JP2001504683A

JP2001504683A - 単球およびマクロファージにおける遺伝子発現

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Publication number: JP2001504683A
Application number: JP53964397A
Authority: JP
Inventors: デイビッド、ロバート、グリーブス
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1996-05-02
Filing date: 1997-05-02
Publication date: 2001-04-10
Also published as: AU2705497A; DE69735535D1; GB9609261D0; EP0914456A1; AU732705B2; WO1997042337A1; ES2260793T3; ATE321143T1; EP0914456B1; NZ332555A; DE69735535T2; CA2253322A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、転写調節配列（trs）の機能を有し、かつ：（ａ）配列番号２のポリヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性を有するポリヌクレオチドフラグメント；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドのうち連続する少なくとも15個の塩基を含むポリヌクレオチド、を含むクローン化されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】単球およびマクロファージにおける遺伝子発現本発明は、CD68遺伝子に関連した調節ヌクレオチド配列に関する。発明の背景遺伝子座調節領域哺乳類の遺伝子発現は、シスに連結したDNA配列を介して調節されている。プロモーター配列は遺伝子の転写開始部位の直ぐ5'側に存在し、エンハンサー配列は、調節する遺伝子の内部または調節する遺伝子に近接して存在し得る。1987年に、ヒト第11染色体上のヒトβ−グロビン遺伝子の5'側の70キロベース（kb）以内に見出されたDNA配列が、トランスジェニックマウスの赤血球系細胞においてヒトβ−グロビン遺伝子の高レベルの、コピー数依存的な発現をもたらし得ることが示された（１）Grosveld，F．et al.，Cell，1987，51，975-985。インビボでのグロビン遺伝子発現の調節において重要な役割を果たすこれらのDNA配列は、優勢な制御配列（Dominant Control Sequences，DCR）と名づけられ、後に遺伝子座調節領域（LCR）と改名された。遺伝子座調節領域は、ヒトα−グロビン遺伝子座の遺伝子などの他の赤血球遺伝子について記載され（２）（Greaves，D .R．et al.，Cell，1989，56，979-986）、そして、他の細胞型における高レベルの遺伝子発現を指示するLCRが記載されてきた。例として、Ｔ−細胞特異的LCR を有するヒトCD2遺伝子、およびＢ−細胞における高レベル発現を指示するＣα 免疫グロブリン重鎖遺伝子座の3'末端が挙げられる（３）Madisen，L．and Grou dine，M.，Genes and Development，1994，8，2212-2226。 CD68遺伝子は、すべてのマクロファージ細胞において発現される。インビボでの発現の特異性は高い。この特異性の原因を調べたところ、驚くべきことにCD68 遺伝子の小さな領域がその原因であることが見出された。発明の概要従って本発明は、転写調節配列（trs）の機能を有し、かつ：（ａ）配列番号２のポリヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性を有するポリヌクレオチドフラグメント；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドのうち連続する少なくとも15個の塩基を含むポリヌクレオチド、を含むクローン化されたポリヌクレオチドまたは単離されたポリヌクレオチドを提供する。好ましくは、このポリヌクレオチドフラグメントは配列番号２のポリヌクレオチドに少なくとも80％の同一性を有し、より好ましくは、配列番号２のポリヌクレオチドに少なくとも90％の同一性を有する。最も好ましくは、本発明に従って単離されたポリヌクレオチドは、配列番号２のポリヌクレオチドを含む。本発明は、CD68の転写調節配列を含む単離されたポリヌクレオチドを更に提供する。本発明はその上、CD68の転写調節配列を含む単離されたポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結され、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、本明細書中で定義されるようなポリヌクレオチドを含むベクターおよびこのベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明は、ポリペプチドを製造する方法を更に提供する。この方法は、細胞がコードされるポリペプチドを発現するように、本明細書中で定義されるようなベクターを用いてこの細胞を形質転換またはトランスフェクトする工程を含む。更なる面において、本発明は、CD68遺伝子に関連した遺伝子座調節領域の特性を示すDNA配列の発見に起因する。１つの面において、本発明は、遺伝子が宿主細胞中で発現され得るように、哺乳類宿主細胞の遺伝物質中にこの遺伝子を組み込むためのベクターを提供する。このベクターは、プロモーター、上記の遺伝子、およびこの遺伝子の宿主細胞型制限的、組み込み部位非依存的、コピー数依存的な発現を誘導し得る遺伝子座調節領域を含み、この遺伝子座調節領域はCD68遺伝子の14kb上流から25kb下流にわたる領域内に位置するという特徴を有する。LCR の機能的定義遺伝子座調節領域は、宿主細胞の染色体への組み込み後の位置効果を受けにくいという点で、他の遺伝子調節配列とは基本的に異なる。ヒトβ−グロビン遺伝子のLCRを用いた研究により、このクラスのDNA配列をプロモーターおよびエンハンサーなどの他の調節配列と区別する３つの基準が示された（１、４、５）Gros veld，F．ら、Cell，1987，51，975-985、Blom van Assendelft，M．ら、Cell， 1989，56，969-977、Talbot，D．ら、Nature，1989，338，352-355。１）LCRは、トランスジェニック動物または細胞株の両方において、宿主ゲノムへの組み込み後、同時に連結されている遺伝子の位置非依存的発現を指示する。結果として、この導入遺伝子の完全なコピーを有するすべてのトランスジェニック動物が、かなりのレベルでこの導入遺伝子を発現する。このことは、他のDNA 配列で得られた結果とは著しく異なる。２）LCRは、導入遺伝子発現のパターンにおいて、厳密な組織特異性を示す。ヒトβ−グロビンLCRの下流に配置されたヒトβ−グロビン遺伝子は、トランスジェニックマウスの赤血球のみで発現する（１、４）。ヒトCD2のLCRの下流に配置された全く同じヒトβ−グロビン遺伝子フラグメントは、トランスジェニック動物のすべてのＴ−細胞で高レベルで発現するが、赤血球では発現しない（２）Gr eaves，D.R．ら、Cell，1989，56，979-986。３）LCRは、高レベルの、コピー数依存的な遺伝子発現を指示する。ヒトβ−グロビン導入遺伝子は、トランスジェニックマウスの赤血球系細胞において、コピー数に基づいて、内因性のマウスβ−グロビン遺伝子と同じ位効率的に発現され得る。各導入遺伝子が同様に高レベルで発現する場合、これは導入遺伝子発現と導入遺伝子のコピー数との間の直接関係をもたらす。従って、LCRはクロマチン開放活性を提供する領域を有することが期待され、この領域は上記の少なくとも第１および第３の活性を提供する。LCRは一般に、クロマチン開放活性を提供する配列に加えて、プロモーターまたはエンハンサーなどの転写調節配列を少なくとも１つ含む。遺伝病であるβ−サラセミア（thalassaemia）および鎌状赤血球貧血は、ヒト β−グロビン遺伝子座内での変異によって生じる。体内のすべての赤血球は、骨髄中に見出される限られた数の造血幹細胞に由来する。β−グロビンLCRがゲノムへの組み込み部位にかかわらず赤血球特異的な発現を指示し得るという証明により、造血幹細胞にβ−グロビンLCRベクターを導入し、このようなトランスフェクトした細胞を骨髄移植に用いることによって、β−サラセミアおよび鎌状赤血球貧血に対する体細胞遺伝子治療をするという考えが提案される。このことは、1987年および1989年に出願された最初のβ−グロビンLCRについての特許（英国特許第8718779号および第8904009.1号）中で詳しく記述されている、提案された適用のうちの１つに記載されている。