CN112430539A - 一种生物反应器及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物反应器及其应用。该生物反应器包括主体部，主体部包括第一圆锥体、圆柱体和第二圆锥体；第一圆锥体内部形成第一空腔；圆柱体内部形成第二空腔，且圆柱体的高径比在3‑8；第二圆锥体的内部形成第三空腔，第三空腔内设有通气单元，通气单元包括板状主体和通气孔；第一空腔、第二空腔、第三空腔相连通。所述生物反应器细胞培养工作体积可操作范围宽，克服摇瓶和摇袋反应器及搅拌式反应器工作体积可操作范围有限的缺点，在扩种培养过程中可代替多步摇瓶培养和摇袋反应器培养，减少转扩种次数，降低污染风险；且有高效传氧效率，克服了摇瓶和摇袋反应器传氧效率低下的问题，能够支持高密度细胞培养，没有开放型操作，染菌风险低。
Description
技术领域
本发明涉及细胞扩增培养技术领域，特别是涉及一种生物反应器及其应用。
背景技术
在过去的三十年，随着基因工程和细胞培养技术的进展，哺乳动物细胞培养广泛地应用于生物制药行业。
动物细胞培养可分为贴壁培养和悬浮培养。贴壁培养系统主要有方瓶(T-flask)、转瓶、中空纤维、微载体、平板式生物反应器等培养系统。由于贴壁培养单位体积提供细胞生长的表面积小，且传质效果和培养液均一性差，不利于扩大培养。悬浮培养主要有摇瓶、摇袋、鼓泡式反应器、气升式反应器、搅拌式反应器等培养系统。搅拌式生物反应器配置有搅拌桨和通气单元，有良好的混合和传质效果；另外搅拌式反应器通常配制有溶氧(DO)、温度、pH等控制系统，能够对细胞培养环境进行良好的控制，反应器的可操控范围大，因此100L以上大规模动物细胞培养基本上都采用搅拌式反应器系统。摇瓶培养具有简单易用的特点，但其氧传递主要通过摇瓶内的气液表面实现，随着培养规模增加，气液表面积和培养体积比降低，因此供氧能力随着培养规模增加快速下降，只适用于小规模的细胞培养。摇袋反应器培养通过流体的波浪形流动且配有表层通气，比摇瓶培养传氧效率有些提高，但比通气搅拌式反应器差，可适用中小规模细胞培养。
综合考虑摇瓶，摇袋反应器和搅拌式反应器的特点，在生物制品的生产过程中通常采用摇瓶和摇袋反应器进行种子细胞扩增，而把搅拌式反应器用于大规模生产培养。目前生物制品生产过程中的大规模动物细胞养通常从复苏一支工作细胞库(WCB)开始，经过摇瓶逐级放大培养获得足够量的细胞，接种到种子罐(WAVE等摇袋反应器或搅拌式反应器)进行进一步扩增，获得足够种子细胞后，再接种到大规模搅拌式生产反应器中进行培养和蛋白表达。
摇瓶培养限于工作体积和传氧效率，主要用于前期种子扩增，工作体积通常不超过5L，在种子逐级扩增中，需要用到多个尺寸的摇瓶，进行多次转种，转种通常在生物安全柜中开放操作，对无菌操作要求高，易染菌。种子罐培养通常采用摇袋反应器或搅拌式反应罐进行扩增培养，相对于搅拌式反应器，摇袋反应器由于操作简单易用，通常用于5-25L工作体积的细胞扩增培养，而搅拌式反应器由于组件繁多、操作复杂、成本高，通常用于更大规模的种子扩增培养或生产培养。当前25L或以下工作体积的种子细胞扩增培养基本上采用一次性使用摇瓶和摇袋反应器，由于摇瓶和摇袋反应器工作体积可操作空间小，需要进行多次转种扩增操作，操作复杂，污染风险高，运行成本高。
发明内容
本发明提供一种生物反应器及其应用，以实现高效率的细胞培养。
针对相关技术中，摇瓶和摇袋反应器的工作体积可操作区间小和传氧效率低的问题，本发明首先提供一种简单易用的生物反应器，可以代替现有技术中的扩增过程中的摇瓶和摇袋反应器。具体技术方案如下：
