TW202342515A - 抗c3抗體及其抗原結合片段及其用於治療眼疾病之用途 - Google Patents

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史堤芬 侯雷爾
史蒂芬尼 容米歇爾
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索菲亞 賴因德爾
菲利普 羅伯特 里奇
法比恩 舍費爾
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Abstract

本發明係關於靶向補體C3的抗體及其片段。更具體而言，揭示了抗C3抗體以及用於治療各種疾病或病症的方法。

Description

抗C3抗體及其抗原結合片段及其用於治療眼疾病之用途
本發明大體上關於靶向補體C3的抗體及其片段。更具體而言，揭示了抗C3抗體及其抗原結合片段以及用於治療各種疾病或病症的方法。亦揭示了包含抗C3抗體的醫藥組合物。
年齡相關性黃斑變性(AMD)通常分為兩大類，乾性AMD及濕性AMD。乾性AMD (亦稱為非滲出性AMD)之特徵在於黃斑區域中存在隱結(黃色沈積物)。濕性AMD (亦稱為滲出性AMD或新生血管性AMD)之特徵在於自黃斑下方之脈絡膜生長異常血管。此過程亦稱為脈絡膜新生血管且新的血管可使體液(諸如血液)滲漏至視網膜中及視網膜周圍。
地圖狀萎縮(GA)亦稱為萎縮性AMD或晚期乾性AMD，係AMD的一種晚期形式，其特徵在於黃斑中之視網膜色素上皮及感光體損失。一旦GA涉及中央窩，則發生不可逆的視力損失。患有早期階段GA之患者通常甚至在視力受影響之前就會經歷視覺功能缺陷。
尚未完全知曉地圖狀萎縮之潛在病理生理學；然而，認為補體活性失調為一種促成因素。已顯示與對照物相比，GA患者之玻璃體樣品、布魯赫膜(Bruch's membrane)及脈絡膜之其他部分中之若干補體活化產物(包括C3a、C5a、C5b-9及補體因子H (CFH))之含量升高。此外，已報導在GA中，補體抑制劑(如CD59，一種攻膜複合物(MAC)形成之膜結合抑制劑)及膜輔因子蛋白質(MCP，一種對補體因子I (CFI)具有輔因子活性之膜結合補體調節劑)之含量降低。
GA治療中之一個主要挑戰為所觀測到的在較深視網膜層中發生之補體活性失調。目前，還沒有具有可接受的功效及患者接受度及依從性的針對GA的合適的治療方法。
因此，對於有效治療眼睛或眼疾病(諸如地圖狀萎縮)並恢復或預防患有此類疾病的患者的視力損失之新的及改進的治療方法仍然存在未滿足的需求。
人類先天系統由補體途徑構成。補體途徑用於抵禦化膿性細菌感染，橋接先天免疫及適應性免疫；以及處理免疫複合物及發炎損傷的產物。補體係一個由超過30種蛋白質構成的系統，參與血漿及細胞表面的級聯反應。補體系統及其補體組分參與各種免疫過程。舉例而言，補體C5b-9複合物，亦稱為末端複合物或攻膜複合物(MAC)，藉由誘導膜滲透性損傷在細胞死亡中發揮重要作用。
存在三種已知的補體活化途徑：經典途徑、凝集素途徑及替代途徑。所有三種途徑均導致C3轉化酶對C3的切割，以及隨後C5轉化酶對C5的切割，釋放出C3a、C3b、C5a及C5b。
補體C3為由13個不同域構成之大型蛋白質且分子尺寸為185千道爾頓(kilodalton)。在補體活化期間，C3經歷蛋白水解切割及不同位點處之結構修飾。C3衍生之片段發揮不同效應功能且形成轉化酶，該等轉化酶有助於三種補體途徑之放大環路。為避免疑義，且除非另有說明，否則本文所用的C3係指UniProt P01024的人類補體組分3及編碼該蛋白質的核酸序列。人類補體C3的序列描述於SEQ ID NO: 47中，且可在UniProt P01024下在線獲得。
C3b衍生自原生C3，且係切割C3形成的兩個元素中較大的一個。
經典途徑及凝集素途徑C3轉化酶C4bC2a使全長C3切割成C3b及過敏毒素(anaphylatoxin) C3a。替代途徑亦產生C3b及C3a，但利用替代途徑C3轉化酶C3bBb。此外，可在補體途徑中產生其他C3降解產物。補體因子I (CFI)為能夠將C3b永久性不活化成iC3b之血漿絲胺酸蛋白酶。接著，iC3b由CFI切割成其他片段(C3dg及C3c)。另一種C3蛋白水解產物C3d結合補體受體2 (CR2)且可在B細胞之細胞週期控制中起重要作用。除C3衍生之蛋白質產物以外，補體途徑包括(但不限於) C1、C2、C4、C4b、C4a C5、C5b、C5a、C6、C7、C8、C9、C1q、C1r、C1s、因子B、因子D、因子P、因子H、因子I、CD46 (MCP)、CD55 (DAF)、CD59 (MAC-IP)、CR1 (CD35)、CR2 (CD21)、CR3、CR4、C3aR、C5aR1、C5aR2、CRIg、C4BP α鏈、C4BP β鏈、纖維膠凝蛋白(ficolin)-1、甘露糖結合凝集素(MBL)、MBL相關絲胺酸蛋白酶-1 (MASP-1)及MBL相關絲胺酸蛋白酶-2 (MASP-2)。補體途徑及各種補體途徑組分進一步詳細描述於Noris等人, Semin Nephrol. 2013; 33(6): 479-492中。
最近的研究表明，補體組分C3及C5係AMD患者中隱結的主要成分。該等組分的存在以及攻膜複合物(MAC) C5b-9及其他急性期反應蛋白在隱結上方的RPE細胞中的存在被推測參與了可以觸發補體活化及MAC形成的過程。
已經表明，在患有GA的患者中，脈絡膜及視網膜中補體系統的增加及不受控制的活化導致脈絡膜毛細血管的破壞、RPE細胞及感光體的損傷及損失。發明人假設並說明了視網膜中C3的中和會阻斷替代補體途徑的放大環路，從而減少細胞毒性攻膜複合物的產生及促發炎補體組分(C3a、C3b、iC3b、C5a)的產生，改善GA患者的臨床結果。
然而，治療眼睛或眼疾病特別具有挑戰性，因為由於多種障壁，包括但不限於血液-視網膜障壁，諸如RPE，治療劑向眼睛的遞送受到限制。穿透RPE並進入眼睛脈絡膜的能力將增強藥物的治療潛力。
為了解決此臨床情況，發明人開發了能夠穿透RPE及眼睛脈絡膜區域的布魯赫膜的新抗體及其片段，從而靶向脈絡膜區域的補體C3。本發明的抗體及其片段顯示增強的特徵以改善患有眼睛或眼疾病的患者的臨床結果。
在一個態樣，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)， - 其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、選自由SEQ ID NO: 2及15組成之群的CDR-H2序列、SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及 - 其中該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、選自由SEQ ID NO: 5及18組成之群的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
在一個實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 20、22或24的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列；及 - 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 21、23或25的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 20、22或24的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列；及 - 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 21、23或25的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列； 其中： - 該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、選自由SEQ ID NO: 2及15組成之群的CDR-H2序列、SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及 - 該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、選自由SEQ ID NO: 5及18組成之群的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
在另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 20的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列；及 - 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 21的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列； 其中： - 該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 2的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及 - 該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
在另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 22的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列；及 - 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 23的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列； 其中： - 該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 15的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
在另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 24的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列；及 - 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 25的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列； 其中： - 該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 15的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 18的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
在一個實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO: 20、22或24的胺基酸序列的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 21、23或25的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： a. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 20及SEQ ID NO: 21的胺基酸序列； b. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 22及SEQ ID NO: 23的胺基酸序列；或 c. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 24及SEQ ID NO: 25的胺基酸序列。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：單鏈可變片段(scFv)、Fab片段、Fab'片段、Fv片段、雙功能抗體、小抗體模擬物。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段係單鏈可變片段(scFv)，其包含以下或由以下組成：由多肽連接子連接之可變重鏈及可變輕鏈。scFv自N端至C端可包含以下或由以下組成：可變輕鏈、連接子及可變重鏈。scFv自N端至C端可包含以下或由以下組成：可變重鏈、連接子及可變輕鏈。連接子可包含選自SEQ ID NO: 43-46及56-65，較佳SEQ ID NO: 46的多肽。
在一替代實施例中，抗C3抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：單域抗體，諸如sdAb、sdFv、奈米抗體、V-Nar及VHH。在此特定實施例中，該抗C3抗體或其抗原結合片段包含可變重鏈。在一個實施例中，該可變重鏈包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、選自由SEQ ID NO: 2及15組成之群的CDR-H2序列、SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列。在另一實施例中，該可變重鏈包含SEQ ID NO: 20、22或24的胺基酸序列。
在一個實施例中，該抗原結合片段係單鏈可變片段(scFv)，更佳人類化scFv。
在另一實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段係單鏈可變片段，其包含與選自由SEQ ID NO: 26、27、28、29、30及31組成之群的序列具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致性的多肽。
在另一實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段係單鏈可變片段，其包含一個選自由SEQ ID NO: 26、27、28、29、30及31組成之群的序列。
在另一實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段係單鏈可變片段，其由以下組成：一個選自由SEQ ID NO: 26、27、28、29、30及31組成之群的序列。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠抑制補體活化途徑，包括經典途徑(CP)、凝集素途徑(LP)及替代途徑(AP)。在某些實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠大致等效地抑制CP、LP及AP補體途徑的活性。例如但不限於，抗C3抗體或其抗原結合片段能夠將CP途徑的活性抑制至少80%，能夠將LP的活性抑制至少80%並且能夠將AP的活性抑制至少80%。在某些實施例中，CP、LP及AP補體途徑的活性抑制為至少80%、至少85%、至少約90%或至少約95%。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠結合補體C3及C3b。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠阻止C3轉化酶的形成。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠穿透布魯赫膜。
在一特定實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段與人類C3結合的K D＜ 50 nM，較佳K D＜ 15 nM，較佳K D＜ 10 nM，較佳K D＜ 7 nM，較佳K D＜ 1 nM，較佳K D＜ 0.5 nM，較佳K D＜ 0.2 nM，較佳K D＜ 0.15 nM，較佳K D＜ 0.10 nM，較佳K D＜ 0.05 nM，較佳K D＜ 0.04 nM，更佳K D＜ 0.03 nM。
在另一實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段與人類C3b結合的K D＜ 50 nM，較佳K D＜ 15 nM，較佳K D＜ 10 nM，較佳K D＜ 7 nM，較佳K D＜ 1 nM，較佳K D＜ 0.5 nM，較佳K D＜ 0.2 nM，較佳K D＜ 0.15 nM，較佳K D＜ 0.10 nM，更佳K D＜ 0.05 nM。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段對C3及C3b具有大致相等的結合親和力。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段對C3a、iC3b、C4、C4b、C5及/或C5b之結合親和力為約10 -4M或更低(亦即，更弱)。
在另一實施例中，相較於對C3及C3b之結合親和力，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段對C3a、iC3b、C4、C4b、C5及/或C5b之結合親和力更弱。
在一特定實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段對C3a、iC3b、C4、C4b、C5及/或C5b不具有結合親和力。如本文中所使用，「不具有結合親和力」係指在此項技術中已知的一或多種結合親和力分析法(諸如(但不限於)ELISA分析法)中，相對於背景不具有可偵測之結合親和力。
在某些實施例中，本發明的抗體能夠以阻止C3轉化酶形成的方式結合補體C3。在一特定實施例中，本發明的抗體抑制C3轉化酶的活性。在一特定實施例中，本發明的抗體能夠抑制C3轉化酶放大環路。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠抑制脈絡膜C3活性。
在某些實施例中，預期本發明的抗C3抗體由於下文所敍述的性質與其他療法相比在治療GA或其他眼睛或眼疾病方面具有更好的功效及安全性。
在一較佳實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠結合補體C3上的抗原決定基，其中此類結合阻止C3轉化酶的形成。
在一個實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其結合SEQ ID NO: 47中所示的胺基酸區域內的至少一個胺基酸殘基。在一較佳實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其結合如SEQ ID NO: 48中所示的胺基酸區域。
在一個態樣，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其結合如SEQ ID NO: 47中所示的人類補體C3的胺基酸366至胺基酸478的殘基內的至少一個胺基酸殘基。
在一個實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其結合如SEQ ID NO: 47中所示的人類補體C3的選自由殘基366、392-396、413-421、425、427、442、453及478組成之群的至少一個胺基酸殘基。
在一個實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其結合如SEQ ID NO: 47中所示的人類補體C3的胺基酸殘基366、392-396、413-421、425、427、442、453及478中的所有殘基。
在一個態樣，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其用作藥物。
在一個實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其用於治療或預防視網膜或眼睛疾病。較佳地，該視網膜或眼睛疾病係補體C3介導的疾病或病症。更佳地，該疾病係指症狀或疾病的發作、發展或持續需要C3參與的任何病症。
在另一實施例中，本發明係關於一種用於治療一或多種視網膜或眼睛疾病之方法，該方法包含根據有需要之患者投與醫藥學上有效量之抗體或抗原結合片段。
在一個態樣，本發明提供該抗C3抗體或該其抗原結合片段用於製造供治療或預防眼睛或眼疾病用之藥物的用途。
在一個態樣，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病：視網膜病變、增生性視網膜病變(PR)，諸如早產兒視網膜病變、缺血性視網膜病變；糖尿病性視網膜病變(DR)，包括增生性糖尿病性視網膜病變(PDR)及非增生性糖尿病性視網膜病變；糖尿病性黃斑水腫(DME)、糖尿病性黃斑缺血(DMI)；年齡相關之黃斑部變性(AMD)，包括乾性AMD及濕性AMD；地圖狀萎縮(GA)、色素性視網膜炎、遺傳性視網膜營養不良、近視性變性、網膜靜脈阻塞、網膜動脈阻塞、眼內炎、眼色素層炎、囊樣黃斑水腫、繼發於任何視網膜疾病的脈絡膜新生血管膜、視神經病變、青光眼、視網膜脫落、中毒性視網膜病變、放射性視網膜病變、外傷性視網膜病變、藥物誘發的視網膜血管病變、視網膜新生血管形成、息肉狀脈絡膜血管病變、視網膜血管炎、視網膜微動脈瘤、晶狀體後纖維組織增生、脈絡膜視網膜炎、福斯氏營養不良(Fuch's dystrophy)、黃斑毛細血管擴張、尤塞氏症候群(usher syndrome)、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)及斯特格病(Stargardt disease)。
在另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病：年齡相關之黃斑部變性、地圖狀萎縮、新生血管性青光眼及糖尿病性視網膜病變。在又一較佳實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其用於治療或預防地圖狀萎縮。
在一個態樣，本發明的抗體抑制補體經典途徑(CP)、凝集素途徑(LP)及替代途徑(AP)的活性。因此，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其用於藉由抑制補體經典途徑(CP)、凝集素途徑(LP)及替代途徑(AP)的活性來治療眼睛或眼疾病的方法。本發明亦提供了一種如上所述的抗原結合蛋白或其片段，其用於藉由抑制定位於脈絡膜的補體C3的活性來治療補體C3介導的疾病或病症的方法。
在一個實施例中，本發明提供一種使用根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段診斷與生物樣品中的補體C3相關的病症的方法。
在一個態樣，本發明提供一種醫藥組合物，其包含抗C3抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
在一個實施例中，本發明提供一種抗C3抗體或其抗原結合片段或一種包含抗C3抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物，其中該抗體或其抗原結合片段藉由非經腸途徑、靜脈內途徑、玻璃體內(IVT)途徑或皮下投藥途徑，較佳藉由玻璃體內途徑投與。
在一個實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含編碼根據本發明的抗體或抗原結合片段的一或多種聚核苷酸及醫藥學上可接受之載劑。
在一個實施例中，本發明提供編碼根據本發明的抗體或抗原結合片段的一或多種經分離聚核苷酸。
在一個態樣，本發明提供一或多種經分離聚核苷酸，其包含： - 編碼SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 24中所示的重鏈可變區的序列，及/或 - 編碼SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 25中所示的輕鏈可變區的序列。
在一個態樣，本發明提供一種經分離聚核苷酸，其包含編碼SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 31中所示的scFv的序列。
在一個實施例中，本發明提供一種表現載體，其包含一或多種經分離聚核苷酸，該一或多種經分離聚核苷酸包含編碼SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 24中所示的重鏈可變區的序列，及/或編碼SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 25中所示的輕鏈可變區的序列。
在一個實施例中，本發明提供一種表現載體，其包含經分離聚核苷酸，該經分離聚核苷酸包含編碼SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 31中所示的scFv的序列。
在一個實施例中，本發明提供一種病毒載體，其包含一或多種經分離聚核苷酸，該一或多種經分離聚核苷酸包含編碼SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 24中所示的重鏈可變區的序列，及/或編碼SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 25中所示的輕鏈可變區的序列。
在一個實施例中，本發明提供一種病毒載體，其包含經分離聚核苷酸，該經分離聚核苷酸包含編碼SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 31中所示的scFv的序列。
在一個實施例中，本發明提供一種宿主細胞，其包含表現載體或一或多種經分離聚核苷酸，該表現載體或一或多種經分離聚核苷酸包含編碼SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 24中所示的重鏈可變區的序列，及/或編碼SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 25中所示的輕鏈可變區的序列。
在一個實施例中，本發明提供一種宿主細胞，其包含表現載體或經分離聚核苷酸，該表現載體或經分離聚核苷酸包含編碼SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 31中所示的scFv的序列。
在一個實施例中，本發明提供一種用於產生抗C3抗體或其抗原結合片段的方法，其包含獲得包含表現載體或一或多種經分離聚核苷酸的宿主細胞，該表現載體或一或多種經分離聚核苷酸包含編碼SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 24中所示的重鏈可變區的序列，及/或編碼SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 25中所示的輕鏈可變區的序列；以及培養該宿主細胞。
在一個實施例中，本發明提供一種用於產生抗C3抗體或其抗原結合片段的方法，其包含獲得包含表現載體或經分離聚核苷酸的宿主細胞，該表現載體或經分離聚核苷酸包含編碼SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30或SEQ ID NO: 31中所示的scFv的序列。
在一個實施例中，用於產生抗C3抗體或其抗原結合片段的方法進一步包含回收及純化抗C3抗體或其抗原結合片段。
定義
抗體或免疫球蛋白之通用結構為熟習此項技術者所熟知，此等分子係通常約150,000道爾頓之由兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈構成之雜四聚醣蛋白。各輕鏈藉由一個二硫鍵共價連接至重鏈以形成雜二聚體，且雜三聚分子經由雜二聚體之兩個相同重鏈之間的共價二硫鍵形成。儘管該等輕鏈及重鏈藉由一個二硫鍵連接在一起，但兩個重鏈之間的二硫鍵數目因免疫球蛋白同型而不同。各條重鏈及輕鏈亦具有有規律地間隔之鏈內二硫橋鍵。各條重鏈在胺基末端均具有可變域(V H=可變重鏈)，隨後係三個或四個恆定域(C H1、C H2、C H3及C H4)，以及C H1及C H2之間的鉸鏈區。各條輕鏈具有兩個域，亦即胺基末端可變域(V L=可變輕鏈)及羧基末端恆定域(C L)。V L域與V H域非共價締合，然而C L域通常經由二硫鍵共價連接至C H1域。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈及重鏈可變域之間形成界面(Chothia等人, 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663)。