本発明の遺伝子座調節領域（LCR）は、CD68遺伝子の5.5ｋｂ上流から12kb下流までにわたる領域内に位置し得、詳細にはCD68遺伝子の2940塩基対（bp）上流から335bp下流までにわたる領域（配列番号３で示される）内に位置し得、そしてより詳細には、CD68遺伝子の直ぐ上流の3kbのBstX1-BstX1の場所内に位置し得る。LCRは、単一の連続した配列であってもよいし、介在ポリヌクレオチドを伴うかまたは伴わないで一緒に連結された２つ以上のこのような配列から構成されてもよい。LCRは、１つ以上のDNAse高感受性部位から構成されてもよいし、それに由来してもよいし、あるいはそれに対応していてもよい。天然に存在する遺伝子座のLCRが、介在する非機能的な配列で隔てられた２つ以上の不連続な部分配列（例えば、２つ以上の高感受性部位）を含む場合、本発明のベクターは、介在する部分配列をすべてまたは部分的に除去して一緒に連結された２つ以上の部分配列を含むLCRを含んでもよい。本明細書中で用いられる用語「ベクター」は最も広い意味において、１つの細胞から別の細胞にDNAを移動させ得る任意の組換えDNA物質を意味する。別の面において、本発明は定義されたようなベクターを用いて形質転換された哺乳類宿主細胞を提供する。この哺乳類宿主細胞は、マクロファージ、単球、樹状細胞、およびそれらの前駆細胞から選択される。他の面において、本発明は、定義されたような哺乳類宿主細胞を培養することによって、ポリペプチドを産生する方法；定義されたようなベクターを用いる形質転換によって、哺乳類宿主または幹細胞を改変する方法；ヒトまたは動物の身体における疾病状態の処置に用いるための形質転換された哺乳類宿主または幹細胞：および遺伝子欠失によって生じたヒトまたは動物の体の疾患状態を治療するための医薬の製造のために、定義されたようなベクター、あるいは定義されたような哺乳類宿主または幹細胞を使用する方法を提供する。図図１−ヒトCD68遺伝子を含むコスミドの制限地図である。図２−ヒトCD68遺伝子の5'フランキング領域のDNA配列である（配列番号１にも示されている）。図３−安定的にトランスフェクトされたRAW細胞におけるRNA発現のノーザンブロット分析である。図４−安定的にトランスフェクトされたRAW細胞におけるCD68およびマクロシアリン（macrosialin）RNAのRT PCR分析である。図５−安定的にトランスフェクトされたRAW細胞およびA20細胞におけるRNA発現のノーザンブロット分析である。図６−安定的にトランスフェクトされたRAW細胞およびA20細胞におけるCD68およびHPRT RNAのRT PCR分析である。詳細な説明本発明によれば、CD68遺伝子として、ヒトのCD68、ヒト以外の哺乳動物のCD68 （例えば、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマまたはラットのCD68 ）、または哺乳動物以外のCD68が挙げられる。マウスのCD68は、マクロシアリンとして知られている。ヒトのCD68が好ましい。 CD68遺伝子の転写を調節するヌクレオチド配列は、市販のヒトゲノムのDNAコスミドライブラリー（Stratagene）から入手可能なCOSMID CD68C1に含まれる。転写調節配列（trs）は、一般に、少なくとも１つのプロモーター領域、および必要に応じて少なくとも１つのエンハンサー領域を含む。trsは、１つの連続したヌクレオチド配列であってもよいが、介在ポリヌクレオチドにより連結した２つ以上のそのような配列または介在ポリヌクレオチドを伴わずに連結した２つ以上のそのような配列から構成されていてもよい。trs領域は、一般に、コード領域の5'（上流）側であるが、ATG開始コドンの3'（下流）側（例えば、コード配列領域またはイントロンの中）にも見出されることがある。具体的には、ヒト CD68のtrs領域は、ATG開始コドン下流の第１イントロン中に同定されている。天然に存在する遺伝子座のtrsが、非機能的な配列（例えば、２つ以上の超過敏性部位）の介在により隔てられた２つ以上の別個の部分配列を含む場合、本発明のベクターは、除去された介在部分配列のすべてまたはその一部により連結された部分配列を２つ以上含むtrsを含んでいてもよい。本発明のベクターを使用して、CD68 trsおよびCD68 trsに作動可能に連結したポリヌクレオチドを含み、異種ポリペプチドをコードする発現カセットをゲノム内に組み込むことができる。同様に、本ベクターを使用しで、キメラ遺伝子を組み込むこともできる。いずれの場合においても、遺伝子または発現カセットのオープンリーディングフレームまたはコード配列が宿主細胞内で発現する。ベクターは、少なくとも、trsおよびオープンリーディングフレームを含む。オープンリーディングフレームはイントロンを含んでいてもよい。オープンリーディングフレームはコード領域のみを含んでいてもよい。キメラ遺伝子は、少なくとも、trsおよびオープンリーディングフレームを含む。必要に応じて、キメラ遺伝子は、複製、転写または翻訳、あるいは宿主細胞内でのポリヌクレオチド発現に重要な他の任意のプロセスを調節するポリヌクレオチド領域をさらに含む。 CD68遺伝子に関する配列位置は、一般に、上流の領域についてはATG開始コドンに関して測定され、下流の領域については停止コドンに関して測定される。単離またはクローン化は、その自然状態からの「ヒトの手による」分離をいう；すなわち、自然の中に存在する場合、その元々の環境からの変化または取り出し、あるいはその両方であることを意味する。例えば、その自然状態の生物の中に天然に存在するポリヌクレオチドまたは天然に存在するポリペプチドは、「単離」されていない。しかし、その自然状態の共存物質と分離したそのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その用語が本明細書中で用いられているとき、「単離」されている。単離の途中またはその後に、そのようなポリヌクレオチドは、例えば、変異誘発のためにDNAなどの他のポリヌクレオチドに結合させ、宿主での増殖または発現のために融合タンパク質を形成させることができる。単離されたポリヌクレオチドは、単独で、またはベクターなどの他のポリヌクレオチドに結合させ、培養中の宿主細胞または生物体内の宿主細胞に導入することができる。培養中の宿主細胞または生物体内の宿主細胞に導入された場合、その用語が本明細書中で用いられているとき、そのようなDNAは、依然として単離されている。なぜなら、そのようなDNAは、それらの自然に存在する形態または環境で存在していないからである。同様に、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、例えば、媒地処方物などの組成物、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、例えば細胞に導入するための溶液、化学反応または酵素反応用の組成物または溶液（これらは、天然に存在する組成物ではない）の中に存在し得、その点で、その用語が本明細書中で用いられているとき、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その用語が意味する範囲内にある。発現カセットそのものは、分子生物学の分野では周知である。そのような発現カセットは、哺乳動物細胞における異種酵素の発現に必要な必須DNA配列をすベて含有する。例えば、好ましい発現カセットは、正しい方向で、コード配列、哺乳動物遺伝子に適切なポリアデニル化シグナル（すなわち、哺乳動物細胞で機能するポリアデニル化シグナル）ならびにエンハンサーおよびプロモーター配列を含有する。通常、哺乳動物細胞において、メッセンジャーRNAをコードする遺伝子の完全で効率的な転写調節を行うためには、プロモーターおよびエンハンサーの２つの DNA配列が必要である。プロモーターは、一般に、転写開始部位のすぐ上流（5' ）に位置する。プロモーター配列は、転写の正確で効率的な開始に必要である。遺伝子特異的な異なるプロモーターによって、共通した構造パターンが明らかにされている。典型的なプロモーターは、（転写開始部位の5'側、約30塩基対のところに位置する）TATAボックスと呼ばれるATに富む領域、および１つ以上の上流プロモーターエレメント（UPE）を含む。UPEは、配列特異的な核転写因子との相互作用に必要な主要標的である。プロモーター配列の活性は、エンハンサーと呼ばれる他の配列により調節される。エンハンサー配列は、上流（5'）または下流（ 3'）のいずれかの位置で、プロモーターから遠く離れていることがある。従って、エンハンサーは、方向および位置に無関係な様式で作用する。しかし、互いに交換可能で類似する構造および機能に基づけば、プロモーターとエンハンサーとの間を完全に区別することは、あまり意味のないことである。エンハンサーによって、プロモーター配列からの転写速度が増大する。それは、主として、哺乳動物細胞に組織特異的な遺伝子発現を可能にするUPE配列およびエンハンサー配列による配列特異的な転写因子との相互作用である。