KR20170100161A - 식물 세포의 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 대량생산방법 - Google Patents

식물 세포의 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 대량생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 세포의 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 대량생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물 세포 소기관의 하나인 소포체 내에 목적 단백질을 고농도로 축적시키기 위해 거대 소포체 바디의 형성뿐만 아니라 소포체 바디의 수의 증대를 유도할 수 있는 TSA1 단백질(TSK-associating protien 1)을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터, 이를 이용한 목적 단백질의 대량생산방법 및 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 식물체를 제공한다.

Description

식물 세포의 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 대량생산방법{Recombinant vector for increasing size and number of endoplasmic reticulum body in plant cell and method of mass production of target protein using the same}
본 발명은 식물 세포의 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터 및 이를 이용한 목적 단백질의 대량생산방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 식물 세포 소기관의 하나인 소포체 내에 목적 단백질을 고농도로 축적시키기 위해 거대 소포체 바디의 형성뿐만 아니라 소포체 바디의 수의 증대를 유도할 수 있는 TSA1 단백질(TSK-associating protien 1)을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터, 이를 이용한 목적 단백질의 대량생산방법 및 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 식물체를 제공한다.
최근까지 약 130종 이상의 단백질 의약품이 FDA 승인을 거쳐 인간과 동물의 질병 치료에 본격적으로 사용되고 있으며, 다양한 종류의 단백질 신약들이 계속해서 연구·개발되어 다양한 질병 치료에 사용될 것이다. 하지만 이들 대부분은 주로 동물 세포 또는 박테리아의 세포 배양에 의해 생산되고 있다. 동물 세포 배양은 고비용의 생산비와 초기 투자비가 많이 들어가는 단점에 더하여 인간과 동물에 질병을 유발할 수 있는 다양한 병원체의 오염으로부터 자유롭지 못하다는 단점이 있다. 또한, 프라이온(prion)과 같은 동물 유래 독성 단백질의 오염에 항상 노출되어 있다는 단점을 가지고 있다. 박테리아 세포 배양의 경우 생산비가 저렴하다는 장점이 있지만, 당쇄화가 일어나지 않는 단점을 가지고 있다. 질병 치료에 사용되는 약 70~80%의 단백질이 당쇄화가 되는데, 이들 단백질들은 현재까지 박테리아 세포 시스템에서는 생산이 불가능하다. 이러한 다양한 단점을 해결할 수 있는 하나의 선택적 방법으로, 최근 식물을 바이오리액터로 활용하여 고부가 가치의 의료용·산업용 단백질을 포함하는 바이오 소재를 생산하고자 하는 연구들이 활발히 진행되고 있다.
식물에서 고부가 가치의 의료용·산업용 단백질을 대량으로 생산하기 위해서는 단백질 고발현 시스템의 개발이 필수적이다. 목적 단백질을 고발현 시키기 위해서는 전사 및 전이 단계에서의 조절뿐만 아니라 세포 내 다양한 소기관으로의 단백질 분배 시스템의 활용 또한 매우 중요하다. 목적 단백질의 특성에 따라 세포 내 어느 소기관에 저장할 것인가를 결정할 수 있으며, 또한 소기관 마다 각기 저장할 수 있는 능력에 차이가 있고 단백질의 종류에 따라 저장되는 안정성이 서로 다르다.
최근의 일부 연구들은 목적 단백질의 저장 안정성과 고축적을 위해 다양한 세포 소기관으로의 단백질 타겟팅을 위한 기술 개발에 초점을 맞추고 있다. 하지만 목적 단백질을 안정적으로 고축적 시키기 위한 방법으로 세포 소기관의 크기와 개수를 증대시킬 수 있는 기술의 개발은 거의 이루어져 있지 않다. 따라서 세포 소기관의 크기와 개수를 조절할 수 있는 기술의 개발은 고부가 가치의 의료용·산업용 단백질을 포함하는 바이오 소재의 대량 생산을 위한 새로운 핵심 기술로 발전할 수 있다.
식물 세포 내 여러 소기관들 중에 고부가 가치의 의료용·산업용 단백질과 같은 목적 단백질의 안정적 저장소로서 세포질 전체에 고루 뻗어있는 소포체는 훌륭한 타겟이 될 수 있다. 특히, N-말단에 신호 펩타이드를 가지는 수용성 단백질의 C-말단에 소포체 유지(retention) 신호로 작용하는 [H/K/R][D/E]EL 또는 KDEL 펩타이드를 포함시키게 되면 이들 단백질은 소포체뿐만 아니라 소포체 바디에 축적되는 특성을 가지며, 안정성 또한 증가된다는 것이 보고되었다.
소포체 바디는 무 뿌리의 외피 및 표피 세포에서 처음으로 발견되었으며, 소포체에 쌀알 형태로 연결되어 있는 식물 세포의 소기관 중 하나이다. 소포체 바디의 형성에 관여하는 유전자로는 전사조절인자 NAI1이 가장 먼저 밝혀졌다.