可變域內的某些域在不同抗體之間差異很大，亦即「高變」。此等高變域含有直接參與各特定抗體與其特異性抗原決定子之結合及特異性之殘基。輕鏈可變域與重鏈可變域中之高變性集中於三個稱為互補決定區(CDR)或高變環(HVL)之區段中。CDR藉由Kabat等人, 1991, 於: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.中的序列比較定義，而HVL根據可變域之三維結構在結構上定義，如由Chothia及Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917所描述。
給定CDR或FR的精確胺基酸序列邊界可以使用額外的命名法進一步確定，諸如Honegger A及Pluckthun A, 「Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool」, J Mol Biol, 2001年6月8日; 309(3):657-70中描述的AHo編號方案，或如Lefranc M P等人, 「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains」, Dev Comp Immunol, 2003年1月; 27(1):55-77中描述的「IMGT」編號方案。
重鏈及輕鏈中之各者內之三個CDR藉由構架區(FR)隔開，該等構架區含有往往不太可變的序列。自重鏈及輕鏈可變域的胺基末端至羧基末端，FR及CDR排列順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。FR的主要β片組態使各條鏈中的CDR彼此非常接近，亦使來自另一條鏈的CDR非常接近。產生的構形有助於抗原結合位點(參見Kabat等人, 1991, NIH出版號91-3242, 第I卷, 第647-669頁)，儘管並非所有CDR殘基均必然直接參與抗原結合。
FR殘基及Ig恆定域可能有助於抗原結合及/或介導抗體效應功能。認為一些FR殘基以至少三種方式對抗原結合產生顯著作用：非共價直接結合於抗原決定基、與一或多個CDR殘基相互作用及影響重鏈與輕鏈之間的界面。恆定域不直接參與抗原結合，但介導各種Ig效應功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)及抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。
根據恆定域的胺基酸序列，脊椎動物免疫球蛋白的輕鏈被分配至兩個明顯不同的類別之一，亦即kappa (κ)及lambda (λ)。相比之下，根據恆定域之序列將哺乳動物免疫球蛋白之重鏈分配至五個主要類別中之一者：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM。IgG及IgA進一步劃分成子類(同型)，例如分別為IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA 1及IgA 2。對應於不同類別免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。該等類別之原生免疫球蛋白的次單元結構及三維組態已為所熟知的。
術語「抗體」、「抗C3抗體」、「人類化抗C3抗體」及「變異體人類化抗C3抗體」在本文中以最廣泛的含義使用並且具體地涵蓋單株抗體(包括全長單株抗體)、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，諸如可變域及表現出所需生物活性(例如，結合C3)的抗體的其他部分。
術語「單株抗體」(mAb)係指基本上均質的抗體群體中的一種抗體；亦即，該群體中的個別抗體係相同的，除了可能存在少量的自然發生的突變。單株抗體具有高度特異性，針對單個抗原決定位，亦即「抗原決定基」。因此，修飾語「單株」指示針對相同抗原決定基的基本上均質的抗體群體，且不應解釋為需要利用任何特定方法產生抗體。應當理解，可以利用此項技術中已知的任何技術或方法製備單株抗體；包括例如雜交瘤方法(Kohler等人, 1975, Nature 256:495)，或此項技術中已知的重組DNA方法(參見例如，美國專利第4,816,567號)，或使用噬菌體抗體庫分離重組產生的單株抗體的方法，使用Clackson等人, 1991, Nature 352: 624-628及Marks等人, 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597中所述之技術。
嵌合抗體由來自一個物種(例如，非人類哺乳動物，諸如小鼠)的抗體的重鏈及輕鏈可變區以及另一物種(例如，人類)抗體的重鏈及輕鏈恆定區組成，並且可以係藉由以下方式獲得：將編碼來自第一物種(例如小鼠)的抗體可變區的DNA序列與來自第二物種(例如人類)的抗體恆定區的DNA序列連接，並用含有所連接序列的表現載體對宿主進行轉形，以使其產生嵌合抗體。替代地，嵌合抗體亦可為重鏈及/或輕鏈之一或多個區或域與單株抗體中來自另一免疫球蛋白類別或同型或來自共有或生殖系序列之對應序列一致、同源或為其變異體的抗體。嵌合抗體可以包括此類抗體的片段，其限制條件係該抗體片段表現出其親本抗體的所需生物學活性，例如結合相同的抗原決定基(參見例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855)。
術語「抗體片段」、「抗原結合片段」、「抗C3抗體片段」、「人類化抗C3抗體片段」、「變異體人類化抗C3抗體片段」係指全長抗C3抗體的一部分，其中保留了可變區或功能能力，例如特異性C3抗原決定基結合。抗體片段或抗原結合片段的實例包括但不限於Fab、Fab'、F(ab') 2、Fd、Fv、scFv及scFv-Fc片段、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體、微型抗體、由抗體片段形成的雙功能抗體、單域抗體(例如，sdAb、sdFv、奈米抗體、VHH)片段及由抗體片段形成的多特異性抗體。
全長抗體可用諸如木瓜酶或胃蛋白酶之酶處理，以產生適用抗體片段。使用木瓜酶消化以產生各自具有單一抗原結合位點之兩種相同的抗原結合抗體片段(稱為「Fab」片段)，及殘餘「Fc」片段。Fab片段亦含有輕鏈之恆定域及重鏈之C H1域。胃蛋白酶處理產生F(ab') 2片段，該片段具有兩個抗原結合位點並且仍然能夠交聯抗原。
Fab'片段與Fab片段的不同之處在於存在額外的殘基，包括來自C H1域C端抗體鉸鏈區的一或多個半胱胺酸。F(ab') 2抗體片段係成對的Fab'片段，由鉸鏈區的半胱胺酸殘基連接。抗體片段的其他化學偶聯亦係已知的。
「Fv」片段含有由緊密非共價締合之一個重鏈可變域及一個輕鏈可變域的二聚體組成之完整抗原識別及結合位點。在此組態中，各可變域之三個CDR相互作用以界定V H-V L二聚體表面上之抗原結合位點。六個CDR共同地賦予抗體以抗原結合特異性。
「單鏈Fv」或「scFv」抗體片段為包含抗體之V H域及V L域的單鏈Fv變異體，其中該等域存在於單一多肽鏈中。單鏈Fv能夠識別且結合抗原。scFv多肽亦可以視情況含有位於V H及V L域之間的多肽連接子，以便於利用scFv形成抗原結合所需的三維結構(參見例如，Pluckthun, 1994, 於: The Pharmacology of monoclonal Antibodies, 第113卷, Rosenburg及Moore編, Springer-Verlag, New York, 第269-315頁)。此類連接子包括但不限於重複的GGGGS胺基酸序列(SEQ ID NO: 43)或其變異體。此類scFv分子可以具有一般結構：NH2-VL-連接子-VH-COOH或NH2-VH-連接子-VL-COOH。scFv通常不含抗體恆定域區，儘管本發明的scFv可以連接或附接至抗體恆定域區(例如，抗體Fc域)以改變scFv的各種性質，包括但不限於延長血清或組織半衰期。scFv通常具有約25 kDa之分子量及約2.5 nm之流體動力學半徑。
在一個實施例中，本發明的抗體及抗體片段係單鏈抗體(scFv)或Fab片段。在scFv抗體的情況下，選定的VL域可以利用可撓性連接子以任一取向連接至選定的VH域。如本文所設想的，可撓性連接子係長度至少為1個胺基酸的肽或多肽連接子。較佳地，連接子為1至100個胺基酸長。更佳地，連接子為5至50個胺基酸長，更佳10至40個胺基酸長，且甚至更佳地，連接子為15至30個胺基酸長。通常使用之小連接子之非限制性實例包括甘胺酸及絲胺酸胺基酸之序列，稱為GS微型連接子。連接子序列的較佳實例係不同長度的Gly/Ser連接子，諸如(gly xser y) z連接子，包括(gly 4ser) 3(SEQ ID NO: 45)、(gly 4ser) 4(SEQ ID NO: 46)、(gly 4ser) (SEQ ID NO: 44)、(gly 3ser) (SEQ ID NO: 56)、gly 3及(gly 3ser 2) 3(SEQ ID NO: 65)。此等連接子中的胺基酸數量可以變化，例如，其可以係4 (例如，GGGS) (SEQ ID NO: 56)、6 (例如，GGSGGS) (SEQ ID NO: 57)、7 (例如，GGGSGGS) (SEQ ID NO: 58)，或其倍數，例如此四個、六個或七個胺基酸的兩個或三個或更多個重複。在一個實施例中，本發明的抗體包含選自由以下組成之群的連接子：SEQ ID NO: 43 (GGGGS)、SEQ ID NO: 44 (GGGGSGGGGS)、SEQ ID NO: 45 (GGGGSGGGGSGGGGS)及SEQ ID NO: 46 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)中所示的序列。在一特定實施例中，該連接子係SEQ ID NO: 46。該連接子亦可以係如Holliger等人 (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448中所述的變異體。可用於本發明的其他連接子由Alfthan等人 (1995), Protein Eng. 8:725-731, Choi等人. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106, Hu等人 (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov等人 (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56及Roovers等人 (2001), Cancer Immunol. Immunother. 50:51-59描述。連接子的進一步實例包括以下：7GS連接子：SGGSGGS (SEQ ID NO: 59)；8GS連接子：9GS連接子：GGGGSGGGS (SEQ ID NO: 60)；18GS連接子：GGGGSGGGGSGGGGGGGS (SEQ ID NO: 61)；25GS連接子：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 62)；30GS連接子：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 63)；及35GS連接子：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 64)。
在根據本發明之scFv中，VL及VH排列可以係VL-連接子-VH或VH-連接子-VL，前一種取向係較佳的。然而，亦考慮了單個VH或VL域抗體。在Fab片段的情況下，選定的輕鏈可變域VL融合至人類Ig κ鏈的恆定區，而合適的重鏈可變域VH融合至人類IgG的第一個(N端)恆定域CH1。在恆定域的C端或可變域或恆定域的其他位點，可以形成鏈間二硫鍵。
如本文中所使用，「VHH」、「奈米抗體」或「僅重鏈抗體」為包含衍生自包括駱駝、美洲駝、羊駝之駱駝科(Camelidae family)物種之單一重鏈可變域之抗原結合蛋白。VHH之分子量通常為約15 kDa。
其他識別之抗體片段包括包含一對串聯Fd區段(V H-C H1-V H-C H1)以形成一對抗原結合區之彼等抗體片段。此等「線性抗體」可為雙特異性的或單特異性的，如例如Zapata等人. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062中所描述的。
人類化抗體或人類化抗體片段為特定類型之嵌合抗體，其包括免疫球蛋白胺基酸序列變異體或其片段，其能夠結合於預定抗原且其包含一或多個實質上具有人類免疫球蛋白之胺基酸序列的FR及一或多個實質上具有非人類免疫球蛋白之胺基酸序列的CDR。通常稱為「導入」序列之此非人類胺基酸序列通常獲自「導入」抗體域，尤其可變域。一般而言，人類化抗體至少包括插入人類重鏈或輕鏈可變域之FR之間的非人類抗體之CDR或HVL。
本發明描述了特定的人類化抗C3抗體，其含有源自鼠、兔、美洲駝或嵌合抗體的CDR，插入在人類生殖系序列重鏈及輕鏈可變域的FR之間。應當理解，某些非人類FR殘基(例如來自鼠、兔、美洲駝或嵌合抗體等)可能對人類化抗體的功能很重要，且因此某些人類生殖系序列重鏈及輕鏈可變域殘基被修飾為與相應的非人類序列的殘基相同。
如本文所用，表述「本發明的抗體」及「本發明的抗C3抗體」係指本文所描述的針對C3的抗體或其抗原結合片段。在一個實施例中，本發明的該抗體係scFv。在一具體實施例中，本發明的抗體包含可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、選自由SEQ ID NO: 2及15組成之群的CDR-H2序列、SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及其中該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、選自由SEQ ID NO: 5及18組成之群的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
在一個實施例中，本發明係關於一種人類化抗C3抗體或其片段。人類化抗體基本上包含至少一個，且通常兩個可變域(諸如含在Fab、Fab'、F(ab') 2、Fabc及Fv片段中)，其中所有或基本上所有CDR對應於非人類免疫球蛋白之彼等，並且在本文中具體而言，CDR係兔來源的，並且FR係人類免疫球蛋白共有序列或生殖系序列之彼等。在另一態樣，人類化抗C3抗體亦包括免疫球蛋白Fc區的至少一部分，通常係人類免疫球蛋白的Fc區。通常，抗體將含有輕鏈以及至少重鏈之可變域兩者。適當時，抗體亦可包括重鏈之C H1、鉸鏈、C H2、C H3及/或C H4區中之一或多者。
人類化抗C3抗體可以選自任何類別的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE，以及任何同型，包括IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA 1及IgA 2。舉例而言，恆定域可以係補體固定恆定域，其中期望人類化抗體表現出細胞毒活性，並且同型通常係IgG 1。當不期望此類細胞毒活性時，恆定域可以係另一同型，例如IgG 2，或者係缺乏細胞毒活性的修飾的IgG1序列，例如含有突變N297A或L234A及L235A。替代的人類化抗C3抗體可以包含來自超過一種免疫球蛋白類別或同型的序列，並且選擇特定的恆定域以最佳化所需的效應功能在此項技術中的一般技術範圍內。在具體實施例中，本發明提供作為IgG1抗體，且更特定言之作為特徵在於減小的效應功能之IgG1抗體之抗體。
人類化抗C3抗體或其片段(包括scFv)的FR及CDR或HVL不需要與親本序列精確對應。舉例而言，導入CDR或HVL或共有或生殖系FR序列中的一或多個殘基可能會藉由取代、插入或缺失而改變(例如，誘變)，使得所得胺基酸殘基不再與親本序列中相應位置的原始殘基相同，但抗體仍保留結合C3的功能。此類改變通常不會係廣泛的並且將係保守的改變。通常，至少75%的人類化抗體殘基將對應於親本共有或生殖系FR及導入CDR序列之彼等，更常見的係至少90%，最常見的係大於95%，或大於98%或大於99%。
術語「共有序列」及「共同抗體」係指在任何特定類別、同型或次單元結構之所有免疫球蛋白中之各位置，例如人類免疫球蛋白可變域處包含最通常出現之胺基酸殘基的胺基酸序列。共有序列可基於特定物種或許多物種之免疫球蛋白。應瞭解，「共有」序列、結構或抗體涵蓋如某些實施例中所描述之共有人類序列，且係指在任何特定類別、同型或次單元結構之所有人類免疫球蛋白中之各位置包含最通常出現之胺基酸殘基的胺基酸序列。因此，共有序列含有在各位置具有存在於一或多個已知免疫球蛋白中之胺基酸的胺基酸序列，但其不可精確重複任何單一免疫球蛋白之整個胺基酸序列。可變區共有序列不獲自任何天然產生之抗體或免疫球蛋白。Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.及其變異體。重鏈及輕鏈共有序列及其變異體的FR為製備人類化抗C3抗體提供了有用的序列。參見例如，美國專利第6,037,454號及第6,054,297號。
人類生殖系序列天然存在於人群中。人類生殖系序列對應於由可變(V)、多樣性(D)及連接(J)基因區段編碼的抗體蛋白分子，其被重新排列，且形成重組基因。VDJ重組導致產生大量但最終數目有限的未突變抗體蛋白，稱為生殖系庫。彼等生殖系基因之組合產生抗體多樣性。抗體之輕鏈的生殖系抗體序列來自保守人類生殖系κ或λ v基因及j基因。類似地，重鏈序列來自生殖系v基因、d基因及j基因(LeFranc, M-P及LeFranc, G, 「The Immunoglobulin Facts Book」 Academic Press, 2001)。
「經分離」抗體為已自其天然環境之組分識別出且分離及/或回收之抗體。抗體天然環境的污染物成分係彼等可能干擾抗體診斷或治療用途的物質，且可以係酶、激素或其他蛋白質或非蛋白質溶質。在一個態樣，抗體將被純化至按抗體重量計至少大於95%的分離。
術語「抗體效能」係指有助於抗原之抗體識別之因素/性質或抗體之活體內效用。在一較佳實施例中，抗體效能係指抗體阻止視網膜細胞之細胞骨架塌陷之能力。抗體之胺基酸序列的變化可影響諸如摺疊之抗體性質，且可影響物理因素，諸如抗體結合於抗原之初始速率(k a)、抗體自抗原之解離常數(k d)、抗體對於抗原之親和力常數(Kd)、抗體之構形、蛋白質穩定性及抗體之半衰期。如本文中所使用，術語「親和力」係指抗體之抗原結合位點與其所結合之抗原決定基之間的相互作用之強度。如熟習此項技術者易於理解，抗體或抗原結合蛋白親和力可報導為解離常數(K D)，以莫耳濃度(M)為單位。抗原結合域結合特定抗原決定位的能力可以經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)或熟習此項技術者熟悉的其他技術，例如表面電漿子共振(SPR)技術(在BIAcore儀器上分析)，例如在25℃下進行(Liljeblad等人, Glyco J 17, 323-329 (2000))，以及傳統的結合分析(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))。
如本文所使用，術語「一致」或「一致性百分比」在兩個或更多個核酸或多肽序列之情形下係指針對最大對應性比較及比對時相同的兩個或更多個序列或子序列或具有指定百分比之相同的核苷酸或胺基酸殘基。為確定一致性百分比，出於最佳比較目的而比對序列(例如，可在第一胺基酸序列或核酸序列中引入間隙以與第二胺基酸或核酸序列最佳比對)。隨後比較相對應胺基酸位置或核苷酸位置處之胺基酸殘基或核苷酸。若第一序列中之位置被與第二序列中之相應位置相同的胺基酸殘基或核苷酸佔據，則分子在該位置處一致。兩個序列之間的一致性百分比係序列共有的相同位置數的函數(亦即，一致性%=相同位置數/位置總數(例如，重疊位置)×100)。在一些實施例中，被比較的兩個序列具有相同的長度，視情況適當時在序列內引入空位之後(例如，排除延伸超出被比較的序列的額外序列)。舉例而言，當比較可變區序列時，不考慮前導及/或恆定域序列。對於兩個序列之間的序列比較，「對應」CDR係指兩個序列中相同位置中之CDR (例如，各序列之CDR-H1)。
可使用數學演算法實現測定兩個序列之間的一致性百分比或類似性百分比。用於比較兩個序列之數學演算法之較佳非限制性實例為Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268之演算法，如Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877中修改。此類算法被納入Altschul等人, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410的NBLAST及XBLAST程式中。可以用NBLAST程式進行BLAST核苷酸搜尋，評分=100，字長=12，以獲得與編碼感興趣的蛋白質的核酸同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程式進行BLAST蛋白檢索，評分=50，字長=3，以獲得與感興趣的蛋白質同源的胺基酸序列。為了獲得用於比較目的的空位比對，可以如Altschul等人, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402中所描述使用空位BLAST。或者，PSI-Blast可用於執行迭代檢索，以偵測分子之間的遠距離關係(Id.)。當使用BLAST、空位BLAST及PSI-Blast程式時，可以使用相應程式(例如XBLAST及NBLAST)的預設參數。用於比較序列的數學演算法的另一較佳非限制性實例係Myers及Miller, CABIOS (1989)的演算法。此類算法被納入ALIGN程式(2.0版)中，該程式係GCG序列比對套裝軟體的一部分。當使用ALIGN程式比較胺基酸序列時，可以使用PAM120權重殘基表，空位長度罰分12，及空位罰分4。用於序列分析的其他演算法在此項技術中係已知的並且包括如Torellis及Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5中描述的ADVANCE及ADAM；及Pearson及Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8中描述的FASTA。在FASTA中，ktup係一個控制選項，用於設置檢索的靈敏度及速度。若ktup=2，則藉由查看對齊的殘基對找到被比較的兩個序列中的相似區域；若ktup=1，則檢查單個對齊的胺基酸。對於蛋白質序列，ktup可以設置為2或1，或對於DNA序列，可以設置為1到6。若ktup未規定，則對於蛋白質預設值為2，且對於DNA為6。替代地，可使用CLUSTAL W演算法進行蛋白質序列比對，如Higgins等人, 1996, Methods Enzymol. 266:383-402所描述。
如本文所用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用，並且所有此類名稱包括其後代。因此，「轉形體」及「轉形細胞」包括主要個體細胞及來源於其之培養物，而與轉移數目無關。
出於治療之目的，術語「哺乳動物」係指歸類為哺乳動物之任何動物，包括人類、家畜與農畜及動物園、競技或寵物動物，諸如狗、馬、貓、奶牛及其類似動物。哺乳動物較佳為人類。
如本文所用，「疾病」或「病症」係將受益於用本文所描述之人類化抗C3抗體治療的任何病況。此病況包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易患所討論之病症之彼等病理病況。
術語「玻璃體內注射」具有此項技術中的通常含義，且係指將抗C3抗體或其抗原結合片段引入患者的玻璃體中。
術語「皮下投與」係指藉由相對緩慢的持續遞送將抗C3抗體或其抗原結合片段自藥物容器引入至動物或人類患者之皮膚下，較佳皮膚與下層組織之間的凹穴內。捏起或拉起皮膚且遠離下層組織可產生凹穴。
術語「皮下輸注」係指藉由相對緩慢的持續遞送將藥物自藥物容器引入至動物或人類患者之皮膚下，較佳皮膚與下層組織之間的凹穴內，保持一段時間，包括(但不限於) 30分鐘或更短、或90分鐘或更短。視情況，輸注可藉由植入於動物或人類患者之皮膚下的藥物遞送泵之皮下植入來進行，其中泵遞送預定量之藥物，保持預定時段，諸如30分鐘、90分鐘或橫跨治療方案長度之時段。
術語「皮下推注」係指在動物或人類患者之皮膚下投與，其中推注藥物遞送短於大約15分鐘；在另一態樣，短於5分鐘，且在又一態樣，短於60秒。甚至在又一態樣，投與係在皮膚與下層組織之間的凹穴內進行的，其中可以藉由捏起或拉起皮膚且遠離下層組織來產生凹穴。
術語「治療有效量」用於指減輕或改善所治療病症的一或多種症狀的抗C3抗體或其抗原結合片段的量。在如此做的過程中，正係此量具有有益患者結果。功效可視待治療之病況而定以習知方式量測。舉例而言，在以表現C3的細胞為特徵的眼睛或眼疾病中，可以藉由確定反應率(例如視力恢復)或藉由評估延遲直至疾病進展的時間來量測功效。
如本文中所用，術語「治療」及「療法」及其類似術語意謂包括疾病或病症之治療性以及防治性或抑制措施，從而產生任何臨床上需要或有益的作用，包括(但不限於)緩解或減輕一或多種症狀、消退、減緩或停止疾病或病症之進展。因此，例如，術語治療包括在疾病或病症的症狀發作之前或之後投與抗C3抗體或其抗原結合片段，從而預防或消除疾病或病症的一或多種徵象。作為另一實例，該術語包括在疾病的臨床表現之後投與抗C3抗體或其抗原結合片段以對抗疾病的症狀。此外，在發病後及出現臨床症狀後投與抗C3抗體或其抗原結合片段(其中投與影響疾病或病症的臨床參數)，無論治療是否導致疾病的改善，均構成如本文所用的「治療」或「療法」。此外，只要與在不使用抗C3抗體組合物或其抗原結合片段的情況下的症狀相比，本發明的組合物單獨或與另一種治療劑組合減輕或改善所治療病症的至少一種症狀，結果應該被認為係對潛在病症的有效治療，而不管疾病的所有症狀是否均得到緩解。
術語「藥品說明書」用以指治療產品之商業包裝中通常包括之說明書，其含有關於適應症、用法、投藥、禁忌及/或關於使用此類治療產品之警告的資訊。
本發明之抗體
在一個實施例中，本發明係關於抗C3抗體或其抗原結合片段。在一特定實施例中，本發明提供人類化抗C3抗體或其抗原結合片段。在另一實施例中，本發明提供人類化單株抗C3抗體或其抗原結合片段。
在最初的表徵中，生成了靶向C3的抗體庫，特別係靶向C3的scFv。發明人已將此等scFv人類化並最佳化，如 實例 4所示。發明人還進一步對具有不同改變的CDR及FR進行工程改造，以提高親和力並最佳化人類抗體中罕見的胺基酸。經由多樣化及徹底的最佳化步驟，發明人開發了非常有前景的治療分子，特別係針對C3的人類化scFv，其具有本文揭示之增強性質。
本發明抗體的CDR序列示於下表1中。表1描述了根據Kabat命名法的CDR。
表 1 ：
名稱 胺基酸序列 SEQ ID NO:
CDR-H1 NYAMN 1
CDR-H2 VISYDGSNKYYADSVKG 2
CDR-H2 IINVGGGTNYADSVKG 15
CDR-H3 AVGYHHARLDP 3
CDR-L1 TLSSAHKTYTID 4
CDR-L2 LKSDGSYTKGS 5
CDR-L2 LKSEGSYTKGS 18
CDR-L3 GTEGVGGYV 6
在一個實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)， - 其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、選自由SEQ ID NO: 2及15組成之群的CDR-H2序列、SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及 - 其中該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、選自由SEQ ID NO: 5及18組成之群的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
在一特定實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含：可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)，其中該VH包含：SEQ ID NO: 1或與SEQ ID NO: 1的胺基酸序列至少80%、至少90%或至少95%一致的胺基酸序列的CDR-H1序列, SEQ ID NO: 2或15或與SEQ ID NO: 2或15的胺基酸序列至少80%、至少90%或至少95%一致的胺基酸序列的CDR-H2序列，及/或SEQ ID NO: 3或與SEQ ID NO: 3的胺基酸序列至少80%或至少90%一致的胺基酸序列的CDR-H3序列；及/或其中該VL包含：SEQ ID NO: 4或與SEQ ID NO: 4的胺基酸序列至少80%、至少90%或至少95%一致的胺基酸序列的CDR-L1序列, SEQ ID NO: 5或18或與SEQ ID NO: 5或18的胺基酸序列至少80%、至少90%或至少95%一致的胺基酸序列的CDR-L2序列，及/或SEQ ID NO: 6或與SEQ ID NO: 6的胺基酸序列至少80%或至少85%一致的胺基酸序列的CDR-L3序列。
