡＫＲ ₂ をコードするＡＦＴ１相互
作用タンパク質であることが判明した、単離ｃＤＮＡの
ＤＮＡ配列（配列番号２１）を示す図である。

【図１１】単離したｃＤＮＡ（配列番号２１）から推
定されるアラビドプシスアンクラインリピーティン
グタンパク質ＡＫＲ ₂ の部分アミノ酸配列（配列番号
２２）を示す図である。

【図１２】プロテオソームをコードするＡＦＴ１相互
作用タンパク質であることが判明した、単離したｃＤＮ
ＡのＤＮＡ配列（配列番号２３）を示す図である。

【図１３】単離したｃＤＮＡ（配列番号２３）から推
定されるプロテオソームの部分アミノ酸配列（配列番号
２４）を示す図である。

【図１４】ＡＦＴ１相互作用タンパク質であることが
判明した、単離したｃＤＮＡのＤＮＡ配列（配列番号２
５）を示す図である。

【図１５】単離したｃＤＮＡ（配列番号２５）から推
定される部分アミノ酸配列（配列番号２６）を示す図で
ある。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成８年８月２９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】ＡＦＴ１によるＬＥＵ２発現のＬｅｘＡ依存
活性化に係る生物の形態を示す写真である。活性化は、
ロイシン非含有培地上の酵母の生育をモニターすること
により行う。ｐＪＧ４−５ベクターを用いて作成したＡ
ＦＴ１／Ｂ４２融合タンパク質の産生を導くＡＦＴ１ク
ローンは、既に複数の異種プラスミドが導入された酵母
株ＥＧＹ４８に導入された。別のＬｅｘＡ融合タンパク
質または非ＬｅｘＡタンパク質のいずれかの産生を誘導
する前記プラスミドは、ｐＥＧ２０２（ＬｅｘＡのみ、
ａ）、ｐＨＭ１−１（ＬｅｘＡ／Ｂｉｏｃｏｉｄ、
ｂ）、ｐＨＭ１２（ＬｅｘＡ／Ｃｄｃ２、ｃ）、ｐＨＭ
７−３（ＬｅｘＡ／Ｆｔｚ、ホメオドメイン、ｄ）、ｐ
ＡＫＲ１−２６１（ＬｅｘＡ／ＡＫＲ１−２６１、
ｅ）、ｐＡＫＲ２４９−４３４（ＬｅｘＡ／ＡＫＲ２４
９−４３４、ｆ）、ｐＡＫＲ１１４−４３４（ＬｅｘＡ
／ＡＫＲ１１４−４３４、ｇ）ｐＨＭ（非ＬｅｘＡ、
ｈ）である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】ゲノムのサザンブロット解析の結果を示す電気
泳動写真である。プローブとしてラベルされたＡＦＴ１
ｃＤＮＡクローンを用いた。Ｃと表記されたレーンに
はコロンビアＤＮＡを、ＬにはリンズバークＤＮＡを乗
せている。解析に用いた制限酵素は、各レーンの上に示
した。λファージゲノムのＨｉｎｄＩＩＩ切断産物であ
るサイズマーカーは、一番左のレーンに示されている。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】５Ａ、Ｂ及びＣは、ＡＦＴ１発現のＲＮＡ（ノ
ーザン）ブロット解析の結果を示す電気泳動写真であ
る。パネル（Ａ）は、植物の発達と共に上昇するＡＦＴ
１の発現を示す写真である。ＲＮＡは、温室栽培植物よ
り抽出した。パネル（Ｂ）は、ＡＦＴ１の組織特異的発
現を示す写真である。葉、根及び茎由来のＲＮＡは、プ
レート栽培植物より抽出した。そして、花及び長角果由
来のＲＮＡは、温室栽培植物より抽出した。パネル
（Ｃ）は、Ｌｈｃａ２及びＡＦＴ１の発現における光の
効果を示す写真である。ＲＮＡは、温室栽培植物より抽
出した。