NAI1은 bHLH(basic helix-loop-helix) type 전사조절인자로서, 이 유전자 기능이 상실되면 소포체 바디의 형성이 저해된다. 또한, NAI1 돌연변이체에서 소포체 형성과 관련된 NAI2, PYK10, MEB1 및 MEB2 유전자의 발현이 현저하게 감소되었을 뿐만 아니라 다양한 JACALIN-RELATED LECTIN 유전자들 (JAL22, JAL23, JAL30, JAL31), GDSL LIPASE-LIKE PROTEIN 유전자들 (GLL23, GLL25) 그리고 MD2-RELATED LIPID RECOGNITION PROTEIN 3(ML3) 등이 NAI1에 의해 발현이 조절된다. TSA1의 동족체(homologue)인 NAI2 역시 소포체 바디의 형성에 관여한다는 것이 보고되었다. NAI2 돌연변이체에서 소포체 바디의 형성이 저해되었으며, 소포체 바디에 저장된다고 보고된 베타-글루코시데이즈 PYK10의 축적이 감소되었을 뿐만 아니라 PYK10이 소포체 전체로 확산되는 현상이 보고되었다. 또한, PYK10과 PYK10의 두 동족체 중의 하나인 베타-글루코시데이즈21 (BGLU21) 이중 돌연변이체에서 소포체 바디의 개수가 감소된다는 것이 보고되었다. 이 외에도 금속이온 수송체 활성을 가지는 MEMBRANE OF ER BODY 1(MEB1)과 MEB2 단백질이 소포체 바디의 막에 특이적으로 존재한다는 것이 알려져 있다. 하지만 특정 유전자의 발현을 통해 소포체 바디의 거대화를 유도하거나 소포체 바디의 개수를 증가시키기 위한 시도나 보고는 전무한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 목적 단백질을 안정적으로 고발현·고축적 시키기 위한 하나의 방법으로 세포 소기관을 거대화 하거나 개수를 증대시킬 수 있는 방법을 연구하던 중 TSA1 단백질의 발현이 거대 소포체 바디의 형성 및 개수를 증대시킴으로써 목적 단백질을 안정적으로 고축적 시키는 효과가 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 TSA1 단백질(TSK-associating protien 1)을 암호화하는 염기서열을 포함하는 식물 세포의 소포체 바디(endoplasmic reticulum body)의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전술한 재조합 벡터가 도입된 형질전환 식물 세포 또는 조직을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 재조합 벡터를 식물 세포 또는 조직에 도입하여 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물 세포 또는 조직으로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물 세포의 소포체 바디의 크기 및 개수가 증가된 식물체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 방법에 의해 제조된 소포체 바디의 크기 및 개수가 증가된 형질전환 식물체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 식물 세포의 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터와 목적 단백질을 소포체 바디로 타겟팅하기 위한 재조합 벡터를 식물 세포 또는 조직에 도입하여 식물 세포 또는 조직을 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 소포체 바디의 크기 및 개수가 증가된 형질전환 식물체와 목적 단백질을 소포체 바디로 타겟팅하기 위한 벡터가 도입된 형질전환 식물체를 교배하여 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열에 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열, 목적 단백질을 암호화하는 염기서열, 및 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열이 추가적으로 작동가능하게 연결된 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터에 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열, 목적 단백질을 암호화하는 염기서열, 및 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열을 추가적으로 작동가능하게 연결하여 제조된 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터에 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열, 목적 단백질을 암호화하는 염기서열, 및 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열을 추가적으로 작동가능하게 연결하여 제조된 재조합 벡터를 식물 세포 또는 조직에 도입하여 식물 세포 또는 조직을 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 식물 세포 내 소포체 바디(endoplasmic reticulum body)의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 전술한 재조합 벡터가 도입된 형질전환 식물 세포 또는 조직을 제공한다.
본 발명은 또한, 전술한 재조합 벡터를 식물 세포 또는 조직에 도입하여 식물 세포 또는 조직을 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물 세포 또는 조직으로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물 세포의 소포체 바디의 크기 및 개수가 증가된 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 재조합 벡터를 식물 세포 또는 조직에 도입하는 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG (Polyethylen glycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 방법에 의해 제조된 식물 세포의 소포체 바디의 크기 및 개수가 증가된 형질전환 식물체를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 및 샐러리로 이루어진 군으로부터 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 및 양파로 이루어진 군으로부터 선택되는 단자엽 식물일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터와 목적 단백질을 소포체 바디로 타겟팅하기 위한 재조합 벡터를 식물 세포에 도입하여 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 목적 단백질을 소포체 바디로 타겟팅하기 위한 재조합 벡터는 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열, 목적 단백질을 암호화하는 염기서열, 및 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열은 BiP(luminal-binding protein) 단백질의 신호 펩타이드 부위를 암호화하는 서열번호 2로 이루어진 염기서열이고, 상기 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu), HEEL(His-Glu-Glu-Leu), KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu), KEEL(Lys-Glu-Glu-Leu), RDEL(Arg-Asp-Glu-Leu) 및 REEL(Arg-Glu-Glu-Leu)로 이루어진 군에서 선택되는 펩타이드를 암호화하는 염기서열일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 소포체 바디의 크기 및 개수가 증가된 형질전환 식물체와 목적 단백질을 소포체 바디로 타겟팅하기 위한 벡터가 도입된 형질전환 식물체를 교배하여 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터에 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열, 목적 단백질을 암호화하는 염기서열, 및 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열을 추가적으로 작동가능하게 연결하여 제조된 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열은 BiP(chaperone binding protein) 단백질을 암호화하는 서열번호 2로 이루어진 염기서열이고, 상기 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 또는 KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 암호화하는 염기서열일 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터에 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열, 목적 단백질을 암호화하는 염기서열, 및 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열을 추가적으로 작동가능하게 연결하여 제조된 재조합 벡터를 식물 세포 또는 조직에 도입하여 식물 세포 또는 조직을 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 식물 세포 내 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터로 형질전환된 식물체는 소포체 바디의 크기와 개수를 조절할 수 있는 TSA1 단백질의 발현을 통해 소포체 바디의 개수뿐만 아니라 거대화된 소포체 바디의 형성을 유도하여 소포체로 타겟팅되는 목적 단백질을 안정적으로 이들 소포체 바디 내에 고축적 시킴으로써 목적 단백질을 대량생산할 수 있다.
