MX2008013514A

MX2008013514A - Celulas productoras de polipeptidos.

Info

Publication number: MX2008013514A
Application number: MX2008013514A
Authority: MX
Inventors: Erhard Kopetzki; Georg Tiefenthaler; Josef Endl; Oliver Ploettner; Ursula Schwarz
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2006-05-17
Filing date: 2007-05-15
Publication date: 2008-10-28
Also published as: AU2007251766B2; ES2573027T3; JP4870208B2; US8541204B2; CA2651478A1; JP2009537124A; CA2651478C; US20130109058A1; BRPI0712073A2; US8354516B2; EP2027273B1; IL193721A0; KR101202498B1; IL193721A; KR20090003327A; BRPI0712073B1; EP2208792A3; BRPI0712073B8; ES2543629T3; CN101410525B

Abstract

La invención describe un ácido nucleico que comprende, en una dirección 5' a 3': a) un primer ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterólogo sin un codón de detección en marco, b) un segundo ácido nucleico que comience con un sitio donador de empalme 5' y que termina en un sitio aceptor de empalme 3' que comprende, en marco, un codón de detección traduccional y una señal de poliadenilación, y c) un ácido nucleico que codifica para: i) por lo menos un fragmento de dominio transmembranal, o ii) un péptido señal para un ancla GPI.

Description

CELULAS PRODUCTORAS DE POLIPEPTIDOS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona con el campo de la producción de polipéptidos . Describe un ácido nucleico que comprende un ácido nucleico empalmable de manera alternativa, células que comprenden este ácido nucleico, un método para el aislamiento de células que expresan un polipéptido heterologo, el cual utiliza un ácido nucleico que comprende un primer ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterologo, un segundo ácido nucleico que comprende un ácido nucleico empalmable de manera alternativa y un tercer ácido nucleico que codifica para al menos un fragmento de dominio transmembranal o un péptido señal para un ancla GPI y también un método para la producción de polipéptidos heterologos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Los sistemas de expresión para la producción de polipéptidos recombinantes son bien conocidos en el estado de la técnica y se describen, por ejemplo, por Marino, M.H., Biopharm. 2 (1989) 18-33; Goeddel, D.V., et al., Methods Enzymol. 185 (1990) 3-7; urm, F. , and Bernard, A., Curr.

Opin. Biotechnol. 10 (1999) 156-160. Para la producción de polipéptidos y proteínas utilizados en aplicaciones farmacéuticas se utilizan preferiblemente células hospedadoras REF. : 195960 de mamífero tales como células CHO, células BHK, células NSO, células Sp2/0, células COS, células HEK, células PER.C6MR y similares. El ácido nucleico que codifica para el polipéptido preferiblemente se introduce en la célula hospedadora comprendida en un ácido nucleico tal como, por ejemplo, un vector de expresión. Los elementos esenciales de un vector de expresión son una unidad de propagación de plásmido procariótico, por ejemplo para Escherichia coli que comprende un origen de replicación y un marcador de selección, un marcador de selección eucariótico y uno o más casetes de expresión para la expresión de uno o varios genes estructurales de interés, cada uno de ellos comprende un promotor, un gen estructural y un terminador de transcripción que incluye una señal de poliadenilación . Para la expresión transitoria en células de mamífero se puede incluir un origen de replicación de un mamífero tal como SV40 Ori u OriP de EBV. Como un promotor se pueden seleccionar un promotor constitutivo o inducible. Para transcripción optimizada se puede incluir una secuencia Kozak en la región 5' no traducida. Para procesamiento de ARN, en particular terminación de transcripción y empalme pre-ARNm, se pueden incluir señales de empalme de ARNm, que dependen de la organización del gen estructural (organización exón-intrón) así como una señal de poliadenilación. La expresión de un gen se realiza ya sea como expresión transitoria o permanente. Uno o varios de los polipéptidos de interés pueden ser un polipéptido secretado que contiene una extensión N terminal (también conocida como la secuencia de señal) la cual es necesaria para el transporte/secreción del polipéptido a través de la célula y dentro del medio extracelular o puede ser un polipéptido citosólico . Para la producción a gran escala de un polipéptido se debe establecer una linea celular altamente productora. Después de la transfección de una linea de célula hospedadora tales como células CHO, células NSO, células Sp2/0, células BHK, células COS, células PER.C6MR o células HEK, en general se obtienen una pluralidad de clones con características diferentes debido, por ejemplo, a la amplia diferencia de polipéptido expresado a partir de plásmidos transíectacos de manera transitoria o integrados de manera estable. Para propósitos de selección, el ácido nucleico introducido en las células adicionalmente posee un marcador seleccionable, por ejemplo un gel que confiere resistencia contra una sustancia que de otra manera es mortal. Después de transfección y por crecimiento en un medio selectivo apropiado, se puede aislar un clon altamente productor. Esto consume tiempo y en consecuencia es costoso. Se han desarrollado varios métodos para manejar este problema. Uno de estos métodos es la amplificación de genes.

En este método las células deficientes de una enzima, dihidrofolato reductasa (DHFR) se transfectan con un vector/plásmido el cual contiene un primer cásete de expresión para la expresión de la proteina DHFR y un segundo cásete de expresión para la expresión de un polipéptido heterologo de interés. Mediante el uso de un medio de cultivo que carece de glicina, hipoxantina y timidina se establecen condiciones de crecimiento selectiva. Para amplificación se agrega un inhibidor de DHFR, metotrexato (MTX) , (Kaufman, R.J., er al., J Mol. Biol. 159 (1982) 601-621; documento de E.U.A. 4, 656, 134) . De manera alternativa se pueden fusionar moléculas reporteras tales como cloramfenicol-acetiltransferasa , luciferasa, proteina fluorescente verde o ß-galactosidasa al polipéptido heterologo para lo cual se desea una linea celular altamente productora y se utiliza como un marcador de selección indirecto. La selección se lleva a cabo en presencia de un sustrato o cofactor exógeno agregado. Un método adicional para la identificación de un clon altamente productor es una transcripción unida del gen marcador seleccionable y un gen estructural que codifica para un polipéptido heterologo vía un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES). Con este diseño, la expresión del polipéptido heterologo se puede relacionar con la expresión del marcador seleccionable .

Las inmunoglobulinas humanas se producen por linfocitos especializados, los linfocitos B. Estas células no secretan inmunoglobulina (slg) sino que también presentan inmunoglobulinas sobre su membrana celular externa como inmunoglobulinas unidas a membrana plasmática (mlg) . Estas mlg juegan un papel importante en el inicio de una respuesta inmunológica . Las inmunoglobulinas unidas a membrana plasmática presentadas tienen la función de receptores celulares de su antigeno correspondiente. Al inicio en 1980 se publicaron artículos en relación con el origen de las formas secretadas y unidas a membrana plasmática de las inmunoglobulinas. Early et al., (Early, P., et al., Cell 20 (1980) 313-319) informaron que en ratones dos especies de ARNm los cuales codifican para la cadena pesada de inmunoglobulina se originan del mismo transcrito primario de un gen µ para inmunoglobulina único. La formación de las formas secretadas (slg) y unida a membrana plasmática (mlg) resulta de un empalme alternativo de pre-ARNm de cadena pesada. Para la isoforma slg todos los exónes codifican para los dominios de la inmunoglobulina y el intrón después del exón codifica para el dominio C terminal se retienen en ARNm y la señal de poliadenilación se localiza hacia el extremo 3 ' del codón de detención en el intrón se utiliza para separación de poliadenilación del transcrito primario. Para la isoforma mlg, un sitio donador de empalme 5' alternativo después del exón que codifica para el dominio C terminal de la forma secretada (es decir, CH3 o CH4, respectivamente) une la región constante con los exónes hacia el extremo 3' Mi y M2 que codifican para un dominio transmembranal . En este caso, la secuencia que codifica para los aminoácidos terminales y el codón de detención de la forma secretada asi como la señal de poliadenilación intrónica adyacente para la forma slg se retiran por el empalme junto con el intrón. Por ejemplo, la proporción entre ARNm que codifica para la forma de cadena pesada de inmunoglobulina secretada y el ARNm que codifica para la forma de cadena pesada de inmunoglobulina unida a membrana plasmática es de 10:1 a 100:1. Esta proporción se establece principalmente durante el empalme pre-ARNm. Los mecanismos de control y post-traduccional contribuyen únicamente en una parte menor (véase, por ejemplo, Xiang, S. D. , et al., Immun. Cell Biol. 79 (2001) 472-481) . La inmunoglobulina unida a membrana plasmática de las células tienen la misma secuencia de aminoácidos y estructura secundaria que su análogo secretado. La diferencia es una extensión en la parte C terminal de la cadena pesada de slg que comprende un dominio transmembranal. Este dominio transmembranal tiene en general una longitud de entre aproximadamente 40 y aproximadamente 75 residuos aminoácidos.

Para inraunoglobulinas murinas y humanas el dominio transmembranal se puede subdividir en tres regiones estructurales distintas: una región extracelular N terminal de los residuos aminoácidos 13-67, una secuencia transmembranal conservada central de 25 residuos aminoácidos y una región citoplasmática C terminal de 3-28 residuos aminoácidos (Major, J.G., et al., Mol. Immunol. 33 (1996) 179-187) . Los vectores de expresión que comprenden un gen seleccionable amplificable, un gen para proteina fluorescente y un gen que codifica para un producto deseado de una manera que se optimiza el enlace transcripcional y traduccional se informa en el documento WO 01/04306. En el documento WO 01/38557 se informa de un método para cribado de células transformadas/transfectadas de manera múltiple para identificar células que expresan por lo menos dos péptidos o proteínas de interés. Estos dos péptidos/proteína se unen por medios de un IRES (sitio de entrada de ribosoma interno) a un gen marcador fluorescente. Los animales y células transgénicas que comprenden un transgen marcador generador de imagen se reportan en la solicitud de patente de E.U.A. 2003/0033616. La solicitud de patente de E.U.A. 2005/0032127 informa de un método para la selección no invasiva de células vivas solas bajo condiciones ligeras a partir de mezclas de células o cultivos de células con respecto a un desempeño de producción específico por métodos de fluorescencia-detección microscópica. Un método para identificar y aislar células las cuales producen proteínas secretadas se muestra en la solicitud de patente de E.U.A. 2002/0168702. Un vector de expresión que consiste de un gen que codifica para una proteína de interés la cual está unida funcionalmente a un promotor de hámster, un gen el cual codifica para una proteína fluorescente y preferiblemente un gen marcador de selección amplificable se muestran en la solicitud de patente de E.U.A. 2004/0148647.

SUMARIO DE LA INVENCION La presente invención comprende un ácido nucleico constituido, en una dirección 5' a 3' por: a) un primer ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterólogo sin un codón de detención traduccional en marco, b) un segundo ácido nucleico que comienza con el sitio donador de empalme 5' y que termina por un sitio aceptor de empalme 3' que comprende un codón de detención traduccional en marco y una señal de poliadenilación, y c) un tercer ácido nucleico que codifica para: i) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal , o ii) un péptido señal para un ancla GPI .

Los aspectos adicionales de la presente invención son un vector adecuado para células eucarióticas que comprende el ácido nucleico de la invención y una célula eucariótica que comprende por lo menos un ácido nucleico de acuerdo con la invención . La presente invención comprende un método para seleccionar una célula eucariótica que expresa un polipéptido heterólogo, por lo que el método comprende: a) transfectar una célula eucariótica con un ácido nucleico que comprende, en la dirección 5' a 3' : i) un primer ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterólogo sin un codón de detención traduccional en marco, ii) un segundo ácido nucleico que comienza con el sitio donador de empalme y que termina por un sitio aceptor de empalme que comprende un codón de detención traduccional en marco y una señal de poliadenilación, iii) un tercer ácido nucleico que codifica para: iiia) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal , o iiib) un péptido señal para un ancla GPI, b) cultivo de la célula transfectada bajo condiciones adecuadas para la producción de pre-ARNm a partir del ácido nucleico, procesamiento del pre-ARNm y traducción del ARNm procesado en un polipéptido, en donde la célula transfectada produce polipéptido heterólogo soluble y polipéptido heterólogo unido a membrana plasmática por empalme alternativo del pre-ARNm, y c) seleccionar una célula con polipéptido heterólogo unido a membrana plasmática que es la célula que expresa un polipéptido heterólogo. En una modalidad, el método de la invención es para seleccionar una célula eucariótica que expresa una inmunoglobulina, por lo que el método comprende: a) transfectar una célula eucariótica con un ácido nucleico que comprende, en la dirección 5' a 3': i) un primer ácido nucleico que codifica para al menos un fragmento de una cadena pesada de inmunoglobulina sin un codón de detención traduccional en marco, ü) un segundo ácido nucleico que comienza con el sitio donador de empalme y que termina por un sitio aceptor de empalme que comprende un codón de detención traduccional en marco y una señal de poliadenilación, iii) un tercer ácido nucleico que codifica para: iiia) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal , o iiib) un péptido señal para un ancla GPI, b) cultivo de la célula transfectada bajo condiciones adecuadas para la producción de pre-ARNm a partir del ácido nucleico, procesamiento del pre-ARNm y traducción del ARNm procesado en una cadena pesada de inmunoglobulina , en donde la célula transfectada produce la cadena pesada de inmunoglobulina soluble y la cadena pesada de inmunoglobulina unida a membrana plasmática por empalme alternativo del pre-ARNm, y c) seleccionar una célula con cadena pesada de inmunoglobulina unida a membrana plasmática para que sea la célula que expresa una inmunoglobulina. La presente invención comprende además un método para la producción de un polipéptido codificado por un ácido nucleico de acuerdo con la invención, al: a) proporcionar una célula eucariótica, b) transfectar la célula eucariótica con un ácido nucleico de acuerdo con la invención, c) cultivar la célula transfectada bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico, d) recuperar el polipéptido del medio de cultivo o el citoplasma de dicha célula. La presente invención comprende además un ácido nucleico que comprende, en la dirección 5' a 3': a) un primer sitio de clonación múltiple, b) un ácido nucleico que comienza con un sitio donador de empalme 5' y termina en un sitio aceptor de empalme 31 , en donde : i) el ácido nucleico comprende un codón de detención traduccional y una señal de poliadenilación, y ii) el ácido nucleico no se separa constitutivamente durante el procesamiento de pre-ARNm, c) un segundo sitio de clonación múltiple. La invención comprende además un vector que comprende al ácido nucleico el cual no se ha separado constitutivamente, de acuerdo con la invención. La presente invención comprende un método para seleccionar una célula eucariótica que expresa un polipéptido o proteina heterólogos, por lo que el método comprende: a) transfectar una célula eucariótica con un ácido nucleico que comprende, en la dirección 5' a 3' : i) un primer ácido nucleico que codifica para un polipéptido o proteina heterólogos sin un codón de detención traduccional , ii) un segundo ácido nucleico que comienza con un sitio donador de empalme 5' y que termina en un sitio aceptor de empalme 3' que comprende un codón de detención traduccional en marco y una señal de poliadenilación, iii) un tercer ácido nucleico que codifica para: iiia) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal , o iiib) un péptido señal para un ancla GPI b) cultivar la célula transfectada bajo condiciones adecuadas para la producción de pre-ARNm a partir del ácido nucleico, procesamiento del pre-ARNm y traducción del ARNm procesado en un polipéptido o proteina, en donde la célula transfectada produce el polipéptido o proteina heterólogos solubles y el polipéptido o proteina heterólogos unidos a membrana plasmática por empalme alternativo de pre-ARNm, c) seleccionar una célula con polipéptido o proteina heterólogos unidos a membrana plasmática para que sea la célula que exprese un polipéptido o proteina heterólogos. Los métodos y técnicas útiles para llevar a cabo la presente invención se describen, por ejemplo, en Ausubel, F.M. (ed. ) , Current Protocols in Molecular Biology, Volúmenes I a III (1997); Glover, N.D., y Hames, B.D., ed., DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (1985), Oxford, University Press; Freshney, R.I. (ed.), Animal Cell Culture -a practical approach, IRL Press Limited (1986); atson, J.D., et al., Recombinant DNA, Segunda Edición, CHSL Press (1992); Winnacker, E.L., From Genes to Clones; N. Y., VCH Publishers (1987); Celis, J. , ed., Cell Biology, Segunda Edición, Academic Press (1998); Freshney, R.I., Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, segunda edición, Alan R. Liss, Inc. , N. Y. (1987) . El uso de tecnología de ADN recombinante permite la producción de numerosos derivados de un polipéptido. Dichos derivados se pueden modificar, por ejemplo, en posiciones de aminoácidos individuales o diversas por medio de sustitución, alteración, cambio, supresión o inserción. La modificación o formación de derivados se puede llevar a cabo, por ejemplo, por medio de mutagénesis dirigida a sitio. Dichas modificaciones se pueden llevar a cabo fácilmente por una persona experta en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A laboratory manual (1999) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA; Hames, B.D., and Higgins, S.G., Nucleic acid hybridization - a practical approach (1985) IRL Press, Oxford, Inglaterra). Dentro del alcance de la presente invención algunos de los términos utilizados se definen de la siguiente manera: Un "ácido nucleico", como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula polinucleótida , por ejemplo a los tipos de ADN y/o ARN . Esta molécula polinucleótida puede ser una molécula polinucleótida como se encuentra de manera natural o una molécula polinucleótida sintética o una combinación de una o más moléculas polinucleótidicas como se encuentran en la naturaleza o fragmentos de las mismas con una o más moléculas polinucleotidicas sintéticas. Esta definición también abarca las moléculas polinucleotidicas como se encuentran de manera natural en las cuales se han cambiado uno o más nucleótidos por ejemplo por medio de mutagénesis se han suprimido o se han agregado. El ácido nucleico puede estar aislado o se puede integrar en otro ácido nucleico, por ejemplo en un vector de expresión o el cromosoma de una célula hospedadora eucariótica. Un ácido nucleico de igual manera está caracterizado por su secuencia de ácido nucleico que consiste de nucleótidos individuales. Se sabe en la técnica la deducción de la secuencia de aminoácidos a partir del ácido nucleico codificante correspondiente y de igual manera derivar un ácido nucleico correspondiente a partir de la secuencia codificada de aminoácidos. Asi, una secuencia de aminoácidos de igual manera está caracterizada por su ácido nucleico. Similarmente, un ácido nucleico está dado por una secuencia de aminoácidos correspondiente. Las expresiones "plásmido" o "vector", las cuales se utilizan de manera intercambiable de esta solicitud incluyen, por ejemplo, plásmidos lanzadera y de expresión asi como plásmidos de transíección . Típicamente, el plásmido también comprenderá un origen de replicación (por ejemplo, el origen de replicación ColEl y oriP) y un marcador seleccionable (por ejemplo un gen de resistencia a ampicilina o tetraciclina ) para replicación y selección, respectivamente, del plásmido en bacterias . Un "cásete de expresión" (secuencia de expresión) se refiere a una construcción (plásmido recombinante ) que contiene los elementos reguladores necesarios para la expresión de por lo menos el gen estructural contenido en una célula. Opcionalmente , los elementos adicionales están contenidos los cuales permiten la secreción del polipéptido o proteina expresado. Un "gen" indica un segmento, por ejemplo en un cromosoma o en un plásmido, el cual es necesario para la expresión de un polipéptido o proteina. Además de la región codificante, el gen comprende otros elementos funcionales que incluyen un promotor, uno o más intrones y/o exones y uno o más terminadores . El término "gen estructural", como se utiliza en esta solicitud, indica la región codificante de un gen, es decir, los exones sin una secuencia de señal pero con intrones interpuestos . Un "marcador seleccionable" indica un gen que permite a las células transportar el gen que va a ser seleccionado específicamente para o contra, en presencia o ausencia de un agente de selección correspondiente. Un marcador seleccionable positivo útil es un gen de resistencia a antibiótico. Este marcador seleccionable permite que la célula hospedadora transformada con el gen se pueda seleccionar positivamente en presencia del antibiótico correspondiente; una célula hospedadora no transformada no será capaz de crecer o sobrevivir bajo condiciones de cultivo selectivas, es decir, en presencia del agente de selección, en un medio selectivo. Los marcadores seleccionables pueden ser positivos, negativos o bifuncionales . Los marcadores seleccionables positivos permiten la selección para células que presenten el marcador, mientras que los marcadores seleccionables negativos permiten que se eliminen selectivamente células que presenten el marcador. Típicamente, un marcador seleccionable conferirá resistencia a un medicamento o compensará un defecto metabólico o catabólico en la célula hospedadora. Los marcadores seleccionables útiles con células eucarióticas incluyen, por ejemplo, los genes para aminoglucósido fosfotransferasa (APH) tales como higromicina fosfotransferasa (hyg) , neomicina y G418 APH, dihidrofolato reductasa (DHFR), timidina cinasa (tk) , glutamina sintetasa (GS) , asparagina sintetasa, triptófano sintetasa (agente selectivo indol), histidinol deshidrogenasa (agente selectivo histidinol D) y genes que codifican para resistencia a puromicina, bleomicina, fleomicina, cloramfenicol , zeocina y ácido micofenólico . Los genes marcadores adicionales se describen en WO 92/08796 y WO 94/28143. Los "elementos reguladores" como se utilizan en la presente, se relacionan con secuencias nucleotidas presentes en cis y/o trans, necesarios para transcripción y/o traducción del gen que comprende el gen estructural de interés. Los elementos reguladores transcripcionales normalmente comprenden un promotor hacia el extremo 5 ' de la secuencia del gen que se va a expresar, sitios de inicio y terminación transcripcionales y una secuencia de señal de poliadenilación .