在一特定實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段 - 其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 2的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列，或 - 其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 15的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列， - 其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 15的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 18的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列，或 - 其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 2的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 18的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
在另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 20、22或24的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列；及/或 - 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 21、23或25的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列。
在又另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 20、22或24的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列；及 - 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 21、23或25的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列； 其中： - 該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、選自由SEQ ID NO: 2及15組成之群的CDR-H2序列、SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及 - 該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、選自由SEQ ID NO: 5及18組成之群的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
在另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 20的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列；及 - 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 21的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列； 其中： - 該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 2的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
在另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 22的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列；及 - 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 23的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列； 其中： - 該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 15的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
在另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： - 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 24的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列；及 - 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 25的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列； 其中： - 該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 15的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 18的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
在一個實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含：包含SEQ ID NO: 20、22或24的胺基酸序列的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO: 21、23或25的胺基酸序列的輕鏈可變區。
在另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： a. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 20及SEQ ID NO: 21的胺基酸序列； b. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 22及SEQ ID NO: 23的胺基酸序列；或 c. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 24及SEQ ID NO: 25的胺基酸序列。
在又另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： a. 可變重鏈，其包含以下，較佳由以下組成：SEQ ID NO: 20的胺基酸序列；及可變輕鏈，其包含以下，較佳由以下組成：SEQ ID NO: 21的胺基酸序列，該抗體稱為「 殖株 I」， b. 可變重鏈，其包含以下，較佳由以下組成：SEQ ID NO: 22的胺基酸序列；及可變輕鏈，其包含以下，較佳由以下組成：SEQ ID NO: 23的胺基酸序列，該抗體稱為「 殖株 II」； c. 可變重鏈，其包含以下，較佳由以下組成：SEQ ID NO: 24的胺基酸序列；及可變輕鏈，其包含以下，較佳由以下組成：SEQ ID NO: 25的胺基酸序列，該抗體稱為「 殖株 III」。
下表描述了根據不同的眾所周知的命名法的根據本發明的抗體的CDR，諸如根據Kabat；根據CCG(Chemical Computing Group，如Almagro等人, Proteins 2011; 79:3050-3066及Maier等人, Proteins 2014; 82:1599-1610中所說明)；根據Chothia；及/或根據Aho。
表2進一步總結了根據本發明的抗體的CDR的胺基酸序列。
表 2 ：
殖株 名稱 胺基酸序列 命名法 SEQ ID NO:
殖株I CDR-H1 NYAMN Kabat 1
CDR-H2 VISYDGSNKYYADSVKG Kabat 2
CDR-H3 AVGYHHARLDP Kabat 3
CDR-L1 TLSSAHKTYTID Kabat 4
CDR-L2 LKSDGSYTKGS Kabat 5
CDR-L3 GTEGVGGYV Kabat 6
CDR-H1 GFTFSNYAMN CCG 7
CDR-H2 VISYDGSNKYYADSVKG CCG 2
CDR-H3 AVGYHHARLDP CCG 3
CDR-L1 TLSSAHKTYTID CCG 4
CDR-L2 LKSDGSYTKGS CCG 5
CDR-L3 GTEGVGGYV CCG 6
CDR-H1 GFTFSNY Chothia 8
CDR-H2 SYDGSN Chothia 9
CDR-H3 AVGYHHARLDP Chothia 3
CDR-L1 TLSSAHKTYTID Chothia 4
CDR-L2 LKSDGSYTKGS Chothia 5
CDR-L3 GTEGVGGYV Chothia 6
CDR-H1 GFTFSNYA Aho 10
CDR-H2 ISYDGSNK Aho 11
CDR-H3 ARAVGYHHARLDP Aho 12
CDR-L1 SAHKTYT Aho 13
CDR-L2 LKSDGSY Aho 14
CDR-L3 GTEGVGGYV Aho 6
殖株II    CDR-H1 NYAMN Kabat 1
CDR-H2 IINVGGGTNYADSVKG Kabat 15
CDR-H3 AVGYHHARLDP Kabat 3
CDR-L1 TLSSAHKTYTID Kabat 4
CDR-L2 LKSDGSYTKGS Kabat 5
CDR-L3 GTEGVGGYV Kabat 6
CDR-H1 GFTFSNYAMN CCG 7
CDR-H2 IINVGGGTNYADSVKG CCG 15
CDR-H3 AVGYHHARLDP CCG 3
CDR-L1 TLSSAHKTYTID CCG 4
CDR-L2 LKSDGSYTKGS CCG 5
CDR-L3 GTEGVGGYV CCG 6
CDR-H1 GFTFSNY Chothia 8
CDR-H2 NVGGG Chothia 16
CDR-H3 AVGYHHARLDP Chothia 3
CDR-L1 TLSSAHKTYTID Chothia 4
CDR-L2 LKSDGSYTKGS Chothia 5
CDR-L3 GTEGVGGYV Chothia 6
CDR-H1 GFTFSNYA Aho 10
CDR-H2 INVGGGT Aho 17
CDR-H3 ARAVGYHHARLDP Aho 12
CDR-L1 SAHKTYT Aho 13
CDR-L2 LKSDGSY Aho 14
CDR-L3 GTEGVGGYV Aho 6
殖株III    CDR-H1 NYAMN Kabat 1
CDR-H2 IINVGGGTNYADSVKG Kabat 15
CDR-H3 AVGYHHARLDP Kabat 3
CDR-L1 TLSSAHKTYTID Kabat 4
CDR-L2 LKSEGSYTKGS Kabat 18
CDR-L3 GTEGVGGYV Kabat 6
CDR-H1 GFTFSNYAMN CCG 7
CDR-H2 IINVGGGTNYADSVKG CCG 15
CDR-H3 AVGYHHARLDP CCG 3
CDR-L1 TLSSAHKTYTID CCG 4
CDR-L2 LKSEGSYTKGS CCG 18
CDR-L3 GTEGVGGYV CCG 6
CDR-H1 GFTFSNY Chothia 8
CDR-H2 NVGGG Chothia 16
CDR-H3 AVGYHHARLDP Chothia 3
CDR-L1 TLSSAHKTYTID Chothia 4
CDR-L2 LKSEGSYTKGS Chothia 18
CDR-L3 GTEGVGGYV Chothia 6
CDR-H1 GFTFSNYA Aho 10
CDR-H2 INVGGGT Aho 17
CDR-H3 ARAVGYHHARLDP Aho 12
CDR-L1 SAHKTYT Aho 13
CDR-L2 LKSEGSY Aho 19
CDR-L3 GTEGVGGYV Aho 6
因此，在一具體態樣，本發明係關於抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)， - 其中該VH包含選自由SEQ ID NO: 1、7、8及10組成之群的CDR-H1、選自由SEQ ID NO: 2、9、11、15、16及17組成之群的CDR-H2序列、選自由SEQ ID NO: 3及12組成之群的CDR-H3序列；及 - 其中該VL包含選自由SEQ ID NO: 4及13組成之群的CDR-L1序列、選自由SEQ ID NO: 5、14、18及19組成之群的CDR-L2序列、及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
在一特定態樣，本發明係關於抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)， - 其中該VH包含SEQ ID NO: 7的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 2的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列，或 - 其中該VH包含SEQ ID NO: 8的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 9的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列，或 - 其中該VH包含SEQ ID NO: 10的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 11的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 12的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 13的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 14的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列，或 - 其中該VH包含SEQ ID NO: 7的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 15的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列，或 - 其中該VH包含SEQ ID NO: 8的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 16的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列，或 - 其中該VH包含SEQ ID NO: 10的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 17的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 12的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 13的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 14的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列，或 - 其中該VH包含SEQ ID NO: 7的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 15的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 18的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列，或 - 其中該VH包含SEQ ID NO: 8的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 16的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 18的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列，或 - 其中該VH包含SEQ ID NO: 10的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 17的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 12的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 13的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 19的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
根據本發明的例示性可變重鏈及可變輕鏈的序列描述於表3中。
表 3 ：
名稱 序列 SEQ ID No
VH - 殖株I QVQLVESGGGSVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHARLDPWGCGTSVTVSS 20
VL - 殖株I QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKCPRYLMQLKSDGSYTKGSGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTEGVGGYVFGGGTKLTVLG 21
VH - 殖株II QVQLVESGGGSVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVAIINVGGGTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHARLDPWGCGTSVTVSS 22
VL - 殖株II QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKCPRYLMQLKSDGSYTKGSGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTEGVGGYVFGGGTKLTVLG 23
VH - 殖株III QVQLVESGGGSVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVAIINVGGGTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHARLDPWGCGTSVTVSS 24
VL - 殖株III QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKCPRYLMQLKSEGSYTKGSGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTEGVGGYVFGGGTKLTVLG 25
本發明的例示性scFv的序列描述於表4中。
表 4
名稱 序列 SEQ ID No
殖株I QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKCPRYLMQLKSDGSYTKGSGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTEGVGGYVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGSVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHARLDPWGCGTSVTVSS 26
殖株I MQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKCPRYLMQLKSDGSYTKGSGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTEGVGGYVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGSVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHARLDPWGCGTSVTVSS 27
殖株II QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKCPRYLMQLKSDGSYTKGSGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTEGVGGYVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGSVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVAIINVGGGTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHARLDPWGCGTSVTVSS 28
殖株II MQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKCPRYLMQLKSDGSYTKGSGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTEGVGGYVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGSVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVAIINVGGGTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHARLDPWGCGTSVTVSS 29
殖株III QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKCPRYLMQLKSEGSYTKGSGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTEGVGGYVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGSVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVAIINVGGGTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHARLDPWGCGTSVTVSS 30
殖株III MQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKCPRYLMQLKSEGSYTKGSGIPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTEGVGGYVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGSVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVAIINVGGGTNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHARLDPWGCGTSVTVSS 31
在一個實施例中，本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：單鏈可變片段(scFv)、Fab片段、Fab'片段、Fv片段、雙功能抗體、小抗體模擬物。在一替代實施例中，抗C3抗體或其抗原結合片段係選自由以下組成之群：單域抗體，諸如sdAb、sdFv、奈米抗體、V-Nar及VHH。在此特定實施例中，該抗C3抗體或其抗原結合片段包含可變重鏈。在另一實施例中，該可變重鏈包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、選自由SEQ ID NO: 2及15組成之群的CDR-H2序列、SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列。在一具體實施例中，該可變重鏈包含SEQ ID NO: 20、22或24的胺基酸序列。
在一個實施例中，本發明的抗體係單鏈片段，其包含連接子，較佳包含SEQ ID NO: 46 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS)中所示的連接子。
在一個實施例中，本發明的抗體係單鏈片段，其包含一個選自由SEQ ID NO: 26、27、28、29、30及31組成之群的序列。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠抑制補體活化途徑，包括經典途徑(CP)、凝集素途徑(LP)及替代途徑(AP)。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠結合補體C3及C3b。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠阻止C3轉化酶的形成。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠穿透布魯赫膜。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段對C3及C3b具有大致相等的結合親和力。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段對C3a、iC3b、C4、C4b、C5及/或C5b之結合親和力為約10 -4M或更低(亦即，更弱)。
在一個實施例中，相較於對C3及C3b之結合親和力，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段對C3a、iC3b、C4、C4b、C5及/或C5b之結合親和力更弱。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段對C3a、iC3b、C4、C4b、C5及/或C5b不具有結合親和力。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠抑制C3轉化酶放大環路。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠抑制脈絡膜C3活性。
