JPWO2005085467A1 - タンパク質複合体検出方法、およびタンパク質複合体検出キット - Google Patents
タンパク質複合体検出方法、およびタンパク質複合体検出キット Download PDFInfo
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Abstract
Description
[特許文献1]
日本国公開特許公報「特開2001−269177公報」(公開日:平成13年(2001)10月2日)
[特許文献2]
日本国公開特許公報「特開2001−269178公報」(公開日:平成13年(2001)10月2日)
[特許文献3]
日本国公開特許公報「特開2001−292776公報」(公開日:平成13年(2001)10月2日)
[特許文献4]
日本国公開特許公報「特開2001−292777公報」(公開日:平成13年(2001)10月23日)
[特許文献5]
日本国公開特許公報「特開2001−269176公報」(公開日:平成13年(2001)10月2日)
[特許文献6]
日本国公開特許公報「特開2001−269179公報」(公開日:平成13年(2001)10月23日)
[特許文献7]
日本国公開特許公報「特開2001−269176公報」(公開日:平成13年(2001)10月2日)
[非特許文献1]
遺伝子工学キーワードブック、緒方宣邦・野島博著、羊土社、254〜255頁、2000年
[非特許文献2]
Ohta,M., Matsui,K., Hiratsu,K., Shinshi,H. and Ohme-Takagi,M., The Plant Cell, Vol.13, 1959-1968, August, 2001
[非特許文献3]
Hiratsu,K., Ohta,M., Matsui,K., Ohme-Takagi,M., FEBS Letters 514(2002)351-354
(1)X1−Leu−Asp−Leu−X2−Leu−X3
(但し、式中、X1は0〜10個のアミノ酸残基を示し、X2はAsn又はGluを示し、X3は少なくとも6個のアミノ酸残基を示す。)
(2)Y1−Phe−Asp−Leu−Asn−Y2−Y3
(但し、式中、Y1は0〜10個のアミノ酸残基を示し、Y2はPhe又はIleを示し、Y3は少なくとも6個のアミノ酸残基を示す。)
(3)Z1−Asp−Leu−Z2−Leu−Arg−Leu−Z3
(但し、式中、Z1はLeu、Asp−Leu又はLeu−Asp−Leuを示し、Z2はGlu、Gln又はAspを示し、Z3は0〜10個のアミノ酸残基を示す。)
(4)Asp−Leu−Z4−Leu−Arg−Leu
(但し、式中、Z4はGlu、Gln又はAspを示す。)
の何れかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
(5)α1−Leu−β1−Leu−γ1−Leu
(但し、式中α1は、Asp、Asn、Glu、Gln、Thr又はSerを示し、β1は、Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser又はHisを示し、γ1は、Arg、Gln、Asn、Thr、Ser、His、又はLysを示す。)
で表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
(但し、式中、X1は0〜10個のアミノ酸残基を示し、X2はAsn又はGluを示し、X3は少なくとも6個のアミノ酸残基を示す。)
(2)Y1−Phe−Asp−Leu−Asn−Y2−Y3
(但し、式中、Y1は0〜10個のアミノ酸残基を示し、Y2はPhe又はIleを示し、Y3は少なくとも6個のアミノ酸残基を示す。)
(3)Z1−Asp−Leu−Z2−Leu−Arg−Leu−Z3
(但し、式中、Z1はLeu、Asp−Leu又はLeu−Asp−Leuを示し、Z2はGlu、Gln又はAspを示し、Z3は0〜10個のアミノ酸残基を示す。)
(4)Asp−Leu−Z4−Leu−Arg−Leu
(但し、式中、Z4はGlu、Gln又はAspを示す。)
の何れかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
(5)α1−Leu−β1−Leu−γ1−Leu
(但し、式中α1は、Asp、Asn、Glu、Gln、Thr又はSerを示し、β1は、Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser又はHisを示し、γ1は、Arg、Gln、Asn、Thr、Ser、His、又はLysを示す。)
で表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
(6)α1−Leu−β1−Leu−γ2−Leu
(7)α1−Leu−β2−Leu−Arg−Leu
(8)α2−Leu−β1−Leu−Arg−Leu
(但し、各式中α1は、Asp、Asn、Glu、Gln、Thr又はSerを示し、α2は、Asn、Glu、Gln、Thr又はSerを示し、β1は、Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser又はHisを示し、β2はAsn、Arg、Thr、Ser又はHisを示し、γ2はGln、Asn、Thr、Ser、His、又はLysを示す。)
の何れかで表されるアミノ酸配列を有するものであることが好ましい。
本発明に係るタンパク質複合体検出方法(本方法)は、少なくとも、キメラ遺伝子発現工程と複合体確認工程とを含む方法である。