El término "sitio de inicio transcripcional " se refiere al nucleótido en el gen que corresponde al primer ácido nucleico que se va a incorporar en el transcrito primario, es decir, el pre-ARNm; el sitio de inicio transcripcional se puede superponer con la secuencia promotora. El término "sitio de terminación transcripcional" se refiere a una secuencia nucleotidica normalmente presente en el extremo 3' del gen de interés que se va a transcribir que provoca que la ARN polimerasa finalice la transcripción. La secuencia de señal de poliadenilación o señal de adición poli-A proporciona la señal para la separación en un sitio especifico en el extremo 3' de un ARNm eucariótico y la adición post-transcripcional de una secuencia de aproximadamente 100-200 nucleótidos de adenina (cola poliA) al extremo 3' separado en el núcleo. La secuencia de señal de poliadenilación puede incluir la secuencia de consenso AATAAA que se localiza aproximadamente a 10-30 nucleótidos hacia el extremo 5' del sitio de separación. Los elementos reguladores traduccionales incluyen un inicio traduccional (AUG) y un codón de detención (TAA, TAG o TGA) . Se puede incluir en algunas construcciones un sitio de entrada ribosómico interno (IRES). Un "promotor" se refiere a una secuencia polinucleotidica que controla la transcripción de un gen o secuencia de ácido nucleico la cual está unido operablemente. Un promotor incluye señales para inicio de unión y transcripción de ARN polimerasa. El promotor usado será funcional en el tipo de célula de la célula hospedadora en la cual se contempla la expresión de la secuencia seleccionada/unida operablemente. Se conocen bien en la técnica una gran cantidad de promotores que incluyen promotores constitutivos, inducibles y reprimibles a partir de una diversidad de fuentes diferentes (e identificados en bases de datos tales como GenBank) y están disponibles como o dentro de polinucleótidos clonados (a partir, por ejemplo, de depositarios tales como ATCC y otras fuentes comerciales o individuales). Un "promotor" comprende una secuencia nucleotidica que dirige la transcripción de un gen estructural. Típicamente, un promotor se localiza en la región no codificante o no traducida 5' de un gen, próximo al sitio de inicio transcripcional de un gen estructural. Los elementos de secuencia dentro de los promotores que funcionan en el inicio de la transcripción con frecuencia están caracterizados por secuencias nucleotídicas de consenso. Estos elementos promotores incluyen sitios de unión de ARN polimerasa, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos específicos de diferenciación (DSEs; McGehee, R.E. Jr., et al., Mol. Endocrinol. 7 (1993) 551-60), elementos de respuesta de AMP cíclico (CRE) , elementos de respuesta séricos (SRE; Treisman, R., Seminars in Cáncer Biol. 1 (1990) 47-58), elementos de respuesta glucocorticoides (GRE) y sitios de unión para otros factores de transcripción tales como CRE/ATF (O'Reilly, M.A., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 19938-43), AP2 (Ye, J. , et al., J. Biol. Chem. 269 (1994) 25728-34), SP1, proteína de unión de elemento de respuesta de AMPc (CREB; Loeken, M.R., Gene Expr. 3 (1993) 253-64) y factores de octámero (véase, en general, Watson et al., eds . , Molecular Biology of the Gene, 4th ed., The Ben amin/Cummings Publishings Company, Inc. (1987), y Lemaigre, F.P. y Rosseau, G.G., Biochem. J. 303 (1994) 1-14). Si un promotor es un promotor inducible, entonces la velocidad de transcripción se incrementa en respuesta a un agente inductor. En contraste, la velocidad de transcripción no es regulada por un agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo. También se conocen promotores reprimibles. Por ejemplo, el promotor c-fos es activado específicamente por unión de la hormona del crecimiento a su receptor sobre la superficie celular. La expresión regulada por tetraciclina (Tet) se puede obtener por promotores híbridos artificiales que consisten, por ejemplo, de un promotor de CMV seguido por dos sitios operadores Tet. El represor Tet se une a los dos sitios operadores Tet y bloquea la transcripción. Ante la adición de la tetraciclina inductora, se libera el represor Tet de los sitios operadores Tet y la transcripción se lleva a cabo (Gossen, M. and Bujard, H. PNAS 89 (1992) 5547-5551) . Para otros promotores inducibles que incluyen metalotioneina y promotores de choque térmico, véase, por ejemplo, Sambrook et al. (supra) y Gossen et al., Curr. Opin. Biotech. 5 (1994) 516-520. Entre los promotores eucarióticos que se han identificado como promotores fuertes para expresión de alto nivel están el promotor temprano SV40, el promotor tardío principal de adenovirus, el promotor de metalotioneina-I de ratón, la secuencia repetida terminal larga del virus de sarcoma de Rous, el factor 1 OÍ de alargamiento de hámster chino (CHEF-1, véase, por ejemplo, el documento de E.U.A. 5,888,809) EF-1 a humana, ubiquitina y el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV IE) . El "promotor" puede ser constitutivo o inducible. Puede ser necesario un mejorador (es decir, un elemento de ADN que actúa cis el cual actúa sobre un promotor para incrementar la transcripción) para funcionar junto con el promotor para incrementar el nivel de expresión que se obtiene con el promotor solo y se puede incluir como un elemento regulador transcripcional . Con frecuencia, el segmento polinucleotídico que contiene el promotor inducirá también secuencias mejoradoras (por ejemplo CMV o SV40) . El término "unido operablemente" se refiere a una yuxtaposición de dos o más componentes en donde los componentes descritos de esta manera están en una relación que permite que funcionen de la manera que se propone. Por ejemplo, un promotor y/o mejorador está unido operablemente a una secuencia codificante, si actúa en cis para controlar o modular la transcripción de la secuencia codificante enlazada. De manera general, aunque no necesariamente, las secuencia de ADN que están "unidas operablemente" son contiguas y, cuando es necesario, unen dos regiones codificantes de proteina tal como un líder secretor y un polipéptido o un polipéptido y un dominio transmembranal o un polipéptido y un péptido señal para un ancla GPI, o un polipéptido y un codón de detención traduccional , contiguo y en marco de lectura. No obstante, aunque un promotor unido operablemente generalmente se localiza corriente arriba de la secuencia codificante, no necesariamente está contiguo a esta. Los mejoradores no necesitan estar contiguos. Un mejorador está unido operablemente a una secuencia codificante si el mejorador incrementa la transcripción de la secuencia codificante. Los mejoradores unidos operablemente se pueden localizar corriente arriba dentro o corriente abajo de las secuencias codificantes y a una distancia considerable del promotor. Un sitio de poliadenilación está unido operablemente a una secuencia codificante si se localiza en el extremo corriente abajo de la secuencia codificante de manera tal que la transcripción se lleva a cabo a través de la secuencia codificante en la secuencia de poliadenilación. En enlace se lleva a cabo por métodos recombinantes conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando metodologías de PCR y/o por ligación en sitios de restricción convenientes. Si no existen los sitios de restricción convenientes, se utilizan adaptadores o enlazantes oligonucleotidicos sintéticos de acuerdo con la práctica convencional . El término "producción de pre-ARNm", como se utiliza en la presente, indica un procedimiento de transcripción de ADN en su pre-ARNm complementario. El ADN eucariótico está constituido de regiones codificantes y no codificantes las cuales se denominan como exones (codificantes) e intrones (no codificantes). En el procedimiento de transcripción de ADN en su pre-ARNm complementario se mantiene la organización genómica de exones e intrones. El término "procesamiento de pre-ARNm", como se utiliza en la presente, indica un procedimiento de modificación post-trancripcional . En esta etapa, los intrones de pre-ARNm se separan de empalme, es decir, se desprenden de pre-ARNm, el extremo 5' del ARNm procesado se remata y se realiza la poliadenilación 3'. El ARNm nuclear final, es decir, maduro, se obtiene en esta etapa. El término "dominio transmembranal", como se utiliza en esta solicitud, indica un polipéptido o proteina el cual es codificado a nivel de ADN por al menos un exón y el cual comprende una región extracelular , una transmembranal y una intracelular . Un dominio transmembranal generalmente comprende tres regiones estructurales distintas: una región extracelular de la parte N terminal, una secuencia transmembranal conservada central y una región citoplasmática en la parte C terminal. En una modalidad, el dominio transmembranal, comprende, en la dirección N o C terminal, una región extracelular y una región transmembranal. El dominio transmembranal adicionalmente puede comprender una región intracelular o citoplasmática . El término "un fragmento de un dominio transmembranal", como se utiliza en esta solicitud, indica la parte de un dominio transmembranal que abarca la membrana celular, es decir, el cual se localiza dentro de la membrana celular, es decir, la secuencia transmembranal. El término "ácido nucleico alternativamente empalmable" indica un ácido nucleico que comienza con un sitio donador de empalme 5' y que termina en un sitio aceptor de empalme 3'. Este ácido nucleico contiene un codón de detención traduccional y una señal de poliadenilación . Este ácido nucleico empalmable alternativamente comprende una región no codificante la cual no se empalma de manera constitutiva del pre-ARNm correspondiente tal como, por ejemplo, el intrón después de que el exón codifica para un dominio de cadena pesada de inmunoglobulina CH3 o CH4. El "evento de empalme alternativo" se lleva a cabo en el sitio donador de empalme 5' del ácido nucleico empalmable alternativamente es un evento de decisión en donde el ácido nucleico empalmable alternativamente se separa del empalme de pre-ARNm o si es mantenido por lo menos parcialmente y está comprendido en el ARNm maduro (procesado) . El término "empalme alternativo" y equivalentes gramaticales del mismo, como se utilizan en la presente, se refieren a un procedimiento en células eucarióticas en el cual a partir de un pre-ARNm único, debido a procesamiento diferente de uno o más intrones, se pueden obtener ARNm maduros diferentes y en consecuencia se pueden expulsar isoformas diferentes de un polipéptido. En una modalidad de la invención se puede empalmar alternativamente uno, es decir, solo un intrón del pre-ARNm producido. En otra modalidad el segundo ácido nucleico se puede empalmar de manera alternativa. En una modalidad adicional, comprende el segundo ácido nucleico con un intrón empalmable de manera alternativa. El procesamiento diferente es una decisión de "si/no" es decir, en el procedimiento de empalme alternativo el intrón que se va a procesar, es decir, el "ácido nucleico empalmable de manera alternativa" es retenido por lo menos parcialmente o separado por empalme. Esto no debe entenderse como un mecanismo de punto de ramificación que resulta en exones diferentes posteriormente. De hecho, es un mecanismo en el cual un ácido nucleico empalmable alternativamente es empalmado o por lo menos mantenido parcialmente en el ARNm maduro. Con este mecanismo, el ácido nucleico empalmable alternativamente y, por lo tanto, el codón de detención traduccional en marco comprendido en el mismo se retienen o se separan . El empalmado alternativo es un mecanismo regulador importante en células procarióticas . Con el empalme alternativo se pueden obtener combinaciones diferentes de exones en un ARNm maduro a partir del mismo pre-ARNm lo que genera una pluralidad de proteínas diferentes codificadas por el mismo ADN . El término "expresión", como se utiliza en la presente, se refiere a un procedimiento de transcripción y/o traducción que se produce dentro de una célula. El nivel de transcripción de un producto deseado en una célula se puede determinar en base en la cantidad de ARNm correspondiente que está presente en la célula. Por ejemplo, el ARNm transcrito de una secuencia seleccionada se puede cuantificar por PCR o por hibridación Northern (véase Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Los polipéptidos se pueden cuantificar por diversos métodos, por ejemplo mediante ELISA, al realizar análisis para determinar la actividad biológica del polipéptido o utilizando análisis que son independientes de dicha actividad tal como transferencia Western, electroforesis en gel de SDS y poliacrilamida, RMN o radioinmunoanálisis , por ejemplo mediante la utilización de anticuerpos que reconocen y que se unen al polipéptido (véase Sambrook et al., 1989, supra) . Una "célula hospedadora" se refiere a una célula en la cual se introduce un ácido nucleico heterologo que codifica para un polipéptido o proteina. Las células hospedadoras incluyen tanto células procarióticas , las cuales se utilizan para propagación de plásmidos, como células eucarióticas , las cuales se utilizan para la expresión de un ácido nucleico heterologo. Preferiblemente, las células eucarióticas son células de mamífero. Preferiblemente, las células de mamífero son células CHO, células BHK, células NSO, células Sp2/0, células COS, células HEK o células PER.C6MR. Un "polipéptido" es un polímero que consiste de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, producidos ya sea de manera natural o sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 20 residuos aminoácidos se pueden denominar como "péptidos" mientras que los polipéptidos que consisten de más de 100 residuos aminoácidos o que consisten de dos o más cadenas de polipéptido se les puede denominar como "proteínas " . Una "proteína" es una macromolécula que comprende por lo menos una cadena polipeptídica de una longitud de 100 aminoácidos o más o que comprende dos o más cadenas de polipéptido . Los polipéptidos y la proteína también pueden comprender componentes no peptídicos tales como grupos carbohidrato, iones metálicos, lipidos, ésteres de ácido carboxilico o combinaciones de los mismos. Los sustituyentes no peptídicos se pueden agregar por la célula, en la cual se produce el polipéptido o proteína y pueden variar con el tipo de célula. Los polipéptidos y proteínas se definen en la presente en términos de sus estructuras principales de aminoácidos; las adicionales tales como grupos carbohidrato generalmente no se especifican pero no obstante, pueden estar presentes . Un "ADN heterologo" o "ácido nucleico heterologo" se refiere a una molécula de ADN o un ácido nucleico, o una población de moléculas de ADN o una población de ácidos nucleicos que no existe de manera natural dentro de una célula hospedadora dada. Las moléculas de ADN heterólogas a una célula hospedadora particular pueden contener ADN derivado de la especie de la célula hospedadora (es decir, ADN endógeno) en la medida en que el ADN hospedador se combine con ADN que no es del hospedador (es decir, ADN exógeno) . Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN que no es del hospedador, que codifica para un polipéptido unido operablemente a un segmento de ADN hospedador que comprende el promotor se considera que es una molécula de ADN heteróloga. Inversamente, el ADN heterologo puede comprender un gen estructural endógeno unido operablemente con un promotor exógeno . Un péptido o polipéptido codificado por un ácido nucleico que no es del hospedador, es decir, heterólogo, es un péptido o polipéptido "heterólogo". El término "polipéptido biológicamente activo" como se utiliza en la presente, se refiere a una molécula orgánica, por ejemplo una macromolécula biológica tal como un péptido, proteina, glucoproteina , nucleoproteina , mucoproteina , lipoproteina, polipéptido sintético o proteina que provoca un efecto biológico cuando se administra dentro o a sistemas biológicos artificiales, tales como bioanálisis que utilizan lineas de células y virus o in vivo a un animal, que incluye pero que no se limita a aves y mamíferos, incluyendo humanos. Este efecto biológico puede ser, pero no se limita a inhibición o activación de enzimas, unión a un receptor o un ligando, ya sea en el sitio de unión o circunferencial, activación de señal o modulación de señal. En una modalidad, el polipéptido biológicamente activo se selecciona del grupo de polipéptidos que comprenden inmunoglobulinas , fragmentos de inmunoglobulina , conjugado de inmunoglobulina y péptidos antifusogénicos . Las moléculas biológicamente activas son, por ejemplo, sin limitación, hormonas; citocinas; interleucinas ; inmunoglobulinas; péptidos antifusogénicos ; factores de crecimiento, ligandos de receptor; agonistas o antagonistas; agentes citotóxicos ; agentes antivirales; agentes generadores de imagen; inhibidores de enzimas; activadores de enzimas o moduladores de actividad enzimática tales como sustancias alostéricas y conjugados de esto. El término "aminoácidos" como se utiliza en esta solicitud indica un grupo de carboxi a-aminoácidos, ya sea directamente o como un precursor que puede ser codificado por ácidos nucleicos que comprenden alanina (código de tres letras Ala, código de una letra: A), arginina (Arg, R) , asparagina (Asn, N) , ácido aspártico (Asp, D) , cisteina (Cys C) , glutamina (Gln, Q) , ácido glutámico (Glu, E) , glicina (Gly, G) , histidina (His, H) , isoleucina (lie, I), leucina (Leu, L) , lisina (Lys, K) , metionina (Met, M) , fenilalanina (Phe, F) , prolina (Pro, P) , serina (Ser, S), treonina (Thr, T) , triptófano (Trp, W) , tirosina (Tyr, Y) y valina (Val, V). Un "vector de clonación" es un ácido nucleico tal como un plásmido, cósmido, fagémido o cromosoma artificial bacteriano (BAC) el cual tiene la capacidad de replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora. Los vectores de clonación típicamente contienen uno o un número pequeño de sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción que permiten la inserción de un ácido nucleico de una manera determinable sin pérdida de la función biológica esencial del vector así como secuencias nucleotídicas que codifican para un marcador seleccionable que es adecuado para uso en la identificación y selección de células transformadas con el vector de clonación. Los marcadores selecciónateles típicamente incluyen genes que proporcionan resistencia a tetraciclina , neomicina, G418 o ampicilina. Un "vector de expresión" es un ácido nucleico que codifica para un polipéptido o proteína heterólogos que se va a expresar en una célula hospedadora. Típicamente, un vector de expresión comprende una unidad de propagación de plásmido procariótico, por ejemplo para E. coli, que comprende un origen de replicación procariótico y un marcador de selección procariótico, un marcador de selección eucariótico y uno o más casetes (secuencias) de expresión para la expresión de un ácido nucleico de interés, cada uno comprende un promotor, un ácido nucleico y un terminador de transcripción que incluye una señal de poliadenilación . La expresión de genes habitualmente se coloca bajo el control de un promotor y dicho gen estructural se dice que está "unido operablemente" al promotor. De manera similar, un elemento regulador y un promotor de núcleo están unidos operablemente sin el elemento regulador controla o modula la actividad del promotor de núcleo . Una "unidad de transcripción policistrónica" es una unidad de transcripción en la cual más de un gen estructural están bajo el control del mismo promotor. Un "polipéptido aislado" o una "proteína aislada" es un polipéptido o proteina que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes tales como carbohidratos no unidos covalentemente, lipidos u otras impurezas proteináceas asi como impurezas no proteináceas relacionadas con el polipéptido o de naturaleza proteinica. Típicamente, una preparación de un polipéptido/proteína aislado contienen al polipéptido/proteína en una forma altamente purificada, es decir, por lo menos aproximadamente 80% puro, por lo menos aproximadamente 90% puro, por lo menos aproximadamente 95% puro, más de 95% puro o más de 99% puro. Una manera de mostrar que una preparación particular contiene un polipéptido o proteína aislado es mediante la apariencia de una banda única después de electroforesis en dodecilsulfato de sodio (SDS)-gel de poliacrilamida de la preparación y teñido del gel con azul brillante de Coomassie. No obstante, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido o proteína en formas físicas alternativas, tales como dímeros o formas de manera alternativa glucosiladas o que formen derivados. Como se utiliza en la presente, el término " inmunoglobulina" indica una proteína que consiste de uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Esta definición incluye variantes tales como formas mutadas, es decir, formas con sustituciones, supresiones e inserciones de uno o más aminoácidos, formas truncadas así como formas fusionadas. Los genes de inraunoglobulinas reconocidos incluyen los diferentes genes de la región constante asi como la gran cantidad de genes de la región variable de inmunoglobulina . Las inmunoglobulinas pueden existir en una diversidad de formatos que incluyen, por ejemplo, Fv, Fab y F(ab)2 asi como cadenas sencillas (scFv) (por ejemplo Huston, J.S., et al., PNAS USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426; y, en general, Hood et al., Immunology, Benjamín N.Y., segunda edición (1984) y Hunkapiller , T., and Hood, L., Nature 423 (1986) 15-16) . Cada una de las cadenas de polipeptido pesada y ligera de una inmunoglobulina, en caso de que estén presentes, puede comprender una región constante (generalmente la porción carboxilo terminal). La región constante de la cadena pesada media la unión del anticuerpo i) a células que presentan un receptor Fe tal como células fagocíticas o ii) a células que presentan el receptor Fe neonatal (FcRn) también conocida como receptor de Brambell. También median la unión a algunos factores que incluyen factores del sistema clásico de complemento tal como el componente Clq. Además, el dominio transmembranal puede seguir al dominio constante C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, es decir, el dominio CH3 o CH4. Este dominio transmembranal permite la formación de inmunoglobulinas o fragmentos de inmunoglobulina o polipéptidos de fusión de inmunoglobulina, unidos a membrana plasmática . Cada una de las cadenas de polipeptido pesada y ligera de una inmunoglobulina, en caso de que estén presentes, puede comprender un dominio variable (generalmente la porción amino terminal) . El dominio variable de la cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina comprende segmentos diferentes, es decir, cuatro regiones de infraestructura (FR) o regiones invariables y tres regiones hipervariables (CDR) . El término "por lo menos un fragmento de" indica una fracción de un ácido nucleico completo o un polipéptido completo, es decir, por lo menos 20%, por lo menos 40%, por lo menos 60% o por lo menos 80% del ácido nucleico, polipéptido o dominio completos. Por ejemplo, "un ácido nucleico que codifica para por lo menos un fragmento de un dominio CH3 o cH4 de inmunoglobulina" indica una fracción del ácido nucleico que codifica para el dominio CH3 o CH4 de inmunoglobulina completo, es decir, por lo menos 20%, por lo menos 40%, por lo menos 60% o por lo menos 80% del ácido nucleico que codifica para el dominio CH3 O CH4 de inmunoglobulina completo. En una modalidad, un fragmento de una cadena pesada de inmunoglobulina es un fragmento de la parte C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. El término "un codón de detención traduccional en marco" indica un codón de detención traduccional (TAA, TAG o TGA) el cual es sucesivo a una región codificante de un ácido nucleico sin desplazamiento del marco de lectura con respecto a la región codificante precedente del ácido nucleico, es decir, el cual finaliza la región codificante durante la traducción. Un codón de detención traduccional en marco está unido operablemente a la región codificante precedente de un ácido nucleico. El término "sin un codón de detención traduccional en marco" indica la ausencia de un codón de detención traduccional (TAA, TAG o TGA) en el ácido nucleico designado y/o la presencia de un codón de detención traduccional el cual se puede encontrar dentro o en el extremo de una región codificante de un ácido nucleico pero que, debido a uno o dos desplazamientos de pares de bases, no es reconocido durante la traducción del ARNm procesado (es decir, fuera del marco, o unido de manera no operable) y por lo tanto no finaliza la región codificante en el procedimiento de traducción. El término "terminador de transcripción" indica dentro de esta solicitud como una secuencia de ADN de 50-750 pares de bases de longitud que proporciona a la ARN polimerasa la señal para finalización de la síntesis de ARNm. Los terminadores muy eficaces (fuertes) en el extremo 3' de un cásete de expresión son aconsejables para evitar que el ARN polimerasa lea a través, particularmente cuando se utilizan promotores fuertes. Los terminadores de transcripción ineficaces pueden generar la formación de un ARNm similar a operón el cual puede ser la razón de una expresión de gen no deseada, por ejemplo codificada por plásmidos. Los términos "no separado constitutivamente durante el procesamiento de pre-ARNm" y "no empalmado constitutivamente del pre-ARNm (correspondiente)" como se utilizan en esta solicitud, indican un procedimiento de empalme que no se lleva a cabo de manera no excepcional durante el procesamiento de pre-ARNm, es decir, el ácido nucleico de un intrón especifico solo algunas veces es separado durante el procesamiento de pre-ARNm. Como un resultado se obtienen dos ARNm maduros diferentes, uno con por lo menos una parte del intrón y uno sin el intrón. El término "ancla GPI", como se utiliza dentro de esta solicitud indica una modificación post-traduccional unida a la parte C terminal de un polipéptido o proteina. Un "ancla GPI" tiene una estructura de núcleo que comprende por lo menos un residuo fosfato de etanolamina, un trimanósido, un residuo glucosamina y un fosfolipido inositol. Sin tomar en consideración está estructura del núcleo, un ancla GPI normalmente posee cierta microheterogeneidad y por lo tanto una proteina que tiene un ancla GPI normalmente es una mezcla de proteínas con anclas GPI homologas de la misma estructura de núcleo que tiene diferentes modificaciones de la cadena lateral . El término "péptido señal para un ancla GPI" indica una secuencia de aminoácidos de la parte C terminal de un polipéptido o proteina la cual consiste de un aminoácido al cual se unirá el ancla GPI, un péptido separador opcional y un péptido hidrofóbico. Casi la totalidad de este péptido señal, es decir, el péptido separador opcional y el péptido hidrofóbico, se separan postraduccionalmente por la enzima GPI-transaminasa y se forma un enlace entre el grupo amino y el fosfato de etanolamina del núcleo del ancla GPI y el aminoácido al cual se une el ancla GPI . Después de transfección con un ácido nucleico heterólogo, necesitan seleccionarse las células que expresen un polipéptido heterólogo codificado por el ácido nucleico heterólogo. Para la selección se utiliza un marcador. El marcador indica células en una población las cuales se han transformado con éxito y facilitan la selección y aislamiento de estas células. Se pueden utilizar diferentes marcadores tales como, por ejemplo, marcadores seleccionables o etiquetas detectables como proteina fluorescente verde (GFP) . La selección de células se puede llevar a cabo en una etapa única o en etapas múltiples. En un procedimiento de etapa única/múltiple, la primera selección se puede llevar a cabo en base, por ejemplo, en el nivel de umbral de un marcador seleccionable , tal como una etiqueta detectable. Por ejemplo, para selección por citometria de flujo (por ejemplo mediante FACS - clasificación de células activado por fluorescencia) , se establece un nivel umbral de fluorescencia y se seleccionan células con una fluorescencia por encima de este nivel umbral. De manera alternativa, se pueden recolectar células dentro de la parte superior 1-15% (es decir, 15% de las células con la marca detectable más intensa) o la parte superior 1-10%, o la parte superior 1-5% o la parte superior 5-10% o la parte superior 5-6% de intensidad de fluorescencia de la población de muestra. Un método alternativo para la selección de células es la unión inmunológica , por ejemplo a esferas magnéticas recubiertas con proteina A o inmunoglobulinas especificas. El conjunto seleccionado de células se puede tomar como la población básica para una etapa de selección posterior, por ejemplo mediante siembra de células solas, cultivo y análisis por ELISA (análisis inmunosorbente de unión de enzima) o por clonación por dilución limitada o mediante la expansión por cultivo bajo condiciones de cultivo selectivas en medio de selección durante varios días y selección FACS adicional o por selección FACS adicional con un nivel de umbral superior, el cual se puede basar, por ejemplo, en las intensidades de fluorescencia detectadas en una selección FACS precedente o por un método de inmunoprecipitación (véase por ejemplo también el documento WO 2005/020924). La selección de una célula de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo por un método que se selecciona de un grupo de citometria de flujo, ELISA, inmunoprecipitación, cromatografía en columna de inmunoafinidad, clasificación de inmunoafinidad por esferas magnéticas, método de aislamiento basados en microscopía o unión inmunológica . En una modalidad la selección de una célula de acuerdo con la invención se puede llevar a cabo por un método que se selecciona del grupo de citometría de flujo, ELISA, inmunoprecipitación, cromatografía en columna de inmunoafinidad, clasificación de inmunoafinidad por esferas magnéticas, métodos de aislamiento basados en microscopía o unión inmunológica, seguida por el método que se selecciona del grupo de siembra de cultivo de células solas, dilución limitada o expansión por cultivo, seguido por el método que se selecciona del grupo de FACS, inmunoprecipitación, cromatografía en columna de inmunoafinidad, clasificación por inmunoafinidad con esferas magnéticas, métodos de aislamiento basados en microscopía o ELISA. Dado que la eficacia de los métodos de transfección y vectores conocidos en la técnica es muy alta y por lo tanto una pluralidad de células transíectadas se obtiene, se prefiere un marcador que también permita una relación con el rendimiento de expresión de la célula transfectada con la "intensidad" detectada del marcador. Por lo tanto, resulta funcional relacionar la expresión del polipéptido heterólogo de interés con la expresión del marcador. La presente invención utiliza metodología de empalme, es decir, empalmado alternativo para expresar un polipéptido heterologo y un marcador a partir del mismo ácido nucleico, es decir, a partir del mismo cásete de expresión por lo que, por ejemplo, no se utiliza IRES. El marcador en la presente invención es una forma del polipéptido heterologo expresado unida a membrana plasmática. En la presente invención, el marcador seleccionable comprende como una parte N terminal al polipéptido heterologo y como una parte C terminal ya sea por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal o un ancla GPI . De esta manera, son idénticos el polipéptido heterologo producido y la parte extracelular del marcador seleccionable, es decir, la parte del marcador seleccionable si se detecta. Esta invención comprende un método para seleccionar una célula eucariótica que expresa un polipéptido heterologo, por lo que el método comprende: a) transfectar una célula eucariótica con un ácido nucleico que comprende, en la dirección 5' a 3': i) un primer ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterologo sin un codón de detención traduccional en marco, ii) un segundo ácido nucleico que comienza con el sitio donador de empalme y que termina por un sitio aceptor de empalme que comprende un codón de detención traduccional en marco y una señal de poliadenilación, iii) un tercer ácido nucleico que codifica para: iiia) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal , o iiib) un péptido señal para un ancla GPI, b) cultivo de la célula transfectada bajo condiciones adecuadas para la producción de pre-ARNm a partir del ácido nucleico, procesamiento del pre-ARNm y traducción del ARNm procesado en un polipéptido heterologo, en donde la célula transfectada produce polipéptido heterologo soluble y polipéptido heterologo unido a membrana plasmática por empalme alternativo del pre-ARNm, y c) seleccionar una célula con polipéptido heterologo unido a membrana plasmática para que la célula exprese un polipéptido heterologo. Durante la transcripción de ADN se obtiene una copia del ADN, el denominado pre-ARN mensajero (pre-ARNm). Este pre-ARNm tiene la misma organización que el ADN plantilla, es decir, tiene una organización genómica intrón-exón. Únicamente los exones contienen la información de la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. De esta manera, debe investigarse a los intrones del pre-ARNm antes de su traducción. Este procedimiento se denomina empalme de ARN . Un "ácido nucleico susceptible de empalme" se caracteriza por al menos un sitio donador de empalme 5' y un sitio aceptor de empalme 3' y lo que también se denomina como un sitio de ramificación, el cual normalmente se localiza 20-50 bases hacia el extremo 5' del sitio aceptor. Esta arquitectura lleva a cabo el reconocimiento y corte del ácido nucleico desde el sitio donador de empalme 5' al sitio aceptor de empalme 3' y a partir del pre-ARNm durante el empalme de ARN. Durante la etapa de empalme se genera ARNm maduro a partir del cual se traduce el polipéptido o proteina. En una modalidad en la presente invención por lo menos un ácido nucleico, preferiblemente el segundo ácido nucleico es un ácido nucleico susceptible de empalme que contiene elemento regulador adicional tal como un codón de detención en marco y una señal de poliadenilación . No obstante, el procedimiento de empalme no es exclusivo. Es posible, por ejemplo, que un intrón no se separe durante el procesamiento de pre-ARNm a partir de pre-ARNm y por lo tanto se incrusta por lo menos parcialmente en el ARNm maduro. Si está presente un codón de detención en marco en este intrón incluido "opcionalmenrte" la traducción se detiene en ese codón de detención y se produce una variante del polipéptido codificado. El reconocimiento y corte del intrón con frecuencia es regulado por elementos de acción cis adicionales en el pre-ARNm. Debido a que función y la posición, estos elementos de denominan como mejorador de empalme exónico (ESE), silenciadores de empalme exónico (ESS) , mejorador de empalme intrónico (ISE) o silenciador de empalme intrónico (ISS), respectivamente (Black, D. L., Annu Rev Biochem 72 (2003) 291-336) . El ADN genómico de la mayor parte de los genes eucarióticos tienen organización intrón-exón. Por ejemplo, dentro del exón que codifica para el dominio C terminal de la forma secretada de una cadena pesada de inmunoglobulina (es decir, CH3 o CH4 , respectivamente) se encuentra el sitio donador de empalme 5 ' . Si este sitio donador de empalme no es eficaz en el procesamiento de pre-ARNm de cadena pesada, el intrón que siga a este exón, el cual contiene un codón de detención y una señal de poliadenilación es retenido por lo menos parcialmente en el ARNm maduro. El ARNm después se traduce en una cadena pesada de inmunoglobulina que termina con un dominio CH3 o CH4 y representa una inmunoglobulina soluble. Esta es la vía principal de procesamiento para los genes de cadena pesada de inmunoglobulina en células secretoras de inmunoglobulina. Si este sitio donador de empalme es eficaz en el procesamiento de pre-ARNm para cadena pesada de inmunoglobulina, el intrón consecutivo y por lo tanto el codón de detención se retira. Por lo tanto, la traducción no se detiene después del dominio C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. Además, la traducción continúa con los empalmados sucesivos a exones que codifican un dominio transmembranal . Esta vía de procesamiento menor para los genes para la cadena pesada de inmunoglobulina resulta en una forma de inmunoglobulina unida a membrana plasmática que se presenta sobre la superficie de la célula de una célula productora de inmunoglobulina . Este procedimiento de denomina como "empalmado alternativo" y el ácido nucleico (es decir, el intrón) opcionalmente separado en este procedimiento se denomina como "ácido nucleico alternativamente susceptible de empalme". Si un ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterólogo o una proteína se une a un ácido nucleico que codifica para al menos un fragmento del dominio transmembranal o ácido nucleico que codifica para un péptido señal para un ancla GPI por medio/mediante un ácido nucleico alternativamente susceptible de empalme, es decir, un ácido nucleico alternativamente susceptible de empalme se localiza entre estos dos ácidos nucleicos y por lo tanto estos tres ácidos nucleicos están unidos operablemente, se expresan dos variantes del polipéptido o proteína heteróloga: una variante soluble, es decir, una variante que comprende únicamente el polipéptido o la proteína, y una variante unida a membrana plasmática, es decir, una variante que comprende tanto el polipéptido o la proteína como el dominio transmembranal o el ancla GPI. En una modalidad, el ácido nucleico transfectado está comprendido en un cásete (secuencia) de expresión. En una modalidad, el primer ácido nucleico está sin un codón de detención traduccional en marco en su parte 3' terminal. En otra modalidad, el primero, segundo y tercer ácidos nucleicos están unidos operablemente. En una modalidad, el tercer ácido nucleico codifica para al menos un fragmento de un dominio transmembanal . En otra modalidad el fragmento de un dominio transmembranal es una región transmembranal. En una modalidad, el tercer ácido nucleico codifica para un péptido señal para un ancla GPI . En una modalidad de la invención, el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende cadenas pesadas de inmunoglobulina , cadenas ligeras de inmunoglobulina, polipéptidos biológicamente activos, fragmentos de los mismos y polipéptidos de fusión de los mismos. En una modalidad de la invención, el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende cadenas pesadas de inmunoglobulina, cadenas ligeras de inmunoglobulina, fragmentos de las mismas y proteínas de fusión de las mismas. En una modalidad, el tercer ácido nucleico codifica para al menos un fragmento de un dominio transmembranal de inmunoglobulina. Con mayor detalle, la presente invención comprende un método para seleccionar una célula eucariótica que expresa una cadena pesada de inmunoglobulina, por lo que el método comprende: a) transfectar una célula eucariótica con un ácido nucleico que comprende, en la dirección 5' a 3': i) un primer ácido nucleico que codifica para una cadena pesada de inmunoglobulina sin un codón de detención traduccional en marco, ii) un segundo ácido nucleico que comienza con el sitio donador de empalme y que termina por un sitio aceptor de empalme que comprende un codón de detención traduccional en marco y una señal de poliadenilación, iii) un tercer ácido nucleico que codifica para: iiia) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal , o iiib) un péptido señal para un ancla GPI, b) cultivo de la célula transfectada bajo condiciones adecuadas para la producción de pre-ARNm a partir del ácido nucleico, procesamiento del pre-ARNm y traducción del ARNm procesado en una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la célula transfectada produce la cadena pesada de inmunoglobulina soluble y la cadena pesada de inmunoglobulina unida a membrana plasmática por empalme alternativo del pre-ARNm, y c) seleccionar una célula con cadena pesada de inmunoglobulina unida a membrana plasmática para que sea la célula que expresa una cadena pesada de inmunoglobulina. En una modalidad, la presente invención comprende un método para seleccionar una célula eucariótica que expresa una inmunoglobulina , por el cual el método comprende: a) transfectar la célula eucariótica con un ácido nucleico que comprende un primer cásete (secuencia) de expresión para una cadena ligera de inmunoglobulina y un segundo cásete de expresión que comprende, en la dirección 5' a 3 ' : i) un primer ácido nucleico que codifica para una cadena pesada de inmunoglobulina sin un codón de detención traduccional en marco, ii) un segundo ácido nucleico que comienza con el sitio donador de empalme y que termina por un sitio aceptor de empalme que comprende un codón de detención traduccional en marco y una señal de poliadenilación, iii) un tercer ácido nucleico que codifica para: iiia) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal , o iiib) un péptido señal para un ancla GPI, b) cultivo de la célula transfectada bajo condiciones adecuadas para la producción de pre-ARNm a partir del ácido nucleico, procesamiento del pre-ARNm y traducción del ARNm procesado en una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la célula transfectada produce inmunoglobulina soluble e inmunoglobulina unida a membrana plasmática por empalme alternativo del pre-ARNm, y c) seleccionar una célula con inmunoglobulina unida a membrana plasmática que es la célula que expresa una inmunoglobulina . En una modalidad, la presente invención comprende un método para seleccionar una célula eucariótica que expresa una inmunoglobulina, por lo que el método comprende: a) transfectar una célula eucariótica con dos ácidos nucleicos ya sea de manera simultánea o secuencial por lo que un ácido nucleico comprende un cásete de expresión para una cadena ligera de inmunoglobulina y el otro ácido nucleico comprende un cásete de expresión que comprende, en la dirección 5 ' a 3 ' : i) un primer ácido nucleico que codifica para una cadena pesada de inmunoglobulina sin un codón de detención traduccional en marco, ii) un segundo ácido nucleico que comienza con el sitio donador de empalme y que termina por un sitio aceptor de empalme que comprende un codón de detención traduccional en marco y una señal de poliadenilación, iii) un tercer ácido nucleico que codifica para: iiia) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal , o iiib) un péptido señal para un ancla GPI, b) cultivo de la célula transfectada bajo condiciones adecuadas para la producción de pre-ARNm a partir del ácido nucleico, procesamiento del pre-ARNm y traducción del ARNm procesado en una cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la célula transfectada produce inmunoglobulina soluble e inmunoglobulina unida a membrana plasmática por empalme alternativo del pre-ARNm, y c) seleccionar una célula con inmunoglobulina unida a membrana plasmática para que dicha célula exprese una inmunoglobulina . En una modalidad, el dominio transmembranal codificado por el tercer ácido nucleico es un dominio transmembranal de inmunoglobulina. En una modalidad de la invención, el segundo ácido nucleico comprende únicamente un sitio donador de empalme 5' y únicamente un sitio aceptor de empalme 3' . En otra modalidad de la presente invención el segundo ácido nucleico es un intrón de cadena pesada de inmunoglobulina como se encuentra de manera natural, el cual es seguido por el exón que codifica para un dominio CH3 o CH4 de cadena pesada de inmunoglobulina en donde se suprime el intrón con por lo menos 50 nucleótidos consecutivos. Por ejemplo, para la expresión recombinante de cadenas pesadas de inmunoglobulina en células eucarióticas se utiliza un ácido nucleico ya sea con organización intrón-exón genómico o únicamente que contiene las regiones codificantes, es decir, ADNc. En ambos casos el ácido nucleico termina con el codón de detención después del exón que codifica para el dominio C terminal de la cadena pesada de inmunoglobulina . Posteriormente en los ¦ intrones de exones sucesivos de la organización genómica que comprenden un ácido nucleico alternativamente susceptible de empalme y un dominio transmembranal, se omiten. Por lo tanto, con dicho ácido nucleico únicamente se obtiene una cadena pesada de inmunoglobulina soluble. Si para la expresión recombinante de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas se retiene por lo menos parcialmente la organización genómica del gen para cadena pesada de inmunoglobulina, es decir, si el intrón después del exón que codifica para el dominio C terminal (es decir, el ácido nucleico alternativamente susceptible de empalme) y uno o varios de los exones excesivos que codifican para un dominio transmembranal se retienen, es posible el empalme alternativo. En el evento de empalme alternativo, los codones terminales 3' y el codón de detención del exón que codifica para el dominio CH3 o CH , respectivamente, se retiran con la secuencia intrónica y se genera en vez de esto un ARNm maduro diferente, en el cual la región codificante, es decir, el marco de lectura, está alargado en su extremo 3' por uno o varios de los exones mantenidos adicionalmente . Este ARNm se traduce en una cadena pesada de inmunoglobulina que se extiende terminalmente en la parte C la cual contiene un dominio transmembranal adicional o un fragmento del mismo codificado por uno o varios de los exones 3' adicionales. Esta cadena pesada de inmunoglobulina alargada se incorpora durante el ensamblado de inmunoglobulinas que resultan en inmunoglobulina unidas a membrana plasmática. Ahora se ha encontrado sorprendentemente que con dicho ácido nucleico de acuerdo con la invención se pueden seleccionar células transfectadas que producen un polipéptido heterólogo. Esta metodología generalmente es aplicable y no se limita a inmunoglobulina. Para práctica de esta metodología, el ácido nucleico para una expresión recombinante de un polipéptido heterólogo si un codón de detención en marco debe unirse operablemente y en marco con el ácido nucleico alternativamente susceptible de empalme derivado de una inmunoglobulina que comprende un codón de detención traduccional en marco y un sitio de poliadenilación . El tercer ácido nucleico sucesivo es variable también y se puede seleccionar de cualquier ácido nucleico que codifica para un dominio transmembranal o un fragmento del mismo así como desde cualquier ácido nucleico que codifica para un péptido señal para un ancla GPI . Estos elementos, es decir, el ácido nucleico que codifica para el polipéptido, el ácido nucleico alternativamente susceptible de empalme y el ácido nucleico que codifica para el dominio transmembranal o el péptido señal para un ancla GPI se pueden seleccionar y combinar a partir de genes diferentes así como de organismos diferentes. El único requisito previo es que los tres ácidos nucleicos se combinen de manera tal que el codón de detención traduccional en el ácido nucleico alternativamente susceptible de empalme este en marco con el marco de lectura del ácido nucleico que codifica para el polipéptido, es decir, que puede ser reconocido por el ribosoma y finaliza la traducción. De manera general, con el empalme alternativo opcionalmente una fracción de la parte C terminal de la forma soluble del polipéptido heterólogo se puede separar de pre-ARNm como parte de un intrón. Esta fracción abarca opcionalmente los codones 3' terminales, la región 3' no traducida, el codón de detención y la señal de poliadenilación de la forma secretada. Por lo tanto, el ácido nucleico que comienza con un sitio donador de empalme 5' y que termina con un sitio aceptor de empalme 3' que ha sido retirado, opcionalmente se superpone/se puede superponer con la parte C terminal de la variante no procesada alternativamente. Por lo tanto, mediante el uso de un ácido nucleico de acuerdo con la invención con una organización genómica retenida por lo menos parcialmente de un gen para cadena pesada de inmunoglobulina se pueden obtener dos variantes de un polipéptido heterólogo, una variante soluble corta y una variante larga unida a membrana plasmática. En una modalidad, en donde el primer ácido nucleico codifica para una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende el primer ácido nucleico, todos los exones y excepto un intrón del gen para cadena pesada de inmunoglobulina organizados genómicamente . En una modalidad que codifica para el tercer ácido nucleico ya sea un fragmento de un dominio transmembranal o un péptido señal para un ancla GPI, por lo que el fragmento del dominio transmembranal es codificado por un exón único. En otra modalidad es el dominio transmembranal un dominio transmembranal de inmunoglobulina codificado por una fusión de Ml- 2-exón, es decir, por un exón único sin el intrón que interpuesto genómicamente. En una modalidad, el dominio transmembranal inmunoglobulina es codificado por un ADNc. Al introducir un ácido nucleico con una organización genómica general retenida por lo menos parcialmente de un gen para cadena pesada de inmunoglobulina en una célula hospedadora, se obtiene una célula que expresa, por una parte, un polipéptido heterólogo soluble, y por la otra, un polipéptido heterólogo unido a membrana plasmática. Por ejemplo, para obtener las dos variantes de inmunoglobulina, es decir, para permitir un empalme alternativo, no es necesario mantener la totalidad de la organización genómica del gen para la cadena pesada de inmunoglobulina es decir, todos los intrones y exones. Únicamente se requiere mantener el sitio de empalme alternativo en una forma susceptible de funcionar. Un "sitio de empalme susceptible de funcionar" es una secuencia de ácido nucleico que comprende un sitio donador de empalme 5' y un sitio aceptor de empalme 3', por lo que se permite el corte de la secuencia de ácido nucleico interyacente desde el pre-ARNm. El reconocimiento y corte de un intrón con frecuencia es regulado por elementos de acción cis adicionales en el pre-ARNm. Debido a su función y posición, estos elementos de denominan como un me orador de empalme exónico (ESE), silenciador de empalme exónico (ESS) , mejorador de empalme intrónico (ISE) o silenciador de empalme intrónico (ISS), respectivamente (Black, D. L., Annu Rev Biochem 72 (2003) 291-336), la cual se incorpora como referencia en la presente) . Para la selección de las células transíectadas que expresan un polipéptido heterólogo se pueden utilizar métodos diferentes tales como, sin limitación, métodos espectroscópicos , por ejemplo fluorescencia, ELISA y variantes de los mismos, mediante análisis de la actividad biológica o mediante la utilización de análisis que son independientes de dicha actividad, tal como la transferencia Western, electrtoforesis en SDS y gel de poliacrilamida o radioinmunoanálisis utilizando anticuerpos que reconocen y se unen al polipéptido heterólogo. Dado que el polipéptido heterólogo unido a membrana plasmática tiene la misma secuencia de aminoácidos y estructuras secundarias que el polipéptido heterólogo soluble excepto por su parte C terminal, se puede determinar, por ejemplo, con los mismos anticuerpos como la variante soluble. La variante unida a membrana plasmática de un polipéptido se conecta firmemente a la célula que lo expresa. Por lo tanto, la variante unida a membrana plasmática se puede utilizar como un marcador para aislar células que han sido transfectadas exitosamente con un ácido nucleico para la expresión de un polipéptido o proteina heterólogos, por ejemplo, una inmunoglobulina . En una modalidad, el péptido es una inmunoglobulina. En una modalidad, la inmunoglobulina se selecciona del grupo de IgG, IgE e IgA. La proporción molecular de la variante soluble y el polipéptido heterólogo respecto a la variante unida a membrana plasmática del polipéptido heterólogo es de más de 50:50 a menos de 100:0, de manera preferible de más de 75:25 a menos de 100:0. Por ejemplo, si se transfecta una célula eucariótica con un ácido nucleico de acuerdo con la invención que codifica para una inmunoglobulina, se pueden seleccionar células transfectadas con éxito por la apariencia de la inmunoglobulina unida a membrana plasmática. Un ácido nucleico de acuerdo con la invención es un ácido nucleico que contiene, en una dirección 5' a 3', una región codificante para un polipéptido heterólogo, un ácido nucleico alternativamente susceptible de empalme y una región codificante para un dominio transmembranal o un fragmento del mismo o una región codificante para un péptido señal para un ancla GPI . Con mayor detalle, la presente invención comprende un ácido nucleico que comprende: a) un primer ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterologo sin un codón de detención traduccional en marco, b) un segundo ácido nucleico que comienza con el sitio donador de empalme 5' y que termina por un sitio aceptor de empalme 3 ' que comprende un codón de detención traduccional en marco y una señal de poliadenilación, y c) un tercer ácido nucleico que codifica para: i) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal , o ii) un péptido señal para un ancla GPI. En otras modalidades, i) el sitio de empalme 5' del intrón alternativamente empalmado se localiza 5' respecto al codón de detención normal del ácido nucleico que codifica para el polipéptido heterologo, ii) el segundo ácido nucleico es un ácido nucleico alternativamente susceptible de empalme, y iii) el sitio de empalme 5' se utiliza sólo algunas veces y no de manera constitutiva, lo que resulta en una proporción molecular de polipéptido heterologo procesado normalmente, es decir, polipéptido soluble, respecto a polipéptido heterologo procesado de manera alternativa, es decir, polipéptido unido a membrana plasmática, de más de 50:50 a menos de 100:0. En una modalidad, el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico están unidos operablemente, es decir, el codón de detención traduccional del segundo ácido nucleico está en marco con el marco de lectura del primer ácido nucleico que codifica para un polipéptido o un fragmento del mismo. El ácido nucleico que se puede separar por empalme alternativo sigue al ácido nucleico que codifica para por lo menos un fragmento de un polipéptido y que precede al ácido nucleico que codifica para por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal o que codifica para un péptido señal para un ancla GPI . En una modalidad, el polipéptido heterologo es un polipéptido de fusión que comprende en la parte N terminal un polipéptido de interés de la parte C terminal por lo menos un fragmento de un dominio CH3 o CH4 de cadena pesada de inmunoglobulina o una variante del mismo. En una modalidad, el ácido nucleico comprende un cuarto ácido nucleico entre el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico y/o el segundo ácido nucleico y el tercer ácido nucleico. Es decir, el cuarto ácido nucleico se localiza, por ejemplo, después del segundo ácido nucleico (es decir, después del sitio aceptor de empalme 3') y antes del extremo 5' del tercer ácido nucleico. Con un ácido nucleico alternativamente susceptible de empalme localizado entre el ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterologo y el ácido nucleico que codifica para un dominio transmembranal o que codifica para un péptido señal para un ancla GPI, se pueden expresar dos variantes del polipéptido heterólogo: un polipéptido heterólogo sin dominio transmembranal o ancla GPI y un polipéptido heterólogo con un dominio transmembranal o ancla GPI. El polipéptido heterólogo se puede seleccionar, sin limitación, por ejemplo, de hormonas; citocinas; factores de crecimiento; ligandos receptores, agonistas o antagonistas; agentes citotóxicos; agentes antivirales; agentes productores de imagen; inhibidores de enzima; activadores de enzima o moduladores de actividad enzimática tales como sustancias alostéricas; inmunoglobulinas ; o fusiones o fragmentos de los mismos. En una modalidad, el polipéptido es una inmunoglobulina , un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina o una inmunoglobulina de fusión. La invención se puede llevar a la práctica con cualquier polipéptido, cualquier dominio transmembranal y cualquier péptido señal para un ancla GPI en la medida en que un ácido nucleico alternativamente susceptible de empalme está incrustado de esta manera. Con mayor detalle, el fragmento de ácido nucleico que comienza con el sitio donador de empalme 5' y que termina con el sitio áceptor de empalme 3' debe seleccionarse apropiadamente. El polipéptido precedente si el dominio transmembranal sucesivo o el ancla GPI se pueden seleccionar libremente. La presente invención comprende además un ácido nucleico que comprende: a) un primer sitio de clonación múltiple, b) un ácido nucleico susceptible de empalme que comienza con un sitio donador de empalme 5' y que termina en un sitio asceptor de empalme 3', en donde: i) el ácido nucleico susceptible de empalme comprende un codón de detención y una señal de poliadenilación, y ii) el ácido nucleico susceptible de empalme no se separa constitutivamente durante el procesamiento de pre- ARNm, c) un segundo sitio de clonación múltiple. La presente invención se puede llevar a la práctica, por ejemplo, sin limitación, con el segundo ácido nucleico, es decir, de manera alternativa ácido nucleico susceptible de empalme derivado del grupo de ácidos nucleicos que codifican para el receptor C3b/C4b (tipo 1 de receptor de complemento) (Hourcade, D. , et al., J. Exp . Med. 168 (1988) 1255-1270), EGFR humano, de pollo y rata (Callaghan, T., et al., Oncogene 8 (1993) 2939-2948; Reiter, J.L., y Maihle, N.J., Nuc. Acids Res. 24 (1996) 4050-4056; Petch, L . , et al., Mol. Cell Biol. 10 (1990) 2973-2982), inmunoglobulina (Ig) a, e , ? y µ de cadena pesada (Zhang, K., et al., J. Exp. Med. 176 (1992) 233-243; Rogers, J.E., et al., Cell 20 (1980) 303-312; Milcarek, C, y Hall, B., Mol. Cell Biol. 5 (1985) 2514-2520; Kobrin, B.J., et al., Mol. Cell Biol. 6 (1986) 1687-1697; Cushley, W., et a., Nature 298 (1982) 77; Alt, F. W., et al., Cell 20 (1980) 293-301; Peterson, M.L., Gene Exp . 2 (1992) 319-327), receptor PLA2 humano (Ancian, P., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 8963-8970), Cek5 de pollo (Connor, R.J., y Pasquale, E.B., Oncogene 11 (1995) 2429-2438), FGFR humano (Johnson, D.E., et al., Mol. Cell Biol. 11 (1991) 4627-4634. En una modalidad el segundo ácido nucleico es un intrón de una inmunoglobulina que se localiza entre el exón que codifica para el dominio CH3/CH4 y el exón que codifica por lo menos para un fragmento del dominio transmembranal . En una modalidad, el segundo ácido nucleico se deriva del grupo de ácidos nucleicos que codifican para la cadena pesada humana (hu) y de inmunoglobulina (Ig) a (alfa), la cadena pesada hu Ig d (delta) , la cadena pesada hu Ig e (epsilón) y la cadena pesada hu Ig ??, ?2, Y3 y Y4 (gamma) , la cadena pesada hu Ig µ (miu) , la cadena pesada murina Ig tipo OÍ (alfa) , la cadena pesada Ig murina tipo d (delta), la cadena pesada Ig murina tipo e (epsilón), la cadena pesada Ig murina tipo ?? (gammal), la cadena pesada Ig murina tipo ?2? (gamma2A) , la cadena pesada Ig murina tipo ?2? (gamma2B) , la cadena pesada Ig murina tipo ?3 (gamma3) y la cadena pesada Ig murina tipo µ (miu) . En una modalidad, el segundo ácido nucleico se selecciona del grupo que de ácidos nucleicos que codifican para la cadena pesada ?? de inmunoglobulina humana, la cadena pesada ?2 de inmunoglobulina humana, la cadena pesada ?3 de inmunoglobulina humana, la cadena pesada ?4 de inmunoglobulina humana, la cadena pesada e de inmunoglobulina humana (1) y la cadena pesada e de inmunoglobulina humana (2) . En una modalidad, el segundo ácido nucleico se deriva/selecciona del grupo de ácidos nucleicos que codifican para la cadena pesada d de inmunoglobulina humana, la cadena pesada ?? de inmunoglobulina humana, la cadena pesada ?2 de inmunoglobulina humana, la cadena pesada µ de inmunoglobulina humana, la cadena pesada murina tipo OÍ, la cadena pesada murina tipo ??, la cadena pesada murina tipo ?2?, la cadena pesada murina tipo ?3 y la cadena pesada murina tipo µ. La presente invención se puede llevar a la práctica, por ejemplo, sin limitación, con el tercer ácido nucleico, en caso de que el ácido nucleico codifique para al menos un fragmento de un dominio transmembranal que se selecciona del grupo de ácidos nucleicos que codifican para el receptor C3b/C4b (tipo 1 de receptor de complemento) (Hourcade, D. , et al., J. Exp. Med. 168 (1988) 1255-1270), EGFR humano, de pollo y rata (Callaghan, T., et al., Oncogene 8 (1993) 2939-2948; Reiter, J.L., y Maihle, N.J., Nuc. Acids Res. 24 (1996) 4050-4056; Petch, L., et al., Mol. Cell Biol. 10 (1990) 2973-2982), cadena pesada de Ig OÍ, e, ? y µ (Zhang, K., et al., J. Exp. Med. 176 (1992) 233-243; Rogers, J.E., et al., Cell 20 (1980) 303-312; Milcarek, C, y Hall, B . , Mol. Cell Biol. 5 (1985) 2514-2520; Kobrin, B.J., et al., Mol. Cell Biol. 6 (1986) 1687-1697; Cushley, W., et al., Nature 298 (1982) 77; Alt, F. W., et al., Cell 20 (1980) 293-301; Peterson, M.L., Gene Exp. 2 (1992) 319-327), receptor PLA2 humano (Ancian, P., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 8963-8970), Cek5 de pollo (Connor, R.J., y Pasquale, E.B., Oncogene 11 (1995) 2429-2438), FGFR humano (Johnson, D.E., et al., Mol. Cell Biol. 11 (1991) 4627-4634. En una modalidad, el tercer ácido nucleico se selecciona del grupo de ácidos nucleicos que codifican para la cadena pesada humana (hu) y de inmunoglobulina (Ig) OÍ (alfa), la cadena pesada hu Ig d (delta) , la cadena pesada hu Ig e (epsilón) , la cadena pesada hu Ig ??, ?2, Y3 y Y4 (gamma) , la cadena pesada hu Ig µ (miu) , la cadena pesada murina Ig tipo a (alfa), la cadena pesada Ig murina tipo d (delta), la cadena pesada Ig murina tipo e (epsilón) , la cadena pesada Ig murina tipo ?? (gammal), la cadena pesada Ig murina tipo ?2? (gamma2A) , la cadena pesada Ig murina tipo ?2? (gamma2B) , la cadena pesada Ig murina tipo ?3 (gamma3) y la cadena pesada Ig murina tipo µ (miu) . En una modalidad, el tercer ácido nucleico se selecciona del grupo de ácidos nucleicos que codifican para la cadena pesada ?? de inmunoglobulina humana, la cadena pesada ?2 de inmunoglobulina humana, la cadena pesada ?3 de inmunoglobulina humana, la cadena pesada ?4 de inmunoglobulina humana, la cadena pesada e de inmunoglobulina humana (1) y la cadena pesada e de inmunoglobulina humana (2) . En una modalidad, el tercer ácido nucleico se selecciona del grupo de ácidos nucleicos que codifican para la cadena pesada d de inmunoglobulina humana, la cadena pesada ?? de inmunoglobulina humana, la cadena pesada ?2 de inmunoglobulina humana, la cadena pesada µ de inmunoglobulina humana, la cadena pesada murina tipo a, la cadena pesada murina tipo ??, la cadena pesada murina tipo ?2?, la cadena pesada murina tipo ?3 y la cadena pesada murina tipo µ. Además del grupo de ácidos nucleicos que codifican para al menos un fragmento de un dominio transmembranal , el tercer ácido nucleico se puede seleccionar del grupo de ácidos nucleicos que codifican para un péptido señal para un ancla GPI . El grupo de ácidos nucleicos que codifican para un péptido señal para un ancla GPI comprende el grupo de ácidos nucleicos que codifican para un péptido señal para un ancla GPI derivada de diesterasa alcalina humana, acetilcolina esterasa, fosfatasa alcalina (intestinal, hepática y placentaria ) , antigeno CA PATH-1, antigeno carcinoembriónico, CD55, CD59, CD90, contactina-1 , antigeno E48, receptor de folato A y B, proteina anclada en GPI pl37, antigeno 3 asociado a función de linfocitos, proteina de interacción mDIA, 5 ' -nucleotidasa, factor activador de plasminógeno de urocinasa; a partir de antigeno murino LY-6C, antigeno LY-6, 5 ' -nucleotidasa, antigeno 0X45, antigeno 2 de células pluripotenciales , molécula 1 de adhesión celular vascular, antigeno 2 de linfocito Qa (Qa2); de trihalasa de conejo; de proteina brevican de rata, CD90, proteina de glipicano, proteoglucano de sulfato de heparina, antigeno RC OX-45, 5'-nucleotidasa , glucoproteina principal de membrana de gránulo secretor pancreático, proteina RT6.2 de superficie de linfocitos T; de proteina PHR1 de reparación de ADN de levadura, proteina 1 de superficie anclada por glucofosfolipido ; proteina precursora amiloide porcina; dipeptidasa; de proteina de superficie variante diversa de Trypanosoma brucei, proteina repetitiva de ácido policiclico; de proteina YNat 1.1 de superficie variante de Trypanosoma congolense; de melanotransferrina de pollo, molécula de adhesión celular neutra; de acetilcolina esterasa de Torpedo marmorata; de proteina de prión de hámster; de 5 ' -nucleotidasa bovino; de proteina Gp64 de membrana de molde lodo, antigeno especifico pre-espora y a partir de Sgpl y Sgp2 calamar. En la Tabla 1 se proporcionan ejemplos de las secuencias de ácido nucleico del segundo ácido nucleico, de acuerdo con la invención. En la Tabla 2 se proporcionan ejemplos de secuencias de ácido nucleico del tercer ácido nucleico de acuerdo con la invención y de secuencias de aminoácidos que corresponden a las terceras secuencias de ácido nucleico de acuerdo con la invención. En la Tabla 3 se incluyen ejemplos de secuencias de ácido nucleico del cuarto ácido nucleico opcional y de secuencias de aminoácidos, que corresponden a los cuartos ácidos nucleicos opcionales de acuerdo con la invención. La Tabla 1 incluye una lista del sitio donador de empalme 5', el segundo ácido nucleico (alternativamente susceptible de empalme) y el sitio aceptor de empalme 3'. Dado que la secuencia del segundo ácido nucleico generalmente excede de 1 kb, las secuencias que se incluyen en la Tabla 1 se acortan y muestran aproximadamente el primero y último 100 nucleótidos del segundo ácido nucleico separado por un número al que se hace referencia como al tamaño total del segundo ácido nucleico completo. La secuencia completa del segundo ácido nucleico está contenida en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO dada de la lista de secuencias. El codón de detención está subrayado. El sitio donador de empalme se proporciona en un formato que comprende la secuencia de consenso precedente del sitio donador de empalme y los primeros seis nucleótidos del segundo ácido nucleico separados por una linea vertical (véase también, por ejemplo Zhang, M.Q., Human Mol. Gen. 7 (1998) 919-932). De igual manera, el sitio aceptor de empalme está dado por la lista de los últimos 6 nucleótidos del segundo ácido nucleico y el sitio aceptor de empalme sucesivo de la secuencia de consenso los cuales están separados por una linea vertical. Los nucleótidos directamente después (5' respecto al sitio donador de empalme) y directamente antes (3' respecto al sitio aceptor de empalme) de la linea vertical son el primero y último nucleótidos del segundo ácido nucleico (susceptible de empalme) . El codón de detención en el segundo ácido nucleico está subrayado en la Tabla 1. El segundo ácido nucleico se puede unir directamente al ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterologo, es decir, el primer ácido nucleico o con una secuencia de ácido nucleico intermedia opcional pequeña (9 a 21 bases) . En una modalidad, el (quinto) ácido nucleico interpuesto opcional se deriva de ácido nucleico que precede al segundo ácido nucleico en el genoma desde el cual se obtiene el segundo ácido nucleico. En la Tabla 2 se incluyen ejemplos de la tercera secuencia de ácido nucleico que codifica para fragmentos de los dominios transmembranales y las secuencias de aminoácidos de los péptidos señal para para las anclas GPI . Esta secuencia puede seguir ya sea directamente o con una secuencia interpuesta opcional, es decir, un cuarto ácido nucleico al sitio aceptor de empalme 3' . En la Tabla 3 se incluyen ejemplos de las cuartas secuencias de ácido nucleico y de las secuencias de aminoácidos correspondientes a los cuartos ácidos nucleicos. En una modalidad, el ácido nucleico de acuerdo con la invención comprende un cuarto ácido nucleico entre el segundo ácido nucleico y el tercer ácido nucleico. En una modalidad, el ácido nucleico de acuerdo con la invención comprende un quinto ácido nucleico entre el primer ácido nucleico y el segundo ácido nucleico. Una modalidad de la presente invención es en donde el tercer ácido nucleico se obtiene a partir de: i) el mismo, o ii) un gen diferente u organismo como el segundo ácido nucleico, es decir, el tercer ácido nucleico no necesariamente se organiza con el segundo ácido nucleico en un genoma . Las secuencias se derivan de genomas o bases de datos disponibles públicamente (por ejemplo el proyecto de genoma humano, http://www.gdb.org/; la base de datos del genoma de ratón, http://www.informatics.jax.org/; SwissProt (http://www.expasy.o g/sprot/) . Cuando está accesible alguna anotación, las secuencias se han predicho o completado por el programa ALOM (véase, por ejemplo, Klein, P., et al, Biochim. Biophys . Acta 787 (1984) 221-226) . En el caso de completado de dominios t ran smembr ana 1 e s las secuencias entre paréntesis se predicen por ALOM además de la secuencia SwissProt dada . En una modalidad, el segundo ácido nucleico se selecciona del grupo de ácidos nucleicos que comprenden las SECUENCIAS DE IDENTIFICACIÓN NUMEROS: 001 , 002 , 003 , 004 , 005 , 006 , 007 , 008 , 009 , 151 , 152 , 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 169, 170, 171, 172, 173. En una modalidad, el segundo ácido nucleico del ácido nucleico de acuerdo con la invención se selecciona del grupo de secuencias de ácido nucleico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 001 a SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 009. En una modalidad, el segundo ácido nucleico se selecciona del grupo de ácidos nucleicos que comprenden la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 002, 003, 156, 157, 170 y 171. En una modalidad, el tercer ácido nucleico del ácido nucleico de acuerdo con la invención se selecciona o es un fragmento de un ácido nucleico que se selecciona del grupo de secuencias de ácido nucleico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 010 a SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 018 y de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para las secuencias de aminoácidos de SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 019 a SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 069. En una modalidad, el tercer ácido nucleico del ácido nucleico de acuerdo con la invención se selecciona o es un fragmento de un ácido nucleico que se selecciona del grupo de secuencias de ácido nucleico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 010, 011, 012, 013, 014, 015, 016, 017, 018, 160, 161, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 174, 175, 176 y de las secuencias de ácido nucleico que codifican para las secuencias de aminoácidos de SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 019 a SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 069 y 162. En una modalidad, el tercer ácido nucleico del ácido 5 nucleico de acuerdo con la invención se selecciona o es un fragmento de un ácido nucleico que se selecciona del grupo de secuencias de ácido nucleico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 011, 012, 165, 166 y 175 y de secuencias de ácido nucleico que codifican ° para las secuencias de aminoácido de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 019 a SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 036. En otra modalidad, el tercer ácido nucleico del ácido nucleico de acuerdo con la invención se selecciona o es un fragmento de un 5 ácido nucleico que se selecciona del grupo de secuencias de ácido nucleico de las SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 011, 012, 165, 166 y 175. En una modalidad, el cuarto ácido nucleico del ácido nucleico de acuerdo con la invención se selecciona o (-> comprende un ácido nucleico que se selecciona del grupo de secuencias de ácido nucleico de la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 070 a SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 078 y de secuencias de ácido nucleico que codifican para las secuencias de aminoácidos de SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 079 a 5 SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NUMERO: 129.