UPEおよびエンハンサー（シス作用する調節配列）に結合するこれらの転写タンパク質因子（組織特異的なトランス活性化因子）の存在は、RNAポリメラーゼを含む転写機構の他の成分が組織特異的な選択性および正確性で転写を開始することを可能にする。当該分野で公知であるように、同一性とは２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係であり、配列を比較することによって求められる。当該分野では、同一性はまた、ポリヌクレオチド間の配列類縁性の程度を意味し、そのような配列間の照合によって求められる。同一性は、容易に計算することができる（Computatio nal Molecular Biology、Lesk，A.M.編、Oxford University Press、New York、1 988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects、Smith，D.W.編、Academ ic Press、New York、1993；Computer Analysis of SequenceData、Part I、Gri ffin，A.M.およびGriffin，H.G.編、Humana Press、New Jersey、1994；Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje,G.、Academic Press、1987；およびSequence Analysis Primer、Gribskov，M.およびDevereux，J.編、M Stockt on Press、New York、1991）。２つのポリヌクレオチド配列間の同一性を求める方法は多数存在するが、この用語は当業者には周知である（Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje G.、AcademicPress、1987；Sequence Analy sis Primer、Gribskov，M.およびDevereux，J.編、 M Stockton Press、New York、1991；およびCarillo,H.およびLipman，D.、SIAM J．Applied Math.、48:1073(1988)）。配列間の同一性を求めるために広く用いられている方法は、Carillo，H.およびLipman，D.、SIAM J.AppliedMath.、48:1 073(1988)に開示されている方法であるが、これらに限定されない。同一性を求める好ましい方法は、調べる配列の間に最大の一致が得られるように設計されている。同一性を求める方法は、コンピュータープログラムにまとめられている。２つの配列間の同一性を求める好ましいコンピュータープログラム法として、GCGプログラムパッケージ（Devereux，J．ら、Nucleic Acids Resear ch 12(1):387(1984)）、BLASTP／BLASTN／FASTA（Atschul，S.F．ら、J．Molec ．Biol．215:403(1990)）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書中で規定されたポリヌクレオチドに対して、70％以上の同一性を有するポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドにおける少なくとも１ヌクレオチドの置換、付加、欠失、融合もしくは切り取り（truncation）に基づいて規定される配列と異なっていてもよい。 CD68遺伝子のマクロファージ特異性に重要であると見出された、CD68遺伝子の領域の１つは、ATG開始コドンから、ATG開始コドンの約80塩基対上流（5'側）のヌクレオチドの領域である。これは、-80bp領域と呼ばれる。重要であることが見出されている第２の領域は、CD68遺伝子のATG開始コドンの下流領域（3'側）であり、それは開始コドンの第１のPU.1部位下流を含有している。PU.1部位は、マクロファージ、好中球およびB細胞で発現されるerfファミリー転写因子に結合し得るDNA配列である。開始コドンの第１のPU.1部位下流はイントロン内に含まれる。ヒトCD68では、第１のPU.1部位を含有するイントロンは開始コドンのヌクレオチド32位〜ヌクレオチド137位である。第１の下流PU.1部位および−80bp領域を含有する領域を作動可能に連結すると、マクロファージ特異性を示す。配列番号２は-80bpからATG開始コドンまでのヒト CD６８の配列を含み、PU.1およびATG開始コドンの第１イントロン下流を含む。特異性を示すのに重要であることが見出されているさらなる領域は、ATG開始コドンの約110bp上流のPU.1を含有する領域である。従って、ATG開始コドンからAT G開始コドンより約150塩基対上流までのヌクレオチド配列は、マクロファージ特異的発現を増大する。特異性を示すさらなる領域はPU.1部位に存在し、ATG開始コドンから約432塩基対上流であることが見出されている。従って、ATG開始コドンから開始コドンより約460塩基対上流まで延在するヌクレオチド配列は、マクロファージ特異的発現をさらに増大する。遺伝子が上記の配列のいずれかの制御下で発現されると、高いマクロファージ特異性が観察される。遺伝子が開始コドンの2940塩基対上流からTGA終止コドンの335塩基対まで延在する領域の制御下で発現される場合にも、高いマクロファージ特異性が観察される。マクロシアリンの第１イントロンの最初の配列も決定されており、それは本発明のポリヌクレオチドである。マクロシアリンのオープンリーディングフレームの全配列を配列番号４に示す。マウスcDNA配列から誘導されるオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、Sv129マウスゲノムDNA由来の1759bpフラグメントをPCR 増幅した。ゲノムのPCR産物をInVitrogenプラスミドベクターpCRIIにクローン化し、マクロシアリン遺伝子の配列を二本鎖DNAのダイターミネーターDNA配列決定法により決定した。DNAコーディング配列を大文字および下線を付して示し、5' および3'非翻訳領域ならびに介在配列を小文字で示す。ATGイニシエーターおよびTGAターミネーターコドンには下線を付している。従って、本発明は、（ａ）本明細書において規定されるポリヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性を有するポリヌクレオチドフラグメント；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドのうち連続する少なくとも15個の塩基を含むポリヌクレオチド；を含むポリヌクレオチド。好ましくは、ポリヌクレオチドは本明細書において規定されるポリヌクレオチドに対して少なくとも80％の同一性、より好ましくは本明細書において規定されるポリヌクレオチドに対して少なくとも90％の同一性を有する。最も好ましくは、本発明の単離ポリヌクレオチドは本明細書において規定されるポリヌクレオチドを含む。具体的には、本発明は、（ａ）配列番号3のポリヌクレオチドに対して少なくとも70％の同一性を有するポリヌクレオチドフラグメント；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の連続する少なくとも15個の塩基を含むポリヌクレオチド；を含む単離ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを提供する。本発明の好ましいヌクレオチドは第1のPU1部位および-80bp領域を含有する領域を含む。さらに好ましいヌクレオチドは、ATG開始コドンからの相対位置が+150bp〜-13 7bpの領域を含む。さらに好ましいヌクレオチドは、ATG開始コドンからの相対位置が+460bp〜-13 7bpの領域を含む。これらの領域のそれぞれのヌクレオチド配列は配列番号３から決定され得、これは、CD68 ATG開始コドンの5'側2951bp（太字で示す）からCD68のTGA開始コドンの3'側2090bp（太字で示す）までのコスミドCD68C1の配列を示す。イントロンの配列を小文字で示し、CD68コーディングおよび3'非翻訳領域に下線を付している。本発明のヌクレオチド配列のそれぞれを逆方向の形態で使用してもよい。上記の領域のそれぞれの１を超えるコピー、例えば2、3または4コピーを用いて単一の遺伝子の発現を制御してもよい。領域の１を超えるコピーを使用する場合、コピーは好ましくは作動可能に連結される。領域は、組み合わせても、または単独で使用してもよい。配列番号2をプローブとして用いて、配列番号3の位置を決定してもよく、次いで、これは公知の制限部位を用いて従来の技術に従い操作され得る。マクロファージ特異的遺伝子調節配列の調査では、コスミドベクターpWE15におけるヒトゲノムDNAライブラリーのPCRスクリーニングによってヒトCD68遺伝子を含有する組換えコスミドを単離した。