まず、本発明の概要について、図1(a)・図1(b)を例に挙げて説明する。本発明では、第1タンパク質および第2タンパク質が複合体を形成するか否かを検出することを目的とする。そこで、図1(a)に示すように、まず、第1タンパク質をXタンパク質11とし、第2タンパク質をYタンパク質21とする。上記キメラ遺伝子発現工程では、タンパク質合成系にて、Xタンパク質11を含むキメラタンパク質10(第1キメラタンパク質)をコードする第1キメラ遺伝子と、Yタンパク質21を含むキメラタンパク質20a(第2キメラタンパク質)をコードする第2キメラ遺伝子とを発現させる。
この工程では、キメラタンパク質10をコードする第1キメラ遺伝子と、キメラタンパク質20aをコードする第2キメラ遺伝子とを、レポーター遺伝子31を含んだタンパク質合成系において発現させる。
Xタンパク質11は、後述するYタンパク質21と相互作用することにより、複合体を形成するかを決定したいタンパク質であり、原則として、任意のタンパク質とすることができる。ただし、Xタンパク質11には、後述するレポーター遺伝子31の転写を単独で抑制するタンパク質が含まれないものとする。このようなタンパク質は、本発明において、複合体を形成するか否かを決定できないからである。
本方法で使用するDBD12は、後述するレポーター遺伝子31に含まれるCIS32(シスエレメント)へ結合することによって、レポーター遺伝子31の転写を活性化する能力を持つ、または転写活性を持たない、いわゆるDNA結合ペプチドである。
Yタンパク質21は、上述したXタンパク質11と相互作用することによって、複合体を形成するか決定したいタンパク質であり、原則として、任意のタンパク質とすることができる。ただし、Yタンパク質21には、後述するレポーター遺伝子31の転写を単独で抑制するタンパク質が含まれないものとする。このようなタンパク質は、本発明において、複合体を形成するか否か決定できないからである。
本発明で用いられる、任意の転写因子を転写抑制因子に転換する機能性ペプチド22は、特に限定されるものではなく、転写因子と融合させたキメラタンパク質を形成させることにより、当該転写因子により制御される標的遺伝子の転写を抑制することができるペプチド(特許文献1〜7、非特許文献2,3等参照)であればよい。このペプチドは、Class II ERF(Ethylene Responsive Element Binding Factor)タンパク質や植物のジンクフィンガータンパク質(Zinc Finger Protein、例えばシロイヌナズナSUPERMANタンパク質等)から切り出されたもので、極めて単純な構造を有している。
(1)X1−Leu−Asp−Leu−X2−Leu−X3
(但し、式中、X1は0〜10個のアミノ酸残基を示し、X2はAsn又はGluを示し、X3は少なくとも6個のアミノ酸残基を示す。)
(2)Y1−Phe−Asp−Leu−Asn−Y2−Y3
(但し、式中、Y1は0〜10個のアミノ酸残基を示し、Y2はPheまたはIleを示し、Y3は少なくとも6個のアミノ酸残基を示す。)
(3)Z1−Asp−Leu−Z2−Leu−Arg−Leu−Z3
(但し、式中、Z1はLeu、Asp−LeuまたはLeu−Asp−Leuを示し、Z2はGlu、GlnまたはAspを示し、Z3は0〜10個のアミノ酸残基を示す。)
(4)Asp−Leu−Z4−Leu−Arg−Leu
(但し、式中、Z4はGlu、GlnまたはAspを示す。)
〔式(1)の機能性ペプチド22〕
上記式(1)の機能性ペプチド22においては、上記X1で表されるアミノ酸残基の数は0〜10個の範囲内であればよい。また、X1で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式(1)の機能性ペプチド22においては、N末端側には、1個の任意のアミノ酸または2〜10個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
上記式(2)の機能性ペプチド22においては、上記式(1)の機能性ペプチド22のX1と同様、上記Y1で表されるアミノ酸残基の数は0〜10個の範囲内であればよい。また、Y1で表されるアミノ酸残基を構成する具体的なアミノ酸の種類は特に限定されるものではなく、どのようなものであってもよい。換言すれば、上記式(2)の機能性ペプチド22においては、上記式(1)の機能性ペプチド22と同様、N末端側には、1個の任意のアミノ酸または2〜10個の任意のアミノ酸残基からなるオリゴマーが付加されていてもよいし、アミノ酸が何も付加されていなくてもよい。
上記式(3)の機能性ペプチド22においては、上記Z1で表されるアミノ酸残基は、1〜3個の範囲内でLeuを含むものとなっている。アミノ酸1個の場合は、Leuであり、アミノ酸2個の場合は、Asp−Leuとなっており、アミノ酸3個の場合はLeu−Asp−Leuとなっている。
上記式(4)の機能性ペプチド22は、6個のアミノ酸残基からなるヘキサマー(6mer)であり、その具体的な配列は、配列番号5、14、53に示す。なお、上記Z4がGluの場合のアミノ酸配列が配列番号5に示すアミノ酸配列であり、上記Z4がAspの場合のアミノ酸配列が配列番号14に示すアミノ酸配列であり、上記Z4がGlnの場合のアミノ酸配列が配列番号53に示すアミノ酸配列である。
上述した各式で表される機能性ペプチド22のより具体的な例として、例えば、配列番号1〜17のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドを挙げることができる。これらオリゴペプチドは、本発明者が上記転写抑制転換ペプチドであることを見出したものである(例えば、特許文献7参照)。
本発明者は、さらに、上記モチーフの構造について検討した結果、新たに6つのアミノ酸からなるモチーフを見出した。このモチーフは、具体的には、次に示す一般式(5)で表されるアミノ酸配列を有するペプチドである。これらのペプチドも、上記転写抑制転換ペプチドに含まれる。
(5)α1−Leu−β1−Leu−γ1−Leu