Tabla 1: Ejemplos de segundos ácidos nucleicos proteína sitio donador Segundo ácido nucleico (ácido nucleico susceptible de sitio aceptor de empalme 5' empalme) de empalme 3' 5 cadena pesada GCT 1 GTGAGTCACCCCCAGGCCCAGGGTTGGGACGGGGACTCTGAGGGGGGCCATAAG CCCCAG 1 de GTGAGT GAGCTGGAATCCATACTAGGCAGGGGTGGGCACTGGGCAGGGGCGGG A inmunoglobulina d ... (2.77 KB total) ... humana GACTCGCCGTCATTTCAGCTCCACGCTGTGCGGGGGTGGGTGGAGGGGTAGCCT GGCCCTCATGACCAGGGAGCTTCTCACTCAGCCCCTGTTCCTCCCCAG 10 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 001) cadena pesada CGG 1 GTAAATGAGTGCCACGGCCGGCAAGCCCCCGCTCCCCAGGCTCTCGGGGTCGCG GTCCAG 1 de GTAAAT CGAGGATGCTTGGCACGTACCCCGTGTACATACTTCCCAGGCACCC A inmunoglobulina ? 1 ... (1.3 kb total) ... humana CCCGGCCGGGCCCTACATCCTGGGTCCTGCCACAGAGGGAATCACCCCCAGAGG CCCAAGCCCAGGGGGACACAGCACTGACCACCCCCTTCCTGTCCAG (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 002) cadena pesada de CGG 1 GTAAATGAGTGCCACGGCCGGCAAGCCCCCGCTCCCCAGGCTCTCGGGGTCGCGCGAGGAT GTCCAG 1 inmunoglobulina ?2 GTAAAT GCTTGGCACGTACCCCGTCTACATACTTCCCGGGCACCC A humana (1.3 kb total) ... CCCGGCCGGGCCCTACATCCTGGGTCCTGCCACAGAGGGAATCACCCCCAGAGGCCCGAGC 5 CCAGCAGGACACAGTATTGACCACCCACTTCCTGTCCAG cadena pesada de CCG 1 GTAAACCCACCCTGTACAACGTGTCCCTGGTCATGTCCGACACAGCTGGCACCTGCTACTG CTGCAG 1 inmunoglobulina µ GTAAAC ACCCTGCTGGCCTGCCCACAGGCTCGGGGCGGCTGGCC A humana ... (1.9 kb total) ... 1 10 GCCTAGGGGCCAAGGGTGGGCCTAGAGGATGGGCCCCGGGGGGGCTTTGCTGGGTGCCACC CCAGCCTGACCCTATTCCCCCGTGCTGTGTCTCCTGCAG (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 004) cadena pesada de CGG 1 GTAAACCCACCAATGTCAGCGTGTCTGTGATCATGTCAGAGGGAGATGGCATCTGCTACTG TTACAG 1 Ig murina tipo a GTAAAC AGCCACCCTGCCTGCCTGTCCCTACTCCTGAAATAAACTCTGT A 15 ... (2.43 kb total) ... CCACTGTCCCCAAAGCCCAAGGAGGCATAGAAGCAGAAACCTTAAGTCTGAGCCCCCATCC CCATGGGTTTGGATCTAGAAGGTCATCTATGTCTTACAG cadena pesada de TTG 1 GTAACACCTCCCTCCATCCCTCCTAGGCCTCCATGTAGCTGTGGTGGGGAAGGTGGATGAC TTGAAG 1 Ig murina tipo e GTAACA AGACATCCGCTCACTGTTGTAACACCAGGAAGCTACCCCAATAAACACTCAGTGCCTGATT A (2) AGAGCCCTGGGT 5 ... (1.7 kb total) ... ACTGGCTGGTCCCACCCCATCCCAGAGCTAGACCTCCAGGACCTATGTATTGAAG cadena pesada de CTG 1 GTAAATGATCCCAGTGTCCTTGGAGCCCTCTGGTCCTACAGGACTCTGACACCTACCTCCA GTCCAG 1 Ig murina tipo ?? GTAAAT CCCCTCCCTGTGTAAATAAAGCACCCAGCACTGCCTTGG G ... (1.4 kb total) ... 1 10 CTGCAGCTTTCTCCTGGGCCTCCATACAGCCTCCTGCCACACAGGGAATGGCCCTAGCCCC ACCTTATTGGGACAAACACTGACCGCCCTCTCTGTCCAG (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 006) cadena pesada de CGG 1 GTAAATGAGCTCAGCACCCACAAAGCTCTCAGGTCCTAAGAGACACTGGCACCCATATCCA GTTCAG 1 Ig murina tipo GTAAAT TGCATCCCTTGTATAAATAAAGCATCCAGCAAAGCCTGG G 15 ?2? ... (1.36 kb total) ... AGATCTCTCCTCTGACTTCATGCAGACATGTCTGCCTCACAGGGAATCTCTCCCAGCATCA ACCATGTTGGGACAAACACTGACTGTCCTCTCTGTTCAG cadena pesada de CTG 1 GTAAATGAGAACAGCACCTAGCCATTCCTCGGGTCTTACAAGACACTGATACCAGCCCTAA GTTCAG Ig murina tipo ?3 GTAAAT CCGGTGAACCCTATAAATAAAGCACCCAGAGATGGGACC A ... (total 1. 7 kb) ... 5 CTGCAGCTTTCTCCTGGGCCTCCATGCAGCCTCCTGCCACACAGGGAATGGCCCTAGCTCT ACCTTGTTGGGACAAACACTGACTTTCCTCTCTGTTCAG cadena pesada de CTG 1 GTAAACCCACACTGTACAATGTCTCCCTGATCATGTCTGACACAGGCGGCACCTGCTATTG TCATAG Ig murina tipo µ GTAAAC ACCATGCTAGCGCTCAACCAGGCAGGCCCTGGGTGTCCA A 10 ... (total 1.86 kb) ... ^1 GTCAATACTCGCTAAGATTCTCCAGAACCATCAGGGCACCCCAACCCTTATGCAAATGCTC AGTCACCCCAAGACTTGGCTTGACCCTCCCTCTCTGTGTCCCTTCATG (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 009) receptor 1 de AAG 1 GTACACACTGTAACTTCTCCTCTCGATGTCCTGCCCTCGCCACGGGCAC . GGGGGGAGCAT ACTCAG C 15 factor de GTACAC GCATTTCCAGGCTTGGGGAGACACAGAGGCAGGAGAGCTGGAAGAATGGGCTCCTGCCTGC crecimiento de CTGGTGCCACATCCTGCCCCAGCTTTGAGGGCTGAATCCTCTCAGCTCAGA fibroblastos ... (2 kb total) ... humanos CATGGACGGGGCCCTCCAAGCCTGCTAACACCCTGTTCGCACTGACTCAG receptor de TGG 1 GTACGTTCAATGGCAGTGGATCTTAAAGACCTTTTGGATCTAAGACCAGAAGCCATCTCTG TTCCAG 1 factor de GTACGT ACTCCCCTCTCACC G crecimiento ... (2.7 kb total) ... 5 epitelial murino GTATGGAATGCCCATATTACCTTCTCTTGTCTCTCATTCCAG receptor 1 de AGG 1 GGGTGAGTTGGCAGCAACATCTCTTGGTTTAAGAGTTCCAGCACAGCGATAGTACTTTCTA CTTTAG 1 complemento GTGAGT GCCACATCTCAGCAAGGAAACTAGGCTATTGCCACCTGCTCTTAAGAGGCTTGAACACA G humano (C3b/C4b) ... (5.7 kb total) ... 10 TAGACTTCTCCTGCATTGTAATCCCTCTGGTTTGCCACATATGCATGCTGTCAGGAAGTTG ATGAGGTATGTACAGCACAATTTATTTTCCATTTTTTGCCTTTAG (SECEUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 153) receptor de ACC 1 GTGAGTATCAGGGTCGTAGGCTGTGAGGATCTCTACAGCCG TTGCAG 1 15 interleucina GTGAGT ... (1.3 kb total) ... A 4 murino GGGCGGCCTCCCCATTCATGACTGTTTTTCTCCTTGCAG (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 154) cadena pesada de CGG 1 GTAAACCCACCCATGTCAATGTGTCTGTTGTCATGGCGGAGGTGGACGGCACCTGCTACTG TGGCAG 1 inmunoglobulina GTAAAC AGCCGCCCGCCTGTCCCCACCCCTGAATAAACTCCATGCTCCCCCAAGCAGCCCCACGCTT G humana ... (2.6 kb total) ... 5 CCCAAGGAAGCATAGCCGCTGTTCACACGAGTCTGGGCCTGGCAG (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO : 155) cadena pesada de CCG 1 GTAAATGACGTACTCCTGCCTCCCTCCCTCCCAGGGCTCCATCCAGCTGTG CCTCAG 1 inmunoglobulina e GTAAAT ... (1.9 kb total) G humana (1) CGTTGACTGACTCGGGACCTGGGTGCCCACCCTCAG 10 in (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 156) cadena pesada de GTG 1 GTAAGTCACAACTGGGTAAGAGTGTCAAGCAAGGACAGCACTTGGTACCTATGATAGACAA CCCTAG 1 5 inmunoglobulina d GTAAGT ATACTCCTGTTTGGGAAGAGGAGGTCTGCATTGTCTAGATAAGAGGAACACTGTGCTTATC G murina TGTTTCAGTTTAAAAGACAGAACTACATAACACTTCACCCTTTCTACAACACTTAGATTTT TCAGCCCTCTCCTCTA ... (6.35 kb total) ... cadena pesada de CCG 1 GTAAATGACGTACTCCTGCCTCCCTCCCTCCCAGGGCTCCATCCAGCTGTG CCCCAG 1 inmunoglobulina e GTAAAT ... [2.1 kb total) ... A humana (2) GCCACTGTGGAGCCGGGAGGGCTGACTGGCCAGGTCCCCCAG 5 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 170) cadena pesada de CGG 1 GTAAATGAGTGCGACGGCCGGCAAGCCCCCGCTCCCCGGGCTCTC GTCCAG 1 inmunoglobulina ?3 GTAAAT ... (1.3 kb total) A humana CCCCAGAGGCCCGAGCCCAGCAGGACACAGCACTGACCACCCTCTTCCTGTCCAG 10 (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 157) cadena pesada de TGG 1 GTAAATGAGTGCCAGGGCCGGCAAGCCCCCGCTCCCCGGGCTCTCGGGGTCGCGCGAGGAT GTCCAG 1 15 inmunoglobulina ?4 GTAAAT GCTTGGCACGTACCCCGTGTACATACTTC A humana ... (1.3 kb total) CCCCAGAGGCCCAAGCCCAGGGGGACACAGCACTGACCACCCCCTTCCTGTCCAG (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 171) cadena pesada de TTG 1 GTAACACCTCCCTCCATCCCTCCTAGGCCTCCATGTAGCTGTGGTGGGGAAGGTGGATGAC TTGAAG 1 Ig murina GTAACA AGACATCCGCTCACTGTTGTAACACCAGGAAGCTACCCCAATAAACACTCAGTGCCTGATT A tipo e (1) AGAGCCCTGGGT 5 ... (1.5 kb total) ... CCACTCTAGCTTCATCAGAACTGCATGAGACAAGTATGGGGTCTACCCCCTCCCCACTGTC ACCTGGAGTCTGGGGAAGCTAACTGGCTGGTCCCACCCCATCCCAGAGCTAGACCTCCAGG cadena pesada de TGG 1 GTAAATGAGCTCAGCACACACAATGCTCCTGGGTCCTAATGGACACTGGCACCCATATCCA GTTCAG 1 Ig murina tipo ?2? GTAAAT TGCATCCCTTGTATAAATAAAGCACCCAGCAAAGCCTGGGACCATGTAAAACTGT G 10 ... (1.35 kb total) ... GAAGGCTCCAGGAAGGGTCTGCTGTACCAGTCAGGCTGGAGCTCTCTCCTCTACTTCATGC AAACATGTCTGCATCACAGGGAATCTCTCCCAGCACCAACCATGTTGGGACAAACACTGAC TGTCCTCTCTGTTCAG GG?G ?G ? ? n r t ?G? t ? tp? G t?? ??G??· mal 15 receptor de ACT 1 GTGAGTATCAAGAGGCCTAAGCAATGGTAATCTCCACTCTCCATTCTTCCCCTG TTCCAG 1 interleucina 4 GTGAGT ... (3.1 kb total) ... C humano GGAGCCCAGGCTGTACCATGGCTGACCTCAGCTCATGGCTTCCCCTCCCACTTCCAG (SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 169) Tabla 2: ejemplo de terceros ácidos nucleicos y aminoácidos correspondientes a los terceros ácidos nucleicos Fuente secuencia nucleotidica o de SECUENCIA DE aminoácidos IDENTIFICACION NUMERO: cadena pesada d de AGCCTGTGGACCACCCTGTCCACGTTTGT 010 inmunoglobulina GGCCCTCTTCATCCTCACCCTCCTCTACAG humana/secuencia CGGCATTGTCACTTTCATCAAGGTGAAG transmembranal cadena pesada yl de GGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCAT 011 inmunoglobulina CACACTCTTCCTGTTAAGCGTGTGCTACAG humana /secuencia TGCCACCGTCACCTTCTTC transmembranal cadena pesada ?2 de GGGCTGTGGACCACCATCACCATCTTCAT 012 inmunoglobul ina CACACTCTTCCTGCTAAGCGTGTGCTACA humana /secuencia GTGCCACCATCACCTTCTTC transmembranal cadena pesada µ de AACCTGTGGGCCACCGCCTCCACCTTCAT 013 inmunoglobulina CGTCCTCTTCCTCCTGAGCCTCTTCTACAG humana /secuencia TACCACCGTCACCTTGTTCAAG transmembranal cadena pesada ig ACTGTGACCTTCCTCACCCTCTTCCTACTG 014 murina tipo AGCTTGTTCTACAGCACAGCACTCACTGTT a/secuencia ACA transmembranal cadena pesada ig GGGCTCTGGACGACCATCACCATCTTCAT 015 murina tipo CAGCCTCTTCCTGCTCAGTGTGTGC (TACA ??/secuencia GCGCTGCTGTCACACTCTTCAAGGTA transmembranal cadena pesada ig GGGCTCTGGACGACCATCACCATCTTCAT 016 murina tipo CAGCCTCTTCCTGCTCAGCGTGTGC (TACA y2B/secuencia GCGCCTCTGTCACACTCTTC ) transmembranal cadena pesada ig GGGCTCTGGACGACCATCACCATCTTCAT 017 murina tipo CAGCCTCTTCCTGCTCAGCGTGTGCTACA y3/secuencia GCGCCTCTGTCACCCTCTTC transmembranal cadena pesada ig (AACCTGTGGACCACTGCCTCCACC) TTCA 018 murina tipo TCGTCCTCTTCCTCCTGAGCCTCTTCTACA µ/secuencia GCACCACCGTCACCCTGTTC (AAGGTG) transmembranal acetilcolinaesterasa GEAARRPGLPLPLLLLHQLLLLFLSHLRRL 019 humana/péptido señal de ancla GPI sin péptido enlazante opcional fosfatase alcalina DAAHPVAASLPLLAGTLLLLGASAAP 020 humana (intestinal) /péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional fosfatasa alcalina SSAGSLAAGPLLVALALYPLSVLF 021 humana (hepática) /péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional fosfatasa alcalina DAAHPGRSVVPALLPLLAGTLLLLETATAP 022 humana (placentaria ) /péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional antigeno CAMPATH-1 SASSNISGGI FLFFVANAI IHLFCFS 023 humano/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional antigeno ASGTSPGLSAGATVGIMIGVLVGVALI 024 carcinoembriónico humano/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional CD55 humano (factor SGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT 025 acelerador de extinción) /péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional CD59 humano/péptido NGGTSLSEKTVLLLVTPFLAAAWSLHP 026 señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional antigeno CD90 humano CEGISLLAQNTSWLLLLLLSLSLLQATDFMSL 027 (Thy-1 ) /péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional contactina-1 humana SGAPTLSPSLLGLLLPAFGILV 028 (CNTN1) /péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional antigeno E48 DLCNEKLHNAAPTRTALAHSALSLGLALSLLA 029 humano/péptido señal VILAPSL ancla GPI sin péptido enlazante opcional receptor A de folato SGAGPWAAWPFLLSLALMLLWLLS 030 humano/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional receptor B de folato NAGEMLHGTGGLLLSLALMLQLWLLG 031 humano/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina pl37 ARGLMNGYRGPAMDSEEDM VTALHSLTL 032 anclada a GPI QTVVIHSLSSVLPGITLAIN humana/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional antigeno 3 asociado SSGHSRHRYALI PI PLAVI TCIVLYMNVL 033 función de linfocito human/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina de SGASSLHRHFGLLLASLAPLVLCLSLL 034 interacción mDIA humana (DIP) /péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional 5' -nucleotidasa STGSHCHGS FSLI FLSLWAVI FVLYQ 035 humana/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional factor activador de GAAPQPGPAHLSLTITLLMTARLWGGTLLWT 036 plasminogeno urocinasa humano/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional antigeno Ly-6C de NAAVPTGASTWTMAGVLLFSLSSVILQTLL 037 proteina de superficie celular murina/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional antigeno ThB Ly-6 NERLVSAAPGHALLSSVTLGLATSLSLLTVMA 038 murino/péptido señal LCL ancla GPI sin péptido enlazante opcional 5' -nucleotidasa SAASHYQGSFPLVILSLSAVI FVLYQ 039 murina/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional antigeno 0X45 murino SSGVCWTATWLVVTTLI IHRILLT 040 (BCM-1 o Blast-l)/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional antigeno 2 de célula NFSAAGLGLRASI PLLGLGLLLSLLALLQLSP 041 pluripotencial murina/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional molécula 1 de AKS FYFICYLCLYLAL 042 adhesión celular vascular murina/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina brevicano GNSAEGSMPAFLLFLLLQLWDT 043 de rata/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional antígeno CD90 de CGGISLLVQNTSWLLLLLLSLSFLQATDFISL 044 rata (Thy-1 ) /péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina de SAATRPEPHYFFLLFLFTLVLAAARPRWR 045 glupicano de rata/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional antigeno OX-45 MRC SSGVHWIAAWLVVTLSIIPSILLA 046 de rata/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional 5' -nucleotidasa de SAASHYQGSFPLIILSFWAVILVLYQ 047 rata/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional glucoproteína GP2 RNTGFLLAWPTFFLPVFLAWLF 048 principal de membrana de gránulo secretor pancreático de rata/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina RT6.2 de SSAGARESCVSLFLVVLPSLLVQLLCLAEP 049 superficie de linfocitos T de rata/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina PHR1 de SSGVKATQQMS VKLVSI ITIVTAFVGGMSV 050 reparación de ADN de VF levadura/pé tido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteína 1 de NAATNVKANLAQVVFTS I I SLS IAAGVGFALV 051 superficie anclada a glucofosfolípido de levadura/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteína precursora ARAAPTTSLGSLMTVSALAILGWSV 052 amiloide porcina /péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional dipeptidasa SAAPSLHLPPGSLLASLVPLLLLSLP 053 porciña/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina IL Tat 1.1 SNSFVIHKAPLFLAFLLF 054 de superficie variante de Trypanosoma ¿rucei/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina MIT 117a de DSS ILVTKKFALTVVSAAFVALLF 055 superficie variante de Trypanosoma j rucei/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina MIT 118a de NGSFLTSKQFAFSVVSAAFVALLF 056 superficie variante de Trypanosoma ¿rucei/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina MIT 221 de SNS FVI SKTPLWLAVLLF 057 superficie variante de Trypanosoma j rucei/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina MITat DGSFLVNKKFALMVYDFVSLLAF 058 1.1000 BC de superficie variante de Trypanosoma £>rucei/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina MITat 1.5b NGSFLTSKQFALMVSAAFVTLLF 059 de superficie variante de Trypanosoma jbrucei/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteína repetiva GAATLKSVALPFAIAAAALVAAF 060 ácida procíclica de Trypanosoma ¿>rucei/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteína TxTat 1 de SNSFVINKAPLLLGFLLF 061 superficie variante de Trypanosoma bruceí/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteína YNat 1.1 de SGSSHGTKAIRSILHVALLM 062 superficie variante de Trypanosoma congolense/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional melanotransferrina AGNKLIQQHLLVITFVPFI ILGGQLQGLG 063 de pollo/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional molécula de adhesión ATLGSPSTSSSFVSLLLSAVTLLLLC 064 celular neural de pollo/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional acetilcolinaesterasa SSSGTSSSKGI I FYVLFS ILYLI FY 065 de Torpedo marmorata/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina de prión de SSAVLFSSPPVILLISFLIFL VG 066 hámster/pép ido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional 5' -nucleotidasa SAGSHCCGSFSLIFLSVLAVIIILYQ 067 bovina/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional proteina Gp64 de SSATTIAFNAFVVFAIVLSVLLF 068 membrana de noho slime/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional antigeno especifico GSASTVVASLSLIIFSMILSLC 069 pre-espora de moho slime/péptido señal ancla GPI sin péptido enlazante opcional receptor 1 de factor TCGCCCCTGTACCTGGAGATCATCATCTAT 160 de crecimiento de TGCACAGGGGCCTTCCTCATCTCCTGCAT fibroblasto humano GGTGGGGTCGGTCATCGTCTAC receptor de factor AAGATACCATCTATTGCCACTGGGATTGT 161 de crecimiento GGGTGGCCTCCTCTTCATAGTGGTGGTGG epitelial murino CCCTTGGGATTGGCCTATTCATGCGAAGA CGT receptor 1 de THDALIVGTLSGTI FFILLI I FLSWI ILK 162 complemento humano (C3b/C4b) receptor 4 de TTCGAGCAGCACCTCCTGCTGGGCGTCAG 174 interleucina humana CGTTTCCTGCATTGTCA TCCTGGCCGTCTGCCTGTTGTGCTATGTC AGCATCACCAA-GATTAAG receptor de CGCCTTCCACTGGGGGTCACCATCTCCTG 163 interleucina 4 CCTCTGCATCCCGTTGTTTTGCCTGTTCTG murino TTACTTCAGCATTACCAAGATT cadena pesada ACCATCACCTTCCTCACCCTCTTCCTGCTG 164 inmunoglobulina a AGCCTGTTCTATAGCACAGCACTGACCGT humana/secuencia GACC transmembranal cadena pesada TGGACGTGGACCGGCCTCTGCATCTTCGC 165 inmunoglobulina e CGCACTCTTCCTGCTCAGCGTGAGCTACA humana/secuencia GCGCCGCCATCACGCTCCTCATGGTGCAG transmembranal cadena pesada GGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCAT 166 inmunoglobulina ?3 CACACTCTTCCTGTTAAGCGTGTGCTACAG humana/secuencia TGCCACCGTCACCTTCTTC transmembranal cadena pesada GGGCTGTGGACGACCATCACCATCTTCAT 175 inmunoglobulina ?4 CACACTCTTCCTGCTAAGCGTGTGCTACA humana/secuencia GTGCCACCGTCACCTTCTTC transmembranal cadena pesada de Ig GAGCTGTGGACCAGTATTTGTGTCTTCATC 167 murina tipo ACCCTGTTCCTGCTCAGTGTGAGCTATGG e/secuencia GGCCACTGTCACCGTCCTC transmembranal cadena pesada de Ig GGCCTGTGGCCCACAATGTGCACCTTCGT 176 murina tipo GGCCCTCTTCCTGCTCACACTGCTCTACA d/secuencia GTGGCTTCGTCACCTTCATCAAGGTA transmembranal cadena pesada de Ig GGGCTCTGGACAACCATCACCATCTTCAT 168 murina tipo CAGCCTCTTCCTGCTCAGCGTGTGTTACA y2A/secuencia GCGCCTCTGTCACACTCTTC transmembranal Tabla 3: Ejemplos de los cuartos ácidos nucleicos y aminoácidos que corresponden a los cuartos ácidos nucleicos . fuente secuencia SECUENCIA DE nucleotidica o de IDENTIFICACIÓN aminoácidos NUMERO: cadena pesada de ACCTGGCCATGACCCCCCTGA 070 inmunoglobulina d TCCC humana cadena pesada de AGCTGCAATGGAGGAGAGC 071 inmunoglobulina ?? TGTGCGGAG humana cadena pesada de AGCTGCAACTGGAGGAGAGC 072 inmunoglobulina ?2 TGTGCGGAGGCGC humana cadena pesada de AGGGGGAGGTGAGCGCCGAC 073 inmunoglobulina µ GAGGA humana cadena pesada de Ig AACGTCAAGAGCCACTTTCCT 074 murina tipo OÍ ATGTGCTACT cadena pesada de Ig GGCTGCAACTGGACGAGACC 075 murina tipo ?? TGTGCTGAGGCCCAGGACGG GGAGCTGG cadena pesada de Ig GGCTAGACCTGGATGATATCT 076 murina tipo ?2? GTGCTG cadena pesada de Ig AGCTGGAACTGAATGAGACCT 077 murina tipo ?3 GT cadena pesada de Ig AGGGGGAGGTGAATGCTGAG 078 murina tipo µ GAGGAAGGCTTTG acetilcolina esterasa GFTH 079 humana fosfatasa alcalina ACTT 080 humana (intestinal) fosfatasa alcalina CAPA 081 humana (hepática) fosfatasa alcalina AGTT 082 humana (placentaria ) antigeno CAMPATH-1 TSSP 083 humano antigeno ITVS 084 carciembriónico humano CD55 humano (factor SGTT 085 acelerador de extinción ) CD59 humano EQLE 086 antigeno CD90 humano KLVK 087 (Thy-1) contactina-1 humana QVK1 088 (CNTN1 ) antigeno E48 humano CCQE 089 receptor A de folato AAAM 090 humano receptor B de folato A HV 091 humano proteina pl37 anclada GSRG 092 a GPI humana antígeno-3 asociado a TCIP 093 función de linfocito humano proteina YGYS 094 interactuante de mDIA humana (DIP) 5 ' -nucleotidasa RIKF 095 humana factor activador de QYRS 096 plasminógeno de urocinasa humano antigeno LY-6C de EDLC 097 proteina de superficie de célula murina antigeno Ly-6 murino TDLC 098 ThB 5 ' -nucleotidasa RIKF 099 murina antigeno 0X45 murina DLAR 100 (BCM-1 o Blast-1) antigeno 2 de célula SSFC 101 pluripotencial murina molécula 1 de HLMF 102 adhesión celular vascular murina proteina brevican de APSS 103 rata/ancla GPI antigeno CD90 de rata KLVK 104 (Thy-1) proteina de glupicano GQKT 105 de rata antigeno MRC OX-45 de TLAR 106 rata 5 ' -nucleot idasa de RIKF 107 rata glucoproteina GP2 NGTP 108 principal de membrana de gránulo secretor pancreático de rata proteina RT6.2 de NCLY 109 superficie de linfocito T de rata proteina PHR1 de GSSS 110 reparación de ADN de levadura proteina 1 de SSKK 111 superficie anclada a glucofosfolipido de levadura/ancla GPI proteina precursora EPLS 112 amiloide porcina dipeptidasa porcina NYGY 113 proteina IL Tat 1.1 NTTG 114 de superficie variante de Trypanosoma brucei Proteina MIT 117a de NACK 115 superficie variante de Trypanosoma brucei proteina MIT 118a de EKCR 116 superficie variante de Trypanosoma brucei proteina MIT 221 de TTGS 117 superficie variante de Trypanosoma brucei proteina MITat en EKCC 118 1.1000 BC de superficie variante de Trypanosoma brucei proteina MITat 1.5b EDCR 119 de superficie variante de Trypanosoma brucei proteina repetitiva EPEP 120 de ácido prociclico de Trypanosoma brucei proteina TxTat 1 de NTTA 121 superficie variante de Trypanosoma brucei proteina YNAt 1.1 de SHLP 122 superficie variante de Trypanosoma congolense melanotransferrina de QCSG 123 pollo molécula de adhesión TVIP 124 celular neural de pollo acetilcolinaesterasa DGEL 125 de marmorata torpedo proteina de prión de DGRR 126 hámster 5 ' -nucleotidasa RIQF 127 bovina proteína Gp64 de NNVC 128 membrana de moho lodo antígeno específico STTT 129 pre-espora de moho lodo En una modalidad es el polipéptido una cadena pesada de inmunoglobulina y el dominio transmembranal es el de una cadena pesada de inmunoglobulina. Para la expresión de una inmunoglobulina, el ácido nucleico de la presente invención se introduce junto con un ácido nucleico que codifica para una cadena ligera de inmunoglobulina en una célula hospedadora eucariótica. Estos ácidos nucleicos se pueden localizar en el mismo ácido nucleico o en ácidos nucleicos diferentes. La invención abarca un vector que comprende el ácido nucleico de la invención así como una célula eucariótica que comprende el vector de la invención. La variante soluble del polipéptido heterólogo codificado por el ácido nucleico de acuerdo con la invención se puede producir al transfectar una célula eucariótica con el ácido nucleico de la invención, cultivar la célula bajo condiciones adecuadas para la expresión del polipéptido codificado por dicho ácido nucleico y recuperar el polipéptido del citoplasma de las células o el medio de cultivo. Para la elaboración de una célula eucariótica de acuerdo con la invención se proporciona un kit. El kit comprende un vector que contiene por lo menos dos sitios de clonación múltiples y un ácido nucleico empalmable que comienza con un sitio donador de empalme 5' y que termina en un sitio aceptor de empalme 3', en donde: i) el ácido nucleico comprende un codón de detención traduccional y una señal de poliadenilación, y ii) el ácido nucleico no se separa constitutivamente durante el procesamiento de pre-ARNm. En una modalidad, la célula eucariótica de la invención es una célula de mamífero. En una modalidad, la célula de mamífero es una célula que se selecciona del grupo que comprende células CHO, células NSO, células Sp2/0, células COS, células K652, células BHK, células PER.C6MR y células HEK. Los siguientes ejemplos, listado de secuencias y figuras se proporcionan para ayudar en la compresión de la presente invención, el verdadero alcance de la cual se establece en las reivindicaciones anexas. Se entiende que se pueden realizar modificaciones en los procedimientos que se establecen sin apartarse del espíritu de la invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1C: tarjeta de plásmido del vector de expresión slgG/mlgG pmlgG-A (fig. 1A) , el vector de expresión slgG/mlgG pmlgGA-A (fig., IB) y el vector de expresión de slgG plgG-A (fig. 1C) . Los elementos del vector que se muestran se describen con detalle en el texto. Figuras 2A-2B: presentación esquemática de estructuras de exón-intrón de los casetes (secuencias) de expresión de cadena ?. Figura 2A: estructura de la región constante de la cadena ?? en el vector de expresión pmlgG-A. el Fragmento de ADN de aproximadamente 7.2 kb se muestra como una linea negra. Los exones están representados por rectángulos claros con sus designaciones indicadas antes. La posición del sitio de poliadenilación para la forma secretada [p(A)s] y para la forma unida a membrana [p(A)M] de IgG se muestran con barras negras. La numeración de los intrones y 3' UTR se indican por debajo del diagrama. Se muestran las posiciones relativas del sitio de restricción Sph I en el intrón 6 y el sitio Sph I mutado en 3'UTR (entre paréntesis). Figura 2B: estructura de una región constante de cadena híbrida ?1-?3-?4 de aproximadamente 4.8 kb en el vector de expresión pmlgGA-A se muestra en la figura 2A. Adicionalmente, el diagrama indica las regiones derivadas de los tres loci de genes ? constantes de la cadena pesada de inmunoglobulina ( IGHG1 , IGHG3, e IGHG4). Figura 3: relación de secreción de IgG y señal de superficie celular en clones que expresan mlgG. Se cultivan durante 48 horas bajo condiciones definidas seis clones independientes de células Sp2/0-Agl4 transíectados con el plásmido pmlgG-A (izquierda), pmlgGA-A (en medio) o plgG-A como control (derecha) . La intensidad de fluorescencia mediana en citometria de flujo, como una medida de la cantidad de IgG unida a la membrana plasmática se representa por barras grises. La concentración de IgG secretada en los sobrenadantes de cultivo celular correspondiente se representa por rombos negros . Figura 4: gráfica de puntos (dot plot) típica de FL1/FSC utilizada para clasificación de células en un citómetro de flujo FACS Vantage (BD) . La compuerta Rl comprende 5.7% de la población de células vivas mostradas que han pasado por dot plot de FSC/SSC antes. Las células que caen dentro de Rl se recolectan durante el procedimiento de clasificación . Figuras 5A-5C: determinación de las velocidades de producción específicas. Se cultivan los clones 5B11, 9B3 y J5-H3 en matraces giratorios durante 92 horas. Figura 5A: crecimiento celular. En los puntos de tiempo indicados después del inicio de los cultivos giratorios se mide el conteo celular de cada clon con un contador de células CASY. Figura 5B: producción de IgG. En los puntos de tiempo indicados (como en la figura 5 A) , las concentraciones de IgG en los sobrenadantes de cultivo celular se determinan por cromatografía de afinidad a proteína A. Figura 5C: tasas de producción específicas. El diagrama de barras muestra la velocidad de producción específica promedio para cada clon, calculada a partir de las cuentas de células y mediciones de IgG en las primeras 69 horas (véase tabla 2 y véase el texto para detalles adicionales). Las desviaciones estándar están indicadas por barras de error. Figura 6: microscopía de inmunofluorescencia . El clon 5B11 (imágenes 1, 4) que expresa slgG secretada y mlgG unida a membrana, el clon J5-H3 (imágenes 2, 5) que expresa únicamente slgG secretada, o las células Sp2/0-Agl4 no transíectadas (imágenes 3, 6) se marcan para IgG sobre la superficie de la célula (imágenes 1-3) o para IgG intracelular (imágenes 4-6) y las imágenes se registran en un microscopio de fluorescencia Axiophot. Figuras 7A-7B: análisis de ARNm por transferencia Northern . Figura 7A: auto-radiografía de transferencia Northern hibridizada con una sonda A marcada con [a-32P] (carriles 1-3) o la sonda B (carriles 4-6) . En cada carril, 10 µg de ARN total aislado del clon 5B11 (carriles 1,4), clon J5-H3 (carriles 2, 5) o células Sp2/0-Agl4 no transfectadas (carriles 3, 6) , se separan por electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante y se transfieren a una membrana de nylon . Figura 7B: presentación esquemática de dos isoformas de ARNm que codifican para la cadena pesada de mlgG unido a membrana o slgG secretada. Los exones están representados por rectángulos. Las regiones complementarias a las sondas A y B se marcan con barras negras. Figura 8: análisis de inmunotransferencia de isoformas de cadena pesada de IgG. Los clones 5B11 (carriles 1, 4), J5-H3 (carriles 2, 5) o células Sp2/0-Agl4 no transfectadas (carriles 3, 6) se extraen de acuerdo con el método de extracción con carbonato alcalino (véase texto) . Las inmunoglobulinas de las fracciones de membrana que contienen proteínas de membrana integral (carriles 1-3) o de las fracciones SN que contienen de manera predominante el contenido soluble de las células (carriles 4-6) se purifican por análisis de extracción descendente de proteína A y se separan por electroforesis en SDS y gel de poliacrilamida . Después de colocación de puntos y marcado con anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa de rábano se visualizan las cadenas pesadas por una reacción de quimioluminiscencia . Las cadenas pesadas slgG secretadas (slgG HC) y las cadenas pesadas mlgG unidas a membrana (mlgG HC) están indicadas. El panel inferior muestra un tiempo de exposición corto para una sección de la transferencia en el panel superior. Figura 9: análisis de ARNm por transferencia Northern. La auto-radiografia de transferencias Northern hibridizada con sonda A marcada con [a-32P] (panel izquierdo) o la sonda B (panel derecho), como se muestra en la figura 7B. En cada carril 10 g de ARN total aislado de los clones 1A1, 1B6, 1C5 o 1D1 (carriles 1-4) y los clones 1D6, 2D6, K02 o K06 (carriles 6-9) se separa por electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante y se transfiere a una membrana de nylon. El clon "27" expresa únicamente slgG y se agrega para control (carriles 5, 10) . Se indican los ARNm de cadena pesada de las isoformas mlgG y slgG. Figura 10: tarjeta de plásmido del vector de expresión slgG/IgG-GPI plgG-GPI-B.