一种生物反应器，包括主体部，主体部包括第一圆锥体、圆柱体和第二圆锥体，所述第一圆锥体、圆柱体和第二圆锥体沿所述主体部的高度方向依次连接，第一圆锥体位于所述主体部的上部，第二圆锥体位于所述主体部的下部，所述第一圆锥体和第二圆锥体的尖部均背向所述圆柱体；其中：
所述第一圆锥体内部形成第一空腔，所述第一圆锥体的顶部设有出气口；
所述圆柱体内部形成第二空腔，且圆柱体的高径比在3-8之间；
所述第二圆锥体的内部形成第三空腔，所述第二圆锥体的底部设有进气口，所述第三空腔内设有通气单元，所述通气单元包括板状主体和通气孔，且所述板状主体沿所述第二圆锥体的径向延伸并和所述第二圆锥体的内壁密封贴合以将所述第三空腔分隔为第一隔腔和第二隔腔；其中，所述通气孔设在所述板状主体上并连通所述第一隔腔和第二隔腔，所述通气孔的直径在0.5mm-3mm之间；
所述第一空腔、第二空腔和第三空腔相连通。
本发明所述的生物反应器，优选地，所述圆柱体的直径在200-300mm范围内。
本发明所述的生物反应器，优选地，所述第一圆锥体的尖部的角度在30-150°之间。
本发明所述的生物反应器，优选地，所述第二圆锥体的尖部的角度在30-90°之间。
本发明所述的生物反应器，优选地，所述主体部还设有进料/出料口；所述进料/出料口设置在所述圆柱体和所述第二圆锥体的连接处，或设置在所述圆柱体的侧面的底部。
本发明所述的生物反应器，所述通气单元的板状主体的直径在1-2cm范围内。
优选地，所述通气孔为多个，优选为3-9个；本领域技术人员可以理解，所述通气孔均匀分布于所述板状主体。
本发明所述的生物反应器，所述通气单元的材质为塑料、陶瓷中的一种；更优选为塑料。
本发明所述的生物反应器，优选地，所述出气口的直径在12-25mm之间。
本发明所述的生物反应器，优选地，所述进料/出料口的直径在6-12mm之间。
本发明所述的生物反应器，优选地，所述出气口与尾气过滤器相连接；
所述进气口与无菌空气过滤器相连接；
所述进料/出料口与无菌管相连接。
本发明所述的生物反应器，优选地，所述进料/出料口连接有导管，所述导管朝向所述第一圆锥体延伸，且与所述圆柱体形成30-60°之间的角度；所述导管与所述无菌管相连接。
本发明所述的生物反应器，优选地，所述第一圆锥体的高与所述圆柱体的高的比值为1/12-1/4；
所述第二圆锥体与所述圆柱体的高的比值为1/6-1/2。
本发明所述的生物反应器，优选地，所述主体部和所述导管一体成型。
本发明的生物反应器主体部由圆柱形和圆锥形结构所构成，底端的圆锥形结构可用于初始的小体积培养，圆柱形主体可用于大体积培养，细胞培养工作体积可操作范围宽，克服了摇瓶和摇袋反应器及搅拌式反应器工作体积可操作范围有限的缺点，在扩种培养过程中可代替多步摇瓶培养和摇袋反应器培养，减少扩种次数，降低污染风险。
且本发明的生物反应器在底部配置有通气单元，有高效的传氧效率，克服了摇瓶和摇袋反应器传氧效率低下的问题，能够支持高密度细胞培养。
本发明的生物反应器最大程度地简化了设计，整个反应器只有三个接口，一个进气口用于接无菌空气过滤器，一个出气口可接尾气滤器，一个进料/出料口可接便于进行无菌焊接的热塑型管子，加料、接种和转种均通过无菌焊接管进行，没有开放型操作，染菌风险低。
且所述圆柱体具有很大的高径比(H/D)，通过底部鼓泡通气进行供氧和流体混合，相对于搅拌式反应罐减少了复杂的搅拌系统，简化了设计，降低了制造成本。
整体而言，本发明的生物反应器结构简单，使用方便，操作弹性大，可以有效地提高生产效率和降低生产成本。
本发明同时提供上述任意一项技术方案所述的生物反应器在细胞扩增培养领域的应用。