但し、上記式(5)中α1は、Asp、Asn、Glu、Gln、Thr又はSerを示し、β1は、Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser又はHisを示し、γ1は、Arg、Gln、Asn、Thr、Ser、His、またはLysを示す。
(6)α1−Leu−β1−Leu−γ2−Leu
(7)α1−Leu−β2−Leu−Arg−Leu
(8)α2−Leu−β1−Leu−Arg−Leu
(9)Asp−Leu−β3−Leu−Arg−Leu
但し、上記各式中、α1は、Asp、Asn、Glu、Gln、Thr又はSerを示し、α2は、Asn、Glu、Gln、Thr又はSerを示す。また、β1は、Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser又はHisを示し、β2はAsn、Arg、Thr、Ser又はHisを示し、β3は、Glu、Asp又はGlnを示す。さらに、γ2は、Gln、Asn、Thr、Ser、His、またはLysを示す。
本発明で利用できるレポーター遺伝子31は、DBD12が結合することができるものである必要はあるが、必ずしもDBD12によって転写が活性化される遺伝子である必要はない。例えば、リポーター遺伝子31がエンハンサー33をプロモーター領域に備えていれば、必ずしもDBD12によって転写が活性化される必要はない。このレポーター遺伝子31には、DBD12が結合するプロモーター配列やエフェクター領域が結合していていることが好ましい。
本方法では、上述のキメラ遺伝子およびレポーター遺伝子31を、遺伝子発現によりタンパク質を生産できるタンパク質合成系中にて発現させる。このようなタンパク質合成系として、後述するように、植物や動物の細胞を使用することが好ましいが、無細胞タンパク質合成系を使用することもできる。
なお、本方法では、以下に説明するように、上記したキメラ遺伝子やレポーター遺伝子31を、それぞれ組換え発現ベクターに組み込んで、タンパク質合成系に導入することが好ましい。そこで、以下では、本方法で使用可能な組換え発現ベクターについて説明する。
キメラタンパク質10をコードするキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクター(第2キメラ遺伝子発現ベクター)は、DBD12のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、Xタンパク質11のアミノ酸配列をコードする塩基配列とが結合した、キメラ塩基配列(第1キメラ遺伝子)を含む構成であればよい。
キメラタンパク質20aをコードするキメラ遺伝子を含む組換え発現ベクター(第2キメラ遺伝子発現ベクター)は、機能性ペプチド22のアミノ酸配列をコードする塩基配列と、Yタンパク質21のアミノ酸配列をコードする塩基配列が結合した、キメラ塩基配列(第2キメラ遺伝子)を含む構成であればよい。
レポーター遺伝子31を含む組換え発現ベクター(レポーター遺伝子発現ベクター)は、上述のようにして取得できるレポーター遺伝子31の塩基配列に相当するポリヌクレオチドを、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどに組み込んだものであればよい。
上述した3種類の組換え発現ベクターには、種々のDNAセグメントを含めてもよい。例えば、これらの組換え発現ベクターの少なくとも何れかには、遺伝子を発現させるための任意のプロモーター配列が含まれていることが好ましい。その際、プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを用いることが好ましい。なお、他にも、イネのアクチンプロモーターを用いることもできる。
本発明では、上記した3種類の組換え発現ベクターを、任意の細胞に導入してこれを形質転換体に転換させることによって、この形質転換体内で、遺伝子発現によりキメラタンパク質10および20aを生産させることが好ましい。
この工程では、レポーター遺伝子31の転写が抑制されたか否かを確認することにより、Xタンパク質11およびYタンパク質21による複合体形成を検出する。
本発明に係るタンパク質複合体検出キット(本キット)として、まず、上述したタンパク質複合体検出方法を行うためのキットを挙げることができる
また、本キットとして、レポーター遺伝子31のプロモーター配列を特異的に認識するDBD12(DNA結合ペプチド)とXタンパク質11(第1タンパク質)とを結合したキメラタンパク質10(第1キメラタンパク質)を生産可能とする第1キメラ遺伝子発現ベクターと、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチド22とYタンパク質21(第2タンパク質)とを結合したキメラタンパク質20a(第2キメラタンパク質)を生産可能とする第2キメラ遺伝子発現ベクターとを含むことを特徴したキットを挙げることもできる。
本実施例では、本発明に係るタンパク質複合体検出方法によって、2つのタンパク質の複合体形成を検出できることを証明するため、すでに複合体を形成することが確かめられている2つのタンパク質を使用して、複合体検出のモデル実験を行った。
〔p35S-NOSの構築〕
pBI221プラスミド(クローンテック社)を、制限酵素XhoIとSacIとで消化した。この消化物をT4ポリメラーゼで平滑末端化処理した後、アガロースゲル電気泳動を行って、消化物からGUS遺伝子を除去した。以上の処理によって、カリフラワーモザイクウイルス35Sのプロモーター(以下、CaMV35Sと略す)およびノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域(NOSターミネーター、以下Nos-terと略す)を含む、p35S-NOSプラスミド断片DNAを得た。