DESCRIPCION DE LAS TABLAS Tabla 1: ejemplos de segundos ácidos nucleicos. Tabla 2: ejemplo de terceros ácidos nucleicos y aminoácidos que corresponden a terceros ácidos nucleicos. Tabla 3: ejemplos de cuartos ácidos nucleicos y aminoácidos que corresponden a cuartos ácidos nucleicos. Tabla 4 : cebador oligonucleotidico para clonación y mutagénesis en la construcción del vector de expresión slgG/mlgG "pmlgG-A". Tabla 5: SPR promedio determinado para cada clon seleccionado en base en cuatro SPR distintos, calculados en varios puntos de tiempo durante la fase de crecimiento exponencial . Tabla 6: tabla 4 que muestra la distribución de clones de diferentes niveles de concentración de IgG tres semanas después de deposición en células solas en placas de 96 pozos y análisis de los sobrenadantes de cultivo celular de 515 clones clasificados por mlgG y de 550 clones control por ELISA. Tabla 7: tabla 5 que muestra la distribución de clones a diferentes niveles de concentración de IgG en la segunda selección. Tabla 8: cuenta celular de cultivos en agitación los días 0, 1, 2, 3, 4 y 7 de cada clon, determinados por contador de células CASYMR TT (Scharfe Systems) . Tabla 9: determinación de productividad de cultivos agitados 10 días, por ELISA.