具体地，提供一种使用上述任一项所述的生物反应器进行细胞扩增的方法；优选地，包括如下步骤：
将待扩增的细胞悬液转移至所述生物反应器内培养，在所述生物反应器内的通气速率为0.1-0.5vvm；
优选地，在所述生物反应器内培养期间，每隔2-4天由所述进料/出料口补充培养基。
本发明所述的方法，优选地，所述待扩增的细胞悬液为：
WCB经过细胞复苏，并经30-50mL或125-250mL培养基扩增培养后的细胞悬液。
本发明所提供的细胞扩增方法简单可行，可以代替现有技术中细胞扩增过程中的摇瓶和摇袋反应器，节约资源，便于控制。
当然，实施本发明的任一产品或方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所提供的一种生物反应器的结构示意图；
图2为本发明所提供的生物反应器中的通气单元的结构示意图；
附图标记：
101：主体部；
102：第一圆锥体；
103：圆柱体；
104：第二圆锥体；
105：第一空腔；
106：出气口；
107：第二空腔；
108：第三空腔；
109：进气口；
110：通气单元；
111：板状主体；
112：通气孔；
113：第一隔腔；
114：第二隔腔；
115：进料/出料口；
116：导管。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
结合附图1和附图2，本实施例提供一种生物反应器，包括主体部101，主体部101包括第一圆锥体102、圆柱体103和第二圆锥体104，所述第一圆锥体102、圆柱体103和第二圆锥体104沿所述主体部101的高度方向依次连接，第一圆锥体102位于主体部101的上部，第二圆锥体104位于所述主体部101的下部，所述第一圆锥体102和第二圆锥体104的尖部均背向所述圆柱体103；其中：
所述第一圆锥体102内部形成第一空腔105，所述第一圆锥体102的顶部设有出气口106；
所述圆柱体103内部形成第二空腔107，且圆柱体103的高径比在3-8之间；
所述第二圆锥体104的内部形成第三空腔108，所述第二圆锥体104的底部设有进气口109，所述第三空腔108内设有通气单元110，所述通气单元110包括板状主体111和通气孔112，且所述板状主体111沿所述第二圆锥体104的径向延伸并和所述第二圆锥体104的内壁相贴合以将所述第三空腔108分隔为第一隔腔113和第二隔腔114；其中，所述通气孔112设在所述板状主体111上并连通所述第一隔腔113和第二隔腔114，所述通气孔112的直径在0.5mm-3mm之间；
所述第一空腔105、第二空腔107和第三空腔108相连通。
由此，所述生物反应器由三部分所组成，最大程度地简化了设计，中间部分的圆柱体103具有很大的高径比，该高径比可显著提升所述生物反应器的使用范围，可满足至少从20mL到50L的细胞悬液的有效培养。通过设置通气单元110可于使用中，持续由进气口109向内部供气，气体由通气孔112流向所述生物反应器内，供给生物反应器的细胞扩增所需。
本实施例所述的生物反应器，优选地，所述圆柱体103的直径在200-300mm范围内。由此，所述生物反应器可满足本领域的不同需求，以实现各种不同体积的细胞悬液的培养和扩增。
本实施例所述的生物反应器，优选地，所述第一圆锥体102的尖部的角度在30-150°之间。
本实施例所述的生物反应器，优选地，所述第二圆锥体104的尖部的角度在30-90°之间。由此，较小的尖部角度有利于在相同悬液体积的情形下，提供更大的液面高度，再通过所述通气单元110向细胞悬液通气，以使气体和细胞接触的更多，从而促进细胞的扩增和生长。