【手続補正４】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図２

【補正方法】変更

【補正内容】

【図２】

【手続補正５】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

【手続補正６】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】組換えＡＦＴ１（アラビドプシス14-3-3
1）ポリペプチド。
【請求項２】配列番号２に記載されたＡＦＴ１のアミ
ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む組換えポ
リペプチド。
【請求項３】転写を活性化する能力を有する領域を含
むＡＦＴ１ポリペプチドの断片または類似体である組換
えポリペプチド。
【請求項４】請求項３のポリペプチドであって、前記
ポリペプチドがＡＦＴ１のアミノ酸配列３４から２４８
残基又はＡＦＴ１のアミノ酸１２２から２４８残基から
なることを特徴とするポリペプチド。
【請求項５】請求項１、２又は３のポリペプチドであ
って、前記ポリペプチドが、植物由来であることを特徴
とするポリペプチド。
【請求項６】請求項５のポリペプチドであって、前記
植物がアブラナ科植物であることを特徴とするポリペプ
チド。
【請求項７】請求項６のポリペプチドであって、前記
植物がアラビドプシスであることを特徴とするポリペプ
チド。
【請求項８】ＤＮＡ結合ポリペプチドと融合させたＡ
ＦＴ１ポリペプチドを含むキメラＡＦＴ１転写活性化タ
ンパク。
【請求項９】請求項８のキメラＡＦＴ１転写活性化タ
ンパクであって、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドがＧａｌ
４又はＬｅｘＡから成ることを特徴とするキメラＡＦＴ
１転写活性化タンパク。
【請求項１０】構成的又は制御プロモーターと作用可
能に連結したＡＦＴ１ポリペプチドからなるトランス遺
伝子を含むトランスジェニック植物。
【請求項１１】請求項８のキメラＡＦＴ１を含むトラ
ンス遺伝子を保持するトランスジェニック植物。
【請求項１２】請求項１０又は１１のトランスジェニ
ック植物由来の種子。
【請求項１３】請求項１０又は１１のトランスジェニ
ック植物由来の細胞。
【請求項１４】所望のポリペプチドを発現するトラン
スジェニック植物であって、前記所望のポリペプチド
が、ａ）請求項８のキメラＡＦＴ１転写活性化タンパクをコ
ードする核酸配列と、ｂ）発現可能な遺伝子構築物において前記所望のポリペ
プチドをコードする核酸とから成り、前記キメラタンパ
クの結合により、前記所望のポリペプチドの発現を調節
することを特徴とするトランスジェニック植物。
【請求項１５】植物貯蔵タンパク遺伝子転写物を含む
ことを特徴とする、請求項１４のトランスジェニック植
物が産生するポリペプチド。
【請求項１６】ＡＦＴ１タンパクをコードする実質的
に純粋なＤＮＡ。
【請求項１７】配列番号１に記載されたＡＦＴ１ポリ
ペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸を含
む組換えポリペプチドをコードする実質的に純粋なＤＮ
Ａ。
【請求項１８】請求項１６又は１７のＤＮＡであっ
て、該ＤＮＡが、構成的または制御型プロモーターと作
用可能に結合していることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項１９】請求項１８のＤＮＡであって、前記Ｄ
ＮＡがｃＤＮＡであることを特徴とするＤＮＡ。
【請求項２０】請求項１８のＤＮＡであって、該ＤＮ
Ａがアブラナ科植物由来であることを特徴とするＤＮ
Ａ。
【請求項２１】ＡＦＴ１をコードする実質的に純粋な
ＤＮＡを含むベクターであって、該ベクターが、導入さ
れた細胞内において該ＤＮＡによりコードされたタンパ
クの発現を誘導できることを特徴とするベクター。
【請求項２２】請求項１６又は１７のＤＮＡまたは請
求項２１のベクターが導入された細胞。
【請求項２３】請求項２２の細胞であって、該細胞が
植物細胞であることを特徴とする細胞。
【請求項２４】ＡＦＴ１をコードする実質的に純粋な
ＤＮＡを保持するトランスジェニック植物。
【請求項２５】配列番号２に記載されたＡＦＴ１ポリ
ペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列
を含む組換えポリペプチドをコードする実質的に純粋な
ＤＮＡを含むトランスジェニック植物。
【請求項２６】請求項２４又は２５のトランスジェニ
ック植物由来の種子。
【請求項２７】請求項２４又は２５のトランスジェニ
ック植物由来の細胞。
【請求項２８】植物の防御に関与するタンパクと相互
作用可能なドメインを含むＡＦＴ１ポリペプチドの断片
又は類似体である組換えポリペプチド。
【請求項２９】請求項２８のポリペプチドであって、
該ポリペプチドがＡＦＴ１（３３−１９４）であること
を特徴とするポリペプチド。
【請求項３０】請求項２８のＡＦＴ１ポリペプチドの
断片又は類似体をコードする実質的に純粋なＤＮＡ。
【請求項３１】請求項３０のＤＮＡであって、前記Ｄ
ＮＡが配列番号１に記載されたＤＮＡ配列と実質的に同
一なＤＮＡ。
【請求項３２】請求項３１のＤＮＡであって、前記Ｄ
ＮＡが構成的または制御型プロモーターと作用可能に結
合していることを特徴とするＤＮＡ。