DESCRIPCION DE LAS SECUENCIAS SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 001 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina d humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 002 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina ?? humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 003 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina ?2 humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 004 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina µ humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 005 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo a SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 006 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo ?? SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 007 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo ?2? SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 008 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo ?3 SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 009 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina raurina tipo µ SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 010 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina d humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 011 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina ?? humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 012 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina ?2 humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 013 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina µ humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 014 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo a SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 015 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo ?? SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 016 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo ?2? SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 017 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo ?3 SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 018 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo µ SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 019 derivado de AChE humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 020 derivado de fosfatasa alcalina intestinal humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 021 derivado de fosfatasa alcalina hepática SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 022 derivado de fosfata alcalina placentaria SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 023 derivado de antigeno CAMPATH- 1 humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 024 derivado de antigeno carcinoembriónico humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 025 derivado de CD55 humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 026 derivado de CD59 humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 027 derivado de CD90 humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 028 derivado de contactina-1 humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 029 derivado de antigeno E48 humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 030 derivado de receptor A de folato humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 031 derivado de receptor B de folato humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 032 derivado de proteina pl37 anclada por GPI humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 033 derivado de antigeno 3 asociado a la función de linfocitos humanos SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 034 derivado de proteina de interacción mDIA humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 035 derivado de 5 ' -nucleotidasa humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 036 derivado de factor activador de plasminógeno de urocinasa humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 037 derivado de antigeno LY-6C de proteina de superficie celular murino SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 038 derivado de antigeno ThB Ly-6 murino SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 039 derivado de 5 ' -nucleotidasa murina SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 040 derivado de antigeno 0X45 murino SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 041 derivado de antigeno 2 de células pluripotenciales murinas SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 042 derivado de molécula 1 de adhesión celular vascular murina SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 043 derivado de brevicana de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 044 derivado de antigeno CD90 de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 045 derivado de glupicano de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 046 derivado de antigeno MRC 0X45 de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 047 derivado de 5' -nucleotidasa de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 048 derivado de glucoproteina GP2 principal de membrana de gránulo secretor pancreático de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 049 derivado de proteina RT6.2 de superficie de linfocitos T de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 050 derivado de proteina PHR1 de reparación de ADN de levadura SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 051 derivado de proteina 1 de superficie anclada en glucofosfolipido de levadura SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 052 derivado de proteina precursora amiloide porcina SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 053 derivado de dipeptidasa porcina SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 054 derivado de proteina IL Tat 1.1 de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 055 derivado de proteina MIT 117a de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 056 derivado de proteina MIT 118a de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 057 derivado de proteina MIT 221 de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 058 derivado de proteina MITat 1.1000 BC de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 059 derivado de proteina MITat 1.5b de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 060 derivado de proteina repetitiva de ácido prociclico de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 061 derivado de proteina TxTat 1 de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 062 derivado de proteina YNat 1.1 de superficie variante de Trypanosoma congolense SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 063 derivado de melanotransferrina de pollo SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 064 derivado de molécula de adhesión celular neural de pollo SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 065 derivado de AChE de Torpedo marmorata SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 066 derivado de proteina de prión de hámster SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 067 derivado de 5' -nucleotidasa bovina SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 068 derivado de proteina Gp64 de membrana de moho de lodo SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 069 derivado de antigeno especifico de pre-espora de moho de lodo SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 070 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina d humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 071 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina ?? humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 072 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina ?2 humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 073 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina µ humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 074 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo a SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 075 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo ?? SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 076 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo ?2? SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 077 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo ?3 SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 078 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina murina tipo µ SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 079 derivado de AChE humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 080 derivado de fosfatasa alcalina intestinal humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 081 derivado de fosfatasa alcalina hepática SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 082 derivado de fosfata alcalina placentaria humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 083 derivado de antigeno CAMPATH- 1 humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 084 derivado de antigeno carcinoembriónico humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 085 derivado de CD55 humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 086 derivado de CD59 humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 087 derivado de CD90 humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 088 derivado de contactina-1 humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 089 derivado de antigeno E48 humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 090 derivado de receptor A de folato humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 091 derivado de receptor B de folato humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 092 derivado de proteina pl37 anclada por GPI humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 093 derivado de antigeno 3 asociado a la función de linfocitos humanos SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 094 derivado de proteina de interacción mDIA humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 095 derivado de 5 ' -nucleotidasa humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 096 derivado de factor activador de plasminógeno de urocinasa humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 097 derivado de antigeno LY-6C de proteina de superficie celular murina SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 098 derivado de antigeno ThB Ly-6 murino SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 099 derivado de 5 ' -nucleotidasa murina SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 100 derivado de antigeno 0X45 murino SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 101 derivado de antigeno 2 de célula pluripotencial murina SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 102 derivado de molécula 1 de adhesión celular vascular murina SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 103 derivado de brevicana de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 104 derivado de antigeno CD90 de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 105 derivado de glupicano de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 106 derivado de antigeno MRC 0X45 de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 107 derivado de 5 ' -nucleotidasa de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 108 derivado de glucoproteina GP2 principal de membrana de gránulo secretor pancreático de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 109 derivado de proteina RT6.2 de superficie de linfocitos T de rata SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 110 derivado de proteina PHR1 de reparación de ADN de levadura SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 111 derivado de proteina 1 de superficie anclada por glucofosfolipido de levadura SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 112 derivado de proteina precursora amiloide porcina SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 113 derivado de dipeptidasa porcina SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 114 derivado de proteina IL Tat 1.1 de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 115 derivado de proteina MIT 117a de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 116 derivado de proteina MIT 118a de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 117 derivado de proteina MIT 221 de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 118 derivado de proteina MITat 1.1000 BC de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 119 derivado de proteina MITat 1.5b de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 120 derivado de proteina repetitiva de ácido prociclico de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 121 derivado de proteina TxTat 1 de superficie variante de Trypanosoma brucei SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 122 derivado de proteina YNat 1.1 de superficie variante de Trypanosoma congolense SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 123 derivado de melanotransferrina de pollo SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 124 derivado de molécula de adhesión celular neural de pollo SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 125 derivado de AChE de Torpedo marmorata SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 126 derivado de proteina de prión de hámster SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO : 127 derivado de 5 ' -nucleotidasa bovina SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 128 derivado de proteina Gp64 de membrana de moho de lodo SECUENCIA DE IDENTIFICACION cuarto ácido nucleico NUMERO: 129 derivado de antigeno especifico de pre-espora de moho de lodo SECUENCIA DE IDENTIFICACION gen para ?? constante pesada NUMERO: 130 de inmunoglobulina humana (IGHG1) que incluye los exones de CH1 a CH3 con todos los intrones intermedios y la región no traducida 3' adyacente SECUENCIA DE IDENTIFICACION secuencia de aminoácidos de NUMERO: 131 la región constante de la cadena ? codificada por el plásmido plgG-A SECUENCIA DE IDENTIFICACION cebador oligonucleotidico TM-NUMERO: 132 fwl SECUENCIA DE IDENTIFICACION cebador oligonucleotidico TM-NUMERO: 133 rvl SECUENCIA DE IDENTIFICACION cebador oligonucleotidico Ml-NUMERO: 134 rv SECUENCIA DE IDENTIFICACION cebador oligonucleotidico M2-NUMERO: 135 fw SECUENCIA DE IDENTIFICACION cebador oligonucleotidico TM-NUMERO: 136 fw2 SECUENCIA DE IDENTIFICACION cebador oligonucleotidico TM-NUMERO: 137 rv2 SECUENCIA DE IDENTIFICACION cebador oligonucleotidico NUMERO: 138 mutSphl-l SECUENCIA DE IDENTIFICACION cebador oligonucleotidico NUMERO: 139 mutSphI-2 SECUENCIA DE IDENTIFICACION gen ?? constante pesado de NUMERO: 140 inmunoglobulina humana (IGHG1) que incluye los exones de CHl a M2 con todos los intrones intermedios, el sitio de poliadenilación para la forma secretada de IgGl en el intrón 6 y el 3'UTR que contiene el sitio de poliadenilación para la forma unida a membrana de IgGl SECUENCIA DE IDENTIFICACION Las secuencias de aminoácidos NUMERO: 141 de la isoforma corta (slgG) codificada por el plásmido pmlgG-A SECUENCIA DE IDENTIFICACION Las secuencias de aminoácidos NUMERO: 142 de la isoforma larga (mlgG) de la región constante de cadena ? codificada por el plásmido pmlgG-A SECUENCIA DE IDENTIFICACION Gen IGHG1 humano que incluye NUMERO: 143 los exones de CH1 a CH3 con todos los intrones intermedios y la parte 5' adyacente del intrón 6 que incluye el sitio de poliadenilación para la forma secretada de la inmunoglobulina SECUENCIA DE IDENTIFICACION Las secuencias de aminoácidos NUMERO: 144 de la isoforma corta (slgG) de la región constante de cadena ? codificada por el plásmido pmlgGA-A SECUENCIA DE IDENTIFICACION Secuencias de aminoácidos de NUMERO: 145 la isoforma larga (mlgG) de la región constante de la cadena ? codificados por el plásmido pmlgGA-A SECUENCIA DE IDENTIFICACION secuencia codificada separada NUMERO: 146 del plásmido pmlgGA-B SECUENCIA DE IDENTIFICACION Secuencia codificada NUMERO: 147 insertada para la generación del plásmido plgG-GPI-B (secuencia de aminoácidos del péptido señal carboxi terminal de fosfatasa alcalina placentaria humana (NCBI acceso: M13077; nucleótidos: 1542-1643) ) SECUENCIA DE IDENTIFICACION Secuencia de ADN de la región NUMERO: 148 constante del cásete (secuencia) de expresión de cadena ? a partir de CH1 a 3'UTR del plásmido de expresión plgG-GPI-B SECUENCIA DE IDENTIFICACION secuencia de aminoácidos de NUMERO: 149 la isoforma slgG de la región constante de cadena ? codificada por el plásmido plgG-GPI-B SECUENCIA DE IDENTIFICACION secuencia de aminoácidos de NUMERO: 150 la isoforma larga de la región constante de cadena ? que incluye el péptido señal carboxi terminal de fosfatasa alcalina placentaria humana codificada por el plásmido plgG-GPI-B SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 151 derivado del receptor 1 de factor de crecimiento de fibroblasto humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 152 derivado de receptor de factor de crecimiento epitelial murino SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 153 derivado del receptor 1 de complemento humano (C3b/C4b) SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 154 derivado del receptor de interleucina 4 murino SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 155 derivado de la cadena pesada de inmunoglobulina a humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 156 derivado de la cadena pesada de inmunoglobulina e humana (1) SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 157 derivado de la cadena pesada de inmunoglobulina ?3 humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 158 derivado de la cadena pesada Ig de murina tipo e SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 159 derivado de la cadena pesada Ig de murina tipo ?2? SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 160 derivado de receptor 1 de factor de crecimiento de fibroblasto humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 161 derivado de receptor de factor de crecimiento epitelial murino SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 162 derivado del receptor 1 de complemento humano (C3b/C4b) SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 163 derivado del receptor de interleucina 4 murino SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 164 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina a humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 165 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina e humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 166 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina ?3 humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 167 derivado de cadena pesada Ig de murina tipo e SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 168 derivado de cadena pesada Ig de murina tipo ?2? SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 169 derivado de receptor de interleucina 4 humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 170 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina e humana (2) SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 171 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina ?4 humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 172 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina d humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION segundo ácido nucleico NUMERO: 173 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina e humana (2) SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 174 derivado de receptor de interleucina 4 humano SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 175 derivado de cadena pesada de inmunoglobulina ?4 humana SECUENCIA DE IDENTIFICACION tercer ácido nucleico NUMERO: 176 derivado de cadena pesada Ig murina tipo d DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION EJEMPLOS Ejemplo 1 Clonación de fragmentos genómicos y construcción de vectores de expresión eucarióticos slgG/mlgG a) Construcción del vector de expresión slgG "plgG-A" Para la expresión de una inmunoglobulina con especificidad con contra una proteina "A" se construye el vector "plgG-A". Codifica para la forma secretada slgG de la inmunoglobulina y comprende los siguientes elementos (véase la figura 1C) : 1. Una unidad de transcripción para la cadena pesada gamma (?) 1 humana, constituida de - el mejorador temprano inmediato y promotor del citomegalovirus humano (hCMV) , - una región no traducida 5' sintética que incluye secuencia de consenso Kozak (Kozak, M., Nucleic Acids Res. 15 (1987) 8125-48), una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina murina que incluye el intrón de secuencia de señal , - un ADNc de cadena pesada variable de un anticuerpo con especificidad contra una proteina "A", un intrón 2 híbrido de cadena pesada de ratón/humano que incluye el mejorador Ig µ de ratón (región switch JH3-JH4) unida con el gen para la región constante ? 1 pesada de inmunoglobulina humana (IGHG1) que incluye los exones de CH1 a CH3 con todos los intrones intermedios y la región no traducida 3' adyacente que contiene el sitio de poliadenilación para la cadena pesada de la forma secretada de IgGl - La secuencia nucleotídica de la región constante de la cadena pesada se indica en la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 130. La secuencia de aminoácidos de la región constante de cadena ? codificada por el plásmido plgG-A se reporta en la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 131. 2. Una unidad de transcripción para una cadena ligera kappa (?) humana, constituida de: - el mej orador temprano inmediato y el promotor de citomegalovirus humano (hCMV) , - una región 5' no traducida sintética que incluye la secuencia de consenso Kozak, una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina murina que incluye el intrón de secuencia de señal , - ADNc de cadena ? variable de un anticuerpo con especificidad contra una proteina "A" - el mejorador ? de Ig 2 de intrón de ratón con el gen constante ? de inmunoglobulina humano (IGKC), y - la región no traducida 3' del gen IGKC humano que contiene el sitio de poliadenilación. 3. Una unidad de transcripción de neomicina fosfotransferasa como un marcador seleccionable para células de mamífero. 4. Un origen de replicacion para el vector pUC18 para la replicación del plásmido en E. coli. 5. Un gen para ß-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli. b) Construcción del vector de expresión slgG/mlgG "pmlgG-A" Un fragmento genómico de 5.2 kb del locus ? 1 constante pesado de inmunoglobulina humano (IGHG1) que comprende la parte principal del intrón hacia el extremo 3' del exón CH3 (intrón 6) , el exón MI, el intrón hacia el extremo 3' del exón MI (intrón 7), el exón M2 y la región no traducida 3' adyacente (3'UTR) que incluye la señal de poliadenilación para la forma unida a membrana de la cadena ?? se amplifica a partir de ADN genómico humano (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) por PCR utilizando el sistema PCR de plantilla larga expandida (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) y el cebador oligonucleotidico que se especifica en la tabla 4.