pAS2-1ベクター(クローンテック社)を制限酵素HindIIIで消化した。この消化物から、アガロースゲル電気泳動を行って、GAL4タンパク質のDNA結合領域(1〜147アミノ酸残基)をコードする748bpのDNA断片(以下、GAL4DBと略す)を単離した。単離したGAL4DBに対して、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。このGAL4DBコード領域を含むDNA断片を、p35S-NOSにおける、CaMV35SとNos-terとの間の、平滑末端化処理した部分に挿入した。このようにして得たベクターの中から、CaMV35Sに対して、GAL4タンパク質のDNA結合領域のオープンリーディングフレームが順方向に並んでいるものを選抜して、p35S-GAL4DBDを構築した。
GAL4DBDの読み枠(フレーム)が一致するように設計した、ヒトJUN遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列277〜315番(配列番号134)に相当する領域の、リン酸化した5末端アッパープライマー(配列番号135)と、制限酵素SalIによって認識される部位を有する3末端ローワープライマー(配列番号136)とを化学的に合成した。
〔p35s-NLS-NOSの構築〕
まず、SV40 T-antigen nuclear localization sequenceである核移行シグナル配列(配列番号137)をコードする2つのDNAストランド(配列番号138、配列番号139)を化学的に合成した。その際、これらのDNAストランドの5末端をリン酸化し、それからアニーリングして、2本鎖DNAとした。このようにして合成したDNA断片を、p35S-NOSベクターのSmaI部位に挿入した。こうして得たベクターの中から、CaMV35Sに対して上記のDNA断片が順方向に並んでいるものを選抜することによって、核移行シグナル配列をコードするDNAストランドの3末端にSmaI部位を有するp35s-NLS-NOSを構築した。
まず、JUNと相互作用するFOSタンパク質のアミノ酸配列133〜215番を含み、かつ、C末端にリプレッションドメインであるSRDX(本発明の機能性ペプチド、配列番号140)が連結されたキメラタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するDNAを得るために必要な、5’末端アッパープライマー(配列番号141)および3’末端ローワープライマー(配列番号142)をそれぞれ化学的に合成した。
まず、JUNと相互作用するFOSタンパク質のアミノ酸配列133〜215番を含むタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列に相当するDNA(FOS−DNA)を得るための、5’末端アッパープライマー(配列番号141)および3’末端ローワープライマー(配列番号143)をそれぞれ化学的に合成した。
〔35S-GAL4-LUCレポーター遺伝子の構築〕
まず、pBI221プラスミド(クローンテック社)を制限酵素EcoRIとSstIとで消化して、この消化物からNos-terを含む270bpのDNA断片を、アガロースゲル電気泳動によって単離した。そして、単離したDNA断片を、制限酵素EcoRIとSstIで消化しておいたプラスミドpUC18の、EcoRI-SstI部位に挿入した。
次に、ホタル・ルシフェラーゼ遺伝子(LUC)をもつプラスミドベクターpGV-CS2(商品名、東洋インキ社製)を、制限酵素XbaIとNcoIで消化した。この消化物に対してT4DNAポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動によって、この消化物からルシフェラーゼ遺伝子を含む1.65kbのDNA断片を単離して精製した。精製したDNA断片を、上記のTATA-BoxとNos-terとを含むプラスミドに挿入し、pTATA-LUCレポーター遺伝子を構築した。
次に、酵母GAL4タンパク質のDNA結合配列を5コピー持つプラスミドpG5CAT(商品名、クローンテック社製)を、制限酵素SmaIとXbaIとによって消化した。この消化物に対してT4DNAポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、5コピーのGAL4タンパク質のDNA結合配列を含むDNA断片を、この消化物からアガロースゲル電気泳動で単離精製した。さらに、pTATA-LUCベクターを制限酵素BglIIで消化し、得た消化物に対してT4DNAポリメラーゼで平滑末端化処理を行った。この部位に、平滑末端化した5コピーのGAL4タンパク質のDNA結合配列を含むDNA断片を挿入した。このようにして得たプラスミドのうち、GAL4タンパク質のDNA結合配列が順方向に向いているものを選抜し、レポーター遺伝子pGAL4-LUCを構築した。
プラスミドpBI121を鋳型としてPCRを行い、CaMV35Sの塩基配列のうち−800〜−46番目の領域を含むDNA断片を得た。このときPCRに用いた5’末端アッパープライマーおよび3’末端ローワープライマーは、それぞれ配列番号146および147に示す通りである。
ウミシイタケ由来のルシフェラーゼ遺伝子をもつカセットベクターpRL-null(商品名:プロメガ社製)を制限酵素NheIとXbaI制限酵素で切断し、T4DNAポリメラーゼで平滑末端化処理を行った後、アガロースゲル電気泳動でウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子を含む948bpのDNA断片を精製した。このDNA断片を、エフェクタープラスミドの構築の際に用いた、GUS遺伝子を除いたpBI221ベクターのGUS遺伝子があった領域に挿入した。こうして得たプラスミドのうち、ウミシイタケ・ルシフェラーゼ遺伝子が順方向に向いているものを選抜し、pPTRLを構築した。
シロイヌナズナに、レポーター遺伝子とエフェクタープラスミドとをパーティクルガン法にて導入し、エフェクターの効果を、レポーター遺伝子の活性を測定することにより調べた。