도 1A는 본 발명의 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 식물 세포 내 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터(TSA1:GFP 구성)의 모식도이다.
도 1B는 본 발명에 사용된 TSA1 단백질의 아미노산 서열이다.
도 1C는 본 발명에 사용된 BiP 단백질의 신호 펩타이드 부위를 암호화하는 염기서열이다.
도 2는 본 발명의 제조방법에 따라 제조한 형질전환 식물체 1세대에서 TSA1 단백질의 별현을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
도 3은 본 발명의 제조방법에 따라 제조한 형질전환 식물체에서 TSA1 단백질에 의한 소포체 바디의 형태적 변화를 형광현미경으로 찍은 이미지이다.
도 4A는 형질전환 식물체 BiP:mCherry:HDEL 계통과 BiP:mCherry:HDEL/TSA1:GFP 이중 호모 계통에서 소포체 바디에 타겟팅 되어 있는 mCherry의 형광 시그날을 현미경으로 관찰한 것이다.
도 4B는 형질전환 식물체 BiP:mCherry:HDEL 계통과 BiP:mCherry:HDEL/TSA1:GFP 이중 호모 계통에서 각각 소포체 바디 내에 목적 단백질 BiP:mCherry:HDEL의 축적 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
상술한 바와 같이, 목적 단백질의 저장 안정성과 고축적을 위해 다양한 세포 소기관으로 단백질을 타겟팅하는 기술이 개발되고 있으나, 목적 단백질을 안정적으로 저장할 수 있는 세포 소기관 자체의 크기와 개수를 증대시키는 기술 개발은 전무한 실정이다.
이에 본 발명자들은 목적 단백질을 안정적으로 고발현·고축적 시키기 위한 하나의 방법으로, 식물 세포 내 소포체 바디의 크기와 개수를 조절할 수 있는 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터, 이를 이용한 목적 단백질의 대량생산방법 및 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 식물체를 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명에 따른 식물 세포 내 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터로 형질전환된 식물체는 소포체 바디의 크기와 개수를 조절할 수 있는 TSA1 단백질의 발현을 통해 소포체 바디의 개수뿐만 아니라 거대화된 소포체 바디의 형성을 유도하여 소포체로 타겟팅되는 목적 단백질을 안정적으로 이들 소포체 바디 내에 고축적시킴으로써 목적 단백질을 대량생산할 수 있다.
본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 식물 세포 내 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명의 일실시예에서는 도 1A에 나타낸 모식도와 같이 재조합 벡터를 제조하였다.
본 발명자들은 소포체의 형태 변화를 유도하는 유전자를 스크리닝하는 과정에서 거대한 소포체 바디와 소포체 바디 수의 증가를 유도하는 TSA1 단백질을 암호화하는 유전자를 동정하였다. 도 1B에 나타난 바와 같이, TSA1 단백질은 총 759 개의 아미노산으로 구성되어 있으며(서열번호 1), 이 단백질을 암호화하는 유전자를 확보하기 위하여 PCR 방법을 통해 애기장대(Arabidopsis thaliana) cDNA 라이브러리로부터 2277bp의 DNA를 확보하였다.
상기 재조합 벡터는 이미 시판되고 있거나 공지된 일반적인 식물 발현 벡터를 기본 골격으로 하여 다양한 프로모터와 함께 TSA1 단백질을 암호화하는 유전자를 순차적으로 작동가능하게 연결한 재조합 발현 벡터일 수 있다.
본 발명에서 상기 “발현 벡터”라는 용어는 본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 염기서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 “작동가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열,
적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
상기 프로모터로는 식물체 내에서 삽입 유전자를 발현시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않으며, 이에 한정되는 것은 아니나, CaMV의 35S RNA 및 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 또는 유비퀴틴 프로모터 등을 들 수 있다. 또한 식물 세포 내로 본 발명에 따른 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열을 도입시키기 위한 적합한 벡터로는 Ti 플라스미드 및 식물 바이러스 벡터가 있다. 상기 적합한 벡터의 예로는 이에 한정되지는 않으나, p35S일 수 있다. 당업자라면 본 발명의 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열을 도입시키는데 적합한 벡터를 선택할 수 있으며, 본 발명에서는 상기 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열을 식물 세포 내로 도입할 수 있는 벡터라면 모두 사용 가능하다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 식물 세포 또는 조직, 상기 형질전환된 식물 세포 또는 조직으로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물 세포의 소포체 바디의 크기 및 개수가 증가된 식물체의 제조방법 및 상기 제조방법에 의해 제조된 형질전환 식물체를 제공한다.
상기 재조합 벡터를 식물 세포 또는 조직에 도입하는 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG (Polyethylen glycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법일 수 있다.
상기 방법으로 제조된 소포체 바디의 크기 및 개수가 증가된 형질전환 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 및 샐러리로 이루어진 군으로부터 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 및 양파로 이루어진 군으로부터 선택되는 단자엽 식물일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니며, 형질전환이 가능한 식물이라면 제한없이 본 발명의 제조방법에서 사용 가능하다.