本实施例所述的生物反应器，优选地，所述主体部101还设有进料/出料口115；所述进料/出料口115设置在所述圆柱体103和所述第二圆锥体104的连接处，或设置在所述圆柱体103的侧面的底部。
本实施例所述的生物反应器中，所述板状主体111的直径在1-2cm范围内。由此，板状主体111具有较小的直径，可设置在所述第二圆锥体104靠近尖部的位置。
优选地，在所述通气单元110中，所述通气孔112为多个，优选为3-9个；本领域技术人员可以理解，所述通气孔112均匀分布于所述板状主体111。由此，在使用时，气体可由多个通气孔112均匀向所述生物反应器内部流动，供给细胞悬液的生长。
本实施例所述的生物反应器，所述通气单元110的材质为塑料、陶瓷中的一种；更优选为塑料。由此，选用塑料可有效缩减成本，且提升整体生物反应器的安全性，同时有利于使所述通气单元110有效和第二圆锥体104的内壁密封贴合。
本实施例所述的生物反应器，优选地，所述出气口106的直径在12-25mm之间。由此，所述出气口106的直径有效配合圆柱体103的直径以及其较大的高径比，提升通气量，显著提升生物反应器内的细胞扩增效率。
本实施例所述的生物反应器，优选地，所述进料/出料口115的直径在6-12mm之间。由此，所述进料/出料口115的孔径适宜，有效提升进料、出料的效率。
本实施例所述的生物反应器，优选地，所述出气口106与尾气过滤器相连接；
所述进气口109与无菌空气过滤器相连接；
所述进料/出料口115与无菌管相连接。
本实施例所述的生物反应器，优选地，所述进料/出料口115连接有导管116，所述导管116朝向所述第一圆锥体102延伸，且与所述圆柱体103形成30-60°之间的角度；所述导管116与所述无菌管相连接。
本实施例所述的生物反应器，优选地，所述第一圆锥体102的高与所述圆柱体103的高的比值为1/12-1/4；所述第二圆锥体104与所述圆柱体103的高的比值为1/6-1/2。由此，以确保所述第二圆锥体104的高径比在1/2以上(即圆锥角度小于90°)，一方面可以降低最小工作体积，另一方面有利于细胞悬液的循环混合。
本实施例所述的生物反应器，优选地，所述主体部101和所述导管116一体成型。
本实施例所提供的生物反应器结构简单，使用方便，操作弹性大，可以有效地提高生产效率和降低生产成本。
实施例2
本实施例提供一种使用实施例1所述的生物反应器进行细胞扩增的方法。
具体步骤如下：
(1)取一支悬浮哺乳动物细胞的工作细胞库(WCB)在37℃水浴化冻和复苏后，在125mL或250mL摇瓶培养2-5天，培养条件如下：
温度：36-37℃，转速100-150rpm，CO2浓度5-7％；
选用的培养基可由本领域技术人员选择适合该细胞的商业化培养基。
(2)将步骤(1)培养得到的细胞悬液取20-50mL由所述进料/出料口115导入生物反应器内，添加5-10倍细胞悬液体积的步骤(1)所述的培养基，使在所述生物反应器内的细胞悬液体积达到150-300mL，于36-37℃条件下进行培养，并通入5-7％CO2和空气混合气体，其中通气率为0.4vvm。
(3)培养2-4天后，添加步骤(1)所述的培养基，使所述生物反应器内部的细胞悬液体积达到1.5-3.0L。
(4)培养2-4天后，添加步骤(1)所述的培养基，使所述生物反应器内部的细胞悬液体积达到15-30L，通气速率调整为0.3vvm。
(5)培养2-4天，当细胞密度达到>＝2.0×106个/mL时，根据所需的生产规模，由所述进料/出料口115导出细胞悬液接种到100-300L生产罐或种子罐。