ヒトCD68は、マウスマクロシアリンのヒト相同体であり、このタンパク質はすべての単球およびマクロファージのファゴソーム区画において見出される。14キロベースの5'フランキング配列および25キロベースの3'フランキング配列を有する全CD68遺伝子を含有する２つのタイプのヒトCD68コスミドが観察された（図1）。コスミドをプローブとして用いて、ヒトCD68遺伝子がヒト第17染色体の短腕上に位置することを示した。コスミドをテンプレートとして用いて、CD68遺伝子および1870bpのCD68プロモーターのDNA配列を決定した（図2）。 CD68コスミドをマウスマクロファージ細胞株RAW264.7にトランスフェクションし、G418中で増殖させることにより安定にトランスフェクションされたRAW細胞集団およびポリクローンを選択した。放射性標識ヒトCD68遺伝子プローブ（図3A ）およびRNAの充填および移動についてのコントロールに対するマウスリゾチームプローブ（図3B）を用いてG418耐性RAW細胞から単離された全RNAのノーザンブロット分析を行った。末梢血単核細胞（PBMC）培養物から調製した総RNAを同フィルター上で分析した。ヒトCD68コスミドをトランスフェクションしたRAW細胞は、予想されるサイズのヒトCD68 mRNAを極めて高いレベルで発現する。ヒトCD68 mRNAのレベルは、培養したヒト単球よりもコスミドをトランスフェクションした RAW細胞のほうが高い。この結果は、ヒトCD68およびマウスマクロシアリン特異的PCRプライマーを用いて、トランスフェクションしたRAW細胞RNAを逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）分析で分析することによって確認した（図4）。トランスフェクションしたヒトCD68遺伝子は、内在性マウスマクロシアリン遺伝子よりも高いレベルで発現される。同じCD68コスミドDNAをマウスA20 B細胞および3T3繊維芽細胞にトランスフェクションした。CD68 RNA発現のノーザンブロット分析は、CD68 mRNAのレベルが、同じコスミドでトランスフェクションしたマウスマクロファージ細胞株RAW264 .7において観察されるレベルよりも50倍低いことを示した（図5）。これらの結果を、トランスフェクションした細胞のRNAをCD68およびHPRT特異的PCRプライマーを用いてRT-PCR分析することによって確認した（図6）。 G418耐性RAW細胞集団由来の単一細胞クローンを単離し、トランスフェクションされたRAW264.7細胞において導入遺伝子のコピー数と導入遺伝子の発現との間に直接的関係があるか否かについて決定するために分析する。これは、CD68コスミドにマクロファージ特異的遺伝子座調節領域が存在する場合に予測される。コスミドをトランスフェクションしたRAW細胞に認められるきわめて高いレベルのヒトCD68 mRNA（図3、4および５）は、重要なマクロファージ特異的遺伝子調節エレメントがCD68コスミドのcosCD68C1およびcosCD68g1内に含まれることを示す。トランスジェニック動物実験においてヒトリゾチームプロモーターを用いる本発明者らの研究は、マクロファージにおける導入遺伝子発現のための介在領域およびポリA+付加配列に対する重要な役割を示している（7,8）Dighe，A.S.， et al．Immunity，1995，3，657-666およびS.，et al Proc．Natl．Acad。Sci． (USA)，1996，93;1434-1438。効率的な導入遺伝子の発現における介在配列に対する役割については、他の多くの系において記載されている。マクロファージ特異的遺伝子発現ベクターの開発単球およびマクロファージにおいて異種遺伝子を高レベルで発現させるためには、CD68発現ベクターを設計するのが好ましい。そのようなベクターは、ヒトCD 68コスミドにおけるすべてのDNA配列を含み、これは、高レベルのマクロファージ特異的遺伝子発現を指令し、CD68イントロンおよびポリA+配列ならびに目的の異種遺伝子をコードするcDNAの挿入物のための独特な制限酵素認識部位を伴う。コスミドcosCD68C1に存在するヒトCD68遺伝子配列の操作を容易にするために、5.5kbの5'フランキングおよび12.5kbの3'フランキング配列を伴う全ヒトCD68 遺伝子を含む20kbのEcoRIフラグメントを、プラスミドベクターBluescript SK（ Stratagene）の独特なEcoRI部位にクローン化して組換えプラスミドpCD68R1A（図1）を得た。２つのさらなる組換えプラスミドを、ヒトCD68遺伝子の5'フランキングおよび3'フランキング配列を含有するpCD68R1A、pCD68RS1およびpCD68SR1 から誘導した（図1）。CD68遺伝子プロモータの直ぐ上流およびCD68遺伝子のATG 開始コドンの直ぐ下流の異種遺伝子をコードするcDNAの挿入物を操作するために、プラスミドpCD68RS1を制限酵素BstX1で設計し、CD68 ATG開始コドンを除去するT4 DNAポリメラーゼで処理した後3kbのBstX1フラグメントをプラスミドベクターであるBluscript SK（Stratagene）にクローン化した（図2）。図１に示す組換えプラスミドに存在するヒトCD68ゲノムDNAフラグメントは、マクロファージ細胞株、トランスジェニック動物およびヒトの初代細胞における使用のための適応性に富みかつ容易に操作されるヒトCD68発現系の開発を可能にする。表１一過的にトランスフェクションしたRAW264.7およびP388.D1細胞におけるC D68プロモーター5'欠失系列のプロモーター活性 20μgの指示されたCATレポータープラスミドおよび５μgのβ-ガラクトシダーゼレポータープラスミドpcDNA3β-galの存在下で、RAW264.7またはP388.D1細胞をエレクトロポレーションした。トランスフェクションの48時間後に、細胞溶解物を実験手順に記載のようにβ-ガラクトシダーゼおよびCAT酵素活性について分析した。細胞溶解物のCAT酵素活性をトランスフェクション効率に対して補正した。同実験におけるSV40プロモーター／エンハンサープラスミドpCATControlによって得られたCAT酵素活性の百分率としてデータを表す。すべての細胞溶解物のCAT酵素活性は、同実験において分析したCAT酵素希釈系列から決定されるように、アッセイの直線範囲内にあった。示したデータは単一のトランスフェクション実験に由来する。相対プロモーター活性は、両細胞株において各構築物を用いた少なくとも3つの独立したトランスフェクション実験において再現性が認められた。表２一過的にトランスフェクションしたマウスマクロファージ細胞株における骨髄遺伝子プロモーター活性の比較 20μgの指示されたCATレポータープラスミドおよび５μgのβ-ガラクトシダーゼレポータープラスミドpcDNA3β-galの存在下で、P388.D1またはRAW264.7細胞をエレクトロポレーションした。トランスフェクションの28時間後に、細胞溶解物を実験手順に記載のようにβ-ガラクトシダーゼおよびCAT酵素活性について分析した。細胞溶解物のCAT酵素活性をトランスフェクション効率に対して補正し、同実験におけるSV40プロモーター／エンハンサープラスミドpCATControlによって得られたCAT酵素活性の百分率として表した。すべての細胞溶解物のCAT酵素活性は、同実験において分析したCAT酵素希釈系列から決定されるように、アッセイの直線範囲内にあった。示したデータは単一のトランスフェクション実験に由来する。プロモーター活性は、各構築物を用いた少なくとも２つの独立したトランスフェクション実験において再現性が認められた。表３プラスミド遺伝子プロモーター受託番号 -24940CD68pCAT hCD68 -2940〜+2* 本文献 hLZMpCAT hLysozyme +517〜+26 X57103 mLZMpCAT mLysozyme -487〜+11 D13263 CD11b pCAT hCD11b -1706〜+91 M76724 c-fes pCAT h c-fes -446〜+71 X06292 hMSRpCAT h MSR -487〜+11 D13263 表３は本発明において使用した骨髄プロモーターを示す。すべての骨髄遺伝子プロモーターフラグメントをCATレポーターベクターpCATB asicの複数のクローニング部位にクローン化した（実験手順を参照）。ヒトの遺伝子をｈで表し、マウスの遺伝子をｍで表す。示したプロモーター候補は、Genbank受託番号から取得し、主な転写開始部位を+1として表す。但し、CD68ではATG開始コドンのＡを+1として表す(*)。表５一過的にトランスフェクションしたRAW264.7およびCHO細胞株におけるCD6 8第１イントロンの効果 20μgの指示されたCATレポータープラスミドおよび５μgのβ-ガラクトシダーゼレポータープラスミドpcDNA3β-galの存在下で、RAW264.7細胞をエレクトロポレーションした。トランスフェクションの48時間後に、トランスフェクションした細胞溶解物をβ-ガラクトシダーゼおよびCAT酵素活性について分析した。