Tabla 4 : Cebador oligonucleotidico para clonación y mutagénesis . Usado para Nombre Secuencia SECUENCIA DE (en dirección IDENTIFICACION 5' a 3' ) NUMERO: Ampli ficación TM-fwl GGCCGAGTCTGAGGCCTGAGT 132 de fragmento GGCATGAGGGAGGCAGAGT IGHG1 genómico TM-rvl AACTGGATCCATGTAGAAAAGAGG 133 de 5.2 kb AGAAGCCCCGGGGGYCCATGTAGT Amplificación TM-fwl GGCCGAGTCTGAGGCCTGAGT 132 de fragmento GGCATGAGGGAGGCAGAGT IGHG3 genómico Ml-rv GATCCACTTCACCTTGAAGAAGGT 134 de 1.1 kb GACGGTGGCACTGTAGCACACGC Ampli ficación M2-fw CACCTTCTTCAAGGTGAAGTGGAT 135 de fragmento CTTCTCCTCGGTGGTGGACCTGAA IGHG4 genómico G de 1.6 kb TM-rvl AACTGGATCCATGTAGAAAAGAGG 133 AGAAGCCCCGGGGGTCCATGTAGT Amplificación TM-fw2 CTCCAGCAGCAGCTGCCCTGGGCT 136 unido IGHG3- GGGCCACGA IGHG4 TM-rv2 CAGGGATCCCCCGAGGTGCAGCTG 137 GACCAGCCTCCTCCTGACCGTGTT TT Mutación del mutSphl CTACCCCAGACCTCCGCTGCTTGG 138 sitio Sph I en -1 TGCcTGCAGGGCACTGGGGGCCAG 3' UTR GTGTCCCCTCAGCAGGACGT* mutSphl CCTGCTGAGGGGACACCTGGCCCC 139 -2 CAGTGCCCTGCAgGCACCAAGCAG CGGAGGTCTGGGGT* * Los nucleótidos alterados para la mutagénesis del sitio Sph I se indican por letras minúsculas.