实施例3
本实施例提供一种使用实施例1所述的生物反应器进行细胞扩增的方法，与实施例2相比较，其区别在于：
步骤(1)所使用的悬浮哺乳动物细胞为CHO细胞；
步骤(1)所使用的培养基为CD CHO培养基。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种生物反应器，其特征在于，包括主体部，主体部包括第一圆锥体、圆柱体和第二圆锥体，所述第一圆锥体、圆柱体和第二圆锥体沿所述主体部的高度方向依次连接，第一圆锥体位于所述主体部的上部，第二圆锥体位于所述主体部的下部，所述第一圆锥体和第二圆锥体的尖部均背向所述圆柱体；其中：
所述第一圆锥体内部形成第一空腔，所述第一圆锥体的顶部设有出气口；
所述圆柱体内部形成第二空腔，且圆柱体的高径比在3-8之间；
所述第二圆锥体的内部形成第三空腔，所述第二圆锥体的底部设有进气口，所述第三空腔内设有通气单元，所述通气单元包括板状主体和通气孔，且所述板状主体沿所述第二圆锥体的径向延伸并和所述第二圆锥体的内壁密封贴合以将所述第三空腔分隔为第一隔腔和第二隔腔；其中，所述通气孔设在所述板状主体上并连通所述第一隔腔和第二隔腔，所述通气孔的直径在0.5mm-3mm之间；
所述第一空腔、第二空腔和第三空腔相连通。
2.根据权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述第一圆锥体的尖部的角度在30-150°之间；
和/或，
所述第二圆锥体的尖部的角度在30-90°之间。
3.根据权利要求1或2所述的生物反应器，其特征在于，所述主体部还设有进料/出料口；所述进料/出料口设置在所述圆柱体和所述第二圆锥体的连接处，或设置在所述圆柱体的侧面的底部；
优选地，所述第一圆锥体的高与所述圆柱体的高的比值为1/12-1/4；所述第二圆锥体与所述圆柱体的高的比值为1/6-1/2。
4.根据权利要求1-3任一项所述的生物反应器，其特征在于，所述通气单元的板状主体的直径在1-2cm范围内；
和/或，所述通气孔为多个，优选为3-9个。
5.根据权利要求1-4任一项所述的生物反应器，其特征在于，所述通气单元的材质为塑料、陶瓷中的一种；优选为塑料。
6.根据权利要求3-5任一项所述的生物反应器，其特征在于，所述圆柱体的直径在200-300mm范围内；
和/或，所述出气口的直径在12-25mm之间；
和/或，所述进料/出料口的直径在6-12mm之间。
7.根据权利要求3-6任一项所述的生物反应器，其特征在于，所述出气口与尾气过滤器相连接；
所述进气口与无菌空气过滤器相连接；
所述进料/出料口与无菌管相连接。
8.根据权利要求3-7任一项所述的生物反应器，其特征在于，所述进料/出料口连接有导管，所述导管朝向所述第一圆锥体延伸，且与所述圆柱体形成30-60°之间的角度；所述导管与无菌管相连接。
9.权利要求1-8任一项所述的生物反应器在细胞扩增培养领域的应用。
10.一种使用权利要求1-8任一项所述的生物反应器进行细胞扩增的方法；
优选地，包括如下步骤：
将待扩增的细胞悬液转移至所述生物反应器内培养，在所述生物反应器内的通气速率为0.1-0.5vvm；
更优选地，在所述生物反应器内培养期间，每隔2-4天由所述进料/出料口补充培养基；
进一步优选地，所述待扩增的细胞悬液为：WCB经过细胞复苏，并经30-50mL或125-250mL培养基扩增培养后的细胞悬液。
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