본 발명의 일실시예에서는 애기장대 및 담배 형질전환 식물체를 제작하였으며, 하이그로마이신 내성 검사로 선별된 식물체를 직접 현광현미경 하에서 녹색형광단백질에 의해 생성되는 형광 신호를 관찰하고 웨스턴 블럿을 통해 단백질 발현이 잘되는 계통을 선별하여 형질전환 1세대를 확보하였다(도 2).
또한, TSA1 단백질의 세포 내 위치 및 TSA1 단백질의 발현에 의해 유도되는 소포체 바디의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 형질전환 식물체로부터 원형질체를 분리하여 형광현미경으로 관찰을 하였다. C-말단에 녹색형광단백질이 결합된 TSA1 단백질은 소포체에 전체적으로 분포를 하는 것이 아니라, 소포체 바디에 특이적으로 위치하는 것을 관찰하였다 (도 3). 뿐만 아니라, TSA1 단백질이 위치하고 있는 소포체 바디는 쌀알 형태의 일반적인 소포체 바디의 형태와는 큰 차이를 보이는 길고 거대한 형태의 소포체 바디가 형성되었으며, 소포체 바디 개수 또한 현저하게 증가함을 형광현미경을 통해 쉽게 관찰할 수 있었다 (도 3).
본 발명은 또한, 전술한 재조합 벡터와 목적 단백질을 소포체 바디로 타겟팅하기 위한 재조합 벡터를 식물 세포 또는 조직에 도입하여 식물 세포 또는 조직을 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 방법을 제공한다.
상기 목적 단백질을 소포체 바디로 타겟팅 하기 위한 재조합 벡터는 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열, 목적 단백질을 암호화하는 염기서열, 및 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열을 포함할 수 있다.
상기 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열은 소포체로의 타겟팅에 관여하는 다양한 신호 펩타이드를 제한 없이 사용할 수 있으며, 하나의 예로서 BiP(luminal-binding protein) 단백질의 신호 펩타이드 부위를 암호화하는 염기서열을 사용할 수 있고, 바람직하게는 도 1C에 제시된 서열번호 2로 이루어진 염기서열을 사용할 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열로는 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 [His/Lys/Arg][Asp/Glu]Glu-Leu 의 조합에서 선택될 수 있는 펩타이드를 암호화하는 염기서열을 사용할 수 있다. BiP 단백질의 N-말단에는 소포체로의 타겟팅을 결정하는 신호 펩타이드를 함유하고 있어 목적 단백질들을 소포체로 타겟팅 시키는 역할을 할 수 있으며, 소포체로의 타겟팅을 위해 삽입되는 신호 펩타이드는 BiP 단백질의 N-말단의 신호 펩타이드에 국한되는 것은 아니며 소포체로의 타겟팅에 관여하는 다양한 신호 펩타이드를 사용할 수 있다. 또한, N-말단에 신호 펩타이드를 가지는 수용성 단백질의 C-말단에 소포체 유지(retention) 신호로 작용하는 [His/Lys/Arg][Asp/Glu]Glu-Leu의 조합에서 선택될 수 있는 펩타이드를 포함시키게 되면 이들 단백질은 소포체뿐만 아니라 소포체 바디에 축적되는 특성을 가지며, 안정성 또한 증가된다는 것이 보고되었다.
따라서, 이러한 BiP의 신호 펩타이드 및 소포체 유지 신호 펩타이드를 이용한 발현 벡터를 사용할 경우, 목적 단백질을 소포체 바디에 축적시켜 안정적으로 저장할 수 있다.
상기에서 목적 단백질은 생산하고자 하는 단백질을 의미하는 용어로서, 특정 단백질로 한정되지 않는다. 또한, 상기 목적 단백질로서 리포터 단백질들이 포함될 수 있는데, 상기 리포터 단백질은 리포터 유전자에 의해 발현되는 단백질로서 그 존재에 의해서 세포 내에서의 그의 활성을 알려주는 표지 단백질을 말한다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 목적 단백질로 BiP:mCherry:HDEL을 사용하였으나, 목적 단백질이 이에 한정되는 것은 아니며, 의료용, 산업용 단백질을 포함하여 소포체 바디로 타겟팅 시킬 수 있는 단백질이라면 제한 없이 본 발명의 대량 생산 방법으로 생산될 수 있다.