本發明之抗C3抗體或根據本發明之其抗原結合片段以高親和力與人類C3結合。在與此態樣相關之一實施例中，本發明之抗C3抗體與人類C3結合的K D＜ 50 nM，較佳K D＜ 15 nM，較佳K D＜ 10 nM，較佳K D＜ 7 nM，較佳K D＜ 1 nM，較佳K D＜ 0.5 nM，較佳K D＜ 0.2 nM，較佳K D＜ 0.15 nM，較佳K D＜ 0.10 nM，較佳K D＜ 0.05 nM，較佳K D＜ 0.04 nM，更佳K D＜ 0.03 nM，例如，以藉由SPR所測定。在一個實施例中，本發明之抗C3抗體與人類C3結合的K D包含在0.16至0.023 nM之間，如 實例 8中所例示。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段與人類C3b結合的K D＜ 50 nM，較佳K D＜ 15 nM，較佳K D＜ 10 nM，較佳K D＜ 7 nM，較佳K D＜ 1 nM，較佳K D＜ 0.5 nM，較佳K D＜ 0.2 nM，較佳K D＜ 0.15 nM，較佳K D＜ 0.10 nM，更佳K D＜ 0.05 nM，例如，以藉由SPR所測定。在另一實施例中，本發明之抗C3抗體與人類C3結合的K D包含在0.15 nM至0.05 nM之間，如 實例 8中所例示。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段對C3及C3b具有約10 -8M至約10 -14M的結合親和力。在某些實施例中，根據本發明的抗體對C3及C3b具有約10 -10M至約10 -12M的結合親和力。在某些實施例中，本發明的抗C3抗體對C3及C3b具有至少(強於)約10 -8M、至少(強於)約10 -9M、至少(強於)約10 -10M、至少(強於)約10 -11M或至少(強於)約10 -12M的結合親和力。在一個實施例中，根據本發明的抗體對C3及C3b具有大致相等的結合親和力。舉例而言，但絕不限制，根據本發明的抗體可以對C3具有約10 -10M的結合親和力及對C3b具有約10 -10M的結合親和力。在一特定實施例中，根據本發明的抗體對C3具有約10 -11M的結合親和力及對C3b具有約10 -11M的結合親和力。在另一實施例中，根據本發明的抗體對C3具有約10 -12M的結合親和力及對C3b具有約10 -12M的結合親和力。
在一個替代實施例中，對C3的結合親和力在對C3b的結合親和力的10倍以內。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段顯示出與食蟹獼猴C3的交叉反應性。發明人已在 實例 8中顯示本發明的抗體亦結合食蟹獼猴C3。食蟹獼猴( Macaca fascicularis) C3與人類C3有95.1%的一致性，且交叉反應性允許在相關動物模型中對本發明的抗C3抗體進行臨床前及毒理學測試。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段對C3疾病相關單核苷酸多型性(SNP)具有結合親和力，更確切地說係C3 SNP P314L及C3 SNP R102G。發明人亦在 實例 8中表明，本發明的抗體結合人類C3的疾病相關SNP，確保本發明的抗體可以治療範圍廣泛的患有眼睛或眼疾病的患者。
根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的高結合親和力有助於延長玻璃體內注射後C3的中和時間並進一步允許降低的注射頻率。更高的結合親和力進一步允許投與更低的劑量，從而限制潛在的副作用。有利的結合親和力及降低的注射頻率顯著改善了有需要之患者的治療功效。
由於其高結合親和力、其有利的半衰期及其高度濃縮的能力，本發明的抗C3抗體允許增加給藥之間的間隔時間。其亦為患者提供了寶貴的益處，尤其係改善了藥物的遵從性及依從性。
根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段可以具有長於1個月的治療有效持續時間，此與其他治療劑相比可以係更長的持續時間。增加的治療有效持續時間可能係由於本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的莫耳濃度，其可高達7 mM。
與其他治療劑相比，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段可以更容易地注射至眼中。在一個實施例中，本發明的抗C3抗體不含PEG，從而降低了其黏度，如 實例 13所說明。因此，本發明的抗C3抗體的黏度預計會低於其他治療劑的黏度。由於背壓降低，黏度降低的溶液(諸如小於或等於20厘泊(cP)的溶液)更容易注射至眼睛中。
發明人已經表明根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段呈現出優異的醫藥學特徵，如改進的穩定性所說明的。發明人確實在 實例 11中表明，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段顯示出改進的熱穩定性。此等結果說明本發明的抗體在生理溫度下保持其原生及活性構形。值得注意的是，較高的熱轉變中點( T m)反映了蛋白質在較低溫度下穩定性的提高。發明人因此已經表明，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段顯示改善的熱穩定性質，有助於改善治療功效，同時允許減少對患者的注射劑量及頻率。此外， T m表示延長的架儲期及改善的治療產品的時間穩定性。
在另一態樣，如 實例 4 及 12所述，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段被證明具有低免疫原性風險。此等結果證實本發明的抗體對於治療眼睛或眼疾病係高度合適及有前途的，因為其顯示出低免疫原性風險及/或產生抗藥物抗體(ADA)的低風險。
補體系統係先天免疫系統的重要組成部分，參與許多發炎及自體免疫性疾病的組織損傷。補體系統包括超過30種細胞相關蛋白及循環蛋白(例如，C1、C1q、C1r、C1s、C2、C3、C3a、C3b、C4、因子B、因子D、因子H、因子I)。
存在活化補體的三種主要途徑，亦即經典途徑(CP)、凝集素途徑(LP)及替代途徑(AP)。
三種補體途徑由不同的因素啟動，各因素均會導致補體組分C3的切割。
經典途徑通常由抗原與正確同型或亞類的特異性抗體相互作用觸發；免疫球蛋白M (IgM)、IgG3及IgG1係經典途徑最有效的活化因子。此會誘導C1複合物的構形變化，使其能夠切割C4及C2以生成C4bC2b複合物。C4bC2b作為經典途徑的C3轉化酶。
凝集素補體途徑由C型凝集素、甘露聚糖結合凝集素(MBL；亦稱為甘露糖結合凝集素)或稱為纖維膠凝蛋白(ficolin) (L-纖維膠凝蛋白、H-纖維膠凝蛋白及M-纖維膠凝蛋白)的相關系列的蛋白質與見於微生物表面上的醣蛋白或包膜多醣上表現的末端糖的結合觸發。
替代途徑由循環C3的緩慢水解引發，此暴露了內部硫酯基團，此種現象稱為『C3逐漸停滯(C3 tickover)』。替代途徑特異性蛋白質因子B、因子D及備解素(properdin)與水解的C3或與補體切割片段C3b的結合導致C3的進一步活化。呈C3b形式的經切割C3接著可以與微生物或內毒素(細菌脂多醣)表面的多醣或蛋白質相互作用，以啟動替代途徑活化並產生MAC，如在經典途徑活化期間發生的那樣。
在某些實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段根據其抑制一或多種補體途徑，亦即經典途徑、替代途徑及凝集素途徑的能力進行選擇。在某些實施例中，根據其抑制所有三種補體途徑，亦即經典途徑、替代途徑及凝集素途徑的能力來選擇本發明的抗C3抗體。在某些實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠抑制眼睛中的所有三種補體途徑。
通常，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段在抑制經典途徑、替代途徑及凝集素途徑中的功能效力可以藉由補體抑制分析或溶血分析來確定，如 實例 7中所述。效力可以用IC50(半數最大抑制濃度)表示。因此，在一個實施例中，根據本發明的抗體或其片段 -抑制經典途徑(CP)，效力在70及80 nM之間，以藉由補體抑制分析法所量測 -抑制凝集素途徑(LP)，效力在340及360 nM之間，以藉由補體抑制分析法所量測，及 -抑制替代途徑(AP)，效力在60至70 nM之間，以藉由補體抑制分析法所量測。
根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段抑制所有三種補體途徑的能力進一步提高了其在治療眼睛或眼疾病中的治療潛力。在一個實施例中，本發明的抗體抑制所有三種補體途徑的能力進一步提高了其在治療眼睛或眼疾病，特別係AMD或GA中的治療潛力。不希望受理論的束縛，抑制所有三種補體途徑可以藉由防止一種活性途徑的疾病促進作用補償其他不活化途徑來提高本發明的抗C3抗體的治療潛力。
因此，在一特定實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠抑制眼睛脈絡膜區域中的所有三種補體途徑。脈絡膜區域為在眼睛背部排列之含有血管之層且位於視網膜與鞏膜之間。脈絡膜區域分為四個層，亦即哈勒氏層(Haller's layer)、薩特勒氏層(Sattler's layer)、脈絡膜毛細管層及布魯赫膜。布魯赫膜，亦稱為玻璃體層，為脈絡膜之最內層且與視網膜色素上皮(RPE)相鄰。在某些實施例中，本發明的抗C3抗體能夠滲透或擴散穿過布魯赫膜並進入脈絡膜的其他層，諸如但不限於脈絡膜毛細血管層。
視網膜有大量的物理障壁，可能會阻止大分子(諸如全長免疫球蛋白)滲透至更深層，此可能會導致治療效果降低(Jackson等人 Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;44(5): 2141-6)。相比之下，較小的抗體衍生物可更深地滲透至視網膜中。具有約60 kDa或更低之分子量之例示性抗體衍生物為抗體片段，包括(但不限於)Fab、Fab'片段、scFab、scFv、Fv片段、奈米抗體、VHH、dAb、V-Nar、sdAb、sdFv以及雙特異性及二價抗體，諸如單鏈雙功能抗體(scDb)，或DART。在某些實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段具有約60 kDa或更低的分子量，例如約55 kDa、約50 kDa、約45 kDa、約40 kDa、約35 kDa、約30 kDa、約25 kDa、約20 kDa、約15 kDa或更低。
在一個實施例中，scFv格式能夠實現3個月的投與頻率。與需要更頻繁投與的治療眼睛或眼疾病的現有治療方法相比，此代表了顯著的改進。因此，本發明的scFv顯著提高了患者的依從性。
發明人已在 實例 10中表明，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段(殖株I)顯示出較高的擴散穿過布魯赫膜的能力，特別係與如實例2中所述的比較化合物A2及比較化合物A3相比時。因此，在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段能夠部分地由於其低至足以促進滲透的大小而穿透或擴散穿過布魯赫膜。在某些實施例中，本發明抗體的大小藉由分子量量測。在某些實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段具有小於約60 kDa的分子量。在某些實施例中，本發明的抗C3抗體為約20 kDa至約30 kDa或約10 kDa至約20 kDa。在某些實施例中，本發明的抗C3抗體為約25 kDa。在某些實施例中，本發明的抗C3抗體約為15 kDa。在某些實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的大小藉由其流體動力學半徑量測。在某些實施例中，本發明的抗C3抗體具有小於或等於約3.0 nm的流體動力學半徑。在某些實施例中，本發明的抗C3抗體具有小於或等於約2.5 nm的流體動力學半徑。在某些實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段具有小於或等於約2.0 nm的流體動力學半徑。
人類化及胺基酸序列變異體
可以基於在SEQ ID NO: 1至6、15及18中描述的序列下鑑定的一組CDR來工程改造其他變異體抗C3抗體及抗體片段。應當理解，在一些實施例中，在抗C3抗體及抗體片段的該變異體中，CDR的胺基酸序列保持不變，但可以對周圍區域(例如FR區域)進行工程改造。抗C3抗體或其片段的胺基酸序列變異體可以藉由向抗C3抗體DNA中引入適當的核苷酸改變，或藉由肽合成來製備。此類變異體包括例如本文實例的抗C3抗體或其片段的胺基酸序列內的殘基的缺失及/或插入及/或取代。進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為該最終構築體擁有所需特徵。胺基酸變化亦可以改變人類化或變異體抗C3抗體或其抗原結合片段的轉譯後過程，例如改變醣基化位點的數目或位置。
抗體之另一類型胺基酸變異體涉及改變抗體之原始醣基化模式。在此上下文中，術語「改變」意謂缺失一或多個見於抗體中之碳水化合物部分，及/或添加一或多個先前不存在於抗體中之醣基化位點。
在一些態樣，本發明包括編碼本文所描述之抗C3抗體或其抗原結合片段的胺基酸序列變異體的核酸分子。編碼抗C3抗體或其片段的胺基酸序列變異體的核酸分子藉由此項技術中已知的多種方法製備。此等方法包括但不限於自天然來源分離(在天然存在的胺基酸序列變異體的情況下)或藉由寡核苷酸介導的(或定點)誘變、PCR誘變及卡匣式誘變先前製備的抗C3抗體或其抗原結合片段的變異體或非變異體形式進行製備。
在某些實施例中，本發明的抗C3抗體係抗體片段。存在已開發用於產生抗體片段之技術。片段可經由完整抗體之蛋白分解消化衍生(參見例如Morimoto等人, 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117；及Brennan等人, 1985, Science 229:81)。替代地，片段可在重組宿主細胞中直接產生。舉例而言，Fab'-SH片段可直接自大腸桿菌(E. coli)中回收並化學偶聯形成F(ab') 2片段(參見例如，Carter等人, 1992, Bio/Technology 10:163-167)。藉由另一種方法，可以自重組宿主細胞培養物中直接分離F(ab') 2片段。用於產生抗體片段的其他技術對於熟習此項技術者而言為顯而易見的。
抗C3抗體及其抗原結合片段可以包括修飾。本文中所提供之抗體之變異體可由在構架及/或CDR中引入缺失、取代、添加及/或修飾而產生。接著，可使用本文中所描述之方法測試抗體變異體之所需功能。可對抗原結合蛋白或其片段進行缺失、取代、添加、修飾及插入之任何組合，其限制條件為所產生之變異體具有可使用適當方法篩檢之所需特徵。
如本文中所使用，「保守性取代」係指保持親本抗體之功能性質之修飾。舉例而言，保守性胺基酸取代包括其中胺基酸殘基由具有類似性質之胺基酸殘基置換之取代。舉例而言，將丙胺酸(A)取代為纈胺酸(V)；用離胺酸(K)取代精胺酸(R)；用麩醯胺酸(Q)取代天冬醯胺酸(N)；用麩胺酸(E)取代天冬胺酸(D)；用絲胺酸(S)取代半胱胺酸(C)；用天冬胺酸(D)取代麩胺酸(E)；用丙胺酸(A)取代甘胺酸(G)；用精胺酸(R)或離胺酸(K)取代組胺酸(H)；用白胺酸(L)取代異白胺酸(I)；用白胺酸(L)取代甲硫胺酸(M)；用酪胺酸(Y)取代苯丙胺酸(F)；用蘇胺酸(T)取代絲胺酸(S)；用酪胺酸(Y)取代色胺酸(W)；用色胺酸(W)取代苯丙胺酸(F)；及/或用白胺酸(L)取代纈胺酸(V)，反之亦然。
在某些實施例中，可能需要使用抗C3抗體片段而不係完整抗體。可能需要修飾抗體片段以增加其血清半衰期。此可例如藉由將救助受體結合抗原決定基併入抗體片段中來達成。在一種方法中，抗體片段之適當區域可經改變(例如，經突變)，或可將抗原決定基併入至肽標籤中，該肽標籤接著例如藉由DNA或肽合成在任一末端或在中間融合至抗體片段。參見例如，WO 96/32478。
在其他實施例中，本發明包括抗C3抗體或抗原結合片段的共價修飾。共價修飾包括半胱胺醯基殘基、組胺醯基殘基、離胺醯基及胺基端殘基、精胺醯基殘基、酪胺醯基殘基、羧基側基(天冬胺醯基或麩胺醯基)、麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基、或絲胺醯基、或蘇胺醯基殘基之修飾。另一類型之共價修飾涉及以化學方式或以酶方式將醣苷偶合至抗體。若適用，此類修飾可藉由化學合成或藉由抗體或其片段的酶或化學切割來進行。藉由使抗體或其片段的目標胺基酸殘基與能夠與選定的側鏈或胺基末端或羧基末端殘基反應的有機衍生劑反應，可以將抗體的其他類型的共價修飾引入分子中。
抗體或其片段上存在的任何碳水化合物部分的去除可以化學方式或以酶方式完成。化學去醣基化由Hakimuddin等人, 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52及Edge等人, 1981, Anal. Biochem., 118:131描述。可以藉由使用如Thotakura等人, 1987, Meth. Enzymol 138:350所描述的多種內切及外切醣苷酶達成抗體上碳水化合物部分的酶切割。
另一種類型的有用的共價修飾包含以美國專利第4,640,835號、美國專利第4,496,689號、美國專利第4,301,144號、美國專利第4,670,417號、美國專利第4,791,192號及美國專利第4,179,337號中之一或多者中所述的方式將抗體連接至多種非蛋白質聚合物中之一種，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧伸烷基。
本文所描述之抗體或其抗原結合片段的變異體，諸如包含與本文揭示之序列具有一定一致性百分比水平的序列的變異體，較佳保留上述抗體或其抗原結合片段的功能能力，例如，特異性C3抗原決定基結合，能夠抑制補體活化途徑，包括經典途徑(CP)、凝集素途徑(LP)及替代途徑(AP)，能夠結合補體C3及C3b，能夠阻止C3轉化酶的形成及/或能夠穿透布魯赫膜。
抗原決定基結合
在一個態樣，本發明提供識別特定「C3抗原決定基」的抗體或其抗原結合片段。如本文所用，術語「C3抗原決定基」係指能夠結合抗C3抗體或其抗原結合片段的分子(例如，肽)或分子片段。此等術語進一步包括，例如，被本發明的任何抗體或抗原結合片段識別的C3抗原決定位。
C3抗原的抗原決定基可以包括在蛋白質、蛋白質片段、肽或其類似物中。抗原決定基最常見的係蛋白質、短寡肽、寡肽模擬物(亦即模擬C3抗原的抗體結合性質的有機化合物)或其組合。
在抗原決定基結合的上下文中，片語「在胺基酸區X-Y內結合…」係指根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段結合序列中指定胺基酸區內的至少一個胺基酸殘基。
本發明的抗體或抗原結合片段結合如SEQ ID NO: 47中所示的人類補體C3的抗原決定基。在一個實施例中，本發明的抗體結合如SEQ ID NO: 48中所示的人類補體C3c的鏈D的抗原決定基。SEQ ID NO: 48可以參考PDB: 2A74_D在線獲得。
本發明的抗體或抗原結合片段結合如SEQ ID NO: 47中所示的人類補體C3的抗原決定基。在另一實施例中，本發明的抗體結合如SEQ ID NO: 48中所示的人類補體C3c的鏈D的抗原決定基。SEQ ID NO: 48可以參考PDB: 2A74_D在線獲得。
已經發現根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段結合人類補體C3的獨特抗原決定基。在一個實施例中，本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段結合如SEQ ID NO: 47中所示的人類補體C3的胺基酸366至胺基酸478的殘基內的至少一個胺基酸殘基。
在一個實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其結合如SEQ ID NO: 47中所示的人類補體C3的選自由殘基366、392-396、413-421、425、427、442、453及478組成之群的至少一個胺基酸殘基。
在一個實施例中，本發明提供了抗C3抗體或其抗原結合片段，其結合如SEQ ID NO: 47中所示的人類補體C3的殘基366、392-396、413-421、425、427、442、453及478中的所有殘基。在一個實施例中，本發明係關於抗C3抗體或其抗原結合片段，其結合如SEQ ID NO: 48中所示的人類補體C3c的鏈D的胺基酸344至胺基酸456的殘基內的至少一個胺基酸殘基。
在一個實施例中，本發明係關於抗C3抗體或其抗原結合片段，其結合如SEQ ID NO: 48中所示的人類補體C3c的鏈D的選自由殘基344、370-374、391-399、403、405、420、431及456組成之群的至少一個殘基。
在一個實施例中，本發明的抗體或其抗原結合片段結合如SEQ ID NO: 48中所示的人類補體C3c的鏈D的殘基344、370-374、391-399、403、405、420、431及456中的所有殘基。
在一個實施例中，本發明係關於抗C3抗體或其抗原結合片段，其結合如SEQ ID NO: 48中所示的人類補體C3c的D鏈的胺基酸369至胺基酸418的殘基內的至少一個胺基酸殘基。
在另一實施例中，本發明係關於抗C3抗體或其抗原結合片段，其結合如SEQ ID NO: 48中所示的人類補體C3c的鏈D的選自由殘基369至379、389、391至401、403及418組成之群的至少一個殘基。
在另一實施例中，本發明的抗體結合如SEQ ID NO: 48所示的人類補體C3c的鏈D的殘基369至379、389、391至401、403及418中的所有殘基。
下表5描述了序列SEQ ID NO: 47及48。
表 5 ：
名稱 序列 SEQ ID NO:
人類C3 MGPTSGPSLLLLLLTHLPLALGSPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANREFKSEKGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLQSGYLFIQTDKTIYTPGSTVLYRIFTVNHKLLPVGRTVMVNIENPEGIPVKQDSLSSQNQLGVLPLSWDIPELVNMGQWKIRAYYENSPQQVFSTEFEVKEYVLPSFEVIVEPTEKFYYIYNEKGLEVTITARFLYGKKVEGTAFVIFGIQDGEQRISLPESLKRIPIEDGSGEVVLSRKVLLDGVQNPRAEDLVGKSLYVSATVILHSGSDMVQAERSGIPIVTSPYQIHFTKTPKYFKPGMPFDLMVFVTNPDGSPAYRVPVAVQGEDTVQSLTQGDGVAKLSINTHPSQKPLSITVRTKKQELSEAEQATRTMQALPYSTVGNSNNYLHLSVLRTELRPGETLNVNFLLRMDRAHEAKIRYYTYLIMNKGRLLKAGRQVREPGQDLVVLPLSITTDFIPSFRLVAYYTLIGASGQREVVADSVWVDVKDSCVGSLVVKSGQSEDRQPVPGQQMTLKIEGDHGARVVLVAVDKGVFVLNKKNKLTQSKIWDVVEKADIGCTPGSGKDYAGVFSDAGLTFTSSSGQQTAQRAELQCPQPAARRRRSVQLTEKRMDKVGKYPKELRKCCEDGMRENPMRFSCQRRTRFISLGEACKKVFLDCCNYITELRRQHARASHLGLARSNLDEDIIAEENIVSRSEFPESWLWNVEDLKEPPKNGISTKLMNIFLKDSITTWEILAVSMSDKKGICVADPFEVTVMQDFFIDLRLPYSVVRNEQVEIRAVLYNYRQNQELKVRVELLHNPAFCSLATTKRRHQQTVTIPPKSSLSVPYVIVPLKTGLQEVEVKAAVYHHFISDGVRKSLKVVPEGIRMNKTVAVRTLDPERLGREGVQKEDIPPADLSDQVPDTESETRILLQGTPVAQMTEDAVDAERLKHLIVTPSGCGEQNMIGMTPTVIAVHYLDETEQWEKFGLEKRQGALELIKKGYTQQLAFRQPSSAFAAFVKRAPSTWLTAYVVKVFSLAVNLIAIDSQVLCGAVKWLILEKQKPDGVFQEDAPVIHQEMIGGLRNNNEKDMALTAFVLISLQEAKDICEEQVNSLPGSITKAGDFLEANYMNLQRSYTVAIAGYALAQMGRLKGPLLNKFLTTAKDKNRWEDPGKQLYNVEATSYALLALLQLKDFDFVPPVVRWLNEQRYYGGGYGSTQATFMVFQALAQYQKDAPDHQELNLDVSLQLPSRSSKITHRIHWESASLLRSEETKENEGFTVTAEGKGQGTLSVVTMYHAKAKDQLTCNKFDLKVTIKPAPETEKRPQDAKNTMILEICTRYRGDQDATMSILDISMMTGFAPDTDDLKQLANGVDRYISKYELDKAFSDRNTLIIYLDKVSHSEDDCLAFKVHQYFNVELIQPGAVKVYAYYNLEESCTRFYHPEKEDGKLNKLCRDELCRCAEENCFIQKSDDKVTLEERLDKACEPGVDYVYKTRLVKVQLSNDFDEYIMAIEQTIKSGSDEVQVGQQRTFISPIKCREALKLEEKKHYLMWGLSSDFWGEKPNLSYIIGKDTWVEHWPEEDECQDEENQKQCQDLGAFTESMVVFGCPN 47
來自人類血漿組分1的C3c補體(鏈D) SPMYSIITPNILRLESEETMVLEAHDAQGDVPVTVTVHDFPGKKLVLSSEKTVLTPATNHMGNVTFTIPANREFKSEKGRNKFVTVQATFGTQVVEKVVLVSLQSGYLFIQTDKTIYTPGSTVLYRIFTVNHKLLPVGRTVMVNIENPEGIPVKQDSLSSQNQLGVLPLSWDIPELVNMGQWKIRAYYENSPQQVFSTEFEVKEYVLPSFEVIVEPTEKFYYIYNEKGLEVTITARFLYGKKVEGTAFVIFGIQDGEQRISLPESLKRIPIEDGSGEVVLSRKVLLDGVQNLRAEDLVGKSLYVSATVILHSGSDMVQAERSGIPIVTSPYQIHFTKTPKYFKPGMPFDLMVFVTNPDGSPAYRVPVAVQGEDTVQSLTQGDGVAKLSINTHPSQKPLSITVRTKKQELSEAEQATRTMQALPYSTVGNSNNYLHLSVLRTELRPGETLNVNFLLRMDRAHEAKIRYYTYLIMNKGRLLKAGRQVREPGQDLVVLPLSITTDFIPSFRLVAYYTLIGASGQREVVADSVWVDVKDSCVGSLVVKSGQSEDRQPVPGQQMTLKIEGDHGARVVLVAVDKGVFVLNKKNKLTQSKIWDVVEKADIGCTPGSGKDYAGVFSDAGLTFTSSSGQQTAQRAELQCPQP 48
很可能特定的C3抗原決定基結合導致本發明的抗體或其抗原結合片段的意想不到的功能性質，例如，對C3及C3b兩者的高結合親和力，以及對包括經典途徑(CP)、凝集素途徑(LP)及替代途徑(AP)在內的所有三種補體活化途徑的強力抑制。
治療用途
在一個態樣，本發明係關於用作藥物的抗C3抗體或其抗原結合片段。
如前所述，發明人現在已經表明，視網膜中C3的中和將阻斷所有補體途徑的放大環路，且藉此減少細胞毒性攻膜複合物的產生及促發炎補體組分(C3a、C3b、iC3b、C5a)的產生，改善地圖狀萎縮患者的臨床結果。
因此，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其用於治療或預防視網膜或眼疾病。
在一個態樣，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其用於治療或預防眼睛或眼疾病。在一個態樣，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病：視網膜病變、增生性視網膜病變(PR)，諸如早產兒視網膜病變、缺血性視網膜病變；糖尿病性視網膜病變(DR)，包括增生性糖尿病性視網膜病變(PDR)及非增生性糖尿病性視網膜病變；糖尿病性黃斑水腫(DME)、糖尿病性黃斑缺血(DMI)；年齡相關之黃斑部變性(AMD)，包括乾性AMD及濕性AMD；地圖狀萎縮(GA)、色素性視網膜炎、遺傳性視網膜營養不良、近視性變性、網膜靜脈阻塞、網膜動脈阻塞、眼內炎、眼色素層炎、囊樣黃斑水腫、繼發於任何視網膜疾病的脈絡膜新生血管膜、視神經病變、青光眼、視網膜脫落、中毒性視網膜病變、放射性視網膜病變、外傷性視網膜病變、藥物誘發的視網膜血管病變、視網膜新生血管形成、息肉狀脈絡膜血管病變、視網膜血管炎、視網膜微動脈瘤、晶狀體後纖維組織增生、脈絡膜視網膜炎、福斯氏營養不良、黃斑毛細血管擴張、尤塞氏症候群、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)及斯特格病。
在另一實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其用於治療或預防選自由以下組成之群的疾病：年齡相關之黃斑部變性、地圖狀萎縮、新生血管性青光眼及糖尿病性視網膜病變。在又一較佳實施例中，本發明提供抗C3抗體或其抗原結合片段，其用於治療或預防地圖狀萎縮。