CHO 細胞を4.5μgの指示されたCATレポータープラスミド、および50μgの陽イオン性脂質Lipofectamine（Gibco BRL）と複合した0.5μgのβ-ガラクトシダーゼレポータープラスミドpcDNAでトランスフェクションした。細胞溶解物のCAT酵素活性をトランスフェクション効率に対して補正し、同実験において分析したSV40プロモーター／エンハンサープラスミドpCATControlによって得られたCAT酵素活性の百分率として表した。すべての細胞溶解物のCAT酵素活性は、同実験において分析したCAT酵素希釈系列から決定されるように、アッセイの直線範囲内にあった。示したデータは単一のトランスフェクション実験に由来する。プロモーター活性は、各細胞株の各構築物を用いた少なくとも３つの独立したトランスフェクション実験において再現性が認められた。表４ CD68およびHIVプロモーターに対するCD68の第１イントロンの効果 20μgの指示されたCATレポータープラスミドおよび５μgのβ-ガラクトシダーゼレポータープラスミドpcDNA3β-galの存在下で、RAW264.7およびP388.D1細胞をエレクトロポレーションした。トランスフェクションの48時間後にトランスフェクションした細胞溶解物をβ-ガラクトシダーゼおよびCAT酵素活性について分析した。細胞溶解物のCAT酵素活性をトランスフェクション効率に対して補正し、同実験において分析したSV40プロモーター／エンハンサープラスミドpCATCont rolによって得られたCAT酵素活性の百分率としてデータを表す。すべての細胞溶解物のCAT酵素活性は、同実験において分析したCAT酵素希釈系列から決定されるように、アッセイの直線範囲内にあった。示したデータは単一のトランスフェクション実験に由来する。プロモーター活性は、各細胞株において各構築物を用いた少なくとも3つの独立したトランスフェクション実験において再現性が認められた。方法プロモーターレポータープラスミドの構築 cosCD68C1よりサブクローン化されたEcoR1-Spelフラグメントから、2940塩基対のBstX1フラグメントを精製した。BstX1フラグメントをT4DNAポリメラーゼおよび4種すべてのdNTPとインキュベーションすることにより平滑末端化し、プラスミドpCD68Bst3-2に挿入するためにpBluescipt SK-(Stratagene)のEcoRV部位内でクローン化を行った。BsX1の3'部位はCD68ATG開始コドンを有しており、この部分をT4DNAポリメラーゼの3'エキソヌクレアーゼ活性により除去した。プラスミド-2940CD68pCATに挿入するため、CD68ATGコドン上流に2940塩基対のDNAを有するHindIII-XbaIフラグメントをレポーターベクターpCAT Basic（Promega、Gen ebank受託番号X65322）内でクローン化した。プラスミド-2940 CD68pCATをXhol 、BgIIIあるいはSst1で切断し、DNAポリメラーゼであるKlenowフラグメントあるいはT4 DNAポリメラーゼで処理することにより、突出端をリン酸化HindIIIリンカーで連結する前に平滑化した。HindIIIおよびXbaIで切断した5'切断CD68プロモーターフラグメントをゲルから精製し、プラスミド-2258CD68pCAT、-1576CD68 pCATおよび-951CD68pCATに挿入するため、HindIIIおよびXbaIで切断したpCATBas ic内でサブクローン化した。プラスミド-2940CD68pCATを鋳型とし、HindIII部位を加えた5'オリゴヌクレオチドプライマーと、プラスミド-2940 CD68pCATのXbaI クローニング部位を連結した通常の3'PCRプライマー（表1に列挙）を用い、他のすべてのCD68プロモーター欠失部をPCRにより作成した。増幅したフラグメントをHindIIIおよびXbaIで切断し、ゲルから精製した後、プラスミド-333CD68pCAT 、-232CD68pCAT、-150CD68pCATおよび-80 CD68pCATに挿入するためHindIIIおよびXbaIで切断した-pCATBasic内でサブクローン化した。CD68遺伝子の第１イントロンを、EcoR1およびXbaI部位（下線部）を加えたプライマー5'ccggaattcTGCTGG GGCTACTGGCAGおよび5'tgatctagaGTCCCCTGGGCTTTTGGCAGを用いてPCR増幅を行った。EcoR1およびXbaI切断後、CD68イントロンフラグメントをプラスミドpCD68BstI VSに挿入するため、EcoR1およびXbaIで切断したpCD68Bst3-2内でクローン化した。また、3022塩基対のHindIII-XbaIフラグメントをプラスミド-2940IVSpCATに挿入するため、pCATBasic内でクローン化した。HIV最小LTR構築物がLewらにより報告されている（1991 Mol.Cell.Biol.11、182-191）。HIVta r配列における非反復性のBgIII部位にpCD68BstIVSのEcoR1からXbaIIVS1までのフラグメントを連結することによって、構築物HIV IVS pCATを作製した。すべての CD68プロモーターレポーター構築物をM13逆方向およびCATプライマーを用いて配列決定すると、図示したCD68プロモーター配列と正確に一致することが明らかになった。1.7kbのHindIII-BamH1（平滑）フラグメントは、-1706から+91まで配列しているCD11bを有している。このフラグメントをプラスミドpB202から切り出し（Dzjemmis et al,1995，Blood，85，319-329）、クローンCD11b pCATに挿入するためpCATBasicのHindIIIおよびXbaI（平滑）部位間でクローン化した。516塩基対のHindIII-XbaIフラグメントは、-446から+71まで配列しているc-fesを有している。このフラグメントをプラスミドp446（Celeste Simon、Heydemannらの好意による、1996）から切り出し、プラスミドc-fes pCATに挿入するためpCATBasi cのHindIIIおよびXbaI部位間でクローン化した。クローンDNAあるいはヒトゲノムDNAを鋳型に、表１に列挙した公開された配列から設計したプライマーを用い、他の骨髄性の遺伝子プロモーターをPCRによりクローン化した。SV40初期スプライシングおよびプラスミドpMSG（Pharmacia）のポリアデニル化配列を有するS maI-BamH1を、Sma-BamH1で切断したプラスミドpH2KBSに連結した。このpH2KBSは、プラスミドpH2KSVに挿入するためpBluescript（D．Mokophidis医師の好意による）のEcoRIII部位内でクローン化した1.6kbのH2K cDNAを有している。 pH2KSVの2.5kb HindIII-BamH1フラグメントをT4DNAポリメラーゼ処理により平滑末端化し、プラスミドpCD68-H2KSVに挿入するため小さく切断したCD68プロモータープラスミドpCD68Bst3-2に連結した。また、同等のpH2KSVフラグメントをh LZM-H2KSVに挿入するため、HincIIで切断したヒトリゾチームプロモータープラスミドpBH7.4内に連結した（Clarke et al.，1996）。プラスミドpKb-HindIIIは、 H2kb遺伝子における7.4kbのHindIIIゲノムDNAを有している(Weiss et al.，1992 )。 500mlのE.coli培養液をNaOH/SDSで溶菌することによりスーパーコイル状プラスミドDNAを作製した。これをCsCl／臭化エチジウム勾配中で平衡遠心した後、フェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製した（Sambrook Fritsch&Maniatis 1989）。哺乳動物細胞の培養および一過性トランスフェクションマウスマクロファージ細胞株RAW264.7およびP388.D1を、10％熱不活化ウシ胎児血清（FCS）（Sigma）、100単位／mlペニシリン、100μg／mlストレプトマイシン、２mMグルタミンおよび10mM Hepes（pH7.0）を補充したRPMI 1649培地（Gi bco BRL）に維持した。CHO K1細胞を、10％FCS、抗生物質およびグルタミンで補充したHamのF-12培地（Gibco BRL）に維持した。すべての細胞を５％ＣＯ₂／空気中加湿型インキュベーターにおいて37℃で増殖させた。RAW264.7およびP388.D 1細胞をT175フラスコにおいて集密度まで増殖させ、リン酸緩衝化生理食塩水（P BS）中で回収し、RAW細胞に対してはOptimeml無血清培地（Gibco BRL）またはP3 88D1細胞に対してはRPMI 1640（FCS含まず）中で１度洗浄し再懸濁した。細胞を計数し、最終密度を４×１０⁷個の細胞／mlに調整した。２×１０⁷個の細胞（0. 