pGAL4-LUCレポーター遺伝子1.6μgと、エフェクタープラスミドの総DNAを1.2μgと、リファレンス遺伝子プラスミド0.4μgを直径1μmの金粒子(バイオラッド社製)510μgにコーティングした。生育期間21日目のシロイヌナズナ葉4〜7枚を、水で湿らせた濾紙をおいた9cmシャーレに並べ、この葉に、バイオラッド社製PDS−1000/Heボンバートメント機を用いてDNAを打ち込んだ。
14〜18時間静置したシロイヌナズナ葉を、液体窒素中で粉砕し、Dual-LuciferaseTM Reporter Assay System(プロメガ社製)に添付されているPassive Lysis Buffer200μlに懸濁した後、遠心して上清を回収した。この細胞抽出液20μlをDual-LuciferaseTM Reporter Assay System(プロメガ社製)に添付されている測定バッファー100μlに混合し、ルミノメーター(TD20/20,Turener Design社製)を用いてルシフェラーゼ活性測定を行った。ホタル・ルシフェラーゼおよびウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性を、測定キットの説明書にしたがって、10秒間の発光を積分モードでカウントして測定した。リファレンス遺伝子の活性値をレポーター遺伝子の活性値で割り、その相対値であるRelative lucifarase activityを、測定値として求めた。
シロイヌナズナの細胞内に導入したエフェクター遺伝子の種類別の、レポーター遺伝子の活性の結果を、図3に示す。図3において、CONTOLはエフェクタープラスミドを導入していない結果を示し、それ以外は、それぞれ図に示すエフェクター遺伝子を導入した結果を示している。
本実施例では、組換え発現ベクターの構築、およびレポーター遺伝子活性の測定には実施例1と同一の手法を用いたが、GAL4を連結させるタンパク質をJUNではなくFOSにし、かつ、SRDXを連結させるタンパク質をFOSではなくJUNにした。
本実施例では、シロイヌナズナ由来のタンパク質であり、互いに相互作用することが明らかになっているPIとAP3とを、Xタンパク質11およびYタンパク質21として使用した。ここで、PIの全アミノ酸配列を配列番号153に示し、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号154に示す。また、AP3の全アミノ酸配列を配列番号155に示し、そのアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号156に示す。なお、本実施例においても、組換え発現ベクターの構築、およびレポーター遺伝子活性の測定には、実施例1と同一の手法を用いた。
以下の実施例4においては、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターと、ノパリン合成酵素遺伝子の転写終止領域との間に、転写抑制転換ペプチドのひとつである12アミノ酸ペプチドLDLDLELRLGFA(SRDX)(配列番号140)をコードするポリヌクレオチドまたは上記SRDXのロイシンを変換した変異ペプチドであるSRDXmをコードするポリヌクレオチドを、TTG1遺伝子の下流に結合したポリヌクレオチドを組み込んだ組換え発現ベクターを構築し、これをシロイヌナズナにアグロバクテリウム法を用いて導入することにより、シロイヌナズナを形質転換した。
形質転換用ベクター構築用ベクターであるp35SGを、図13に示すように、以下の工程(1)〜(4)のとおりに構築した。
5’−ctagaggatccacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattacagatcccgggggtaccgtcgacgagctc−3’(配列番号166)
5’−cgtcgacggtacccccgggatctgtaattgtaatgttgtttgttgtttgttgttgttggtaattgtggatcct−3’(配列番号167)
転写抑制転換ペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込んだ構築用ベクターであるp35SSRDXGを、図14に示すように、以下の工程(1)〜(2)のとおりに構築した。
5’−gggcttgatctggatctagaactccgtttgggtttcgcttaag−3’(配列番号168)
5’−tcgacttaagcgaaacccaaacggagttctagatccagatcaagccc−3’(配列番号169)
構築用ベクターのatt部位で挟まれたDNA断片と組換えるための、2つのatt部位を有する植物形質転換用ベクターであるpBIGCKHを、図15に示すように、以下の工程(1)から(3)のとおりに構築した。
上記構築用ベクターp35SSRDXGにシロイヌナズナ由来の転写因子TTG1タンパク質をコードするポリヌクレオチドを以下の工程(1)〜(3)のとおりに組み込んだ。
プライマー1 5’−gatggataattcagctccagattcgttatc−3’(配列番号170)
プライマー2 5’−aactctaaggagctgcattttgttagcaaa−3’(配列番号171)
TTG1ポリヌクレオチドのコードするアミノ酸配列およびTTG1ポリヌクレオチドのcDNAをそれぞれ配列番号172および173に示す。
(1)TTG1とSRDXmとのキメラタンパク質であるTTG1SRDXmをコードするキメラ遺伝子を含むプラスミドDNAを鋳型として、以下のプライマーを用いてPCRを行った。TTG1SRDXmは、TTG1のコード領域を含んでいる。
プライマー1 5’−gatggataattcagctccagattcgttatc−3’(配列番号170)