在一較佳實施例中，本發明提供一種抗C3 scFv，其用於治療地圖狀萎縮，其中該抗C3 scFv包含可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)，其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、選自由SEQ ID NO: 2及15組成之群的CDR-H2序列、SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及其中該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、選自由SEQ ID NO: 5及18組成之群的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。在一特定實施例中，該抗C3 scFv包含有分別包含SEQ ID NO: 20及SEQ ID NO: 21的胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈。在另一特定實施例中，該抗C3 scFv包含有分別包含SEQ ID NO: 22及SEQ ID NO: 23的胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈。在另一特定實施例中，該抗C3 scFv包含有分別包含SEQ ID NO: 24及SEQ ID NO: 25的胺基酸序列的可變重鏈及可變輕鏈。
發明人已經說明，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段顯示出比先前技術中提到的及 實例 5中描述的靶向C3的其他「比較化合物」更有利的性質。
根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段不同於基於APL2、NGM621及ZIMURA®的治療方法。
APL-2或派賽可潘(Pegcetacoplan)係環狀十肽坎普他汀(compstatin) (補體組分C3的抑制劑)的聚乙二醇化衍生物。APL-2的活性組分係APL-1。如 實例 5A所示，發明人開發了替代化合物(比較化合物A1及比較化合物A2)用於比較目的。
APL-2具有350 kDa的大分子量當量及約7.8 nm的流體動力學半徑，因此難以深入至視網膜中。可能歸因於3.5 mM之低濃度，APL-2僅具有1個月之有效期。APL-2亦為聚乙二醇化分子，由此增加其黏度且可能使其難以注射至眼睛中。因此，需要更有效地減少GA進展。
NGM621係一種人類化IgG1單株抗體，可有效結合補體C3 (C3)並抑制補體活化。如 實例 5B所示，發明人開發了此化合物用於比較目的。NGM621被描述為能夠抑制經典及替代途徑。
ZIMURA® (或阿瓦卡塔德聚乙二醇(avacincaptad pegol))旨在抑制補體因子C5切割為C5a及C5b。ZIMURA®不與C3結合。
發明人在 實例 6B中已經說明，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的格式提高了每次玻璃體內注射在眼睛中遞送的藥物分子的量。事實上，與其他化合物相比，scFv格式可以在每次IVT注射中遞送更多的藥物。此證實了scFv格式可以實現更大的補體抑制，從而增強治療效果。此外，發明人已經表明，與Fab或IgG相比，scFv格式在IVT注射後允許更好的視網膜滲透。
發明人比較了根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段與尤其坎普他汀衍生物(諸如比較化合物A1)及針對C3的IgG (諸如比較化合物A3)的效力，如在 實例 7中所說明。發明人已經表明，與比較化合物A1及比較化合物A3相比，本發明的抗體更有效地抑制經典途徑、替代途徑及凝集素途徑。發明人進一步評估了與比較化合物A1相比，本發明的例示性抗體或其片段在抑制CP及LP方面更有效。發明人還表明，與比較化合物A1相比，在溶血分析中抑制AP的效力有所提高。
發明人亦在 實例 8中例示了根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段與現有化合物坎普他汀衍生物(諸如比較化合物A1)及針對C3的IgG (諸如比較化合物A3)相比的結合親和力。例示性抗體的較高結合親和力有助於延長玻璃體內注射後C3的中和時間並進一步允許降低的注射頻率。改進的結合親和力及降低的注射頻率顯著改善了對患者的治療功效。其亦為患者提供了寶貴的益處，尤其係改善了藥物的遵從性及依從性。
此外，本發明人已表明，與坎普他汀衍生物(諸如比較化合物A1)及針對C3的IgG (諸如比較化合物A3)相比，本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段以更高的親和力結合人類C3及C3b，從而能夠更有效地抑制C3。與比較化合物A3相比，本發明的抗體以更高的親和力結合C3b，且因此將阻斷C3放大環路中C3b的產生以及已經沈積的C3b及由替代活化途徑產生的C3b的活性。
發明人亦在 實例 8中表明，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段結合人類C3的疾病相關單核苷酸多型性(SNP)，確保本發明的抗體可以治療廣泛的範圍患有眼睛或眼疾病的患者。發明人進一步表明，與比較化合物A1對人類C3的該SNP的結合親和力相比，該結合親和力得到改善。
發明人已在 實例 10中說明，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段允許改善穿過布魯赫膜的滲透，而比較化合物A2及ZIMURA®顯示沒有滲透，而比較化合物A3僅顯示降低的滲透。由於大部分補體活性位於RPE/布魯赫膜/CC區域，因此極好的穿過布魯赫膜的滲透及擴散對於抑制C3途徑的治療方法至關重要。
最後，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段以高親和力及效力抑制所有補體效應子，如 實例 7所說明。此導致抑制所有途徑中的C3放大環路以及已經形成的C3b及由C3「逐漸停滯」活化產生的C3b的活性。結果係完全抑制所有補體活化途徑及所有補體效應功能。
總之，發明人因此開發了用於治療患有GA的患者的非常有前景的治療策略，並且已經顯示根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段優於比較化合物A2及比較化合物A3。發明人確實已經表明，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段： ●允許改善每次玻璃體內注射的藥物遞送( 實例 6B)並且尤其由於其格式而在等莫耳玻璃體內注射後表現出更好的視網膜滲透； ●尤其由於其格式而具有改進的治療有效持續時間，確保改進的給藥頻率及增強的患者遵從性； ●對目標組織有更好的滲透力( 實例 10)，具有滲透RPE及布魯赫膜的能力，由此提高其在眼睛或眼疾病治療中的治療潛力； ●具有改進的效力及更有效的補體阻斷，證實根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段抑制所有補體效應功能，具有高親和力及效力( 實例 7 及 8)； ●對C3具有提高的結合親和力，有助於延長玻璃體內注射後C3的中和時間，並進一步降低注射頻率( 實例 8)； ●對C3b具有提高的結合親和力，特別係根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段以相似的親和力結合C3及C3b，藉此確保抑制C3放大環路中C3b的產生( 實例 8))；及 ●對人類C3的疾病相關SNP具有改善的結合親和力，確保本發明的抗體可以治療廣泛的患有眼睛或眼疾病的患者( 實例 8)； ●表現出改善的穩定性( 實例 11 及 13)；及 ●具有低免疫原性風險( 實例 4 及 12)。
此外，在本發明的一個具體實施例中，抗C3抗體或其抗原結合片段未被聚乙二醇化。在此實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段顯示出誘導新血管形成的風險降低，如在關於比較化合物(諸如ZIMURA®或APL-2)揭示之臨床試驗中所觀察到的。
總的來說，本發明的抗體被證明係一種非常有效的治療，具有最長的作用持續時間、改善患者最佳可能的遵從的藥物莫耳，以及在濕性AMD尤其GA中的視網膜功效最佳。
在一個態樣，本發明提供一種醫藥組合物，其包含抗C3抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
抗C3抗體或其抗原結合片段藉由任何合適的方式投與，包括玻璃體內、口服、非經腸、皮下、腹膜內、肺內及鼻內。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。此外，抗C3抗體適合藉由脈衝輸注投與，特別係抗體劑量遞減。在一個態樣中，部分視投與之短期或長期性而定，可藉由注射，最佳地靜脈內或皮下注射來提供給藥。在一個實施例中，抗C3抗體經由玻璃體內注射至眼睛中投與。
為了預防或治療疾病，抗體的適當劑量將取決於多種因素，諸如待治療疾病的類型(如上所定義)、疾病的嚴重程度及病程、抗體是否用於預防或治療目的、既往療法、患者的臨床病史及對抗體的反應，以及主治醫師的判斷。一次性或在一系列治療中適當地向患者投與抗體。
在一些實施例中，每次注射適用的本發明抗體的劑量範圍通常為1 mg/眼至20 mg/眼，或在5 mg/眼至20 mg/眼之間，或在10 mg/眼至15 mg/眼之間或約15 mg/眼。
術語「抑制」在本文中在與「改善」及「緩解」相同之情形下使用，意謂減輕或減少疾病之一或多個特徵。
抗體組合物將以與良好醫學實踐一致之方式調配、給藥及投與。在此情形下，考慮因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病況、病症之病因、藥劑遞送部位、投與方法、投與時程及醫學從業者已知之其他因素。待投與的抗體的「治療有效量」將由此類考慮因素決定，並且係預防、改善或治療本發明的抗體所針對的眼睛或眼疾病所需的最小量。
抗體不需要但視情況與一或多種目前用於預防或治療所討論病症的藥劑一起調配。此類其他藥劑的有效量取決於調配物中存在的抗C3抗體的量、病症或治療的類型以及上述其他因素。此等通常以與上文所用相同的劑量及投與途徑使用，或者係前文所用劑量的約1%至99%。
在一特定態樣，本發明亦提供了醫藥組合物，其包含抗C3抗體或其抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑以及至少一種另外的治療劑。
治療方法
在另一態樣，本發明亦涵蓋用於治療或預防有需要之患者的眼睛或眼疾病的任何方法，該方法包含投與本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段。
在一些實施例中，本發明係關於一種用於治療或預防眼睛或眼疾病的方法，其包含向有需要之患者投與醫藥學上有效量之根據本發明的抗體或其片段。在一個實施例中，該疾病係選自由以下組成之群：視網膜病變、增生性視網膜病變(PR)，諸如早產兒視網膜病變、缺血性視網膜病變；糖尿病性視網膜病變(DR)，包括增生性糖尿病性視網膜病變(PDR)及非增生性糖尿病性視網膜病變；糖尿病性黃斑水腫(DME)、糖尿病性黃斑缺血(DMI)；年齡相關之黃斑部變性(AMD)，包括乾性AMD及濕性AMD；地圖狀萎縮(GA)、色素性視網膜炎、遺傳性視網膜營養不良、近視性變性、網膜靜脈阻塞、網膜動脈阻塞、眼內炎、眼色素層炎、囊樣黃斑水腫、繼發於任何視網膜疾病的脈絡膜新生血管膜、視神經病變、青光眼、視網膜脫落、中毒性視網膜病變、放射性視網膜病變、外傷性視網膜病變、藥物誘發的視網膜血管病變、視網膜新生血管形成、息肉狀脈絡膜血管病變、視網膜血管炎、視網膜微動脈瘤、晶狀體後纖維組織增生、脈絡膜視網膜炎、福斯氏營養不良、黃斑毛細血管擴張、尤塞氏症候群、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)及斯特格病。
本文中所述之所有所揭示之技術特徵適用於該治療方法。
醫藥組合物及其投與
可以將包含抗C3抗體或其抗原結合片段的組合物投與患有眼睛或眼疾病或處於患眼睛或眼疾病風險中的個體。本發明進一步提供了抗C3抗體或其抗原結合片段在製造預防或治療C3相關疾病的藥物中的用途。如本文所用，術語「個體」係指可以向其投與抗C3抗體或其抗原結合片段的任何哺乳動物患者，包括例如人類及非人類哺乳動物，諸如靈長類動物、嚙齒動物及狗。特定預期使用本文所描述之方法治療之個體包括人類。抗C3抗體或其抗原結合片段可以單獨投與或與其他組合物組合投與。
多種遞送系統係已知的並且可用於投與抗C3抗體或其抗原結合片段。引入方法包括但不限於玻璃體內、滴眼劑、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外及經口途徑。抗C3抗體或其抗原結合片段可以例如藉由輸注、推注或注射投與，並且可以與其他生物活性劑一起投與。投與可以係全身的或局部的。在較佳實施例中，藉由玻璃體內注射投與。用於此類注射之調配物可在例如預填充注射器中製備。
在某些實施例中，眼內投與根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段。向眼睛之不同結構(諸如視網膜)遞送治療化合物係具有挑戰性的。挑戰包括但不限於幾種限制性眼障壁、淚液機制，包括眨眼及沖洗掉遞送的化合物、有限的局部注射體積、有限的局部生物可用度以及對雜質及污染物的低耐受性(參見例如，Patel等人 World J Pharmacol. 2013; 2(2): 47-64；Morrison等人 Ther. Deliv. 2014; 5(12): 1297-1315)。本發明的抗體可以克服此等挑戰。本發明的抗體較佳具有約60 kDa或更小的分子量，較佳約25 kDa。約60 kDa或更小的抗原結合蛋白的實例包括但不限於scFv、VHH及Fab片段。約25 kDa或更小的抗原結合蛋白的實例包括但不限於scFv及VHH。scFv的較小尺寸使得每次注射能夠遞送更多的治療化合物。此允許高濃度的抗體進入眼睛。本發明的抗體，特別係scFv的較小尺寸亦可以提高其對疾病相關組織(亦即眼睛的脈絡膜區域)的滲透。本發明的抗體能夠穿透脈絡膜區域的一或多層，包括哈勒氏層、薩特勒氏層、脈絡膜毛細血管層及布魯赫膜，藉此靶向脈絡膜區域之彼等層內的補體C3及C3b。
在某些實施例中，眼內投與係用藥物遞送裝置達成的，諸如脈絡膜上藥物遞送裝置或視網膜下藥物遞送裝置。脈絡膜上投與程序涉及將藥物投與至眼睛之脈絡膜上腔，且通常使用脈絡膜上藥物遞送裝置來進行，諸如具有微針之微小注射器(參見例如Hariprasad, 2016, Retinal Physician 13: 20-23；Goldstein, 2014, Retina Today 9(5): 82-87；其中之各者以全文引用之方式併入本文中)。
在某些實施例中，經由玻璃體內途徑達成眼內投藥。通常藉由注射器及27號規格(gauge)至30號規格針進行玻璃體內投藥(參見例如Jiang等人, 見上文)。
雖然所有此等投與形式均被明確地考慮在本發明的範疇內，但是投與形式可以係注射溶液，特別係用於玻璃體內注射的溶液。通常，適用於注射之醫藥組合物可包含緩衝液(例如，乙酸鹽、磷酸鹽或檸檬酸鹽緩衝液)、界面活性劑(例如，聚山梨醇酯)、視情況選用之穩定劑(例如，人類白蛋白)等。然而，在與本文的教示內容相容的其他方法中，可以將本發明的抗體直接遞送至不利細胞群的部位，藉此增加患病組織對治療劑的暴露。
在替代實施例中，醫藥組合物可以根據常規程式調配為適於靜脈內或皮下投與人類的醫藥組合物。通常，藉由注射投與之組合物為於無菌等張水性緩衝液中之溶液。必要時，醫藥物亦可包括助溶劑及諸如利多卡因(lignocaine)之局部麻醉劑以減輕注射部位之疼痛。一般而言，該等成分係單獨提供或以單位劑型混合在一起，例如呈於指示活性劑量之氣密密封容器(諸如安瓿或藥囊)中之乾燥凍乾粉末或無水濃縮物形式。當藉由輸注投與醫藥物時，其可用含有無菌醫藥級水或鹽水之輸注瓶來配藥。當藉由注射投與醫藥物時，可提供注射用無菌水或鹽水之安瓿，以使得該等成分可在投與前混合。
此外，醫藥組合物可以作為醫藥套組提供，該醫藥套組包含(a)容納凍乾形式的根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的容器及(b)容納用於注射的醫藥學上可接受之稀釋劑(例如，無菌水)的第二容器。醫藥學上可接受之稀釋劑可用於復原或稀釋凍乾的抗C3抗體或其抗原結合片段。視需要與該(等)容器相關聯的可為由管理醫藥物或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式的注意事項，該注意事項反映了製造、使用或銷售機構批准用於人類投藥。
可藉由標準臨床技術確定有效治療或預防眼睛或眼疾病的根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的量。另外，活體外分析可視情況用於幫助鑑別最佳劑量範圍。調配物中所用的精確劑量亦將取決於投與途徑及病症的階段，並且應根據醫師的判斷及各患者的情況來決定。可自來源於活體外或動物模型測試系統之劑量反應曲線外推出有效劑量。
例如，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的毒性及治療功效可以在細胞培養物或實驗動物中藉由用於確定ED 50(在50%群體中有效的治療劑量)的標準醫藥學程序來確定。展現出較大治療指數的抗C3抗體或其抗原結合片段係較佳的。
自細胞培養物分析及動物研究獲得之資料可用於調配用於人類的劑量範圍。抗C3抗體或其抗原結合片段的劑量通常在包括ED 50在內的循環濃度範圍內，毒性很小或沒有毒性。劑量可視所採用劑型及所用投與途徑而在此範圍內變化。對於此方法中使用的任何抗C3抗體或其抗原結合片段，治療有效劑量最初可自細胞培養分析中估計。可在動物模型中調配劑量以達成包括以在細胞培養物中所測定之IC 50(亦即，達成症狀之半數最大抑制的測試化合物之濃度)之循環血漿濃度範圍。此類資訊可用於更準確地測定人類中之適用劑量。可例如藉由高效液相層析、ELISA及其類似方法量測血漿中之含量。
對於根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的玻璃體內注射，通常較長的治療間隔係較佳的。由於其改進的效力，本發明的抗C3抗體可以以更長的間隔投與。
在一個實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段每6週，較佳每7週，較佳每8週，較佳每9週，較佳每10週，較佳每11週，且更佳每12週投與。在又一較佳的實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段每3個月投與一次。
由於可以投與眼睛的體積受到嚴格限制，所以根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段可以調配成高濃度係非常重要的。此外，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的效力非常重要，因為有效的抗體可以在甚至更低的劑量下發揮其作用，且藉此延長活性及治療間隔。
本發明的抗體可以調配成非常高的劑量，包括但不限於20 mg/ml，30 mg/ml，40 mg/ml，50 mg/ml，60 mg/ml，70 mg/ml，80 mg/ml，90 mg/ml，100 mg/ml，110 mg/ml，120 mg/ml，130 mg/m，140 mg/ml，150 mg/ml，160 mg/ml，170 mg/ml，180 mg/ml，190 mg/ml，200 mg/ml。較佳地，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段可以調配成液體調配物，其濃度包含90 mg/ml至180 mg/ml，更佳130 mg/ml至160 mg/ml。較佳地，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段可以調配成約150 mg/ml的液體調配物。
可投與患者的典型劑量為約2.5 mg/眼至20 mg/眼，或7.5 mg/眼至15 mg/眼。在一具體實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段可以以每隻眼睛7.5 mg的濃度投與患者。在另一具體實施例中，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段可以每隻眼睛15 mg的濃度投與患者。可用於此類調配物的典型緩衝組分包含例如乙酸鈉、PS20及二水合海藻糖。
在一些實施例中，包含抗C3抗體或其抗原結合片段的醫藥組合物可以進一步包含與結合劑結合或未結合的治療劑。
關於組合投與的治療方案，在一特定實施例中，抗C3抗體或其抗原結合片段與治療劑同時投與。在另一特定實施例中，治療劑在投與抗C3抗體或其抗原結合片段之前或之後相隔至少一小時及長達幾個月投與，例如在投與抗C3抗體或其抗原結合片段之前或之後至少一小時、五小時、12小時、一天、一週、一個月或三個月。
聚核苷酸、載體、宿主細胞及重組方法
在一個態樣，本發明涵蓋包含編碼根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的序列的經分離聚核苷酸、包含該等聚核苷酸的載體及宿主細胞，以及用於產生該抗體的重組技術。經分離聚核苷酸可以編碼任何所需形式的抗C3抗體或其抗原結合片段，包括例如全長單株抗體、Fab、Fab'、F(ab') 2及Fv片段、雙功能抗體、線性抗體、單鏈抗體分子及由抗體片段形成的多特異性抗體。
如此項技術中已知的，包含編碼根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的序列的聚核苷酸可以融合至一或多個調節或控制序列，並且可以包含在合適的此項技術中已知的表現載體或宿主細胞中。編碼重鏈或輕鏈可變域的聚核苷酸分子中之各者可以獨立地融合至編碼恆定域(諸如人類恆定域)的聚核苷酸序列，從而能夠產生完整的抗體。或者，可以將聚核苷酸或其部分融合在一起，從而提供用於產生單鏈抗體之模板。
對於重組生產，將編碼抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸插入可複製載體中用於選殖(DNA擴增)或表現。許多適合表現重組抗體的載體係可用的。載體組分通常包括但不限於以下的一或多種：信號序列、複製起點、一或多種標記基因、強化子元件、啟動子及轉錄終止序列。
根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段亦可以作為融合多肽產生，其中該抗體或其片段與異源多肽融合，諸如信號序列或在成熟蛋白質或多肽的胺基末端具有特異性切割位點的其他多肽。所選擇的異源信號序列通常係被宿主細胞識別及加工(亦即，被信號肽酶切割)的序列。對於不會識別及加工抗C3抗體信號序列的原核宿主細胞，可以用原核信號序列替代該信號序列。信號序列可以係例如鹼性磷酸酶、青黴素酶、脂蛋白、熱穩定腸毒素II前導子及其類似物。對於酵母分泌，可以用例如自酵母轉化酶α-因子(包括酵母菌及克魯維酵母α-因子前導子)、酸性磷酸酶、白色念珠菌葡萄糖澱粉酶獲得的前導序列或在WO90/13646中描述的信號替代原生信號序列。在哺乳動物細胞中，可以使用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導子，例如單純疱疹病毒gD信號。此類前驅體區域的DNA在讀框中連接至編碼人類化抗C3抗體或其抗原結合片段的DNA。
表現載體及選殖載體含有使得載體能夠在一或多個選定的宿主細胞中複製之核酸序列。一般而言，在選殖載體中，此序列為使得載體能夠獨立於宿主染色體DNA而複製之序列，且包括複製起點或自主複製序列。此類序列對於各種細菌、酵母及病毒而言為熟知的。質體pBR322的複製起點適用於大多數革蘭氏陰性菌，2-υ.質體來源適用於酵母，且各種病毒來源(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV及BPV)可用於在哺乳動物細胞中選殖載體。一般而言，哺乳動物表現載體不需要複製起點組分(通常可僅使用SV40起點，因為其含有早期啟動子)。
表現載體及選殖載體可含有編碼可選標記之基因，以便於識別表現。典型可選標記基因編碼如下蛋白質：其賦予對抗生素或其他毒素，例如胺苄青黴素(ampicillin)、新黴素(neomycin)、甲胺喋呤(methotrexate)或四環素(tetracycline)之抗性，或替代地為補充營養缺陷型缺乏，或在其他替代方案中提供不存在於複雜培養基中之特定營養素，例如編碼用於桿菌(Bacilli)之D-丙胺酸消旋酶之基因。
選擇方案的之一個實例利用藥物來阻滯宿主細胞生長。此等經異源基因成功轉形之細胞產生賦予耐藥性之蛋白質且因此在選擇療法中存活。此種優勢選擇的實例使用藥物新黴素、黴酚酸及潮黴素。哺乳動物細胞的常見選擇標記係彼等能夠鑑定能夠攝取編碼人類化抗C3抗體的核酸的細胞的標記，諸如DHFR(二氫葉酸還原酶)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I及-II(諸如靈長類動物金屬硫蛋白基因)、腺苷脫胺酶、鳥胺酸脫羧酶及其類似物。藉由在含有DHFR競爭性拮抗劑胺甲喋呤(Mtx)的培養基中培養所有轉形體，首先鑑定用DHFR選擇基因轉形的細胞。當使用野生型DHFR時，合適的宿主細胞係DHFR活性缺乏的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞株(例如DG44)。
或者，宿主細胞(特別係含有內源性DHFR的野生型宿主)用編碼抗C3抗體、野生型DHFR蛋白及另一種選擇標記(諸如胺基糖苷3'-磷酸轉移酶(APH))的DNA序列轉形或共轉形，可以藉由在含有選擇標記的選擇劑(諸如胺基糖苷類抗生素，例如康黴素( kanamycin)、新黴素或G418)的培養基中進行細胞生長來選擇。參見例如，美國專利第4,965,199號。
在酵母細胞作為宿主細胞執行重組生產之情況下，存在於酵母質體YRp7中之TRP1基因(Stinchcomb等人, 1979, Nature 282: 39)可用作選擇標記。TRP1基因為缺乏在色胺酸中生長能力的酵母突變菌株提供選擇標記，例如ATCC編號44076或PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12)。酵母宿主細胞基因體中存在trp1損傷接著提供藉由在不存在色胺酸下生長偵測轉形之有效環境。類似地，諸如ATCC 20,622及38,626之Leu2p缺乏酵母菌株由帶有LEU2基因之已知質體來補充。
另外，衍生自1.6 μm環形質體pKD1之載體可用於克魯維酵母之轉形。或者，針對乳酸克魯維酵母報導了一種用於大規模生產重組小牛凝乳酶的表現系統(Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135)。亦已揭示用於藉由工業克魯維酵母菌株分泌成熟重組人類血清白蛋白之穩定多複本表現載體(Fleer等人, 1991, Bio/Technology 9:968-975)。
表現載體及選殖載體通常含有被宿主生物體識別並可操作地連接至編碼抗C3抗體或其多肽鏈的核酸分子的啟動子。適合於與原核宿主一起使用之啟動子包括phoA啟動子、β-內醯胺酶及乳糖啟動子系統、鹼性磷酸酶、色胺酸(trp)啟動子系統及雜合啟動子，諸如tac啟動子。其他已知細菌啟動子亦為適合的。用於細菌系統的啟動子亦將含有Shine-Dalgamo (S.D.)序列，該序列可操作地連接至編碼人類化抗C3抗體的DNA。
已知許多真核啟動子序列。幾乎所有的真核基因均具有富AT區，其位於轉錄起始位點上游約25至30個鹼基處。在許多基因轉錄起點上游70至80個鹼基處發現的另一序列為CNCAAT區，其中N可為任何核苷酸。大多數真核基因的3'端係AATAAA序列，其可能係將poly A尾添加至編碼序列3'端的信號。所有此等序列適合插入至真核表現載體中。
適合與酵母宿主一起使用之啟動序列之實例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖分解酶的啟動子，該等糖分解酶諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸去氫酶、己糖激酶、丙酮酸去羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙醣磷酸異構酶、磷酸葡萄糖異構酶以及葡糖激酶。
誘導性啟動子具有藉由生長條件控制之額外轉錄優勢。此等啟動子包括用於醇去氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關之衍生酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸去氫酶及負責麥芽糖及半乳糖利用之酶的酵母啟動子區。酵母強化子亦宜與酵母啟動子一起使用。