El fragmento amplificado corresponde a los nucleótidos 87203513 - 87208691 de la "región contigua genómica del cromosoma 14 de Homo sapiens" (NCBI, acceso: NT_026437, complemento inverso). El secuenciado del producto PCR subclonado muestra una identidad de 98 por ciento en comparación con la secuencia del cromosoma 14 correspondiente con todas las diferencias que se encuentran en los intrones de la región no traducida 3' (3'UTR) . El sitio de restricción Sph I 219 pares de bases hacia el extremo 3' del codón de detención M2 de exon se destruye por mutagénesis dirigida a sitio basada en PCR utilizando los cebadores oligonucleotidicos especificados en la tabla 2. El fragmento después se une con la parte flanqueante 5' del intrón 6 por clonación vía un sitio de restricción Sph I dentro del vector de expresión de cadena ? 1 de inmunoglobulina plgG-A, con lo que se genera una unidad de transcripción de cadena ? 1 organizada genómicamente completa. Por subclonación del vector de expresión eucariótico "pmlgG-A" se construye de manera que codifica para la forma secretada (slgG) y la forma unida a membrana (mlgG) de un anticuerpo con especificidad contra una proteina "A". El plásmido contiene los siguientes elementos (véase también la figura 1A) : 1. La unidad de transcripción mencionada antes para una cadena pesada ? 1 humana, constituida de: - el mejorador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano (hCMV) , - una región no traducida 5' sintética que incluye secuencia de consenso Kozak, - una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina murina que incluye el intrón de secuencia de señal, - un ADNc de cadena pesada variable de un anticuerpo con especificidad contra una proteina "A", un intrón 2 híbrido de cadena pesada de ratón/humana que incluye el mejorador miu (µ) Ig de ratón de la región switch JH3-JH4 (Banerji, J. , et al., Cell 33 (1983) 729-740; Gillies, S.D., et al., Cell, 33 (1983) 717-728) unida con el gen ? 1 constante pesado de inmunoglobulina humana (IGHG1) que incluye los exones de CH1 a M2 con todos los intrones intermedios, el sitio de poliadenilación para la forma secretada de IgGl en el intrón 6 y 3'UTR que contiene el sitio de poliadenilación para la forma unida a membrana de IgGl . La organización genómica de la región constante de cadena pesada se muestra en la figura 2A, la secuencia nucleotídica se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 140. Las secuencias de aminoácidos de la isoforma corta (slgG) o de la isoforma larga (mlgG) de la región constante de cadena ? codificada por el plásmido pmlgG-A se muestra en la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 141 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACION NUMERO: 142, respectivamente. 2. Una unidad de transcripción para una cadena ligera kappa (?) humana, constituida de: el mejorador y promotor tempranos intermedios de citomegalovirus humano (hCMV) , una región no traducida 5' sintética que incluye una secuencia de consenso Kozak, una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina murina que incluye el intrón de secuencia de señal , ADNc para la cadena ? variable de un anticuerpo con especificidad contra una proteina "A" el mejorador ? de Ig intrón 2 de ratón (Emorine, L., et al., Nature 304 (1983) 447-449; Picard, D. , and Schaffner, W., Nature (1984) 307, 80-82) unido con el gen constante de inmunoglobulina ? humano (IGKC) y el gen IGKC humano 3 ' UTR que contiene el sitio de poliadenilación . 3. Una unidad de transcripción de neomicina fosfotransferasa como un marcador seleccionable para células de mamífero. 4. Un origen de replicacion del vector pUC18 para la replicacion del plásmido en E. coli. 5. Un gen para beta ( ß ) -lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli. c) Construcción de los vectores de expresión slgG/mlgG en "pmlgGA-A" y "pmlgGA-B" De una manera similar a la descrita en el ejemplo Ib), se amplifica por PCR un fragmento genómico de 1.1 kb del locus Y 3 constante pesado de inmunoglobulina humana (IGHG3) que comprende la parte principal del intrón hacia el extremo 3' del exón CH3 (intrón 6) y el exón MI (para los oligonucleótidos , véase la tabla 2) . El fragmento corresponde a los nucleótidos 87235195 - 87236300 de "secuencia contigua genómica de cromosoma 14 de Homo sapiens" (NCBI acceso: NT_026437, complemento inverso) con una identidad de secuencia de 98 por ciento. Todas las diferencias se encuentran dentro del intrón excepto para un cambio nucleotidico único dentro del exón MI que no se manifiesta, y por lo tanto no cambia la secuencia de aminoácidos codificada. De manera similar, un fragmento genómico de 1.6 kb de locus ? 4 constante pesado de inmunoglobulina humana (IGHG4) que comprende el exón M2 y la región no traducida 3 ' adyacente incluye la señal de poliadenilación para la forma unida a membrana de la cadena ? 4 se amplifica por PCR (para los oligonucleótidos véase la tabla 2). El fragmento corresponde a los nucleótidos 87087786 - 87089377 de "secuencia contigua genómica de cromosoma 14 de Homo sapiens" (NCBI acceso: NT_026437, complemento inverso) con una identidad de secuencia de 98 por ciento y todas las diferencias encontradas en 3'UTR. El sitio Sph I 212 pares de bases hacia el extremo 3' del codón de detención del exón M2 se destruye por mutagénesis dirigida a sitio basada en PCR. Ambos fragmentos se unen entre MI y M2 , se amplifican por PCR (para oligonucleótidos véase tabla 2) y después se clonan en el vector de expresión de cadena ? 1 por un sitio Sph I en el intrón 6, por lo que se genera un cásete de expresión híbrido ? 1 - ? 3 - ? 4 con una organización genómica que carece del intrón entre MI y M2 (intrón 7) . Por subclonación se construye el vector de expresión eucariótico "pmlgGA-A" que codifica para slgG secretada y la forma mlgG unida a membrana de un anticuerpo con especificidad contra una proteína "A". El plásmido contiene los siguientes elementos (véase también la figura IB) : 1. La unidad de transcripción mencionada antes para una cadena pesada híbrida ? 1 - ? 2 - ? 3 - ? 4, constituida de: el mejorador y promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (hCMV) , una región no traducida 5' sintética que incluye una secuencia de consenso Kozak, una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina murina que incluye el intrón de secuencia de señal , ADNc de cadena pesada variable de un anticuerpo con especificidad contra una proteína "A", un intrón 2 híbrido de cadena pesada de ratón/humano que incluye el mejorador µ de Ig de ratón (región switch JH3-JH4) unida con el gen IGHG1 humano que incluye los exones de CH1 a CH3 con todos los intrones intermedios y la parte 5' adyacente del intrón 6 que incluye el sitio de poliadenilación para la forma secretada de la inmunoglobulina, la parte 3 ' del intrón 6 y exón Mi del gen IGHG3 humano, y el exón M2 y la región no traducida 3' que contiene el sitio de poliadenilación para la forma unida a membrana de la inmunoglobulina del gen IGHG4 humano. La organización genómica de la región constante de cadena pesada se muestra en la figura 2B, la secuencia nucleotídica se reporta en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 143. Las secuencias de aminoácidos de la isoforma corta (slgG) o la isoforma larga (mlgG) de la región constante de cadena ? codificada por el plásmido pmlgGA-A se reporta en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 144 o la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 145, respectivamente. 2. Una unidad de transcripción para una cadena ligera kappa humana, constituida de: el mejorador y promotor tempranos inmediatos de citomegalovirus humano (hCMV) , una 5 ' UTR sintética que incluye una secuencia de consenso Kozak, una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina raurina que incluye el intrón de secuencia de señal, un ADNc para la cadena ? variable de un anticuerpo con especificidad contra una proteina "A" el mejorador ? de Ig intrón 2 de ratón unido con el gen constante de inmunoglobulina ? humano (IGKC) , y la región no traducida 3' del gen IGKC humano que contiene el sitio de poliadenilación. 3. Una unidad de transcripción de neomicina fosfotransferasa como un marcador seleccionable para células de mamífero. 4. Un origen de replicación del vector pUC18 para la replicación del plásmido en E. coli. 5. Un gen ß-lactamasa que confiere resistencia a ampicilina en E. coli. Mediante cambio de las secuencias de ADNc que codifican para las regiones variables de la cadena ? y ?, se construye el vector de expresión slgG/mlgG "pmlgGA-B" . Tiene la misma organización a la descrita para pmlgGA-A anterior pero codifica para una inmunoglobulina con especificidad contra una proteína "B" en vez.

Ejemplo 2 Transfección y análisis de células Sp2/0-Agl4 a) Cultivo y electroporación de células Sp2/0-Agl4 Células de hibridona Sp2/0-Agl4 (ATCC, número CRL-1581, Shulman, . , et al., Nature 276 (1978) 269-270) se cultivan en medio RMPI (Invitrogen Corp., Estados Unidos) suplementado con suero bovino fetal ultra bajo en IgG 10% (FCS) (Invitrogen Corp., US) y glutamina 2 mM (Invitrogen Corp., US) a 37°C, C02 5% y humedad 95%. Para transfección las células se someten a electroporacion con 10 yg de ADN plasmidico por 10 de las 6 células en amortiguador HEPES 20 mM (ácido (N- (2-hidroxietil) -piperazin-N ' -2-etansulfónico) , pH 7.0 que contiene NaCl 137 mM, KC1 5 mM, Na2HP04 0.7 mM y glucosa 6 mM a 4°C. La electroporacion se realiza a 220 V y 960 µG con un dispositivo de electroporacion Genepulser (Bio-Rad Laboratories Inc., Estados Unidos). Después de la transfección las células se distribuyen a placas de 96 pozos con 5000 células en 100 µ? de medio por pozo. Para la selección de células transfectadas se agregan 500 g/ml de G418 (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) al medio un día después de la electroporacion. El medio se cambia cada dos a tres días para mantener la presión de selección. Aproximadamente dos semanas después de la transfección los clones trasfectados se aislan de las placas de 96 pozos y se propagan adicionalmente en recipientes de cultivo apropiados. Para almacenamiento, aproximadamente 106 células de un clon se congelan en sulfóxido de dimetilo 10% ( Sigma-Aldrich Co . , Alemania) en FCS bajo IgG (Invitrogen Corp., Estados Unidos) y se almacena en nitrógeno liquido.

Las transfecciones de cada uno de 106 células con los plásmidos pmlgG-A, pmlgGA-A y plgG-A producen 15, 19 y 12 clones independientes, respectivamente. A partir de cada transfección se seleccionan aleatoriamente 6 clones para análisis adicional. b) Cuantificación de IgG y análisis por citometria de flujo Una cantidad de 105 células de cada clon del ejemplo 2a) se siembran en 2 mi de medio que contiene G418 (como se describe en lo anterior) en placas de 6 pozos y se cultivan durante 48 horas. Posteriormente los sobrenadantes se recolectan y la cantidad de IgG secretada se cuantifica por inmunoanálisis de fluorescencia resuelto en tiempo homogéneo (HTRF) utilizando el "kit de detección de Fe humano" (CIS bio international) de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Para analizar los anticuerpos unidos a membrana plasmática por citometria de flujo, 105 células de cada clon se lavan dos veces con PBS (solución salina amortiguada con fosfato) a 4°C y después se resuspende en 50 µ? de anticuerpo de ratón anti IgG humano fragmento F(ab' ) 2 conjugado a FITC (Dianova, Alemania) diluido 1:50 en PBS que contiene BSA 1% (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) y se incuba durante 1 hora a 4°C en la oscuridad. Después de lavar dos veces con PBS las células se resuspenden en PBS y se analizan con un Citómetro de flujo BD FACSCalibur (BD Biosciences, Estados Unidos). Como una medida de la cantidad de IgG unido a la superficie celular se determina la mediana de intensidad de fluorescencia para cada clon. En la figura 3 se muestran la mediana de intensidad de fluorescencia en citometria de flujo junto con la concentración de IgG en el sobrenadante de cultivo celular para cada clon. Se observa que para los clones transfectados con pmlgG-a o pmlgGA-A (es decir, los plásmidos que codifican para ambas formas, slgG y mlgG) una cantidad aumentada de IgG secretada corresponde a una señal de superficie celular elevada. Dicha relación no se observa para clones transfectados con plgG-A (es decir, el plásmido que codifica únicamente para slgG, la forma secretada del anticuerpo) .

Ejemplo 3 Clasificación de células transfectadas de manera estable por citometria de flujo Para la generación de clones que expresen de manera estable IgG se transfectan 3 x 106 células Sp2/0-Agl4 con el plásmido pmlgGA-B por electroporación como se describe en lo anterior. Un día después de la transfección las células se transfieren a 500 yg/ml de medio de selección G418 y se cultivan como acumulado durante aproximadamente dos semanas. Después la selección de IgG unida a la superficie de las células transfectadas se marcan y las células con las señales más intensas se clasifican por citometria de flujo. De esta manera, 4 x 106 células del acumulado se lavan dos veces con medio a 4°C y después se incuban con anticuerpo de ratón anti-IgG humano fragmento F(ab')2 conjugado con fluoresceina (FITC) (Dianova, Alemania), 1:50 diluido en medio, durante 20 minutos en hielo. Después de dos etapas de lavado con medio, las células se resuspenden en medio y se transfieren a un citómetro de flujo BD FACSVantage (BD Biosciences, US). Se establece una compuerta que abarca células con la parte superior 5-6% de intensidad de fluorescencia de la población de la muestra (figura 4) y las células clasificadas por esta compuerta se recolectan. Las células recolectadas se expanden por cultivo en medio de selección durante varios días. Con estas células el segundo y de manera consecutiva el tercer ciclo de clasificación se realizan como se describe en lo anterior. En vez de recolectar las células clasificadas como acumulado se utiliza una cuarta etapa de clasificación final para deposiciones de células solas en placas de 96 pozos. La deposición genera 141 clones independientes de los cuales 21 se seleccionan para análisis de expresión de IgG por inmunoanálisis HTRF como se describe en el Ejemplo 2b) . Dos clones de estos, 5B11 y 9B3, que muestran las tasas de secreción de IgG más altas y, de manera correspondiente, las señales de superficie de células más fuertes, se adaptan a crecimiento libre de suero en cultivo giratorio para determinación adicional de su productividad.

Ejemplo 4 Determinación de la productividad especifica de los clones Para la determinación de su productividad especifica, se cultivan los clones 5B11 y 9B3 bajo condiciones definidas en medio ProCHO 6k (Cambrex Corp., US), suplementado con concentrado de colesterol/lipido lx (Invitrogen Corp., US), glutamina 4 m (Invitrogen Corp., US) y 250 µ?/ml de G418 (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) en matraces giratorios de 100 mi (Belco, US.) . Las células se hacen crecer a 37°C, C02 5% y humedad 95% hasta que alcanzan una fase de crecimiento estacionaria. En varios puntos de tiempo durante la fase de crecimiento exponencial se determina el conteo celular de cada clon con un contador de células CASY (Scharfe Systems, Alemania) y se determina la concentración de IgG en los sobrenadantes por cromatografía de afinidad de proteína A (véase abajo) . Como referencia, el clon J5-H3 se cultiva y se analiza bajo condiciones iguales. Este clon también se deriva de la transfección de células Sp2/0-Agl4 y expresa de manera estable el anticuerpo idéntico que los clones 5B11 y 9B3, aunque únicamente la forma secretada. El clon J5-H3 se genera de manera convencional por varias etapas de dilución limitante y subclonación y se ha seleccionado de más de 1000 clones para satisfacer los requerimientos de productividad para un procedimiento de fabricación industrial. Las concentraciones de IgG en los sobrenadantes de cultivo celular se determinan por cromatografía de afinidad analítica utilizando una unidad de cromatografía ÁktaMR explorer (GE Healthcare, anteriormente Amersham Biosciences, Suecia) . Un volumen definido de un sobrenadante de cultivo celular se aplica a una columna de proteína A y Sepharose para facilitar la unión de IgG a la matriz de afinidad. La columna se lava con ácido cítrico 100 mM, pH 5.0 y después los anticuerpos unidos se eluyen con ácido cítrico 100 mM, pH 3.0. La elución se supervisa con registro continuo de la absorción UV del eluato a 260 nm. La concentración de anticuerpo de una muestra se calcula a partir de la absorción UV integrada después de calibración del sistema con muestras estándar que contienen concentraciones definidas de anticuerpo. Para cada clon se calculan las tasas de producción específicas (SPR) a partir de los conteos celulares y las concentraciones de IgG en los sobrenadantes de cultivo celular por medio de la siguiente ecuación: Ac(/gG) Pg c(células) ¦ At célula · día en donde "Ac(IgG)" es la diferencia de concentración de IgG en el sobrenadante entre el inicio y el final del intervalo de tiempo, en [pg/ml], "c(células)" es el promedio aritmético del conteo celular del inicio y final del intervalo de tiempo en [células/ml] , y - "At" es la duración del intervalo de tiempo en [días ] . Se determina una SPR promedio para cada clón en base en cuatro SPR distintos calculados en varios puntos de tiempo durante la fase de crecimiento exponencial (figura 5 y Tabla 5) .

Tabla 5 : Determinación de tasas de producción especif cas (SPR) . Clon Forma IgG intervalo de SPR SPR promedio ± DE expresada tiempo [h] [pg/célula · d] [pg/célula · d] 5B11 slgG, 0 - 26.2 16.9 mlgG 26.2 - 45.3 22.3 45.3 - 52.7 14.3 52.7 - 68.5 19.6 18.3 ± 3.4 9B3 slgG, 0 - 25.7 19.9 mlgG 25.7 - 45 19.3 45 - 52.4 8.5 52.4 - 68.3 ' 17.4 16.3 ± 5.3 J5- slgG 0 - 26 16.7 H3 26- 45.2 17.3 45.2 - 52.6 15.6 52.5- 68.4 23.8 18.4 ± 3.7 Ambos clones clasificados por mlgG unido a membrana, 5B11 y 9B3 muestran SPR promedio entre 15 y 20 pg/célula · d, el cual está en un intervalo que es adecuado para fabricación de clones en una escala industrial. Los SPR de estos clones son comparables con un SPR que se puede obtener con un clon que se obtienen por una estrategia convencional laboriosa en la misma linea celular y que exprese el mismo anticuerpo (clon J5-H3) .

Ejemplo 5 Detección de slgG y mlgG por microscopía de inmunofluorescencia Los anticuerpos intracelulares y unidos a superficie celular se detectan por microscopía de inmunofluorescencia . Para tinción intracelular las células unidas a portaobjetos de microscopía recubiertos con poli-L-lisina se fijan con formaldehído 2% (v/v) en PBS durante 10 minutos, se vuelven permeables con Tritón X-100 0.2% (v/v) en PBS durante 10 minutos y se lavan dos veces con PBS. Los sitios de unión no específicos se bloquean con BSA (albúmina sérica bovina) 3% (p/v) en PBS durante 30 min. Las células se lavan dos veces con amortiguador de lavado (WB: BSA 0.2% (p/v) , Tween 20 0.1% (v/v) en PBS), después se incuba con anticuerpo de chivo anti-IgG humano fragmento F(ab' ) 2 conjugado con R-ficoeritrina (Dianova, Alemania), 1:50 diluido en WB durante una hora. Después de lavado cuatro veces con WB y dos veces con H20 desionizada doblemente, las células se montan bajo el cubreobjetos y se almacenan a 4°C en la oscuridad hasta el análisis microscópico. Para tinción de los anticuerpos unidos a la superficie celular se lavan 105 células con BSA frío 1% (p/v) en PBS, y después los sitios de unión inespecificos se bloquean con BSA 1% en PBS sobre hielo, durante 30 minutos. Para el marcado de IgG, las células se incuban con anticuerpo de chivo anti IgG humano fragmento F(ab' ) 2 conjugado con R-ficoeritrina (Dianova, Alemania), 1:50 diluido en BSA 1% (p/v) en PBS, durante una hora, en hielo. Después de lavar tres veces con PBS frío las células se unen a portaobjetos de microscopio recubiertos con poli-L-lisina y se fijan con formaldehido 2% (v/v) en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar dos veces con PBS las células se montan debajo de un cubreobjetos y se almacenan a 4°C en la oscuridad hasta el análisis microscópico. Las marcas intracelulares en la superficie de las células se analizan con un microscopio de fluorescencia Axiophot utilizando un objetivo Plan-APOCHROMAT 40 x/1.0 (Cari Zeiss, Alemania). En el clon 5B11 se pueden detectar anticuerpos sobre la superficie celular (figura 6, imagen 1), la cual es principalmente la forma mlgG, asi como intracelular (imagen 4), las cuales son ambas formas de IgG sobre las vías de expresión/secreción. En contraste, en el clon J5-H3 únicamente se pueden detectar anticuerpos intracelulares (figura 6, imágenes 2 y 5), dado que estos clones no expresan mlgG. No se observó tinción con ambos métodos en la linea de células no transíectadas Sp2/0-Agl4 (figura 6, imágenes 3 y 6) dado que estas células no expresan IgG de manera alguna.

Ejemplo 6 Detección de las isoformas de ARNm de cadena ? por transferencia Northern Para definir la proporción entre las dos isoformas de cadena pesadas que surgen por empalme/poliadenilación alternativa del transcrito primario, el ARN de clones transíectados de manera estable se analiza por transferencia Northern. Por lo tanto se aisla ARN total de células utilizando tecnología RNeasy (Qiagen, Alemania) . En cada caso 10 µg de ARN total después se fraccionan por electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante y se transfieren a una membrana de nylon utilizando un sistema NorternMax (Ambion Inc., US) . Para hibridación de la membrana de transferencia se marcan dos sondas de ADN diferentes con [alfa-32P] mediante el método de cebado aleatorio utilizando el kit DECAprime II (Ambion Inc. US) . Como se muestra en la figura 7B, la sonda "A" es complementaria al ARNm de la cadena pesada entre el exón CH1 y CH3 y por lo tanto hibridiza con ambas isoformas. En contraste, la sonda "B" únicamente se une a 3 ' UTR del ARNm de la cadena pesada mlgG larga. Después de hibridación y lavado riguroso de la membrana, la transferencia se analiza por autorradiografia . La figura 7A representa una autorradiografia de una transferencia Northern con ARN total del clon 5B11, clon J5-H3 y la linea celular Sp2/0-Agl4. La hibridación con las sondas "A" muestra una señal predominante de 1.8 kb en ambos clones que expresan anticuerpo (carriles 1 y 2), lo cual corresponde al tamaño esperado de la isoforma de ARNm corta que codifica para la cadena pesada de slgG. En la exposición prolongada mostrada también algunas señales débiles entre 2 y 4 kb se detectan. La banda de 3.3 kb, la cual se observa únicamente en el clon 5B11 (carril 1), representa la isoforma de ARNm larga que codifica para la cadena pesada de mlgG dado que una banda en el mismo patrón de desplazamiento se detecta como señal única cuando la transferencia se hibridiza con la sonda "B" (carril 4). La comparación de las fuerzas de señal relativas de la banda de 1.8 kb y de 3.3 kb en el carril 1 sugiere que el transcrito primario del transgen de cadena pesada de anticuerpo es procesado de manera predominante a la isoforma de ARNm pequeña, lo que genera la forma slgG secretada del anticuerpo. Únicamente una cantidad menor (menos de 5%) se empalma por completo con la isoforma de ARNm grande con lo que se genera mlgG unido a membrana plasmática.