5ml）のアリコートを50μgのCATレポータープラスミドDNAおよび５μgのpcDNA3 β-ガラクトシダーゼプラスミドDNAと混合し、0.4cm電極ギャップエレクトロポレーションキュベット（BioRad）に添加し、BioRad Gene Pus1ser（300V、960μ FD）中室温でショックを与えた。細胞を直ちに、予め37℃に加温し、35mmおよび直径９cmの組織培養ペトリ皿（Nunc）にプレート化した10mlの細胞増殖培地中に回収した。エレクトロポレーション24時間または48時間後に、固定、振盪させた細胞を、記載（Hogan et al:1994）のように5-ブロモ-4-クロロ-3-インドイル- β-D-ガラクトピラノシド（X-ga1、Sigma）で染色することによって細胞をトランスフェクション効率について分析した。通常20〜30％の一過性トランスフェクション効率がP388.D1マウスマクロファージで得られ、最適化後はRAW264. 7細胞で40％を超える一過性トランスフェクション効率を得ることができた。CHO 細胞を９cmのペトリ皿内で70〜80％の集密度まで増殖させ、５mlのプラスミドDN A：脂質複合体（Optiment中５μg DNA：50μgリポフェクトアミン（Gibco BRL））を添加する前にOptimentで２回洗浄した。６〜16時間のインキュベーション後、培地を吸引し、細胞をPBSで2回洗浄し、分析の24〜36時間前に完全培地に回収した。通常、X-ga1染色およびFACS分析は40％を超えるCHO細胞の一過性トランスフェクション効率を示した。レポーター遺伝子のアッセイトランスフェクションした細胞をPBS中に掻き出すことによって回収し、PBSで 1回洗浄して細胞のペレットを100μlの0.25M Tris-HCl（pH7.8）中に再懸濁し、３回の凍結解凍溶解に供した。２mM MgCl₂を含む50mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.3）中で96穴プレートアッセイにおいて発色基質のクロロフェノールレッドβ- D-ガラクトピラノシド（CPRG、Boehringer Marmheim）を用いることによって、細胞溶解物をβ-ガラクトシダーゼ酵素活性についてアッセイした。精製したE.c oliβ-ガラクトシダーゼ酵素（Sigma）の希釈物を用いて標準曲線を作成し、37 ℃で30分間インキュベーションした後に570nmでの分光法により酵素活性を測定した。補因子として0.2ｍｇ／mlのn-ブチリルCoAを含有する0.25M Tris-HCl（pH 8.0）中の125μl反応において基質として10μCi¹⁴C標識クロラムフェニコール（ 54Ci/mmol、Amersham）を用い、細胞溶解物のCAT酵素活性を熱処理（65℃、20分間）後に測定した。37℃で2時間インキュベーション後、混合キシレン（Aldrich ）中に抽出されたブチリル-¹⁴Ｃクロラムフェニコールの量を決定することによって、CAT酵素活性を測定した（参考文献を参照のこと）。核実験において精製C AT酵素（Promega）の希釈物を使用することによってCAT酵素の標準曲線を作成したところ、トランスフェクションした細胞の抽出物を用いたすべての CAT酵素アッセイは、酵素アッセイの直線範囲内にあった。図１ヒトCD68遺伝子を含有するコスミドの制限地図 PCRプライマーCD68 L1およびCD68 L2を用い、機械的に拾い上げたアンピシリン耐性HB101クローンのプールをPCRスクリーニングすることにより、ベクターpW E15中にヒトCD68遺伝子を含有する組換えコスミドを単離した。CD68 PCR陽性の単一クローンを用いて、コスミドDNAを調製し、放射性標識CD68遺伝子プローブを用いて制限地図およびサザンブロッティングにより分析した。制限酵素Spe I （Spe）、Cla IおよびNot Iに対する部位を示す。括弧内のNot I部位（Not I）は、pWE15コスミドベクターのクローニング部位由来であり、ヒトゲノムDNA挿入物に隣接する。組換えプラスミドpCD68R1Aを示すために、cosCD68CD68C1の地図の下に、プラスミドベクターpBluescriptSKにクローン化された20kbのEcoRIフラグメントの位置を示す。プラスミドベクターpBluescriptSKにクローン化された他のcosCD68C1 制限フラグメントの位置も示す。3'末端側にCD68遺伝子ATG開始コドンを含有する３kbのBStXIフラグメントを示す。図２ヒトCD68遺伝子の5'フランキング領域のDNA配列テンプレートとしてのCD68コスミドおよび公開されているヒトCD68 cDNA配列( 17)由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて二本鎖配列決定を行うことにより、CD68遺伝子の5'フランキング領域のDNA配列を決定した。CD68遺伝子のATG コドンをコードするイニシエーターのメチオニンはBstXI制限酵素認識部位内に含まれ、枠で囲まれている。CD68コーディング領域に下線を付し、公開されているCD68 cDNA配列との比較から類推される介在配列を垂直の矢印で表す。配列を両方の鎖上で確認してはいないが、複数の配列の読み取りでのあいまいな部分は、Nus．Acids．Res．13，3021-3030（1985）に記載のIUPAC-IUB基準に従い、小文字で示す。配列中の点線は化学結合を示す。図３安定にトランスフェクションされたRAW細胞におけるRNA発現のノーザンブロット分析 G418耐性RAW細胞集団（少なくとも10,000個の独立したG418耐性コロニーに由来する）またはポリクローン（50〜100個の独立したG418耐性コロニーに由来する）から総RNAを調製した。RAW細胞を,10μgのスーパーコイル状またはPvu I線状CD68コスミドまたはG418に対して耐性を示すpcDNA3 CATプラスミドでトランスフェクションした。総RNA（10μg）をホルムアルデヒドで変性させ、アガロースゲル電気泳動に供し、ナイロン膜に移して放射性標識ヒトCD68およびマウスリゾチームプローブでハイブリダイゼーションを行った。比較のため、PMAで24時間処理したヒトTHP1 細胞から調製した総RNA（５μg）およびヒトPBMC培養物を分析した。６時間のオートラジオグラフィー暴露を示す。図４安定にトランスフェクションされたRAW細胞におけるCD68およびマクロシアリンRNAのRT PCR分析図３のノーザンブロッティングにより分析したG418耐性RAW細胞集団から調製されたRNA（10μg）を用いて、最終容積100μlの逆転写（RT）反応においてオリゴdTプライマー化cDNAを調製した。同じRNAサンプル（-RT）を用い、逆転写酵素を除いたコントロールのRT反応を行った。テンプレートとして１μlのニートRT 反応または指示された希釈物を用いて、マクロシアリンおよびCD68特異的プライマーを用いる30サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。RT PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、予想されるサイズのマウスマクロシアリンおよびヒトCD68 PCR産物の位置を示す。図５安定にトランスフェクションされたRAWおよびA20細胞におけるRNA発現のノーザンブロット分析 RAWおよびA20細胞をG418に対して耐性を示す10μgのスーパーコイル状あるいはPvu I線状CD68コスミドまたはpcDNA3 CATプラスミドでトランスフェクションした。G418耐性細胞集団から調製された総RNA（10μg）をホルムアミドで変性させ、アガロースゲル電気泳動に供し、ナイロン膜に移して放射性標識ヒトCD68プローブでハイブリダイゼーションを行った。比較のため、PMAで24時間処理したヒトTHP1細胞から調製した総RNA（５μg）およびヒトPBMC培養物を分析した。６時間のオートラジオグラフィー暴露を示す。図６安定にトランスフェクションされたRAWおよびA20細胞におけるCD68および HPRT RNAのRT PCR分析図３および５のノーザンブロッティングにより分析したG418耐性RAW細胞集団から調製されたRNA（10μg）を用いて、最終容積100μlの逆転写（RT）反応においてオリゴdTプライマー化cDNAを調製した。テンプレートとして1R1のニートRT 反応または指示された希釈物を用いて、CD68およびHPRT特異的プライマーを用いる30サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行った。RT PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、予想されるサイズのヒトCD68 PCRおよびHPRT P CR産物の位置を示す。表１表はRAWおよびP388.D1トランスフェクションにおいてCD68 5'プロモーターを欠失すること効果を示す。 -2940pCAT 38.6 78.4 -666pCAT 37.5 74.4 -575pCAT 48.4 129.5 -460pCAT 71.6 132.2 -333pCCAT 30.5 112.3 -232pCAT 34.4 96.4 -150pCAT 11.6 176 -80pCAT 0.64 9.5 pCATBasic 0 2 pCATControl 100 100 プラスミド構築物 RAW264.7 P388.D1 表２表は、P388.D1およびRAW264.7おいて異なる脊髄遺伝子プロモーターを有するプラスミドのCATレポーター遺伝子活性のレベルを比較する。 pCAT Control 100 100 pCAT Basic 0 8.4 -2940 CD681VS 117 163.9 -2940 CD68 pCAT 39 50 hLZM pCAT 17.6 66 mLZM pCAT 20.1 73.3 CD11b pCAT 42 23 -c-fes pCAT 4.8 47.3 hMSR pCAT 3 35.5 CATレポーター RAW264.7 P388.D1 プラスミド表４表は、P388.D1およびRAW264.7細胞においてCD68およびHIV最小LTRプロモーターを有するプラスミドのCATレポーター遺伝子活性のレベルを比較する。 pCAT Control 100 100 pCAT Basic 0 0 -2940 CD681VS 117 163.9 -2940 CD68pCAT 39 50 HIV IVS pCAT 0.8 15 HIVpCAT 0.8 69 CATレポーター RAW264.7 P388D1 プラスミド表５表は、RAWおよびCHO細胞において異なるCD68プロモーターフラグメントに対してCD68 IVSイントロンを付加することの効果を示す。 pCAT Control 100 100 pCAT Basic 0 0 -2940 CD68pCAT 31 50 -2940 IVS 154 63 -80 pCAT 0.6 5 -80 IVS 53 1.9 プラスミド構築物 RAW264.7 CHOCD68 LCR についての適用可能性遺伝子療法のための送達ビヒクルとしてのマクロファージマクロファージは、重要なヒト疾患の範囲において、治療用遺伝子産物の送達について他の細胞タイプよりいくつかの重要な利点を有する。マクロファージは、高い生合成能を有する。マクロファージは、生理学的に有意な量のサイトカイン、増殖因子、炎症性メディエーター、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビターおよび他の重要な生物学的に活性な巨大分子を分泌する。マクロファージは寿命が限られている。若干分化した段階の組織（commitment tissue）に存在するマクロファージおよび補充されたマクロファージは多くても僅か1または2回分裂する。このことが多くのヒト遺伝子療法プロトコルにおいて独特な利点となる。マクロファージは実質的にすべての組織において認められる。身体の実質的にすべての組織に顕著な数でマクロファージが存在すれば、マクロファージ特異的遺伝子発現を指令するLCRの有用性が増大する。肺および腸にマクロファージが存在すれば、多くの異なる経路によるマクロファージへの組換えDNAの送達が可能になる。マクロファージは炎症部位に迅速に補充される。炎症部位に補充される細胞タイプにおいて異種遺伝子の発現を指令する能力は、しばしば、慢性炎症性疾患における治療介入に関し独特な手段を提供する。全身遺伝子療法ヒトの一遺伝子疾患が、「古典的」全身遺伝子療法の候補であるマクロファージの機能に特異的に影響を与えることは現在のところ報告されていない。しかし、CD68 LCRを使用して、重要なヒト疾患のすべての範囲においてヒトマクロファージで治療遺伝子産物を発現させ得る。候補遺伝子として挙げられるのは：実験的に誘発させた関節炎を抑制するのに、組換えレトロウイルスベクターによる炎症性ラットの膝関節への可溶生IL-1Raの局所送達が、sIL-IRAの全身投与よりも1 0,000培効率が高いことが明らかにされていることである（９）Makarov，S.S，e t al Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)，1996，93;402-406。現在、毒素ショック症候群および英国の人口の１％が慢性関節リウマチなどの多くの自己免疫疾患の治療において、抗TNFα療法が多いに注目されている。多くの重要なヒト疾患は、免疫系の調節の欠陥の結果生じる。マクロファージならびにIL-2およびIL-10などのマクロファージから分泌されるサイトカインは、Ｔ細胞の機能を調節するのに役割を果たす。トランス優性ネガティブIL-4レセプターのマクロファージ特異的発現は、潰瘍性大腸炎およびクローン病などの自己免疫疾患において適用され得る。 Apo Eおよび他のいくつかの遺伝子産物は、アテローム性動脈硬化症および脳卒中における血管の閉塞の原因であるアテローム性プラークの発生に役割を果たすことが提唱されている。アテローム性プラークに存在するマクロファージで発現されるApo Eは、血管閉塞の治療に適用され得る（10）。CD68はヒト疾患組織において見出される泡沫細胞由来のマクロファージに存在し、本発明者らは、CD 68、マクロシアリンのマウス相同体がアテローム性動脈硬化症のapo E^-/-マウスモデルのアテローム性プラークに高レベルで存在することを明らかにしている。 CD68、マクロシアリンのネズミ相同体は、酸化型LDLに結合することが報告されている（11）。アテローム性プラークに存在するマクロファージ中のヒトCD68 、ネズミマクロシアリンまたはヒトマクロファージスカベンジャーレセプターが過剰発現すると、アテローム性動脈硬化病変のアテローム性酸化型LDLの量が有効に減少する。慢性肉芽腫症（CGD）は、NAPDH酸化酵素遺伝子の変異によって生じる遺伝子疾患である。CGD患者は、食細胞において反応性の酸素代謝物を作製することができないため、患者は再発性の細菌感染症を患う。全身遺伝子療法によるCGD患者のマクロファージにおけるNAPDH酸化酵素の発現は、非常に有益である（12）。いくつかの比較的まれなヒト遺伝子疾患は、欠損細胞に取り込まれ得る精製タンパク質を提供してその遺伝子欠損を修正することにより、治療することができる。例として、ゴーシェ病患者のβセレブロシダーゼおよびリソソーム保存傷害において欠損している他の遺伝子が挙げられる（13）。リソソーム保存障害の治療でCD68 LCRが特に注目されるのは、脳に存在する小膠細胞、単各職細胞でCD68 が発現されることである。成人の小膠細胞のいくつかは補充された血液中の単球から誘導されるため、CD68 LCRはCD68 LCRベクターをトランスフェクションした補充された血液中の単球を介して、治療用遺伝子産物を発現する能力を提供し得る。感染性疾患の治療いくつかの重要なヒト病原体は、マクロファージのエンドソームコンパートメントにおいて生存し、複製する。これらには、結核、リューシュマニア症（leis maniasis）およびらい病の原因因子が挙げられる。HIVウイルスは単球中で生存し、複製する。Mycobacterium bovisを感染させたマクロファージに対してγインターフェロンの産生を標的とすることは、Tbの治療のための生存ストラテジーである。HIVデコイター配列および他の甲HIV試薬を単球およびマクロファージに送達すると、HIV感染に耐性の単球のプールが作製される。Ｔリンパ球の「細胞内ワクチン接種」のための類似の遺伝子療法プロトコルが提唱されている。マクロファージ発現系本来のβグロブリンLCRベクターを使用して、培養した赤血球細胞系統で異種遺伝子産物を過剰に産生するための発現系が開発されている（14）。CD68 LCRは、例えば、サイトカインおよび可溶性レセプター（それらのグリコシル化のパターンはそれらの生物活性に重要であった）の産生において、ヒトおよびマウスマクロファージ細胞系統での異種遺伝子の過剰発現のために使用され得る。遺伝子ワクチン接種最近、裸DNA（naked DNA）を動物に使用することによって、致死性のウイルスチャレンジに対して防御機能を有する免疫性を与え、重要な体液成功体応答を誘発させ得ることが明らかにされた。遺伝子ワクチン接種の現行のプロトコルは、 SV40またはHCMVプロモーターおよびエンハンサーに基づく標準的な哺乳動物の発現ベクターを使用している。異種遺伝子は筋原繊維（myofibre）で発現されるが、有効な免疫応答を構築するための外来性抗原を提示する細胞は知られていない（15）。マクロファージおよびおそらくは樹状細胞への異種遺伝子発現を目的としてCD68 LCRベクターを使用すると、遺伝子ワクチン接種プロトコルの効率および効力が増大する。免疫療法樹状細胞は、免疫系の細胞に提示するために高原を処理する。CD68抗原を発現するヒトの樹状細胞は、臓器移植の拒絶および自己免疫疾患において寛容性を提供するのに重要である。CD68 LCRは、骨髄または末梢血の前駆体から培養物中で増殖させた樹状細胞の重要なサブセットである。