根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段自哺乳動物宿主細胞中的載體的轉錄受到例如以下各者的控制：獲自病毒基因體的啟動子，該等病毒諸如為多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳突瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40 (SV40)；來自異源哺乳動物啟動子，例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子；或來自熱休克啟動子，其限制條件係啟動子與宿主細胞系統相容。
SV40病毒之早期及晚期啟動子宜以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制性片段形式獲得。人類巨細胞病毒之即刻早期啟動子適宜以HindIII E限制性片段形式獲得。在哺乳動物宿主中使用牛乳頭狀瘤病毒作為載體表現DNA之系統揭示於美國專利第4,419,446號。此系統的修改描述於美國專利第4,601,978號。亦參見Reyes等人, 1982, Nature 297:598-601，其揭示在來自單純性疱疹病毒之胸苷激酶啟動子的控制下，人類p-干擾素cDNA於小鼠細胞中之表現。或者，可使用勞斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)長末端重複序列作為啟動子。
可用於重組表現載體的另一有用元件係強化子序列，其用於增加高等真核生物對編碼根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的DNA的轉錄。許多強化子序列現在已知來自哺乳動物基因(例如球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白及胰島素)。然而，通常使用來自真核細胞病毒之強化子。實例包括複製起點後側(bp 100-270)上之SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、複製起點後側上之多瘤病毒強化子以及腺病毒強化子。關於增強真核啟動子活化之元件之描述亦參見Yaniv, 1982, Nature 297:17-18。強化子可以剪接至載體中抗C3抗體編碼序列的5'或3'位置，但較佳位於啟動子的5'位點。
真核宿主細胞(酵母細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞、動物細胞、人類細胞或來自其他多細胞生物體之有核細胞)中使用的表現載體亦可含有終止轉錄及穩定mRNA所需的序列。此類序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA的5'及偶爾3'非轉譯區獲得。此等區域包含在編碼根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的mRNA的非轉譯部分中轉錄為聚腺苷酸化片段的核苷酸片段。一種有用的轉錄終止組分係牛生長激素聚腺苷酸化區域。參見WO94/11026及其中揭示之表現載體。在一些實施例中，可以使用CHEF系統表現抗C3抗體。(參見例如，美國專利第5,888,809號)。
本文中用於在載體中選殖或表現DNA的適合宿主細胞為上文所描述之原核生物、酵母或高級真核生物細胞。為此目的合適的原核生物包括真細菌，諸如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科( Enterobacteriaceae)，諸如大腸桿菌屬( Escherichia)(例如大腸桿菌(E. coli))、腸桿菌屬( Enterobacter)、伊文氏桿菌屬( Erwinia)、克留氏菌屬( Klebsiella)、變形桿菌屬( Proteus)、沙門桿菌屬( Salmonella)(例如鼠傷寒沙門氏菌( Salmonella typhimurium))、鋸桿菌屬( Serratia)(例如黏質鋸桿菌)及志賀桿菌屬( Shigella)，以及桿菌( Bacilli) (諸如枯草桿菌( B. subtilis)及地衣桿菌( B. licheniformis) (例如1989年4月12日出版的DD 266,710中揭示之地衣桿菌41P))、假單胞菌屬( Pseudomonas) (諸如銅綠假單胞菌( P. aeruginosa))及鏈黴菌屬( Streptomyces)。一種較佳的大腸桿菌選殖宿主係大腸桿菌294 (ATCC 31,446)，儘管其他菌株，諸如大腸桿菌 B、大腸桿菌 X1776(ATCC 31,537)及大腸桿菌 W3110(ATCC 27,325)亦係合適的。此等實例係說明性的而並非限制性的。
除原核生物外，真核微生物，諸如絲狀真菌或酵母亦係編碼抗C3抗體的載體的合適選殖或表現宿主。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通麵包酵母係低等真核宿主微生物中最常用的。然而，許多其他屬、種及菌株在本文中係普遍可用及有用的，諸如粟酒裂殖酵母( Schizosaccharomyces pombe)；克魯維酵母屬( Kluyveromyces)宿主，諸如乳酸克魯維酵母( K. lactis)、脆壁克魯維酵母( K. fragilis) (ATCC 12,424)、保加利亞克魯維酵母( K. bulgaricus) (ATCC 16,045)、威克克魯維酵母( K. wickeramii) (ATCC 24,178)、瓦爾特克魯維酵母( K. waltii) (ATCC 56,500)、果蠅克魯維酵母(K . drosophilarum) (ATCC 36,906)、耐熱克魯維酵母( K. thermotolerans)及馬克斯克魯維酵母( K. marxianus)；耶氏酵母屬( yarrowia) (EP 402,226)；巴斯德畢赤酵母( Pichia pastors) (EP 183,070)；假絲酵母菌屬( Candida)；里氏木黴屬( Trichoderma reesia) (EP 244,234)；紅麵包黴( Neurospora crassa)；許旺酵母屬( Schwanniomyces)，諸如西方許旺酵母( Schwanniomyces occidentalis)；及絲狀真菌，諸如紅黴屬( Neurospora)、青黴菌屬( Penicillium)、彎頸黴屬( Tolypocladium)及麴菌屬( Aspergillus)宿主，諸如構巢麴黴( A. nidulans)及黑麴黴( A. niger)。
用於表現醣基化抗C3抗體或其抗原結合片段的合適宿主細胞來源於多細胞生物體。無脊椎細胞之實例包括植物及昆蟲細胞，包括例如許多桿狀病毒株及變異體以及來自諸如以下宿主之對應容許昆蟲宿主細胞：草地黏蟲( Spodoptera frugiperda) (毛蟲)、埃及斑蚊( Aedes aegypti) (蚊蟲)、白紋斑蚊( Aedes albopictus) (蚊蟲)、黑腹果蠅( Drosophila melanogaster) (果蠅)及家蠶( Bombyx mori) (桑蠶(silk worm))。用於轉染之各種病毒株可公開獲得，例如苜蓿銀紋夜蛾( Autographa californica) NPV之L-1變異體及家蠶 NPV之Bm-5株，且此類病毒可尤其用於轉染草地黏蟲細胞。
棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄及菸草之植物細胞培養物亦可用作宿主。
本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段亦可以摻入病毒載體中，亦即將編碼抗C3抗體或其抗原結合片段的聚核苷酸引入病毒載體中，接著感染病毒後在患者體內表現。
在另一態樣，根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的表現在脊椎動物細胞中進行。脊椎動物細胞在培養物(組織培養物)中的繁殖已成為常規程序，且技術廣泛可用。有用的哺乳動物宿主細胞株的實例係SV40轉形的猴腎CV1株(COS-7，ATCC CRL 1651)、人類胚腎株(293或293細胞次選殖用於懸浮培養生長(Graham等人, 1977, J. Gen Virol. 36: 59)、幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)、中國倉鼠卵巢細胞/-DHFR1 (CHO，Urlaub等人, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216；例如，DG44)、小鼠塞特利氏細胞(sertoli cell) (TM4，Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251)、猴腎細胞(CV1 ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL -1587)、人類宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)、水牛大鼠肝細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)、人類肝細胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)、TR1細胞(Mather等人, 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68)、MRC 5細胞、FS4細胞及人類肝腫瘤細胞株(Hep G2)。
宿主細胞用上述用於抗C3抗體或其抗原結合片段生產的表現或選殖載體進行轉形，並在經適當改良以誘導啟動子、選擇轉形體或擴增編碼所需序列的基因的習知營養培養基中培養。
可以在多種培養基中培養用於產生根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段的宿主細胞。市售培養基，諸如Ham's F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.)、最低必需培養基((MEM), (Sigma-Aldrich Co.))、RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.)及杜爾貝寇改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) ((DMEM), Sigma-Aldrich Co.))適用於培養宿主細胞。此外，Ham等人, 1979, Meth. Enz. 58: 44、Barnes等人, 1980, Anal. Biochem. 102: 255、美國專利第4,767,704號、美國專利第4,657,866號、美國專利第4,927,762號、美國專利第4,560,655號、美國專利第5,122,469號、WO 90/103430及WO 87/00195中之一或多者描述的任何培養基均可用作宿主細胞的培養基。此等培養基中之任一者可視需要補充激素及/或其他生長因子(諸如胰島素、轉鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣鹽、鎂鹽及磷酸鹽)、緩衝液(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷及胸苷)、抗生素(諸如健他黴素(gentamicin))、痕量元素(定義為通常以微莫耳濃度範圍內之最終濃度存在的無機化合物)及葡萄糖或等效能量來源。亦可以熟習此項技術者已知之適當濃度包括其他補充劑。培養條件(諸如溫度、pH值及其類似條件)為先前用於經選擇用於表現之宿主細胞之培養條件，且對於一般熟習此項技術者而言將顯而易見。
當使用重組技術時，抗體或其片段可以在細胞內、在周質間隙中產生，或直接分泌至培養基中。若抗體於細胞內產生，則第一步可將細胞破壞以釋放蛋白質。可例如藉由離心或超濾移除微粒碎片，亦即宿主細胞或溶解片段。Carter等人, 1992, Bio/Technology 10:163-167描述用於分離被分泌至大腸桿菌之周質間隙的抗體之程序。簡言之，在乙酸鈉(pH 3.5)、EDTA及苯基甲基磺醯基氟(PMSF)存在下歷時約30分鐘解凍細胞漿料。可藉由離心來移除細胞碎片。在抗體分泌至培養基中之情況下，通常首先使用市售蛋白質濃縮過濾器(例如Amicon或Millipore Pellicon超濾單元)濃縮此類表現系統之上清液。在任何先前步驟中可包括諸如PMSF之蛋白酶抑制劑以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物生長。可使用多種方法自宿主細胞分離抗體。
由細胞製備之抗體組合物可使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析及親和力層析加以純化，其中親和力層析為典型純化技術。蛋白質A作為親和配位體之適合性視抗體中存在之任何免疫球蛋白Fc域之物種及同型而定。蛋白質A可用於純化基於人類γ1、γ2或γ4重鏈的抗體(參見例如，Lindmark等人, 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13)。針對所有小鼠同型及人類γ3，推薦蛋白質G (參見例如Guss等人, 1986 EMBO J. 5:1567-1575)。連接親和配位體之基質最常為瓊脂糖，但其他基質係可用的。與瓊脂糖可達成的相比，機械上穩定的基質(諸如孔受控的玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)允許較快流動速率及較短處理時間。當抗體包含C H3域時，Bakerbond ABX™樹脂(J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.)可用於純化。取決於欲回收的抗體，亦可以使用其他蛋白質純化的技術，諸如離子交換管柱分級分離、乙醇沈澱、反相HPLC、二氧化矽層析、肝素SEPHAROSE™層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬胺酸柱)層析、層析聚焦、SDS-PAGE及硫酸銨沈澱。
在任何初步純化步驟之後，包含感興趣的抗體或其片段及污染物的混合物可以使用pH在約2.5-4.5之間的溶離緩衝液進行低pH疏水相互作用層析，通常在低鹽濃度下進行(例如，約0-0.25 M鹽)。
亦包括在如本文所定義的低、中和高嚴格條件下與由經分離聚核苷酸序列代表的核苷酸序列的全部或部分(例如，編碼可變區的部分)雜交的核酸，該(等)聚核苷酸序列編碼根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段。雜交核酸之雜交部分的長度通常為至少15 (例如20、25、30或50)個核苷酸。雜交核酸的雜交部分與編碼抗C3多肽(例如，重鏈或輕鏈可變區)或其補體的部分或全部核酸的序列至少80%，例如至少90%，至少95%，或至少98%一致。可使用本文所描述之類型之雜交核酸例如作為選殖探針、引子，例如PCR引子或診斷探針。
在一個實施例中，本發明係關於一或多種經分離聚核苷酸，其包含編碼SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 24中所示的重鏈可變區的序列，及編碼SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23及/或SEQ ID NO: 25中所示的輕鏈可變區的序列。
應當理解，在該抗C3抗體及抗體片段中，編碼CDR的核酸序列保持不變(相對於其編碼的胺基酸不變，由於密碼子的簡併性，DNA序列的等價物係可能的)，但可以工程改造周圍區域，例如FR區域。
製品
在另一態樣中，包括含有適用於治療上文所述病症之材料的製品。製品包含容器及標籤。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器及試管。容器可由各種材料形成，諸如玻璃或塑膠。容器容納有效治療病況之組合物且可具有無菌接取口。舉例而言，容器可為具有可藉由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶。組合物中的活性劑係根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段。容器上或與容器相關聯之標籤指示該組合物用於治療所選病況。製品可以進一步包含第二容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝液，諸如磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及葡萄糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者的觀點來看合乎需要的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針、注射器及帶有使用說明書之藥品說明書。
本發明在以下實例中進一步加以描述，其不意欲限制本發明之範疇。 實例
實例 1 ：地圖狀萎縮的 C3 機制及病因學
在GA患者中，補體系統之增加及不受控制的活化會導致脈絡膜毛細血管的破壞、RPE細胞的損傷以及最終感光體的喪失。
補體活化與疾病病理生理學的相關性基於以下幾點：
A. AMD 患者視網膜中補體蛋白的表現及補體系統的活化
補體級聯的所有蛋白質被發現在視網膜的不同細胞類型中局部表現。在患者中，隱結及GA病變中幾種補體因子(例如C3、CFB及C5)的蛋白質含量升高。此外，發現AMD患者的眼房液及血漿中補體活化產物C3a、C4a、C3d、CBb含量升高。攻膜複合物(MAC)的免疫組織化學染色顯示患者GA病灶附近的布魯赫膜、RPE層及脈絡膜毛細血管沈積增加。
B.AMD 遺傳學
GWAS研究確定補體因子H (CFH)中的Y402H多型性係發生AMD的主要風險因素。在此突變的純合子個體中發現風險增加高達7倍。CFH係補體系統的主要負調節因子。其增強了C3轉化酶C3bBb的衰變並調節已經沈積的C3b的蛋白水解降解。Y402多型性導致CFH與其他蛋白質的結合減少，並且在純合子患者中發現補體活化產物含量增加以及MAC沈積增加。此外，其他補體基因(例如CFB、C3、C7、C9)的多型性與AMD的發展有關。
C. 補體抑制劑的臨床研究 現有的治療策略，包括用C3抑制劑(APL-2)及C5抑制劑(ZIMURA®)治療，在2期臨床試驗中減少了GA病灶的生長。抑制C3將抑制C3放大環路，且因此抑制補體系統的替代途徑、經典途徑及凝集素途徑。
實例 2： 抗 C3 抗體庫的生成及表徵
為了產生抗C3抗體，用原生人類C3蛋白免疫3隻新西蘭白兔。各隻動物在不同時間點接受4次C3蛋白注射，使用完全或不完全弗氏佐劑(Freund's adjuvant)。用ELISA測試各隻動物的免疫反應，且血清中的特異性抗體滴度表明極好的免疫反應。
scFv抗體cDNA庫係經由PCR擴增自分離的兔PBMC及脾淋巴球中提取的RNA構築的。可變輕域及重域的編碼序列分別擴增，並經由一系列重疊PCR步驟連接，得到最終的scFv產物。
使用適當的限制酶消化編碼來自兔的scFv的擴增DNA序列，並接合至噬菌粒載體中。噬菌粒載體被轉形至非常適合抗體噬菌體展示庫生成的大腸桿菌TG1電勝任細胞中。
實例 3 ：抑制所有三種補體途徑的抗 C3 抗體的篩選
為了篩選具有高親和力的抗C3抗體，將展示在噬菌體上的scFv提交給針對原生人類C3的幾輪生物淘選(選擇)。藉由降低生物淘選中使用的C3蛋白的濃度或增加洗滌的嚴格性，各輪均會增加選擇的嚴格性。選擇大約380種單株噬菌體並篩選其在ELISA分析中結合C3的能力。
基於噬菌體ELISA數據及DNA指紋，展示的scFv的選擇被重組產生為Fab格式的抗體蛋白。評估所得蛋白質結合人類C3及C3b的能力。
為了鑑定阻斷所有3種補體途徑的抗體，使用酶免疫分析法篩選抗體，使用WEISLAB®補體系統篩選(Svar Life Science AB, Malmö, Sweden)定性測定人類血清中功能性經典途徑、凝集素及替代補體途徑。殖株IV (SEQ ID NO: 32)被鑑定為能夠抑制所有三種補體途徑，如表6所示。
表 6.單劑量2 μM的殖株IV對CP依賴性、LP依賴性及AP依賴性MAC形成的補體途徑抑制.
殖株IV的補體活化[%]
經典途徑 凝集素途徑 替代途徑
2.9 ± 0.0 0.5 ± 0.9 -0.1 ± 0.2
殖株IV序列概述於下表7中。
表 7 ：
名稱 胺基酸序列 SEQ ID NO:
殖株IV QSVKESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLYNYAMNWVRQAPGKGLEWIGIINTDGNTNYASWAKGRFTISTTSSTTVDLKITSPTTEDTATYFCPRAVGYHHHALDPWGPGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGASELVLTQSPSVSAALGASAKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQQGEAPRYLMQLKSDGSYTKGTGVPDRFSGSSSGADRYLIIPSVQADDEADYYCGTDYGGGYVFGGGTQLTVTG 32
實例 4 ：重新格式化、人類化及最佳化實驗 (campaign)
重新格式化及人類化： 為了抗體人類化及重新格式化為scFv抗體片段格式，將源自兔的殖株IV CDR序列移植至人類生殖系序列的可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)中。為了VH的人類化，CDR被移植至IMGT_hVH_3_30構架中。為了VL的人類化，CDR被移植至IMGT_hVL_4-69構架中。可變域使用(GGGGS) 4連接子(SEQ ID NO: 46)以VL-連接子-VH方式連接。對於構架4，使用了IGLJ2*01連接(J)基因序列。
重新格式化及人類化的變異體殖株V (SEQ ID NO: 33)保留了其抑制經典及替代補體途徑的能力，但顯示出與親本分子殖株IV相比較低的對C3及C3b的結合親和力。
藉由用生殖系序列代替額外的源自兔的胺基酸進一步修飾變異體，從而產生殖株VI (SEQ ID NO: 34)。其對人類C3及C3b的親和力與親本分子相當，且構築體的熱穩定性提高了11.7℃。
殖株V及殖株VI序列概述於下表8中。
表 8 ：
名稱 胺基酸序列 SEQ ID NO:
殖株V MQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKGPRYLMQLKSDGSYTKGTGVPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTDYGGGYVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQVVESGGGSVQPGRSLRLSCAASGFSLYNYAMNWVRQAPGKGLEWIGIINTDGNTNYASWAKGRFTISTDNSKNTLYLQMNSLRAEDTASYYCPRAVGYHHHALDPWGQGTSVTVSS 33
殖株VI MQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKGPRYLMQLKSDGSYTKGTGVPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTDYGGGYVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQVVESGGGSVQPGRSLRLSCAASGFSLYNYAMNWVRQAPGKGLEWIGIINTDGNTNYASWAKGRFTISTDNSKNTLYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHHALDPWGQGTSVTVSS 34
親和力成熟
庫構築：為了提高分子的親和力，使用殖株VI (SEQ ID NO: 34)作為模板構築位點飽和庫。對CDR L1、L2、L3及H3進行隨機化。
生物淘選：將包含輕鏈隨機化的庫合併成一個庫。同樣，將包含重鏈隨機化的庫合併成另一庫。對輕鏈及重鏈庫進行針對人類C3的生物淘選。在第二輪、第三輪及第四輪生物淘選(ROP2-4)中，引入了與50 μg/mL殖株IV的競爭，以提高選擇嚴格性並允許鑑定比親本分子具有更高親和力的結合物。對藉由ROP2-4中的噬菌體ELISA鑑定的命中進行定序。ROP4中最有前景的候選物以scFv格式表現及純化。
命中表徵：ROP4中鑑定的所有命中均包含CDR L3或CDR H3中的胺基酸取代。
所有命中均已成功表現及純化。對於殖株VII (SEQ ID NO: 35)、殖株VIII (SEQ ID NO: 36)及殖株IX (SEQ ID NO: 37)觀察到對人類C3及C3b的最佳結合親和力，C3親和力分別為1.1 nM、184 pM及1.3 nM。
殖株VII及殖株IX顯示出與親本分子殖株IV相當的結合親和力及補體抑制活性。與殖株IV相比，殖株VIII顯示對C3及C3b的結合親和力增加了大約10倍，並且在補體抑制分析中表現出優異的效能。
殖株VII、VIII及IX的序列概述於下表9中。
表 9 ：
名稱 胺基酸序列 SEQ ID NO:
殖株VII MQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKGPRYLMQLKSEGSYTKGTGVPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDSAVYYCGTEGVGGYVFGCGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQVVESGGGSVQPGRSLRLSCAVSGFSLYNYAMNWVRQAPGKCLEWIGIINVGGGTNYASWAKGRFTISTDNSKNTVYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHHALDPWGQGTSVTVSS 35
殖株VIII MQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKGPRYLMQLKSEGSYTKGTGVPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDSAVYYCGTEGVGGYVFGCGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQVVESGGGSVQPGRSLRLSCAVSGFSLYNYAMNWVRQAPGKCLEWIGIINVGGGTNYASWAKGRFTISTDNSKNTVYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHSRLDPWGQGTSVTVSS 36
殖株IX MQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKGPRYLMQLKSEGSYTKGTGVPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDSAVYYCGTDGVGGYVFGCGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQVVESGGGSVQPGRSLRLSCAVSGFSLYNYAMNWVRQAPGKCLEWIGIINVGGGTNYASWAKGRFTISTDNSKNTVYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHHALDPWGQGTSVTVSS 37
scFv 的穩定性
藉由引入二硫鍵(VL 43C、VH 105C)進行scFv的穩定化。天然抗體在恆定輕鏈及恆定重鏈CH1域之間有保守的鏈間二硫鍵，可強烈穩定輕鏈及重鏈之間的相互作用。scFv中不存在此鏈間二硫鍵可能導致可變域不穩定及形成二聚體、三聚體及更高級的寡聚物物種，尤其係在以高濃度調配時。二硫鍵的存在因此可以穩定scFv的VH/VL界面。
殖株VI的重鏈構架的穩定性藉由引入構架取代進行了探索，從而特別創建了殖株X (SEQ ID NO: 38)。殖株X及其二硫鍵穩定的變異體殖株XI (SEQ ID NO: 39)在37℃及＞100 mg/mL蛋白質濃度下的穩定性研究中進行了比較。殖株XI在37℃下培育兩週僅導致3.3%的單體純度損失，而親本分子殖株X損失了60.4%的單體含量(表10)。
表 10 ：二硫鍵穩定的scFv殖株XI及親本分子殖株X在37℃下的濃度依賴性單體穩定性.