상기 형질전환된 식물체로부터 목적 단백질을 생산하는 방법은 본 발명의 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터와 목적 단백질을 소포체 바디로 타겟팅하기 위한 재조합 벡터를 식물체에 도입하거나 또는 상기 재조합 발현 벡터로 세포를 형질전환 시킨 다음, 목적 단백질이 발현되도록 적당한 시간동안 배양한 후, 형질전환된 식물 또는 세포로부터 수득할 수 있다. 이때 상기 목적 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지된 방법이라면 모두 사용가능하다. 또한 형질전환된 식물 또는 세포에서 고발현된 목적 단백질의 회수는 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있으며, 통상적으로 세포 조각(cell debris) 등을 제거하기 위하여 상기 세포 용해물을 원심분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전)등을 수행할 수 있고, 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 친화성 컬럼 크로마토그래피, 또는 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 목적 단백질을 정제할 수 있다(Maniatis 외., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook 외., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
또한, 본 발명은 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 다른 방법으로, 본 발명에서 제조된 소포체 바디의 크기 및 개수가 증가된 형질전환 식물체와 목적 단백질을 소포체 바디로 타겟팅하기 위한 재조합 벡터가 도입된 형질전환 식물체를 교배하여 목적 단백질을 대량 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일실시예에서는 소포체 및 소포체 바디 마커 BiP:mCherry:HDEL 계통과 TSA1:GFP 형질전환체 계통의 교배를 통하여 TSA1:GFP와 BiP:mCherry:HDEL이 동시에 발현되는 형질전환 식물체를 제조하고, BiP:mCherry:HDEL 계통과 BiP:mCherry:HDEL/TSA1:GFP 이중 호모 계통에서 소포체 바디에 타겟팅 되어 있는 mCherry의 형광 시그날을 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4A에 나타난 바와 같이 BiP:mCherry:HDEL 계통에서는 mCherry 형광 시그날이 소포체 전반에 고루 분포하여, 일부 시그날이 소포체 바디에서 관찰이 되었으나, BiP:mCherry:HDEL/TSA1:GFP 이중 호모 계통에서는 mCherry 형광 시그날이 거대한 소포체 바디 및 개수가 증가된 소포체 바디 내에서 강하게 관찰되었다.
또한, 소포체 바디 내에 축적된 목적 단백질 BiP:mCherry:HDEL의 정량적 분석을 위하여 웨스턴 블럿을 수행하여 목적 단백질의 축적 정도를 정량화 하였다.
그 결과, 도 4B에 나타난 바와 같이 BiP:mCherry:HDEL 계통과 비교하여 BiP:mCherry:HDEL/TSA1:GFP 계통에서 목적 단백질의 축적이 약 2~7 배 현저하게 증가된 것을 관찰할 수 있었다.
이를 통해, 본 발명의 TSA1 단백질을 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 식물체는 TSA1 단백질의 발현을 통해 거대 소포체 바디의 형성 및 소포체 바디의 개수 증대를 유도함으로써 안정적으로 목적 단백질을 소포체 바디 내에 고축적 시킬 수 있음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명은 고부가 가치의 의료용·산업용 단백질뿐만 아니라 다양한 바이오소재의 대량생산을 위한 하나의 전략으로 적극 활용될 수 있을 것이다.
본 발명은 또한, 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터에 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열, 목적 단백질을 암호화하는 염기서열, 및 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열을 추가적으로 작동가능하게 연결하여 제조된 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
상기 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열은 BiP(chaperone binding protein) 단백질을 암호화하는 서열번호 2로 이루어진 염기서열일 수 있고, 상기 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열은 [His/Lys/Arg][Asp/Glu]Glu-Leu 조합, 즉, HDEL(His-Asp-Glu-Leu), HEEL(His-Glu-Glu-Leu), KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu), KEEL(Lys-Glu-Glu-Leu), RDEL(Arg-Asp-Glu-Leu) 및 REEL(Arg-Glu-Glu-Leu)로 이루어진 군에서 선택되는 펩타이드를 암호화하는 염기서열일 수 있다.
본 발명은 또한 소포체 바디의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터에 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열, 목적 단백질을 암호화하는 염기서열, 및 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열을 추가적으로 작동가능하게 연결하여 제조된 재조합 벡터를 식물 세포 또는 조직에 도입하여 식물 세포 또는 조직을 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
발현 벡터 제작
본 발명자들은 발현 벡터로 CaMV 35S 프로모터-TSA1:녹색형광단백질(green fluorescence protein, GFP)의 형태를 사용하였다 (도 1). 녹색형광단백질은 세포 내 TSA1 단백질의 위치뿐만 아니라 소포체 바디의 형태적 변화를 추적하기 위하여 포지하였다. 상기 벡터를 식물 세포에서 발현시키면 TSA1 단백질의 N-말단에 존재하는 신호 펩타이드에 의해 소포체로 타겟팅되며 그 제작 방법은 하기와 같다. TSA1 단백질을 암호화하는 유전자(AT1G52410)는 애기장대 cDNA 라이브러리로부터 PCR법을 통해 확보하였으며, PCR에 사용된 정방향 프라이머 5‘- GCTCTAGAATGGAAATCTACACCATGAAA -3’(서열번호 3)와 역방향 프라이머 5‘-CGGGATCCAAGAGAACTAAGAAACTTAAC -3’(서열번호 4)에는 각각 XbaI과 BamHI의 추가하여 클로닝을 용이하게 하였다. pCAMBIA 1300 플라스미드의 멀티클로닝 사이트 부위에 PstI/EcoRI으로 절단한 326-GFP (Arabidopsis Biological Resource Center, Ohio State University, Ohio, USA) 플라스미드의 DNA 조각을 삽입하여 기본 벡터를 제조하였으며, 326-GFP 플라스미드의 절단된 DNA 조각에는 CaMV 35S 프로모터, 녹색형광단백질, 그리고 NOS 종결자가 포함되어 있다. 이렇게 제조된 기본 벡터의 CaMV 35S 프로모터와 녹색형광단백질 사이에 XbaI/BamHI으로 절단한 TSA1 단백질을 암호화하는 유전자를 삽입하여 식물 발현 벡터를 제작하였다 (도 1).