Ejemplo 7 Purificación y detección de las isofozrmas de cadena pesada de IgG por extracción con carbonato alcalino e inmunotransferencia Para detectar la cadena pesada de mlgG, las proteínas de membrana se extraen de células transfectadas de manera estable utilizando el método de extracción con carbonato alcalino desarrollado por Fujiki (Fujiki, Y., et al., J. Cell Biol. 93 (1982) 97-102). En cada caso se lavan dos veces 107 células con PBS y después una vez con NaCl 0.1 M en hielo. Después de resuspensión en 1 mi de Na2C03 0.1 M, pH 11.5, las células se rompen por sonicado durante 20 segundos, se incuban en hielo durante 30 minutos y después se centrifugan durante 60 minutos con 200,000 x g a 4°C. Mediante esta etapa las membranas celulares que aún contienen proteína de membrana integral se separan del contenido soluble. Los sobrenadantes se recolectan y se agrega Tritón X-100 a una concentración final de 1% (p/v) , N-octil- -D-glucopiranósido a una concentración final de 60 mM, TRIS-HC1, pH 7.4 a una concentración final de 50 mM y NaCl a una concentración final de 300 mM ("fracción SN") . De manera concordante, los sedimentos de membrana se separan en 1.1 mi de Na2C03 0.1 M, pH 11.5, Tritón X-100 1% (p/v) , N-octil- -D-glucopiranósido 60 mM, TRIS-HC1 50 mM, pH 7.4 y NaCl 300 mM. Los componentes insolubles después de esta etapa se separan por centrifugación durante 10 minutos a 15,000 x g y los sobrenadantes se recolectan como "fracción de membrana". Los análisis de disminución de proteina A se realizan para purificar las isoformas de anticuerpo a partir de la membrana o de las fracciones SN . Por lo tanto, cada fracción se incuba con 30 µ? de volumen de lecho de proteina A y sepharose (GE Healthcare, anteriormente Amersham Biosciences, Suecia) durante 60 minutos a 4°C, después se lava cuatro veces con PBS que contiene Igepal CA360 0.02% (v/v) . Las proteínas unidas a la matriz de proteína A se eluyen con amortiguador de muestra de gel de proteína reductor a 70°C y se separan por electroforesis en SDS gel de poliacrilamida (sistema NuPAGEMR, Invitrogen Corp., US) . Después de la separación las proteínas se transfieren a una membrana PVDF (fluoruro de polivinilideno) de acuerdo con el método de inmunotransferencia semiseco (Ausubel, F.A., et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Vol . 2, John Wiley y Sons, Inc., Nueva York (1995)). Las cadenas pesadas de IgG inmovilizadas en la membrana se marcan con anticuerpos de conejo anti-IgG humana policlonales acoplados a peroxidasa de rábano ( DakoCytomation, DAKO A/S, Dinamarca) y se detectan por reacción de quimioluminiscencia (LUMI-Light PLUS Western Blotting Kit, Roche Diagnostics GmbH) en un kit LUMI-Imager Fl (Roche Diagnostics GmbH) . Una señal fuerte de acuerdo con la cadena pesada de slgG se puede detectar en la membrana y la fracción SN de ambos clones que expresan anticuerpos (clones 5B11 y J5-H3, véase la figura 8, carriles 1, 2, 4 y 5) . En el caso del clón 5B11 se detecta una proteina adicional la cual se desplaza por encima de la cadena pesada slgG (figura 8, carril 1) . Esta banda se encuentra de manera predominante en la fracción membranal de este clón en la cual se enriquecen las proteínas de membrana integrales. Representa la isoforma de cadena pesada mlgG más grande la cual tiene un peso molecular calculado de 8 kDa mayor que la cadena pesada de slgG. De manera concordante no hay una señal correspondiente en el clón J5-H3 (figura 8, carril 2) y este clón únicamente expresa la forma secretada del anticuerpo.

Ejemplo 8 Cultivo y transfección de células CHO-K1. Células CH0-K1 (ATCC No. CCL-61; Puck, T.T., et al., J. Exp. Med. 108 (1958), 945-956), que se han adaptado previamente a crecimiento sin suero en cultivo de suspensión se cultivan en medio ProCH04-CDM (Cambrex Corp., US) suplementado con L-alanil-L-glutamina 8 mM (Invitrogen Corp., US) y suplemento HT lx (Invitrogen Corp., US) a 37°C, C02 5% y humedad 95% en matraces de suspensión. Cada 3-4 días se dividen las células con 2 x 105 células/ml en medio fresco. Para transíección, las células se someten a electroporación con 20 de ADN plasmídico por 7.5 x 106 células en un volumen total de 200 µ? de PBS a temperatura ambiente. Las electroporaciones se realizan con un dispositivo de electroporación Gene Pulser XCell (Bio-Rad Laboratories, US) en una cubeta con una separación de 2 mm utilizando un protocolo de onda cuadrada con un pulso único de 160 V durante 15 ms . Para la generación de clones que expresen de manera estable IgG, se someten a electroporación 6 x 107 células con el plásmido pmlgGA-B como se ha descrito. Posteriormente, las células se cultivan como acumulado en el medio especificado en lo anterior durante aproximadamente dos semanas con 700 g/ml de G418 (Roche Diagnostics GmbH, Alemania), agregado al cultivo un día después de la transfección para selección de las células transíectadas de manera estable.

Ejemplo 9 Clasificación de células CHO-K1 transfectadas de manera estable por citometría de flujo. Después de la selección de IgG unido a la superficie de las células transfectadas se marcan y las células con las señales más intensas se clasifican por citometría de flujo. Por lo tanto, 4 x 107 células del acumulado se hacen pasar primero a través de una malla se nylon de 40 µ? para eliminar agregados de células grandes y después se incuban con Accumax (PAA) durante 15 minutos a 37°C para separar agregados remanentes más pequeños. Las células se incuban en BSA 1% (p/v) en medio (véase ejemplo 8) durante 20 minutos en hielo, después se tiñen con 10 ng/ml de Proteina A Alexa Fluor 488 (Molecular Probes Inc., Invitrogen Corp., US), en un volumen total de 8 mi de medio con BSA 1% (p/v) durante 30 minutos en hielo en la oscuridad. Después de dos etapas de lavado con BSA 1% (p/v) en medio, las células se resuspenden en medio y se transfieren a un clasificador de células BD FACSAria (BD Biosciences, US) . La población de células solas vivas se divide por una gráfica de puntos (dot plot) de dispersión directa/dispersión lateral (FSC/SSC). Se define una subpoblación que abarca las células con la parte superior 5% de intensidad de fluorescencia de las células vivas divididas y aproximadamente 45,000 células de esta población se recolectan (acumulado de células clasificado mlgG) . Como control se recolectan aproximadamente 40,000 células aleatoriamente de la población de células vivas divididas por FSC/SSC sin importar su fluorescencia (acumulado de células control). Los acumulados de células recolectadas se expanden por cultivo en medio de selección (véase ejemplo 8) durante dos semanas. Después se realiza un segundo ciclo de clasificación. Las células del acumulado de células clasificado por ralgG se tiñen para IgG en la superficie celular como se describe en lo anterior. Utilizando un clasificador de células BD FACSAria (BD Bioscience, US) las células en la parte superior de 4% de intensidad de fluorescencia se clasifican de la población de células solas vivas (divididas por transferencia de puntos (dot plot) FSC/SSC) . Las células clasificadas se recolectan como células solas en placas de 96 pozos. A partir del acumulado de células control se recolectan células solas aleatoriamente a partir de una población de células vivas no teñidas divididas por FSC/SSC. Los clones de células solas se expanden por cultivo en medio de selección (véase el ejemplo 8) durante tres semanas .

Ejemplo 10 Determinación de las concentraciones de IgG por ELISA La concentración de inmunoglobulina en sobrenadantes de cultivo celular se determina por prueba de ELISA tipo emparedado (indirecta) la cual utiliza un fragmento F(ab')2 anti IgG humano biotinado, como el reactivo de captación para la detección de un fragmento de anticuerpo F(ab')2 anti IgG humana conjugado con peroxidasa. Placas de 96 pozos recubiertas con estreptavidina (Pierce Reacti-BindMR Streptavidin Coated Polystyrene Strip Plates, Código No. 15121) se recubren con 0.5 pg/ml de fragmentos de anticuerpo F(ab')2 anti IgG humano policlonal de chivo biotinado ( F ( ab ' ) 2<h- FCY>BÍ ; Dianova, Alemania, Código No. 109-066-098) de anticuerpo de captación (01 ml/pozo) en amortiguador diluyente (amortiguador diluyente: amortiguador PBS que contiene 0.5% en peso, en volumen de albúmina sérica bovina (p/v)) por incubación durante 1 hora a temperatura ambiente ( RT ) bajo agitación.

Posteriormente las placas se lavan tres veces con más de 0.3 mi de amortiguador de lavado (amortiguador de lavado: PBS que contiene Tween 20 1% (p/v) ) . Los sobrenadantes de cultivo celular (muestras) que contienen IgG se diluyen de manera seriada (dobles) hasta una concentración de 0.5-20 ng/ml en amortiguador diluyente, se agrega a los pozos y se incuba durante 1 hora a RT con agitación. El anticuerpo estándar purificado (0.5 - 20 ng/ml) en amortiguador diluyente se utiliza para la generación de una curva estándar de proteina IgG. Después del lavado de las placas tres veces con 03 ml/pozo de amortiguador de lavado, se detectan complejos unidos a anticuerpo anti-Fcy humano con un fragmento F(ab')2 conjugado a peroxidasa de anticuerpo de chivo policlonal anti IgG especifico F(ab')2 humano ( F ( ab ' ) 2<h-Fcy>POD; Dianova, Alemania, Código No. 109-036-098) . Después del lavado de las placas tres veces con 0.3 ml/pozo de amortiguador de lavado las placas se revelan con solución de sustrato de peroxidasa ABTSMR (ácido 2, 2' -azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) (Roche Diagnostics GmbH, Alemania, Código No. 1684302). Después de 10-30 minutos se mide la absorbancia a 405 nm y 490 nm contra un blanco de reactivo (amortiguador de incubación + solución ABTS) en un lector de placa Tecan Spectrafluorplus (Tecan Deutschalnd GmbH, Alemania) . Para corrección de fondo se resta la absorbancia a 490 nm de la absorbancia a 405 nm, de acuerdo con la siguiente fórmula: 405 nm , 490nm blanco blanco ) El contenido de IgG de las muestras se calcula a partir de la curva estándar.

Ejemplo 11 Cribado y selección de clones de CHO que expresan mlgG Tres semanas después de las deposiciones de células solas en placas de 96 pozos los sobrenadantes de cultivo celular de 515 clones clasificados por mlgG y de 550 clones control se analizan por ELISA (véase ejemplo 10) . La tabla 6 muestra la distribución de clones a diferentes niveles de concentración de IgG.

Tabla 6: Cribado de clones depositados en placa de 96 pozos por ELISA IgG en Clones clasificados por Clones control SN mlgG # de clones % de clones # de clones % de clones < 1 0 0 495 90.0 < 2 65 12.6 44 8.0 < 3 76 14.8 5 0.9 < 4 67 13.0 2 0.4 < 5 66 12.8 0 0 < 6 58 11.3 1 0.2 < 7 35 6.8 0 0 < 8 39 7.5 0 0 < 9 32 6.2 1 0.1 < 10 21 4.1 0 0 < 11 16 3.1 0 0 < 12 9 1.8 1 0.2 < 13 6 1.1 1 0.2 < 14 4 0.8 < 15 3 0.6 < 16 2 0.4 < 17 3 0.6 < 18 2 0.4 < 19 1 0.2 < 20 2 0.3 < 21 1 0.2 < 22 1 0.2 < 22 6 1.2 observa que en la aproximación control de todos los clones muestran una concentración de IgG de 1 µq/t l e inferior. En contraste, ningún clón clasificado por mlgG se encuentra dentro de este grupo. Además, en este enfoque, las concentraciones de IgG mayores de 22 g/ml se alcanzan por 6 clones, mientras que la concentración de IgG más alta medida en el enfoque control es de 12.3 µg/ml. Todos los clones clasificados por mlgG con más de 10 g/ml y todos los clones control con más de 3 pg/ral después se transfieren a placas de 24 pozos para un segundo cribado. Los clones se hacen crecer por cultivo en medio de selección (véase ejemplo 8) durante 20 días, y después las concentraciones de IgG en los sobrenadantes de cultivo de células se determinan por ELISA. La tabla 7 muestra la distribución de los clones para los diferentes niveles de concentración de IgG .

Tabla 7: Cribado de clones depositados en 24 pozos por ELISA Los clones control muestran niveles de expresión de hasta 16.8 µg/ml con una concentración de IgG promedio de 6.1 g/ml. En contraste, la expresión promedio de los clones clasificados por mlgG es de 31.4 g/ml con 58.3 µg/ml como la concentración de IgG observada más alta de un clón en este grupo. Los seis clones clasificados por mlgG con más de 45 g/ml y los dos clones control con más de 10 pg/ml después se transfieren a matraces de agitación de 125 mi para determinación adicional.

Ejemplo 12 Determinación de productividad de los clones CHO seleccionados Para adaptación a agitación los clones seleccionados del Ejemplo 11 se transfieren a matraces de agitación de 125 mi y se cultivan en 25 mi de medio de selección (véase ejemplo 8) durante una semana en un agitador giratorio con 150 rpm bajo condiciones estándar (véase ejemplo 8). Posteriormente, para cada clon 25 mi de medio ProCH05-CDM (Cambrex Corp., US), suplementado con L-alanil-L-glutamina 8 mM (Invitrogen Corp., US), suplemento HT lx (Invitrogen Corp., US) y 400 µg/ml de G418 (Roche Diagnostics GmbH, Alemania) se inoculan con 1 x 106 células/ml y se cultiva en matraces de agitación de 125 mi como se describe en lo anterior. Los días 0, 1, 2, 3, 4 y 7 se determina la cuenta de células de cada clon con un contador de células CASYMR TT (Schárfe Systems, Alemania) indicando un crecimiento comparable de todos los clones probados (véase Tabla 8) .

Tabla 8: Cuenta de células de cultivos en agitador.

En el día 10, los sobrenadantes de cultivo celular se recolectan y se determinan las concentraciones de IgG por ELISA (véase Tabla 9) .

Tabla 9 : Determinación de productividad de cultivos agitados durante 10 dias, por ELISA. clon IgG en SN [µ%/ta1] clones clasificados por mlgG 1A1 47.9 1B6 57.2 1C5 188.9 1D1 151.0 1D6 59.1 2D6 165.6 clones control K02 56.5 K06 34.6 observa que tres de seis clones clasificados por mlgG (es decir, clones 1A1, 1B6 y 1D6) muestran niveles de expresión en un intervalo comparable a los dos clones control. Los otros tres clones clasificados por mlgG (es decir, clones 1C5, 1D1 y 2D6) muestran una expresión de IgG notablemente elevada que es de hasta 3.3 veces mayor que la observada en los clones control.

Ejemplo 13 Análisis de transferencia Northern de los clones CHO seleccionados Los seis clones clasificados por mlgG y los dos clones control adaptados para crecer en matraces de agitación (véase ejemplo 12) se analizan por transferencia Northern para definir la proporción entre las dos isoformas de cadena pesada que surgen por empalme alternativo del transcrito primario. Para comparación, se analiza en paralelo el clon "27". Este clon se ha obtenido por transfección estable de células CH0-K1 con un vector de expresión organizado genómicamente para únicamente la forma secretada del anticuerpo idéntico. La transferencia Northern se realiza como se describe en el Ejemplo 6 con detalle y se muestra en la figura 9.

Ejemplo 14 Construcción del vector de expresión slgG/lgG-GPI "plgG-GPI-B" Para anclaje a membrana plasmática de una inmunoglobulina el dominio transmembranal nativo codificado por la parte 3' del exón Mi y la región intracelular codificada por el exón M2 se sustituyen por el péptido señal carboxi terminal de fosfatasa alcalina placentaria humana la cual media el anclaje de glucosilfosfatidilinositol (GPI) . Por lo tanto, la secuencia de ADN en el plásmido pmlgGA-B (véase ejemplo le) codificada para los siguientes 53 aminoácidos. LWTTIT1FITLFLLSVCYSATVTFFKVKWIFSSVVDLKQTIVPDYRNMIRQGA (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 146) es sustituido por la secuencia de ADN que codifica para la siguiente secuencia de aminoácidos del péptido de la señal carboxi terminal de fosfatasa alcalina placentaria humana (NCBI acceso: M13077; nucleót_idos : 1542 - 1643) AGTTDAAHPGRSVVPALLPLLAGTLLLLETATAP (SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 147) . La secuencia de ácido nucleico de la región constante del cásete de expresión de cadena ?, de CH1 a 31 UTR del plásmido de expresión plgG-GPI-B está proporcionada en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 148. La secuencia de aminoácidos correspondiente de la isoforma slgG de la región constante de cadena ? codificada por el plásmido plgG-GPI-B está proporcionada en la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 149. La secuencia de aminoácidos correspondiente de la isoforma grande de la región constante de cadena ? que incluye el péptido señal carboxi terminal de fosfatasa alcalina placentaria humana codificada por el plásmido plgG-GPI-B está proporcionada por la SECUENCIA DE IDENTIFICACIÓN NÚMERO: 150. Este plásmido permite la expresión de la forma secretada (slgG) y la forma anclada a GPI de un anticuerpo por empalme alternativo de pre-ARNm para la cadena pesada (véase la figura 10 ) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un ácido nucleico, caracterizado porque comprende, en una dirección 5' a 3': a) un primer ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterologo sin un codón de detención en marco, b) un segundo ácido nucleico que comienza con un sitio donador de empalme 5' y que termina en un sitio aceptor de empalme 3 ' que comprende un codón de detención traduccional en marco y una señal de poliadenilación, c) un tercer ácido nucleico que codifica para: i) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal , o ii) un péptido señal para un ancla GPI . 2. El ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido heterologo y un marcador se expresan a partir del mismo ácido nucleico . 3. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el primer ácido nucleico está sin un codón de detención traduccional en marco en su parte 3' terminal. . El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico se selecciona del grupo que comprende cadenas pesadas de inmunoglobulina , cadenas ligeras de inmunoglobulina , fragmentos de las mismas y fusiones de las mismas. 5. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el segundo ácido nucleico comprende únicamente un sitio donador de empalme 5' y únicamente un sitio aceptor de empalem 3'. 6. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el segundo ácido nucleico es un intrón de cadena pesada de inmunoglobulina que se presenta de manera natural, en donde se han suprimido del intrón por lo menos 50 nucleótidos consecutivos . 7. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el primer ácido nucleico codifica para una cadena pesada de inmunoglobulina que comprende todos los exones y todos excepto un intrón del gen para la cadena pesada de inmunoglobulina organizado genómicamente . 8. El ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el polipéptido es una inmunoglobulina, un polipéptido de cadena pesada de inmunoglobulina o una fusión de inmunoglobulina. 9. Una célula eucariótica, caracterizada porque comprende un ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1. 10. Una célula eucariótica de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la célula eucariótica se selecciona del grupo que consiste de células CHO, células NSO, células Sp2/0, células COS, células K562, células BHK, células PER.C6MR, y células HEK. 11. Un vector, caracterizado porque comprende, en una dirección 5' a 3': a) un primer sitio de clonación múltiple, b) un ácido nucleico que comienza con un sitio donador de empalme 5' y que termina con un sitio aceptor de empalme 3', en donde i) el ácido nucleico comprende un codón de detención y una señal de poliadenilación, y ii) el ácido nucleico no es separado constitutivamente durante el procesamiento de pre-ARNm, c) un segundo sitio de clonación múltiple. 12. Un método para seleccionar una célula eucariótica que expresa un polipéptido heterólogo, caracterizado porque comprende: a) transfectar una célula eucariótica con un ácido nucleico que comprende, en una dirección 5' a 3': i) un primer ácido nucleico que codifica para un polipéptido heterologo sin un codón de detención traduccional en marco, ii) un segundo ácido nucleico que comienza con un sitio donador de empalme y que termina en un sitio aceptor de empalme que comprende un codón de detención traduccional en marco y una señal de poliadenilación, iii) un tercer ácido nucleico que codifica para : iiia) por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal , o iiib) un péptido señal para un ancla GPI, b) cultivar la célula transfectada bajo condiciones adecuadas para la producción de pre-ARNm a partir de dicho ácido nucleico, procesamiento del pre-ARNm y traducción del ARNm procesado en un polipéptido, en donde la célula transfectada produce polipéptido heterologo soluble y polipéptido heterologo unido a membrana plasmática por empalme alternativo de pre-ARNm, y c) seleccionar una célula con polipéptido heterologo unido a membrana plasmática que es la célula que expresa un polipéptido heterologo. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el polipéptido heterologo se selecciona del grupo de polipéptidos que comprenden hormonas; citocinas; interleucinas ; inmunoglobulinas ; péptidos antifusogénicos ; factores de crecimiento; ligandos de receptor, agonistas o antagonistas; agentes citotóxicos; agentes antivirales; agentes generadores de imagen; inhibidores de enzima; activadores de enzima o moduladores de actividad de enzima tales como sustancias alostéricas; asi como fragmentos y fusiones de los mismos. 14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, caracterizado porque: i) el primer ácido nucleico codifica para por lo menos un fragmento de un dominio CH3 o CH4 de cadena pesada de inmunoglobulina, ii) el segundo ácido nucleico comienza con el sitio donador de empalme 5' de un exón de dominio CH3 o CH4 de cadena pesada de inmunoglobulina y termina por el sitio aceptor de empalme 31 del exón MI de dominio transmembranal de cadena pesada de inmunoglobulina sucesivo, iii) el tercer ácido nucleico es por lo menos un fragmento de un dominio transmembranal de inmunoglobulina. 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, caracterizado porque el segundo ácido nucleico se obtiene a partir del ácido nucleico que codifica para un polipéptido o proteina que se selecciona del grupo que consiste de receptor C3b/C4b; EGFR de humano, de pollo y de rata; FGFR; cadena pesada a, e, ?, µ e inmunoglobulina humana y de ratón; receptor PLA2 humano, Cek5 de pollo; y cadena a del receptor de factor inhibidor de leucemia de ratón. 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque únicamente un intrón del pre-ARNm producido se puede empalmar de manera alternativa . 17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, caracterizado porque la selección de una célula se realiza por el método que se selecciona de citometria de flujo, ELISA, inmunoprecipitación, cromatografía en columna de inmunoafinidad, clasificación por inmunoafinidad de esferas magnéticas, métodos de aislamiento basados en microscopía o unión inmunológica . 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 17, caracterizado porque el sitio de empalme 5' se utiliza sólo algunas veces y no de manera constitutiva, lo que resulta en una proporción molecular de polipéptido soluble respecto a polipéptido unido a membrana plasmática desde más de 50:50 a menos de 100:0. 19. Un método para la producción de un polipéptido o proteína heterólogos codificados por el ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende : a) suministrar una célula eucariótica, b) transfectar la célula eucariótica con ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, c) cultivar la célula transfectada bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico, d) recuperación del polipéptido o proteínas del medio de cultivo o el citoplasma de las células. 20. Un kit para la elaboración de una célula de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende un vector de conformidad con la reivindicación 11.