參數 殖株XI 殖株X
起始濃度 152 mg/mL 100 mg/mL
起始單體含量 99.8 % 99.7 %
在37℃下2週後單體含量 96.5 % 39.3 %
殖株X及XI的序列概述於下表11中。
表 11 ：
名稱 胺基酸序列 SEQ ID NO:
殖株X MQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKGPRYLMQLKSDGSYTKGTGVPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTDYGGGYVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQVVESGGGSVQPGRSLRLSCTVSGFSLYNYAMNWVRQAPGKGLEWIGIINTDGNTNYASWAKGRFTISTDNSKNTVYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHHALDPWGQGTSVTVSS 38
殖株XI MQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKCPRYLMQLKSDGSYTKGTGVPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTDYGGGYVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQVVESGGGSVQPGRSLRLSCTVSGFSLYNYAMNWVRQAPGKGLEWIGIINTDGNTNYASWAKGRFTISTDNSKNTVYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHHALDPWGCGTSVTVSS 39
最終最佳化
在殖株XII (SEQ ID NO: 40)、殖株XIII (SEQ ID NO: 41)及殖株XIV (SEQ ID NO: 42)中組合了最有前景的親和力成熟取代及二硫鍵穩定化。
熱穩定性及對人類C3及C3b的親和力由DSF及SPR分析確定。殖株XII、殖株XIII及殖株XIV的解鏈溫度分別為70.4℃、67.7℃及67.2℃。分別地，殖株XII對人類C3及C3b的結合親和力為4.7 nM及4.8 nM，殖株XIII為116 pM及110 pM，且殖株XIV為129 pM及116 pM。
亦在補體抑制分析中測試了殖株XII、殖株XIII及殖株XIV的活性。殖株XII、殖株XIII及殖株XIV在經典途徑中抑制補體的IC50值分別為0.098 μM、0.06 μM及0.05 μM，而親本殖株IV的IC50展示為0.08 μM。殖株XII、殖株XIII及殖株XIV在替代途徑中抑制補體的IC50值分別為0.21 μM、0.26 μM及0.25 μM，而殖株IV的IC50展示為0.28 μM。總的來說，殖株XIII及殖株XIV顯示出比殖株IV更優越的功能性質。此外，在濃度依賴性穩定性研究中比較了殖株XIII及殖株XIV。殖株XIII可濃縮至150 mg/mL，單體含量無損失，且在37℃下培育2週後僅損失2.2%，而殖株XIV在濃縮至50 mg/mL時已損失1.6%的單體含量，且在37℃下培育2週後再損失2.3%。
殖株XII、殖株XIII及殖株XIV的序列概述於下表12中。
表 12 ：
名稱 胺基酸序列 SEQ ID NO:
殖株XII MQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKCPRYLMQLKSEGSYTKGTGVPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTDYGGGYVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQVVESGGGSVQPGRSLRLSCAVSGFSLYNYAMNWVRQAPGKGLEWIGIINVGGGTNYASWAKGRFTISTDNSKNTVYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHARLDPWGCGTSVTVSS 40
殖株XIII MQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKCPRYLMQLKSEGSYTKGTGVPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTEGVGGYVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQVVESGGGSVQPGRSLRLSCAVSGFSLYNYAMNWVRQAPGKGLEWIGIINVGGGTNYASWAKGRFTISTDNSKNTVYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHARLDPWGCGTSVTVSS 41
殖株XIV MQLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSAHKTYTIDWYQQQPEKCPRYLMQLKSEGSYTKGTGVPDRFSGSSSGAERYLTISSLQSEDEADYYCGTEGVGGYVFGGGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQVVESGGGSVQPGRSLRLSCAVSGFSLYNYAMNWVRQAPGKGLEWIGIINVGGGTNYASWAKGRFTISTDNSKNTVYLQMNSLRAEDTASYYCARAVGYHHSRLDPWGCGTSVTVSS 42
最終人類化：經由EpiVax進行的免疫原性風險預測揭示了殖株X (殖株XIII的親代構築體)的中等風險。VH及VL的EpiVax評分分別為-39.36及14.86。此外，殖株XI顯示VH的人類生殖系序列一致性為77%，VL的一致性為87%。
殖株IX向殖株XIII的演化僅包含CDR環修飾，因此殖株XI的FR中確定的責任在殖株XIII中保持不變。因此，在構架區進行了額外的生殖系化。
此外，電腦模擬分析允許識別在人類抗體庫中很少出現的殘基，且因此具有增加的免疫原性風險。因此，為了進一步降低免疫原性的風險，以下突變VH S61D、W62S、A63V及Y30S以及VL T56S被納入候選物。
在最終人類化及最佳化實驗中，發明人創建了殖株III，其沒有關鍵的轉譯後修飾(PTM)基序，進一步經人類化(VL及VH的人類序列一致性分別為86%及89%)且經親和力成熟。
此外，研究了CDR L2上的異構化基序(DG)，因為其對再摺疊良率及親和力有很大影響。因此，藉由引入突變E50D對殖株III進行了修飾，從而產生了殖株II。殖株II顯示VL及VH的人類序列一致性分別為87%及89%。
殖株II的另一變異體係藉由將整個CDR H2交換為完全人類生殖系序列(在VH中將人類序列與人類生殖系的一致性再增加7%)而產生的，從而產生殖株I。
發明人因此確保本發明的抗C3不含有可能引起異構化、脫醯胺及氧化的不利條件。發明人進一步驗證了根據本發明的抗C3抗體或其抗原結合片段具有可接受的黏度，強儲存穩定性，對C3、C3b的高親和力，在經典途徑、替代途徑及凝集素途徑中表現出相似的效力，表現出擴散穿過豬布魯赫膜，且沒有顯示出明顯的T細胞活化。
本發明的例示性抗體包括： - 殖株 I ：包含SEQ ID NO: 20的可變重鏈及SEQ ID NO: 21的可變輕鏈； - 殖株 II ：包含SEQ ID NO: 22的可變重鏈及SEQ ID NO: 23的可變輕鏈；及 - 殖株 III ：包含SEQ ID NO: 24的可變重鏈及SEQ ID NO: 25的可變輕鏈。
免疫原性
發明人進一步評估了本發明的scFv的免疫原性。發明人已經評估了根據本發明的例示性抗體，亦即殖株I、殖株II及殖株III的預測免疫原性。
為此目的，本發明人已使用電腦模擬工具來預測此類T細胞抗原決定基(由EpiVax研發之EpiMatrix)。
藉由篩選多個人類抗體分離物之序列，EpiVax已識別出咸信具有調節潛力之若干高度保守性HLA配位體。實驗證據表明此等肽中之多者在大部分個體中具有積極的耐受性。此等高度保守的、調節性的及混雜的T細胞抗原決定基被稱為T調節細胞抗原決定基(Tregitope) (De Groot等人Blood. 2008年10月15日;112(8):3303-11)。可在大量調控T調節細胞抗原決定基存在下有效地控制人類化抗體中所含有的新抗原決定基之免疫原性潛力。
出於抗體免疫原性分析的目的，EpiVax包括經T調節細胞抗原決定基調整之EpiMatrix分數及抗治療性抗體反應的對應預測。為了計算經T調節細胞抗原決定基調整之EpiMatrix分數，自EpiMatrix蛋白質分數扣除T調節細胞抗原決定基的分數。經T調節細胞抗原決定基調整之分數已顯示與觀察到的一組23種商業抗體的臨床免疫反應密切相關(De Groot等人. Clin Immunol. 2009年5月;131(2):189-201)。
EpiMatrix量表的結果總結在下表13中。
表 13 ：
分子 VH 人類生殖系序列一致性 [%] Epivax (VH) Epivax (VL) VL 人類生殖系序列一致性 [%]
殖株 I 96 -55 8 87
殖株 II   92 -66 8 87
殖株 III   88 -66 19 86
Beovu 80 -66 32 88
Lucentis 76 -49 14 87
Avastin 77 -37 -25 88
蘭帕利珠單抗 (Lampalizumab) 89 -32 -14 78
Eylea na na -16 na   
本發明抗體的序列在EpiMatrix量表的低端得分，表明本發明的scFv具有非常有限的免疫原性潛力。該EpiMatrix量表為熟習此項技術者所熟知，且尤其可以在出版物Mufarrege等人 Clin Immunol., 2017年3月;176:31-41的圖2中找到。
實例 5 ：比較化合物的產生
A. APL-1 替代物及 APL-2 替代物
為了比較的目的，發明人開發了坎普他汀的幾種衍生物，如下： ●APL-1替代物：聚乙二醇化單坎普他汀衍生物(以下稱為「比較化合物A1」或「 化合物 A1」) ●APL-2替代物：聚乙二醇化二聚坎普他汀衍生物(以下稱為「比較化合物A2」或「 化合物 A2」)。
此等化合物在專利申請案US20200282012A1中作為APL-1及APL-2揭示。其進一步揭示於： ●Ricklin D, Lambris JD. Compstatin: a complement inhibitor on its way to clinical application. Adv Exp Med Biol. 2008;632:273-292. doi:10.1007/978-0-387-78952-1_20及 ●Mastellos DC, Ricklin D, Lambris JD. Clinical promise of next-generation complement therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(9):707-729. doi:10.1038/s41573-019-0031-6。 化合物A1係衍生自坎普他汀的抗C3環肽。化合物A2在化合物A1的基礎上進一步開發，延長其循環半衰期，且提高其在血清中的溶解度。化合物A2包含兩個經由線性40 kDa PEG連接子連接的肽部分。
化合物A1及化合物A2的序列總結在下表14中。
表 14 ：
名稱 胺基酸序列 核心序列 註釋
化合物A1 Ac-I-[CV-Trp(Me)-QDWGAHRC]-T-NH 2(SEQ ID NO: 49) ICVWQDWGAHRCT (SEQ ID NO: 49) 化合物A1在C端經乙醯化 4位的色胺酸係1-甲基色胺酸。 括號表示肽經由Cys殘基環化
化合物A2 Gly-I-[CV-Trp(Me)-QDWGAHRC]-T-NH 2(SEQ ID NO: 50) GICVWQDWGAHRCT (SEQ ID NO: 50) 4位的色胺酸係1-甲基色胺酸 括號表示肽經由Cys殘基環化 化合物經由NHS-PEG40-NHS二聚化
關於化合物A1及化合物A2的結構及序列的其他資料可在Adv Exp Med Biol. 2008; 632: 273-292中獲得。
B. NGM621 替代物
為了進行比較，發明人開發了一種NGM化合物，如WO2019195136A1中所揭示。此NGM化合物較佳作為NGM621替代物，在下文中稱為「比較化合物A3」或「 化合物 A3」。該化合物A3為抗C3 IgG，具有以下特徵。
相關序列如下概述於下表15中。
表 15 ：
名稱 胺基酸序列 SEQ ID NO:
化合物A3 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYMDWVRQAPGQRLEWMGYIYPHNGGTTYNQQFTGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGGFDFDYWGQGTLVTVSS 51
化合物A3 VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVDTYVSWYQQKPGKAPKLLIYGASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYHCGQSHSYPLTFGQGTKLEIKR 52   
化合物A3 HC QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDFYMDWVRQAPGQRLEWMGYIYPHNGGTTYNQQFTGRVTITVDKSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRGGFDFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 53
化合物A3 LC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVDTYVSWYQQKPGKAPKLLIYGASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYHCGQSHSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 54
基於上述序列，發明人進一步開發了Fab格式的NGM621替代物。該化合物稱為「化合物A3 Fab」。
實例 6 ：比較數據
A. 不同作用機制
本發明的例示性抗體及比較化合物具有獨特的作用機制及獨特的特徵，總結如下： -本發明的抗體抑制C3及C3b， -APL-2抑制C3及C3b， -NGM621抑制C3，以及 -ZIMURA®抑制C5。
發明人已經表明，與NGM621相反，本發明的例示性抗體殖株I以相似的親和力結合C3及C3b，如下表16所說明。
表 16 ：
   本發明的例示性抗體 ( 殖株 I) NGM621*
C3 (Kd, nM) 0.16 0.34
C3b (Kd, nM) 0.14 ＞ 34
*已發佈的數據Alexander Loktev等人。「 NGM621 is a potent inhibitory anti-complement C3 antibody in development for treatment of geographic atrophy」 ARVO 2020 Meeting, Poster B0267。
B. ScFv 格式可以在每次 IVT 注射中遞送更多的藥物分子
發明人建立了根據本發明的例示性抗體及比較化合物A2、比較化合物A3及ZIMURA®的質量重量、注射體積及可能的劑量(數據可自文獻中獲得)，如下表17所說明。
表 17 ：
   本發明的例示性抗體 ( 殖株 I) APL-2 比較化合物A3 ZIMURA® **
Mw (kDa) 26 43 150 54
注射體積 (ul) 50 100 100 100 100
劑量 (mg) 7.5 15 15 15 2
劑量 (nmol) 287 574 347 100 37
本發明的抗體證明了每次IVT投與眼睛時可提供更高的藥物量，有助於在眼睛中達成更大的補體抑制。
C. 與 Fab 或 IgG 相比， ScFv 格式在等莫耳玻璃體內注射後可以更好地滲透視網膜。
發明人比較了scFv(溴珠單抗)及Fab(蘭尼單抗)在食蟹獼猴中等莫耳玻璃體內注射後的視網膜滲透。數據表明，與Fab或IgG相比，scFv格式可改善視網膜滲透。因此，與Fab相比，scFv格式的本發明抗體在玻璃體內投與時有望達到優異的視網膜暴露水平( 圖 1A 及圖 1B)。
實例 7：本發明的scFv的效力及活體外活性以及與比較化合物A1及比較化合物A3的比較
為了確定功能效力及比較本發明的例示性scFv，進行以下分析：量測攻膜複合物之產生的補體抑制分析及溶血分析。
A. 材料及方法 a. 補體抑制分析
為了監測人類血清中補體系統的抑制，使用酶免疫分析法測試本發明的scFv或比較分子，以使用WEISLAB®補體系統篩選(Svar Life Science AB, Malmö, Sweden)，遵循供應商的說明，對人類血清中功能性經典、凝集素及替代補體途徑進行定性測定。產生的C5b-C9新抗原的量與補體途徑的功能活性成正比。本發明的scFv及比較分子在濃度反應曲線中進行測試，且抑制的IC50使用GraphPadPrism軟體及非線性的4參數曲線回歸計算。 b. 溶血分析
評估了抗C3抗體片段抑制人類血清中經典途徑(CP)或替代途徑(AP)活化介導的抗體致敏綿羊紅血球溶血的能力。為此，綿羊紅血球表面塗有溶血素(兔抗綿羊抗體)以活化人類血清中的補體系統，導致C3活化並隨後形成攻膜複合物(MAC)。MAC聚集在綿羊紅血球的膜上，導致細胞溶解。自溶解的紅血球釋放的血紅蛋白含量在OD 414 nm處量測，並與血清樣品中存在的補體活性成正比。為確定抗C3分子抑制CP活性的能力，將人類血清稀釋在GVB++緩衝液(補體技術)中以最佳活化經典途徑(需要鈣及鎂離子)。自此溶液製備抗C3測試樣品的系列稀釋液，各數據點的終濃度為1%人類血清(在加入紅血球之前)。樣品與抗體致敏的綿羊紅血球在37℃下培育1小時，並在離心步驟後量測上清液中釋放的血紅蛋白。
人類血清樣品中的替代途徑(AP)由兔紅血球自發活化。由於AP活化需要更高濃度的血清，因此需要用MgEGTA阻斷經典途徑以螯合Ca2+離子(AP僅需要Mg2+離子)。AP活化導致C3活化並隨後形成攻膜複合物(MAC)。MAC聚集在兔紅血球膜上，導致細胞溶解。自溶解的紅血球釋放的血紅蛋白含量在OD 414 nm處量測，並與血清樣品中存在的補體活性成正比。
B. 結果
結果總結於下表18中。
表 18 ：
IC50 (nM)    殖株 I 殖株 II 殖株 III 化合物 A1 化合物 A3
經典途徑 MAC沈積 79 77 73 402 56
   溶血 74 69 72 709 56
替代途徑 MAC沈積 344 360 349 333 548
   溶血 705 668 745 2535 207
凝集素途徑 MAC沈積 67 71 64 222 58
本發明的例示性抗體(殖株I、殖株II及殖株III)比化合物A1(化合物A2的活性組分)更有效。重要的是，發明人已經表明與化合物A1相比，本發明的例示性抗體更有效地抑制經典途徑及凝集素途徑。
殖株I顯示出與化合物A1類似的替代途徑活性。
與化合物A1相比，殖株I顯示出對經典途徑更有效的抑制。
與化合物A1相比，殖株I顯示出對凝集素途徑更有效的抑制。
殖株I：發明人已經表明，本發明的例示性抗體(殖株I)抑制所有補體效應功能，具有高親和力及效力。
化合物A1：本發明人已經說明，與本發明的抗體相比，比較化合物A1抑制所有補體效應功能，具有較低的親和力及效力。
NGM621：本發明人已表明，NGM621替代物、比較化合物A3未顯示出C3b抑制作用。
ZIMURA®：ZIMURA®化合物僅靶向C5。
實例 8 ：對人類 C3 及 C3b 的結合親和力以及本發明抗體、比較化合物 A1 及比較化合物 A3 的結合親和力的比較
發明人已經評估了本發明的例示性scFv對人類C3的結合親和力以及化合物A1及化合物A3對人類C3及C3b的結合親和力。
A. 材料及方法
使用表面電漿子共振(SPR)及Biacore T100裝置確定候選物的動力學參數。使用EDC/sulfo-NHC連接化學將C3及其不同變異體(表19)固定為HC30M SPR感測器晶片(XanTec bionanalytics, Germany)上的配位體。使用單循環動力學(SCK)模式連續注入各分子(分析物)的五個遞增濃度以確定動力學參數。候選物之間的再生係用10 mM甘胺酸*HCl、2 M NaCl、pH 3.5完成的。數據擬合1:1朗謬結合模型(Langmuir binding model)，並確定了結合速率(ka)、解離速率(kd)及親和力(K D)的動力學參數。
已在整個人群中觀察到C3中的單核苷酸多型性(SNP)，並且在全基因體關聯研究(GWAS)中確定某些SNP與患AMD的風險增加相關。常見的SNP變異體包括P314L，其出現在大約23.3%的人群中，以及R102G，據報導，其出現在大約26-29%的人群中。在不到2.5%的人群中出現的非常罕見的變異體包括K155Q、R735W、S1619W、K65Q及R161W。
因此，發明人量測了本發明的scFv與最常見的C3形式(亦即R102G及P314L)的結合親和力。使用ExpiFectamine CHO表現套組(Thermo Fisher Scientific)在CHO細胞株中表現野生型人類C3、人類C3 P314L及人類C3 R102G。蛋白質表現成具有N端6×His標籤，並使用HisTrap Excel HP管柱(GE Healthcare)純化，接著進行尺寸排阻層析步驟(SUPERDEX®20010/300GL；GE Healthcare)。
B. 結果
本發明的scFv、化合物A1 (化合物A2的活性組分)及化合物A3分別與人類C3及C3b結合的動力學及親和力數據列於下表19中。
表 19 ：
IC50 (nM) 殖株 I 殖株 II 殖株 III 化合物A1 化合物A3 Fab
親和力人類C3 (nM) 0.152 0.022 0.151 6.2 0.34
親和力人類C3b (nM) 0.149 0.05 0.127 8.6 ＞ 34
化合物A3以對完整人類C3的高親和力(KD=0.34 nM)結合C3，但對C3切割片段C3b顯示出顯著較低的親和力(＞100倍)。
相反，本發明的例示性抗體以比化合物A3更高的親和力結合C3。此外，本發明的例示性抗體對C3及C3b具有大致相等的結合親和力。
值得注意的是，與化合物A1及化合物A3相比，本發明的抗體以更高的親和力結合人類C3及C3b，從而能夠更有效地抑制C3。與化合物A3相比，本發明的抗體以更高的親和力結合C3b，且因此將阻斷C3放大環路中C3b的產生以及已經沈積的C3b及藉由替代活化途徑產生的C3b的活性。
其他結果總結在下表20中。
表 20 ：
分子    C3 C3b 食蟹獼猴 C3 重組 C3 C3 SNP1 P314L C3 SNP2 R102G
殖株 II K D (nM) 0.022 0.05 0.07 0.035 ＜0.04* 0.021
k a (x 10 5 M -1s -1 2.5 2.5 2.1 3 2.9 3.3
k d (x 10 -6 s -1) 5.5 12 15 10 ＜11 7
殖株 I K D (nM) 0.152 0.149 0.267 0.148 0.14 0.135
k a (x 10 5 M -1s -1 3.1 3.2 2.4 3.3 3 3.3
k d (x 10 -6 s -1) 47 48 63 49 42 45
殖株 III K D (nM) 0.151 0.127 0.208 0.128 0.127 0.115
k a (x 10 5 M -1s -1 2.4 2.5 2 2.7 2.5 2.8
k d (x 10 -6 s -1) 36 31 43 35 32 32
化合物A1    K D (nM) 6.2 8.6 n.d. 12.9 13.7 n.d.