TSA1 단백질이 발현되는 형질전환 식물체의 제작
TSA1 단백질의 발현을 통해 거대 소포체 바디의 형성 및 소포체 바디 개수의 증가를 유도할 수 있는 형질전환 식물체를 제조하였다. 식물체 형질전환용 플라스미드는 상기 실시예 1에서 자세히 설명하였다. 상기 제조된 형질전환용 재조합 벡터를 아그로박테리움-매개 형질전환 방법을 이용하여 형질전환된 애기장대와 담배 식물체를 제조하였다. 상기 형질전환 식물체를 제조하기 위해 사용한 기본 벡터인 pCAMBIA 1300은 T-DNA 내에 하이그로마이신 내성 유전자를 포함하고 있기 때문에 하이그로마이신 내성 검사를 통해 본 발명의 방법으로 형질 전환된 식물체를 선별하였다. 또한, 내성 검사로 선별된 식물체는 직접 형광현미경 하에서 녹색형광단백질에 의해 생성되는 형광 신호를 관찰하고 웨스턴 블럿을 통해 단백질이 발현이 잘되는 계통을 선별하여 형질전환 1세대를 확보하였다 (도 2). 형질전환 2세대에서는 하이그로마이신 내성 검사를 이용하여 죽은 개체 : 살아남은 개체가 1 : 3의 비율로 분리되는 계통을 선별하였으며, 이들 계통 중 형질전환 3세대에서 모두 살아남는 개체를 호모(homo) 계통으로 선별하여 형질전환된 식물체 계통을 확보하였다.
TSA1 단백질에 의한 소포체 바디 형태의 변화 분석
TSA1 단백질의 세포 내 위치 및 TSA1 단백질의 발현에 의해 유도되는 소포체 바디의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 형질전환 식물체로부터 원형질체를 분리하여 형광현미경으로 관찰을 하였다. C-말단에 녹색형광단백질이 결합된 TSA1 단백질은 소포체에 전체적으로 분포를 하는 것이 아니라, 소포체 바디에 특이적으로 위치하는 것을 관찰하였다 (도 3). 뿐만 아니라, TSA1 단백질이 위치하고 있는 소포체 바디는 쌀알 형태의 일반적인 소포체 바디의 형태와는 큰 차이를 보이는 길고 거대한 형태의 소포체 바디가 형성되었으며, 소포체 바디 개수 또한 현저하게 증가함을 형광현미경을 통해 쉽게 관찰할 수 있었다 (도 3).
거대 소포체 바디 내에 목적 단백질의 축적 정도 분석
일반적으로, 소포체로 타겟팅 되는 수용성 단백질 C-말단에 소포체 유지 신호인 HDEL 펩타이드를 포함시키게 되면 이들 단백질들은 소포체뿐만 아니라 소포체 바디에 타겟팅 되는 것이 보고되었다. 따라서, TSA1 단백질의 발현을 통해 거대 소포체 바디 형성 및 소포체 바디 개수의 증가를 유도함으로써 소포체 바디로 타겟팅 되는 목적 단백질의 고축적 정도를 분석하고자 하였다. 본 발명자들은 소포체 바디에 축적하기 위한 목적 단백질로 이미 확보하고 있는 소포체 및 소포체 바디 마커 BiP:mCherry:HDEL이 발현되는 형질전환 식물체 계통을 이용하였다. 소포체 및 소포체 바디 마커 BiP:mCherry:HDEL 계통과 TSA1:GFP 형질전환체 계통의 교배를 통하여 TSA1:GFP와 BiP:mCherry:HDEL이 동시에 발현되는 형질전환 식물체를 제조하였다. 두 단백질이 동시에 발현되는 계통을 선별하기 위하여 하이그로마이신과 포스피노트리신 내성 검사를 통해 본 발명의 방법으로 형질 전환된 식물체를 선별하였다. 이들 계통 중 교잡 3세대에서 모두 살아남는 개체를 이중 호모(homo) 계통으로 선별하여 형질전환된 식물체 계통을 확보하였다. 우선, BiP:mCherry:HDEL 계통과 BiP:mCherry:HDEL/TSA1:GFP 이중 호모 계통에서 소포체 바디에 타겟팅 되어 있는 mCherry의 형광 시그날을 현미경으로 관찰하였다. BiP:mCherry:HDEL 계통에서는 mCherry 형광 시그날이 소포체 전반에 고루 분포하여, 일부 시그날이 소포체 바디에서 관찰이 되었다. 하지만, 흥미롭게도 BiP:mCherry:HDEL/TSA1:GFP 이중 호모 계통에서는 mCherry 형광 시그날이 거대한 소포체 바디 및 개수가 증가된 소포체 바디 내에서 강하게 관찰되었다 (도 4). 따라서 소포체 바디 내에 축적된 목적 단백질 BiP:mCherry:HDEL의 정량적 분석을 위하여 각 계통으로부터 단백질을 추출하였으며, 4 에서 10분 동안 저속 원심분리(low-speed centrifugation, 13,000×g)하여 침전물 분획을 제외한 수용성 분획만을 취하여 SDS-PAGE에 사용하였다. 이후 anti-mCherry antibody를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하여 목적 단백질의 축적 정도를 정량화 하였다. 그 결과, BiP:mCherry:HDEL 계통과 비교하여 BiP:mCherry:HDEL/TSA1:GFP 계통에서 목적 단백질이 축적이 약 2~7 배 현저하게 증가된 것을 관찰할 수 있었다 (도 4B). 이러한 실시예를 바탕으로, TSA1 단백질의 발현을 통해 거대 소포체 바디의 형성 및 소포체 바디의 개수 증대를 유도함으로써 안정적으로 목적 단백질을 소포체 바디 내에 고축적 시킬 수 있음을 확인하였다. 본 발명은 고부가 가치의 의료용·산업용 단백질뿐만 아니라 다양한 바이오소재의 대량생산을 위한 하나의 전략으로 적극 활용될 수 있을 것이다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Recombinant vector for increasing size and number of endoplasmic reticulum body in plant cell and method of mass production of target protein using the same <130> PB15-12959 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 759 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Arabidopsis thaliana TSA1 protein <400> 1 Met Glu Ile Tyr Thr Met Lys Thr Asn Phe Leu Val Leu Ala Leu Ser 1 5 10 15 Leu Cys Ile Leu Leu Ser Ser Phe His Glu Val Ser Cys Gln Asp Asp 20 25 30 Gly Ser Gly Leu Ser Asn Leu Asp Leu Ile Glu Arg Asp Tyr Gln Asp 35 40 45 Ser Val Asn Ala Leu Gln Gly Lys Asp Asp Glu Asp Gln Ser Ala Lys 50 55 60 Ile Gln Ser Glu