プライマー2 5’− ttaagcgaaaccgaaacgggcttcttgatccggatcgaacccaac−3’(配列番号174)
TTG1SRDXmポリヌクレオチドのコードするアミノ酸配列を配列番号175に示す。
上記構築用ベクター上にあるCaMV35Sプロモーター、キメラ遺伝子、Nos−ter等を含むDNA断片を、植物形質転換用ベクターpBIGCKHに組換えることにより、植物を宿主とする発現ベクターを構築した。組換え反応はインビトロジェン社のGateway(登録商標)LR clonase(登録商標)を用いて以下の工程(1)〜(3)のとおりに行った。
次に、以下の工程(1)〜(3)に示すように、上記キメラ遺伝子を含むDNA断片をpBIGCKHに組み込んだプラスミドであるpBIG−TTG1SRDXまたはpBIG−TTG1SRDXmで、シロイヌナズナの形質転換を行い、形質転換植物体を生産した。シロイヌナズナ植物の形質転換は、Transformation of Arabidopsis thaliana by vacuum infiltration(http://www.bch.msu.edu/pamgreen/protocol.htm)に従った。ただし、感染させるのにバキュウムは用いないで、浸すだけにした。
Claims (28)
- 第1タンパク質および第2タンパク質が複合体を形成するか否かを検出するために、遺伝子発現によりタンパク質を生産できる植物細胞を用いたタンパク質合成系中にて、第1タンパク質を含む第1キメラタンパク質をコードする第1キメラ遺伝子と、第2タンパク質を含む第2キメラタンパク質をコードする第2キメラ遺伝子とを発現させるキメラ遺伝子発現工程と、
第1タンパク質および第2タンパク質との複合体形成を検出する複合体確認工程とを含んでおり、
上記第1キメラ遺伝子がコードする第1キメラタンパク質が、レポーター遺伝子のプロモーター配列を特異的に認識するDNA結合ペプチドと上記第1タンパク質とを結合したものであるタンパク質複合体検出方法において、
上記第2キメラ遺伝子がコードする第2キメラタンパク質が、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチドと上記第2タンパク質とを結合したものであり、
上記第1キメラタンパク質の第1タンパク質部分と、第2キメラタンパク質の第2タンパク質部分とが結合して複合体を形成した場合に、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されるようになっているとともに、
上記複合体確認工程では、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されたか否かを確認することにより、複合体形成を検出するようになっていることを特徴とするタンパク質複合体検出方法。 - 第1タンパク質および第2タンパク質が複合体を形成するか否かを検出するために、遺伝子発現によりタンパク質を生産できる無細胞タンパク質合成系中にて、第1タンパク質を含む第1キメラタンパク質をコードする第1キメラ遺伝子と、第2タンパク質を含む第2キメラタンパク質をコードする第2キメラ遺伝子とを発現させるキメラ遺伝子発現工程と、
第1タンパク質および第2タンパク質との複合体形成を検出する複合体確認工程とを含んでおり、
上記第1キメラ遺伝子がコードする第1キメラタンパク質が、レポーター遺伝子のプロモーター配列を特異的に認識するDNA結合ペプチドと上記第1タンパク質とを結合したものであるタンパク質複合体検出方法において、
上記第2キメラ遺伝子がコードする第2キメラタンパク質が、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチドと上記第2タンパク質とを結合したものであり、
上記第1キメラタンパク質の第1タンパク質部分と、第2キメラタンパク質の第2タンパク質部分とが結合して複合体を形成した場合に、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されるようになっているとともに、
上記複合体確認工程では、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されたか否かを確認することにより、複合体形成を検出するようになっていることを特徴とするタンパク質複合体検出方法。 - 第1タンパク質および第2タンパク質が複合体を形成するか否かを検出するために、遺伝子発現によりタンパク質を生産できるタンパク質合成系中にて、第1タンパク質を含む第1キメラタンパク質をコードする第1キメラ遺伝子と、第2タンパク質を含む第2キメラタンパク質をコードする第2キメラ遺伝子とを発現させるキメラ遺伝子発現工程と、
第1タンパク質および第2タンパク質との複合体形成を検出する複合体確認工程とを含んでおり、
上記第1キメラ遺伝子がコードする第1キメラタンパク質が、レポーター遺伝子のプロモーター配列を特異的に認識するDNA結合ペプチドと上記第1タンパク質とを結合したものであるタンパク質複合体検出方法において、
上記第2キメラ遺伝子がコードする第2キメラタンパク質が、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する以下に示す式(1)〜(4)の何れかで表されるアミノ酸配列を有する機能性ペプチドと上記第2タンパク質とを結合したものであり、
上記第1キメラタンパク質の第1タンパク質部分と、第2キメラタンパク質の第2タンパク質部分とが結合して複合体を形成した場合に、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されるようになっているとともに、
上記複合体確認工程では、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されたか否かを確認することにより、複合体形成を検出するようになっていることを特徴とするタンパク質複合体検出方法:
(1)X1−Leu−Asp−Leu−X2−Leu−X3
(但し、式中、X1は0〜10個のアミノ酸残基を示し、X2はAsn又はGluを示し、X3は少なくとも6個のアミノ酸残基を示す。)
(2)Y1−Phe−Asp−Leu−Asn−Y2−Y3
(但し、式中、Y1は0〜10個のアミノ酸残基を示し、Y2はPhe又はIleを示し、Y3は少なくとも6個のアミノ酸残基を示す。)
(3)Z1−Asp−Leu−Z2−Leu−Arg−Leu−Z3
(但し、式中、Z1はLeu、Asp−Leu又はLeu−Asp−Leuを示し、Z2はGlu、Gln又はAspを示し、Z3は0〜10個のアミノ酸残基を示す。)
(4)Asp−Leu−Z4−Leu−Arg−Leu
(但し、式中、Z4はGlu、Gln又はAspを示す。) - 第1タンパク質および第2タンパク質が複合体を形成するか否かを検出するために、遺伝子発現によりタンパク質を生産できるタンパク質合成系中にて、第1タンパク質を含む第1キメラタンパク質をコードする第1キメラ遺伝子と、第2タンパク質を含む第2キメラタンパク質をコードする第2キメラ遺伝子とを発現させるキメラ遺伝子発現工程と、
第1タンパク質および第2タンパク質との複合体形成を検出する複合体確認工程とを含んでおり、
上記第1キメラ遺伝子がコードする第1キメラタンパク質が、レポーター遺伝子のプロモーター配列を特異的に認識するDNA結合ペプチドと上記第1タンパク質とを結合したものであるタンパク質複合体検出方法において、
上記第2キメラ遺伝子がコードする第2キメラタンパク質が、任意の転写因子を転写抑制因子に変換する以下に示す式(5)で表されるアミノ酸配列を有する機能性ペプチドと上記第2タンパク質とを結合したものであり、
上記第1キメラタンパク質の第1タンパク質部分と、第2キメラタンパク質の第2タンパク質部分とが結合して複合体を形成した場合に、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されるようになっているとともに、
上記複合体確認工程では、上記レポーター遺伝子の転写が抑制されたか否かを確認することにより、複合体形成を検出するようになっていることを特徴とするタンパク質複合体検出方法:
(5)α1−Leu−β1−Leu−γ1−Leu
(但し、式中α1は、Asp、Asn、Glu、Gln、Thr又はSerを示し、β1は、Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser又はHisを示し、γ1は、Arg、Gln、Asn、Thr、Ser、His、又はLysを示す。) - 上記第1キメラ遺伝子および第2キメラ遺伝子は、何れも発現ベクターに組み込まれて植物細胞に導入されることを特徴とする請求項1に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 上記レポーター遺伝子は、発現ベクターに組み込まれて植物細胞に導入されることを特徴とする請求項1または5に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 上記タンパク質合成系として、植物細胞を用いることを特徴とする請求項3または4に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 上記タンパク質合成系として、無細胞タンパク質合成系を用いることを特徴とする請求項3または4に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 上記第1キメラ遺伝子および第2キメラ遺伝子は、何れも発現ベクターに組み込まれて植物細胞に導入されることを特徴とする請求項7に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 上記レポーター遺伝子は、発現ベクターに組み込まれて植物細胞に導入されることを特徴とする請求項7または9に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 上記DNA結合ペプチドとして、転写因子または転写因子に含まれるDNA結合ドメインを用いることを特徴とする請求項1ないし10の何れか1項に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 上記レポーター遺伝子として、外観上その増減を相対的に確認することが可能なタンパク質をコードする遺伝子を用いることを特徴とする請求項1ないし11の何れか1項に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 上記第1キメラ遺伝子、第2キメラ遺伝子、およびレポーター遺伝子は、それぞれ発現ベクターとして構築された上で、タンパク質合成系中に導入されることを特徴とする請求項1ないし12の何れか1項に記載のタンパク質複合体検出方法。
- 請求項1ないし13の何れか1項に記載のタンパク質複合体検出方法を行うためのタンパク質複合体検出キット。
- レポーター遺伝子のプロモーター配列を特異的に認識するDNA結合ペプチドと第1タンパク質とを結合した第1キメラタンパク質を生産可能とする第1キメラ遺伝子発現ベクターと、
任意の転写因子を転写抑制因子に変換する機能性ペプチドと第2タンパク質とを結合した第2キメラタンパク質を生産可能とする第2キメラ遺伝子発現ベクターとを含むことを特徴とするタンパク質複合体検出キット。 - 上記第1キメラ遺伝子発現ベクターは、少なくとも、(a)上記DNA結合ドメイン(DBD)をコードするポリヌクレオチドであるDBDセグメントと、(b)当該DBDセグメントに隣接し、少なくとも1種の制限酵素(RE)により認識される塩基配列を有するポリヌクレオチドである第1RE認識セグメントとを有しているとともに、