k a (x 10 5 M -1s -1 8.8 10.7    4.99 4.47   
k d (x 10 -6 s -1) 5470.9 9202.7    6444.4 6139.1   
因此，發明人證實，包括殖株I、殖株II及殖株III在內的本發明的抗體對C3及C3b具有更高的親和力，並且比化合物A1更有效地抑制2/3補體活化。
例示性抗體的高結合親和力有助於延長玻璃體內注射後C3的中和時間，並進一步降低注射頻率。改進的結合親和力及降低的注射頻率顯著改善了對患者的治療功效。其亦為患者提供了寶貴的益處，尤其係改善了藥物的遵從性及依從性。
進一步值得注意的是，本發明的scFv以比化合物A1更高的親和力結合野生型C3以及疾病相關的SNP C3P314L。
實例 9： 鑑定人類補體 C3 上的結合抗體的抗原決定基
蛋白質製備：補體組分C3c係C3被C3轉化酶及因子I切割產生的主要片段。自人類血漿中分離的C3c購自Athens Research & Technology (產品編號16-16-030303)，用PNGaseF去醣基化並藉由尺寸排阻層析在SUPERDEX® 200管柱上純化。彙集峰值溶離份，以50 kDa截止值使用Amicon過濾裝置濃縮，並儲存在-80℃。
scFv 的結晶：藉由將0.1 µl蛋白質與0.1 µL含有0.1 M乙酸銨、0.1 M氯化鋅、0.1 M BIS-TRIS pH 6.0及15% w/v PEG Smear High的儲庫溶液混合，使用懸滴蒸汽擴散法獲得晶體。一天之內出現片狀晶體。晶體藉由補充有30% v/v甘油的儲庫溶液進行低溫保護，並在液氮中急驟冷凍。
數據收集及結構確定：數據係在Villigen, Switzerland的SLS的光束線X10SA處以100 K收集的。在EIGER X 16M偵測器上收集了3600訊框，每訊框0.1°。使用autoPROC處理數據。使用先前確定的類似scFv的X射線結構作為模板，使用PHENIX軟體套中的SCULPTOR創建分子置換模型。使用以SCULPTOR製備的scFv模型作為模板，使用PHASER進行分子置換。使用Buster對結構進行細化，使用COOT進行模型構建及最小平方擬合分析。
Cryo-EM 樣品製備及數據收集：C3c與ScFv以1:1.2的比率混合，在277 K下培育16小時，並使用SUPERDEX® 200增量管柱進行純化。峰值溶離份濃縮至36 µM並應用於EM網格(Quantifoil-1.2/1.3 Au 300)。使用Leica GP(Leica Microsystems)準備低溫EM網格。網格在4℃及85%濕度下印漬2秒，接著浸入液氮冷卻的液態乙烷中。在帶有Falcon III偵測器的200 kV電壓下操作的Glacios顯微鏡上篩選冷凍網格，並將良好品質的網格轉移至在300 kV下操作的Titan Krios顯微鏡。使用Falcon IV偵測器(Thermo Fisher Scientific)以超解析度模式收集影像，該偵測器安裝在能量過濾器後，校準像素大小為每像素0.745 Å。顯微照片以60 e -/Å 2的總劑量曝光，並使用CryoSPARC v3.1.1進行處理。堆疊經過運動校正及雙重併像，導致每像素的像素大小為1.49 Å。
Cryo-EM 影像分析：使用CryoSPARC模板選取器自3622張顯微照片中選取了總共1,914,120個粒子。選取的粒子以348像素的框大小提取，並在CryoSPARC中合併為174像素。接著，提取的粒子在cryoSPARC-3.1.1中進行3輪2D分類以去除冰、污染物及聚集體，產生421,628個粒子。具有明確定義的C3c-scFv密度的類別用於cryoSPARC-3.1.0中的重頭起算重建。基於0.9的2D類別臨限值選擇245,993個粒子，並進行一輪均勻及非均勻細化。使用348像素的框大小重新提取粒子，並進行兩輪進一步的均勻及非均勻細化。此導致傅立葉(fourier)殼層解析度為2.55 Å。
模型構建：C3c (pdb 5FOB)及scFv的X射線結構在CHIMERA的幫助下構建至EM密度中，用PHENIX細化實空間並用COOT檢查。界面分析係用PYMOL完成的。
殖株I的結構由X射線晶體學確定，解析度為1.4 Å。結構的每個不對稱單元含有兩個分子。除了鏈A及B中的兩個N端殘基、鏈A中的連接子殘基115-132及鏈B中的114-133以及鏈B中的C端殘基253之外，所有殘基均在電子密度圖中得到了很好的定義。
由於複雜分子在EM網格上的優先取向，解析度在C3c與scFv之間的界面處限制為4-5 Å，此仍然允許將X射線衍生模型放入EM圖中。將scFv附近6 Å內的殘基確定為結合位點殘基，其對應於人類補體C3 (SEQ ID NO: 47)上的胺基酸366、392-396、413-421、425、427、442、453、478。結果表明，殖株I結合了與坎普他汀結合位點部分重疊的抗原決定基，但不限於此。與坎普他汀衍生物相比，本發明的分子表現出的對C3增強的結合親和力可能係由於此擴展的結合界面。此等結果表明，與先前技術的C3抑制劑相比，本發明的分子以不同的模式與C3結合，此可能有助於其抑制所有三種補體途徑的獨特能力，包括經典途徑(CP)、凝集素途徑(LP)及替代途徑(AP)。
實例 10 ：活體外 BrM 滲透分析及 BrM 滲透性
布魯赫膜形成脈絡膜的最內層，且結構變化被認為會觸發GA患者的補體活化。由於補體驅動的脈絡膜毛細血管破壞在GA的病理生理學中起著重要作用，因此極好的擴散穿過布魯赫膜係治療此疾病的補體抑制劑的一個重要特徵。
因此，發明人評估了本發明的scFv在活體外擴散穿過布魯赫膜的能力，並將其與化合物A2及化合物A3進行了比較。
A. 材料及方法
豬布魯赫膜樣品用於此量測。豬眼在動物處死後不超過6小時自屠宰場收集，並在4℃下儲存直至使用(當天)。
富集的布魯赫膜 (BrM) 的製備：將眼睛放入一次性培養皿中，並去除眼球周圍的任何殘留組織。用解剖刀在虹膜旁邊切開眼球，自眼杯中取出眼睛的前部以及晶狀體、玻璃體及視網膜組織。將包括上覆的RPE單層的富集的布魯赫膜自眼杯的整個內表面輕輕取出，放入裝有PBS的培養皿中，並小心地在液體中弄平。之後，將布魯赫膜轉移到尤斯室，關閉尤斯室並在一個隔室內填充1 ml PBS進行洩漏測試。若5分鐘後在第二個隔室中沒有觀察到明顯的液體積聚，則認為膜係完整的。各尤斯室使用來自4隻不同眼睛的布魯赫膜製備物。
用測試樣品培育富集的布魯赫膜：製備APL-2替代物(諸如化合物A2)及抗C3 scFv或APL-2替代物(諸如化合物A2)及NGM621替代物(諸如化合物A3)在PBS (+0.02% NaN3+蛋白酶抑制劑混合物(完整錠劑，微型不含EDTA，EASYpack；Roche))中的主混和液，其足以用於4個尤斯室(每個尤斯室1 ml)，各種化合物的最終濃度為0.1 mg/ml。將1 ml主混和液添加至每個尤斯室的一個隔室(指定的樣品室)中。將1 ml PBS (+0.02% NaN3+蛋白酶抑制劑)添加至每個尤斯室的第二個隔室(指定的擴散質室)。尤斯室用石蠟膜密封並在室溫下培育，輕輕搖動以促進擴散。
取樣及膜完整性分析：對於在不同時間點(4小時、24小時、48小時及72小時)取樣，藉由小心地上下移液將單個隔室中的溶液混合，並自各樣品及擴散質室分別轉移90 μl至收集管中。在培育期結束時，使用Sphero羧基聚苯乙烯藍色粒子(Sphero Carboxyl Polystyrene Blue Particles)進行膜完整性測試：將懸浮液在PBS中按1:10稀釋，並將200 μl添加至每個尤斯室的一個隔室(指定的樣品室)中並培育30分鐘。觀察第二個隔室中藍色粒子的積聚，並記錄照相機相片以控制整體膜完整性。 樣品分析：將來自樣品室及擴散質室的15 µl各溶液與作為加載對照的類似量的儲存的主混和液一起有效地加載至2塊預製聚丙烯醯胺凝膠(NuPAGE Bis-Tris凝膠)上。第一塊凝膠藉由標準SDS-PAGE及基於考馬斯的染色方法進行蛋白質偵測(抗C3 scFv)分析。第二塊凝膠藉由SDS-PAGE及碘化鋇染色進行PEG偵測(化合物A2)分析。
評估：使用ImageJ2軟體(Fiji)分析SDS凝膠的相片。條帶被量化並表示為各別室中的測試化合物百分比，其中100%係指同一尤斯裝置中樣品及擴散質室的條帶強度總和。
B. 結果
比較了本發明的scFv及坎普他汀衍生物(諸如化合物A2)穿過豬BrM的能力，其同時在來自四隻不同豬眼的BrM製備物上培育。與APL-2替代物相比，在所有四種膜製備物中，有顯著更高量的scFv穿過BrM。類似地，比較了NGM621替代物(化合物A3)及APL-2替代物(化合物A2)穿過豬BrM的能力，其同時在來自四隻不同豬眼的BrM製備物上培育。
與化合物A2及化合物A3相比( 圖 3 及圖 4)，本發明的例示性抗體(殖株I)顯示出優異的擴散穿過布魯赫膜的能力。
化合物A2：無滲透
化合物A3：與吾人的根據本發明的例示性抗體相比滲透減少。
ZIMURA®：該分子未經測試。因為其含有與APL-2相同的較大的40 kDa PEG部分，因此預計會有類似的現象。
實例 11 ：本發明的 scFv 的蛋白質熱穩定性
A. 材料及方法
使用的技術：DSF
差示掃描螢光法(DSF)藉由監測螢光隨溫度的變化來量測蛋白質解摺疊。
蛋白質解摺疊的溫度( T m)與抗體穩定性相關聯，具體言之與治療性產物之儲存期間的聚集及長期穩定性相關聯。單株抗體CH2及CH3域之熱量轉變對同型內之不同抗體通常為不變的，且CH2域在CH3域之前解摺疊。
B. 結果
結果總結於下表21中。
表 21 ：
化合物 殖株I    CLONE II CLONE III   
TM解摺疊℃ (DSF) 72.0 / 71.8 69.5 / 69.4 69.0 / 68.5
高 T m值意味著在給定溫度下較少的分子填充未摺疊狀態。因此，高 T m值有利於治療性蛋白質藥物，因為高 T m值可維持生理溫度下的活性構形。
此等結果證實了本發明例示性抗體的極好藥物性質。特別是，改進的熱穩定性質有助於提高治療功效，同時允許減少對患者的注射劑量及頻率。此外，結果表明治療產品具有更長的架儲期及改進的時間穩定性。改進的穩定性及延長的活性有助於使本發明的抗體高度適合於玻璃體內投與。
實例 12 ：免疫原性風險：篩選預先存在的 ADA
發明人使用橋接ELISA篩選健康人類供體的血清中預先存在的針對殖株I的ADA。來自健康人類供體的血清中存在的預先存在的ADA被固定化的抗C3 scFv結合。在下一步中，ADA與生物素標記的相同抗C3 scFv結合，並利用HRP偶聯的鏈黴抗生物素蛋白偵測。
A. 材料及方法
按照供應商的說明，使用「生物素結合套組(快速，A型)-Lightning-Link」-套組(Expedeon/Abcam)對scFv進行生物素標記。未標記的scFv用PBS稀釋至0.5 µg/ml，以每孔50 µl轉移至96孔盤中，且4℃培育隔夜。第二天，用洗滌緩衝液(3×320 µl，0.05% Tween 20於PBS pH 7.4中)洗滌96孔盤，並在室溫下用300 µl/孔封閉緩衝液(SuperBlock Blocking Buffer; ThermoFisher scientifi)封閉非特異性結合位點30分鐘。接著用洗滌緩衝液(3×320 µl/孔)洗滌孔。
來自健康志願者的人類血清在PBS中稀釋至10%，將50 µl/孔添加至96孔盤中，並將盤在室溫下培育1小時。接著用洗滌緩衝液(3×320μl/孔)洗滌盤，每孔加入50 μl/孔的生物素化scFv (0.05 μg/ml於PBS中)並在室溫下培育1小時。
洗滌盤(3×320 μl/孔洗滌緩衝液)，添加50 μl/孔鏈黴抗生物素蛋白-PolyHRP40 (SDT試劑；1:5000於PBS中)並在室溫下培育30分鐘。
洗滌盤(3×320 μl/孔洗滌緩衝液)，添加50 μl/孔TMB受質(Invitrogen)並在室溫下培育5分鐘。接著藉由添加50 µl/孔1 N H2SO4終止反應。在450 nm處量測吸收。預先存在的ADA會導致吸收增加。
B. 結果
對於殖株I，在50個血清樣品中的9個中發現了預先存在的ADA，表明免疫原性的總體風險較低。此等結果證實，本發明的抗體非常適合並有希望用於治療眼睛或眼疾病，且免疫原性風險較低。
實例 13 ：本發明抗體在高濃度調配物中的生物物理學特徵
儲存穩定性
測試殖株I、殖株II及殖株III的儲存穩定性。將樣品濃縮至150 mg/ml (Vivaspin20離心裝置，5 kDa MWCO，3800×g)並在25℃及40℃下儲存長達4週。分析樣品的低聚反應(SE-HPLC)及化學降解(IEX-HPLC)。表22中報導了與起始值相比單體含量的相應降低。各殖株的起始單體純度由SE-HPLC確定為99.96%。對於殖株I、II及III，藉由IEX-HPLC測定的起始裝料純度分別為98.07%、97.16%及96.76%。
殖株I、殖株II及殖株III在25℃及40℃的4週培育期內表現出極好的單體及電荷穩定性。
在高濃度下之黏度
經由標準玻璃體內針頭遞送藥物所需的注射力取決於產品的黏度，並且需要足夠低以使醫生能夠安全注射產品。因此，需要經完全調配之產品的低黏度，在20℃時通常低於15 mPa*s。
使用為儲存穩定性研究準備的樣品進行黏度量測。除了經完全調配的樣品(10 mM His pH 5.5、275 mM蔗糖、0.02% w/v聚山梨醇酯20)外，亦在最低限度的調配物(10 mM組胺酸pH 5.5)中量測各候選物的黏度。執行此操作係為了評估候選物的藥物物質可加工性(例如，過濾、泵送、透濾等)，直至150 mg/ml的最終藥物產品濃度的125%。
使用錐板流變儀在20℃及1000 s -1的剪切速率下量測黏度。簡而言之，將剪切速率逐步增加至1,000 s -1以收集100個數據點，接著將剪切速率進一步增加至2000 s -1，再收集10個數據點。最後，將剪切速率逐步降低至起始速率。獲得的黏度數據呈現於表22中。已觀察到所有候選物均具有良好的填充及可注射性藥物產品處理性質。
表22總結了以＞150 mg/mL調配的殖株I、II及III的黏度及穩定性性質。
表 22
候選者 殖株 I 殖株 II 殖株 III 配方
黏度 [mPa*s]最低限度的緩衝劑，185 g/L 經完全調配，150 g/L    5.4 3.9    4.5 3.9    3.2 3.3    10mM His pH 5.5 10mM His pH 5.5，275mM蔗糖，0.02% w/v聚山梨醇酯20
儲存穩定性， SEC在25℃下4週[D %] 在40℃下4週[D %]    0.06 0.37    0.11 1.59    0.10 0.84 10mM His pH 5.5，150mM NaCl
儲存穩定性， IEX在25℃下4週[D %] 在40℃下4週[D %]    1.1 2.4    0.5 3.3    0.3 3.6 10mM His pH 5.5，150mM NaCl
發明人已經表明，本發明的例示性抗體在高濃度調配物中表現出非凡的穩定性。
圖 1 ：在食蟹獼猴中等莫耳IVT注射後，scFv可更好地滲透視網膜。圖1A描繪了scFv玻璃體內注射(40 nmol scFv，溴珠單抗(brolucizumab)，1 mg)的視網膜暴露水平。數據改編自溴珠單抗BLA。圖1B描繪了Fab玻璃體內注射(40 nmol Fab，蘭尼單抗(ranibizumab)，2 mg)的視網膜暴露水平。數據改編自：Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005年2月;46(2):726-33。
圖 2 ：此圖說明了殖株 I 與人類補體 C3 的結合。圖2A顯示了SEQ ID NO: 55，其係如SEQ ID NO: 47中所示的C3序列的一部分，其中抗原決定基殘基以粗體顯示並加下劃線。圖2B顯示了C3c:殖株I複合物的EM結構，其中分別地，C3c結構以灰色描繪，而scFv結構以黑帶表示。最終的EM圖顯示為半透明的表面，等高線水平為0.214。
圖 3 ：此圖顯示了殖株I及比較化合物A2經由豬布魯赫膜的活體外擴散。在尤斯室(Ussing chamber)中經72小時量測擴散，且經由布魯赫膜擴散的化合物量作為在擴散質室中量測的化合物與總化合物量(樣品及擴散質室)的比較給出。總化合物量設為100%。
圖 4 ：此圖顯示比較化合物A3及比較化合物A2經由豬布魯赫膜的活體外擴散。在尤斯室中經72小時量測擴散，且經由布魯赫膜擴散的化合物量作為在擴散質室中量測的化合物與總化合物量(樣品及擴散質室)的比較給出。總化合物量設為100%。
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Claims (41)

  1. 一種抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含可變重鏈(VH)及可變輕鏈(VL)， 其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、選自由SEQ ID NO: 2及15組成之群的CDR-H2序列、SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及 其中該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、選自由SEQ ID NO: 5及18組成之群的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
  2. 如請求項 1之抗C3抗體或其抗原結合片段， 其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 2的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列，或 其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 15的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 5的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列，或 其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 15的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 18的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列，或 其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、SEQ ID NO: 2的CDR-H2序列及SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、SEQ ID NO: 18的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
  3. 如請求項 1之抗C3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 20、22或24的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列；及 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 21、23或25的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列。
  4. 如請求項 1之抗C3抗體或其抗原結合片段，其包含： 重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 20、22或24的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列；及 輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO: 21、23或25的胺基酸序列至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致的胺基酸序列； 其中： 其中該VH包含SEQ ID NO: 1的CDR-H1序列、選自由SEQ ID NO: 2及15組成之群的CDR-H2序列、SEQ ID NO: 3的CDR-H3序列；及 其中該VL包含SEQ ID NO: 4的CDR-L1序列、選自由SEQ ID NO: 5及18組成之群的CDR-L2序列及SEQ ID NO: 6的CDR-L3序列。
  5. 如請求項 1之抗C3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： 包含SEQ ID NO: 20、22或24的胺基酸序列的重鏈可變區；及 包含SEQ ID NO: 21、23或25的胺基酸序列的輕鏈可變區。
  6. 如請求項 1之抗C3抗體或其抗原結合片段，其中該抗體或其抗原結合片段包含： a. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 20及SEQ ID NO: 21的胺基酸序列； b. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 22及SEQ ID NO: 23的胺基酸序列；或 c. 可變重鏈及可變輕鏈，其分別包含SEQ ID NO: 24及SEQ ID NO: 25的胺基酸序列。
  7. 如請求項 1之抗C3抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段係選自由以下組成之群：單鏈可變片段(scFv)、Fab片段、Fab'片段、Fv片段、雙功能抗體及小抗體模擬物。
  8. 如請求項 1之抗C3抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段係單鏈可變片段(scFv)。
  9. 如請求項 8之抗C3抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段係單鏈片段，該單鏈片段包含選自由SEQ ID NO: 26、27、28、29、30及31組成之群的胺基酸序列。
  10. 一種抗C3抗體或其抗原結合片段，其結合如SEQ ID NO: 47中所示的人類補體C3的選自由殘基366、392-396、413-421、425、427、442、453及478組成之群的至少一個胺基酸殘基。
  11. 一種抗C3抗體或其抗原結合片段，其結合如SEQ ID NO: 47中所示的人類補體C3的胺基酸殘基366、392-396、413-421、425、427、442、453及478中的所有殘基。
  12. 如請求項 10或 11之抗C3抗體或其抗原結合片段，其中該抗C3抗體或其抗原結合片段係如請求項 1 至 9中任一項之抗C3抗體或抗原結合片段。
  13. 如請求項 1 至 11中任一項之抗C3抗體或其抗原結合片段，其中該抗C3抗體或其抗原結合片段能夠抑制補體活化途徑，包括經典途徑(CP)、凝集素途徑(LP)及替代途徑(AP)。
  14. 如請求項 1 至 11中任一項之抗C3抗體或其抗原結合片段，其中該抗C3抗體或其抗原結合片段能夠結合補體C3及C3b。
  15. 如請求項 1 至 11中任一項之抗C3抗體或其抗原結合片段，其中該抗C3抗體或其抗原結合片段能夠阻止C3轉化酶的形成。
  16. 如請求項 1 至 11中任一項之抗C3抗體或其抗原結合片段，其中該抗C3抗體或其抗原結合片段能夠穿透布魯赫膜(Bruch’s membrane)。
  17. 如請求項 1 至 11中任一項之抗C3抗體或其抗原結合片段，其中該抗C3抗體或其抗原結合片段與人類C3結合的K D＜ 50 nM，較佳K D＜ 15 nM，較佳K D＜ 10 nM，較佳K D＜ 7 nM，較佳K D＜ 1 nM，較佳K D＜ 0.5 nM，較佳K D＜ 0.2 nM，較佳K D＜ 0.15 nM，較佳K D＜ 0.10 nM，較佳K D＜ 0.05 nM，較佳K D＜ 0.04 nM，或更佳K D＜ 0.03 nM。
  18. 如請求項 1 至 11中任一項之抗C3抗體或其抗原結合片段，其中該抗C3抗體或其抗原結合片段與人類C3b結合的K D＜ 50 nM，較佳K D＜ 15 nM，較佳K D＜ 10 nM，較佳K D＜ 7 nM，較佳K D＜ 1 nM，較佳K D＜ 0.5 nM，較佳K D＜ 0.2 nM，較佳K D＜ 0.15 nM，較佳K D＜ 0.10 nM，或更佳K D＜ 0.05 nM。
  19. 如請求項 1 至 11中任一項之抗C3抗體或其抗原結合片段，其對C3及C3b具有大致相等的結合親和力。
  20. 如請求項 1 至 11中任一項之抗C3抗體或其抗原結合片段，其對C3a、iC3b、C4、C4b、C5及/或C5b之結合親和力為約10 -4M或更弱。
  21. 如請求項 1 至 11中任一項之抗C3抗體或其抗原結合片段，相較於對C3及C3b之結合親和力，其對C3a、iC3b、C4、C4b、C5及/或C5b之結合親和力更弱。
  22. 如請求項 1 至 11中任一項之抗C3抗體或其抗原結合片段，其對C3a、iC3b、C4、C4b、C5及/或C5b不具有結合親和力。
  23. 如請求項 1 至 11中任一項之抗C3抗體或其抗原結合片段，其能夠抑制C3轉化酶放大環路。
  24. 如請求項 1 至 11中任一項之抗C3抗體或其抗原結合片段，其能夠抑制脈絡膜C3活性。
  25. 一種如請求項 1 至 24中任一項之抗體或抗原結合片段的用途，其用於製造藥物。
  26. 一種如請求項 1 至 24中任一項之抗體或抗原結合片段的用途，其用於製造供治療或預防眼睛或眼疾病用的藥物。
  27. 如請求項 26之用途，其中該疾病係選自由以下組成之群：視網膜病變、增生性視網膜病變(PR)，諸如早產兒視網膜病變、缺血性視網膜病變；糖尿病性視網膜病變(DR)，包括增生性糖尿病性視網膜病變(PDR)及非增生性糖尿病性視網膜病變；糖尿病性黃斑水腫(DME)、糖尿病性黃斑缺血(DMI)；年齡相關之黃斑部變性(AMD)，包括乾性AMD及濕性AMD；地圖狀萎縮(GA)、色素性視網膜炎、遺傳性視網膜營養不良、近視性變性、網膜靜脈阻塞、網膜動脈阻塞、眼內炎、眼色素層炎、囊樣黃斑水腫、繼發於任何視網膜疾病的脈絡膜新生血管膜、視神經病變、青光眼、視網膜脫落、中毒性視網膜病變、放射性視網膜病變、外傷性視網膜病變、藥物誘發的視網膜血管病變、視網膜新生血管形成、息肉狀脈絡膜血管病變、視網膜血管炎、視網膜微動脈瘤、晶狀體後纖維組織增生、脈絡膜視網膜炎、福斯氏營養不良(Fuch's dystrophy)、黃斑毛細血管擴張、尤塞氏症候群(usher syndrome)、陣發性夜間血紅素尿症(PNH)及斯特格病(Stargardt disease)。
  28. 如請求項 26之用途，其中該眼睛或眼疾病係選自由以下組成之群：年齡相關之黃斑部變性、地圖狀萎縮、新生血管性青光眼及糖尿病性視網膜病變。
  29. 如請求項 26之用途，其中該眼睛或眼疾病係地圖狀萎縮。
  30. 如請求項 26之用途，其用於藉由抑制補體經典途徑(CP)、凝集素途徑(LP)及替代途徑(AP)的活性或藉由抑制定位於脈絡膜的補體C3的活性來治療眼睛或眼疾病。
  31. 一種使用如請求項 1 至 24中任一項之抗C3抗體或其抗原結合片段診斷與生物樣品中的補體C3相關的病症的方法。
  32. 一種醫藥組合物，其包含如請求項 1 至 24中任一項之抗體或抗原結合片段及醫藥學上可接受之載劑。
  33. 一種醫藥組合物，其包含編碼如請求項 1 至 24中任一項之抗體或抗原結合片段的一或多種聚核苷酸及醫藥學上可接受之載劑。
  34. 如請求項 26之用途，其中該藥物用於藉由非經腸途徑、靜脈內途徑、玻璃體內途徑或皮下途徑投與。
  35. 如請求項 26之用途，其中該藥物用於藉由玻璃體內途徑投與。
  36. 一種經分離聚核苷酸或多種經分離聚核苷酸，其編碼如請求項 1 至 24中任一項之抗體或抗原結合片段。
  37. 如請求項 36之一種經分離聚核苷酸或多種經分離聚核苷酸，其包含： 編碼SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 24中所示的重鏈可變區的序列，及 編碼SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 23或SEQ ID NO: 25中所示的輕鏈可變區的序列。
  38. 一種表現載體，其包含如請求項 36 或 37之一種經分離聚核苷酸或多種經分離聚核苷酸。
  39. 一種宿主細胞，其包含如請求項 36 或 37之一種經分離聚核苷酸或多種經分離聚核苷酸或如請求項 38之表現載體。
  40. 一種用於產生抗C3抗體或其抗原結合片段的方法，其包含： a. 獲得如請求項 39之宿主細胞，及 b. 培養該宿主細胞。
  41. 如請求項 40之方法，其進一步包含回收及純化該抗體或其抗原結合片段。
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