Asn Gln Asn Asn Thr Thr Val Thr Asp Lys Asn Thr 65 70 75 80 Ile Ser Leu Ser Leu Ser Asp Glu Ser Glu Val Gly Ser Val Ser Asp 85 90 95 Glu Ser Val Gly Arg Ser Ser Leu Leu Asp Gln Ile Lys Leu Glu Phe 100 105 110 Glu Ala His His Asn Ser Ile Asn Gln Ala Gly Ser Asp Gly Val Lys 115 120 125 Ala Glu Ser Lys Asp Asp Asp Glu Glu Leu Ser Ala His Arg Gln Lys 130 135 140 Met Leu Glu Glu Ile Glu His Glu Phe Glu Ala Ala Ser Asp Ser Leu 145 150 155 160 Lys Gln Leu Lys Thr Asp Asp Val Asn Glu Gly Asn Asp Glu Glu His 165 170 175 Ser Ala Lys Arg Gln Ser Leu Leu Glu Glu Ile Glu Arg Glu Phe Glu 180 185 190 Ala Ala Thr Lys Glu Leu Glu Gln Leu Lys Val Asn Asp Phe Thr Gly 195 200 205 Asp Lys Asp Asp Glu Glu His Ser Ala Lys Arg Lys Ser Met Leu Glu 210 215 220 Ala Ile Glu Arg Glu Phe Glu Ala Ala Met Glu Gly Ile Glu Ala Leu 225 230 235 240 Lys Val Ser Asp Ser Thr Gly Ser Gly Asp Asp Glu Glu Gln Ser Ala 245 250 255 Lys Arg Leu Ser Met Leu Glu Glu Ile Glu Arg Glu Phe Glu Ala Ala 260 265 270 Ser Lys Gly Leu Glu Gln Leu Arg Ala Ser Asp Ser Thr Ala Asp Asn 275 280 285 Asn Glu Glu Glu His Ala Ala Lys Gly Gln Ser Leu Leu Glu Glu Ile 290 295 300 Glu Arg Glu Phe Glu Ala Ala Thr Glu Ser Leu Lys Gln Leu Gln Val 305 310 315 320 Asp Asp Ser Thr Glu Asp Lys Glu His Phe Thr Ala Ala Lys Arg Gln 325 330 335 Ser Leu Leu Glu Glu Ile Glu Arg Glu Phe Glu Ala Ala Thr Lys Asp 340 345 350 Leu Lys Gln Leu Asn Asp Phe Thr Glu Gly Ser Ala Asp Asp Glu Gln 355 360 365 Ser Ala Lys Arg Asn Lys Met Leu Glu Asp Ile Glu Arg Glu Phe Glu 370 375 380 Ala Ala Thr Ile Gly Leu Glu Gln Leu Lys Ala Asn Asp Phe Ser Glu 385 390 395 400 Gly Asn Asn Asn Glu Glu Gln Ser Ala Lys Arg Lys Ser Met Leu Glu 405 410 415 Glu Ile Glu Arg Glu Phe Glu Ala Ala Ile Gly Gly Leu Lys Gln Ile 420 425 430 Lys Val Asp Asp Ser Arg Asn Leu Glu Glu Glu Ser Ala Lys Arg Lys 435 440 445 Ile Ile Leu Glu Glu Met Glu Arg Glu Phe Glu Glu Ala His Ser Gly 450 455 460 Ile Asn Ala Lys Ala Asp Lys Glu Glu Ser Ala Lys Lys Gln Ser Gly 465 470 475 480 Ser Ala Ile Pro Glu Val Leu Gly Leu Gly Gln Ser Gly Gly Cys Ser 485 490 495 Cys Ser Lys Gln Asp Glu Asp Ser Ser Ile Val Ile Pro Thr Lys Tyr 500 505 510 Ser Ile Glu Asp Ile Leu Ser Glu Glu Ser Ala Val Gln Gly Thr Glu 515 520 525 Thr Ser Ser Leu Thr Ala Ser Leu Thr Gln Leu Val Glu Asn His Arg 530 535 540 Lys Glu Lys Glu Ser Leu Leu Gly His Arg Val Leu Thr Ser Pro Ser 545 550 555 560 Ile Ala Ser Ser Thr Ser Glu Ser Ser Ala Thr Ser Glu Thr Val Glu 565 570 575 Thr Leu Arg Ala Lys Leu Asn Glu Leu Arg Gly Leu Thr Ala Arg Glu 580 585 590 Leu Val Thr Arg Lys Asp Phe Gly Gln Ile Leu Ile Thr Ala Ala Ser 595 600 605 Phe Glu Glu Leu Ser Ser Ala Pro Ile Ser Tyr Ile Ser Arg Leu Ala 610 615 620 Lys Tyr Arg Asn Val Ile Lys Glu Gly Leu Glu Ala Ser Glu Arg Val 625 630 635 640 His Ile Ala Gln Val Arg Ala Lys Met Leu Lys Glu Val Ala Thr Glu 645 650 655 Lys Gln Thr Ala Val Asp Thr His Phe Ala Thr Ala Lys Lys Leu Ala 660 665 670 Gln Glu Gly Asp Ala Leu Phe Val Lys Ile Phe Ala Ile Lys Lys Leu 675 680 685 Leu Ala Lys Leu Glu Ala Glu Lys Glu Ser Val Asp Gly Lys Phe Lys 690 695 700 Glu Thr Val Lys Glu Leu Ser His Leu Leu Ala Asp Ala Ser Glu Ala 705 710 715 720 Tyr Glu Glu Tyr His Gly Ala Val Arg Lys Ala Lys Asp Glu Gln Ala 725 730 735 Ala Glu Glu Phe