上記第2キメラ遺伝子発現ベクターは、少なくとも、(c)上記機能性ペプチドをコードするポリヌクレオチドである機能性ペプチドセグメントと、(d)当該機能性ペプチドセグメントに隣接し、少なくとも1種の制限酵素(RE)により認識される塩基配列を有するポリヌクレオチドである第2RE認識セグメントとを有しており、
上記第1キメラ遺伝子発現ベクターは、上記(b)第1RE認識セグメントに第1タンパク質をコードする遺伝子を組み込むことで、上記第1キメラタンパク質を生産可能とするとともに、
上記第2キメラ遺伝子発現ベクターは、上記(d)第2RE認識セグメントに第2タンパク質をコードする遺伝子を組み込むことで、上記第2キメラタンパク質を生産可能とすることを特徴とする請求項15に記載のタンパク質複合体検出キット。 - さらに、レポーター遺伝子を発現するレポーター遺伝子発現ベクターを含むことを特徴とする請求項15または16に記載のタンパク質複合体検出キット。
- 上記第1キメラ遺伝子発現ベクター、第2キメラ遺伝子発現ベクター、およびレポーター遺伝子発現ベクターのうち少なくとも何れかには、プロモーターとして、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターが含まれていることを特徴とする請求項17に記載のタンパク質複合体検出キット。
- 上記第1キメラ遺伝子発現ベクター、第2キメラ遺伝子発現ベクター、およびレポーター遺伝子発現ベクターのうち少なくとも何れかには、ターミネーターとして、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーターが含まれていることを特徴とする請求項17または18に記載のタンパク質複合体検出キット。
- 上記DNA結合ペプチドとして、転写因子または転写因子に含まれるDNA結合ドメインが用いられることを特徴とする請求項15ないし19の何れか1項に記載のタンパク質複合体検出キット。
- 上記DNA結合ペプチドとして、酵母GAL4タンパク質のDNA結合ドメインが用いられることを特徴とする請求項20に記載のタンパク質複合体検出キット。
- 上記レポーター遺伝子として、外観上その増減を相対的に確認することが可能なタンパク質をコードする遺伝子が用いられることを特徴とする請求項15ないし21の何れか1項に記載のタンパク質複合体検出キット。
- 上記レポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ遺伝子が用いられることを特徴とする請求項22に記載のタンパク質複合体検出キット。
- 上記機能性ペプチドが、次に示す式(1)〜(4)
(1)X1−Leu−Asp−Leu−X2−Leu−X3
(但し、式中、X1は0〜10個のアミノ酸残基を示し、X2はAsn又はGluを示し、X3は少なくとも6個のアミノ酸残基を示す。)
(2)Y1−Phe−Asp−Leu−Asn−Y2−Y3
(但し、式中、Y1は0〜10個のアミノ酸残基を示し、Y2はPhe又はIleを示し、Y3は少なくとも6個のアミノ酸残基を示す。)
(3)Z1−Asp−Leu−Z2−Leu−Arg−Leu−Z3
(但し、式中、Z1はLeu、Asp−Leu又はLeu−Asp−Leuを示し、Z2はGlu、Gln又はAspを示し、Z3は0〜10個のアミノ酸残基を示す。)
(4)Asp−Leu−Z4−Leu−Arg−Leu
(但し、式中、Z4はGlu、Gln又はAspを示す。)
の何れかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項15ないし23の何れか1項に記載のタンパク質複合体検出キット。 - 上記機能性ペプチドが、次に示す式(5)
(5)α1−Leu−β1−Leu−γ1−Leu
(但し、式中α1は、Asp、Asn、Glu、Gln、Thr又はSerを示し、β1は、Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser又はHisを示し、γ1は、Arg、Gln、Asn、Thr、Ser、His、又はLysを示す。)
で表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項15ないし23の何れか1項に記載のタンパク質複合体検出キット。 - 上記機能性ペプチドが、次に示す式(6)〜(8)
(6)α1−Leu−β1−Leu−γ2−Leu
(7)α1−Leu−β2−Leu−Arg−Leu
(8)α2−Leu−β1−Leu−Arg−Leu
(但し、各式中α1は、Asp、Asn、Glu、Gln、Thr又はSerを示し、α2は、Asn、Glu、Gln、Thr又はSerを示し、β1は、Asp、Gln、Asn、Arg、Glu、Thr、Ser又はHisを示し、β2はAsn、Arg、Thr、Ser又はHisを示し、γ2はGln、Asn、Thr、Ser、His、又はLysを示す。)
の何れかで表されるアミノ酸配列を有するものであることを特徴とする請求項15ないし23の何れか1項に記載のタンパク質複合体検出キット。 - 上記機能性ペプチドが、配列番号1〜38のいずれかに示されるアミノ酸配列を有するペプチドであることを特徴とする請求項15ないし23の何れか1項に記載のタンパク質複合体検出キット。
- さらに、(a)植物細胞に発現ベクターを導入するための試薬群、
(b)第1キメラ遺伝子発現ベクターまたは第2キメラ遺伝子発現ベクターに、第1タンパク質をコードする遺伝子または第2タンパク質をコードする遺伝子を組み込むための試薬群、および、
(c)レポーター遺伝子の発現量の変化を確認するための試薬群のうち、少なくとも一つの試薬群を含むことを特徴とする請求項15ないし27の何れか1項に記載のタンパク質複合体検出キット。
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