Ala Lys Glu Ala Thr Gln Ser Ala Glu Ile Ile Trp 740 745 750 Val Lys Phe Leu Ser Ser Leu 755 <210> 2 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence encoding signal peptide of BiP protein <400> 2 atggctcgct cgtttggagc taacagtacc gttgtgttgg cgatcatctt cttcggatgt 60 ttatttgcgt tgtcctctgc aatagaagag gctacgaagt ta 102 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSA1 forward primer <400> 3 gctctagaat ggaaatctac accatgaaa 29 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TSA1 reverse primer <400> 4 cgggatccaa gagaactaag aaacttaac 29

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 TSA1 단백질(TSK-associating protien 1)을 암호화하는 염기서열을 포함하는 식물 세포 내 소포체 바디(endoplasmic reticulum body)의 크기 및 개수를 증가시키기 위한 재조합 벡터.
  2. 제1항의 재조합 벡터가 도입된 형질전환 식물 세포.
  3. 제1항의 재조합 벡터가 도입된 형질전환 식물 조직.
  4. 제1항의 재조합 벡터를 식물 세포 또는 조직에 도입하여 식물 세포 또는 조직을 형질전환하는 단계; 및
    상기 형질전환된 식물 세포 또는 조직으로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 식물 세포의 소포체 바디의 크기 및 개수가 증가된 식물체의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 재조합 벡터를 식물 세포 또는 조직에 도입하는 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium sp.)-매개에 의한 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG (Polyethylen glycol)-매개성 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법인 것을 특징으로 하는 식물체의 제조방법.
  6. 제4항의 방법에 의해 제조된 식물 세포 내 소포체 바디의 크기 및 개수가 증가된 형질전환 식물체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 식물체는 애기장대, 대두, 담배, 가지 고추, 감자, 토마토, 배추, 무, 양배추, 상추, 복숭아, 배, 딸기, 수박, 참외, 오이, 당근, 및 샐러리로 이루어진 군으로부터 선택되는 쌍자엽 식물; 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 및 양파로 이루어진 군으로부터 선택되는 단자엽 식물인 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
  8. 제1항의 재조합 벡터와 목적 단백질을 소포체 바디로 타겟팅하기 위한 재조합 벡터를 식물 세포 또는 조직에 도입하여 식물 세포 또는 조직을 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 목적 단백질을 소포체 바디로 타겟팅 하기 위한 재조합 벡터는 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열, 목적 단백질을 암호화하는 염기서열, 및 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열은 BiP(luminal-binding protein) 단백질을 암호화하는 서열번호 2로 이루어진 염기서열이고, 상기 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu), HEEL(His-Glu-Glu-Leu), KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu), KEEL(Lys-Glu-Glu-Leu), RDEL(Arg-Asp-Glu-Leu) 및 REEL(Arg-Glu-Glu-Leu)로 이루어진 군에서 선택되는 펩타이드를 암호화하는 염기서열인 것을 특징으로 하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 방법.
  11. 제5항의 형질전환 식물체와 제8항의 목적 단백질을 소포체 바디로 타겟팅하기 위한 재조합 벡터가 도입된 형질전환 식물체를 교배하여 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 방법.
  12. 제1항의 재조합 벡터에 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열, 목적 단백질을 암호화하는 염기서열, 및 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열을 추가적으로 작동가능하게 연결하여 제조된 재조합 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 소포체 바디로 목적 단백질을 타겟팅할 수 있는 염기서열은 BiP(luminal-binding protein) 단백질을 암호화하는 서열번호 2로 이루어진 염기서열이고, 상기 소포체 바디로 목적 단백질을 유지할 수 있는 염기서열은 HDEL(His-Asp-Glu-Leu), HEEL(His-Glu-Glu-Leu), KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu), KEEL(Lys-Glu-Glu-Leu), RDEL(Arg-Asp-Glu-Leu) 및 REEL(Arg-Glu-Glu-Leu)로 이루어진 군에서 선택되는 펩타이드를 암호화하는 염기서열인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  14. 제12항의 재조합 벡터를 식물 세포 또는 조직에 도입하여 식물 세포 또는 조직을 형질전환하는 단계를 포함하는 식물체로부터 목적 단백질을 대량생산하는 방법.
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