組成物本発明はまた、ポリヌクレオチド、ベクター、トランスフェクションされた細胞を含む組成物に関する。従って、本発明のポリペプチドを、細胞、組織あるいは生物で使用するための滅菌処理をしていないまたは滅菌処理をしたキャリア（例えば、被験体に投与するのに適切な薬学的キャリア）と組み合わせて用いてもよい。そのような組成物は、例えば、媒体を添加したまたは治療有効量の本発明のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を含む。そのようなキャリアとしては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられるが、それらに限定されない。処方物は投与の方式に適合させる。キット本発明はさらに、本発明の上記組成物の１つ以上の成分を充填した容器を含む診断用ならびに薬学用包装およびキットに関する。そのような容器には、製剤または生物学的製品の製造、使用、または販売を統制する行政機関によって規定された形態の通達書が添付され、ヒトに投与する製品の製造、使用、または販売のための機関による承認を受けたことを明らかにしている。投与本発明のポリヌクレオチドおよび他の化合物を、単独で、または治療用化合物などの他の化合物と組み合わせて用いてもよい。医薬組成物を、例えば、局所、経口、肛門、膣、静脈、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内または皮内などの経路での投与を含むいずれかの有効、簡便な方法で投与してもよい。医薬組成物は、一般に特定の適応症の治療または予防に対して有効量で投与される。−般に、組成物は、少なくとも約10μg/kg体重の量で投与する。ほとんどの場合、1日あたり約8ｍｇ/kg体重を超えない量で投与する。好ましくは、ほとんどの場合、用量は１日約10μg/kg〜約１mg／kg体重である。最適用量は、それぞれの治療モダリティーおよび適応に対する標準的な方法により決定し、適応症、その重症度、投与経路、合併症状などを考慮する。治療において、または予防として、有効薬剤を注射可能な組成物、例えば、滅菌した水性分散体（好ましくは、等張性）として個体に投与してもよい。あるいは、組成物を局所適用、例えば、軟膏、クリーム、ローション、眼軟膏、点眼剤、点耳剤、含嗽剤、含浸包帯および縫合糸ならびにエアゾル用として処方してもよく、例えば、保存剤、薬物の浸透を補助するための溶媒、ならびに軟膏およびクリーム中の緩和薬を含む適切な従来の添加物を含有してもよい。そのような局所処方物はまた、交換可能な従来のキャリア、例えば、クリームまたは軟膏基剤、およびローション用エタノールまたはオレイルアルコールを含有してもよい。そのようなキャリアは、約１重量％〜約98重量％の処方物を含有し；より通常的には、それらは処方物の約80重量％までを構成する。哺乳動物、特にヒトに投与するために、有効薬剤の１日の用量レベルを0.01m g／kg〜10ｍｇ／kg、代表的には約１mg／kgであることが予想される。いずれにせよ、医師が、個体に最も適切な実際の用量を決定し、特定の個体の年齢、体重および反応によって変化させる。上記の用量は、平均的な場合の例示である。もちろん、より高いまたはより低い用量範囲が当てはまる個々の例が存在し得、それは本発明の範囲内いにある。ワクチン組成物は、便宜上、注射可能な形態であるか、または他の技術、例えば、（例えば、金粒子を使用する）遺伝子銃により投与し得るか、またはエクスビボで従来のアジュバントを用いて免疫応答を増強し得る。ワクチン接種のための適切な単位用量は0.5〜５μg／kgの抗体であり、そのような用量は好ましくは１〜３週間の間隔で１〜３回投与される。適応した用量範囲では本発明の化合物による毒性の副作用は観察されず、適切な個体への有害な投与を防いでいる。本発明のポリヌクレオチド配列、ベクターおよび宿主細胞を、HIVおよびTBなどのウイルス性および細菌性感染症を含む感染性疾患、炎症性疾患、循環器系疾患、慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、網膜症、癌、例えば、腸、結腸、乳または肺癌の治療に使用してもよい。他のＬＣＲ特許マクロファージに対する導入遺伝子の発現を目的とすることにおいて、ほとんど類似の公開されているLCRは、クラスIIのLCRである。このエレメントにつては、（おそらく活性型の）マクロファージ、樹状細胞およびＢリンパ球に対して発現を指令することが記載されている（16）。安定にトランスフェクションしたマウスマクロファージ系統RAW 264.7およびマウスＢ細胞系統A20による本発明者らのデータは、既に、CD68コスミドが発現を指令し、マクロファージに対して制限されることを示している（図5および6）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年５月２２日（１９９８．５．２２）【補正内容】請求の範囲１．転写調節配列（ｔｒｓ）の機能を有し、かつ：（ａ）配列番号2のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドフラグメント；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド；または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドのうち連続する少なくとも１５個の塩基を含むポリヌクレオチド；を含むクローン化されたポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドフラグメントが配列番号２のポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．前記ポリヌクレオチドフラグメントが配列番号２のポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。４．配列番号２のポリヌクレオチドを含む請求項１、２または３に記載のポリヌクレオチド。５．ＣＤ６８の転写調節配列を含む単離されたポリヌクレオチド。６．請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む発現カセット。７．請求項６に記載の発現カセットを含む発現ベクター。８．請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。９．請求項７に記載のベクターで細胞を形質転換またはトランスフェクションする工程および前記形質転換またはトランスフェクションされた細胞を培養する工程を含むポリペプチドの製造法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/00 9/10 9/10 19/02 19/02 27/02 27/02 29/00 １０１ 29/00 １０１ 31/04 31/04 31/18 31/18 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims

【特許請求の範囲】１．転写調節配列（ｔｒｓ）の機能を有し、かつ：（ａ）配列番号２のポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％の同一性を有するポリヌクレオチドフラグメント；（ｂ）（ａ）のポリヌクレオチドに対して相補的であるポリヌクレオチド：または（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のポリヌクレオチドのうち連続する少なくとも１５個の塩基を含むポリヌクレオチド；を含むクローン化されたポリヌクレオチド。２．前記ポリヌクレオチドフラグメントが配列番号２のポリヌクレオチドに対して少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．前記ポリヌクレオチドフラグメントが配列番号２のポリヌクレオチドに対して少なくとも９０％の同一性を有する、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。４．配列番号２のポリヌクレオチドを含む請求項１、２または３に記載のポリヌクレオチド。５．ＣＤ６８の転写調節配列を含むポリヌクレオチド。６．請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと、該ポリヌクレオチドに作動可能に連結され、異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとを含む発現カセット。７．請求項６に記載の発現カセットを含む発現ベクター。８．請求項７に記載のベクターを含む宿主細胞。９．請求項７に記載のベクターで細胞を形質転換またはトランスフェクションする工程および前記形質転換またはトランスフェクションされた細胞を培養する工程を含むポリペプチドの製造法。１０．異種遺伝子が哺乳動物宿主細胞で発現され得るように前記遺伝子を前記宿主細胞のゲノムに組み込むためのベクターであって、前記ベクターが転写調節配列、前記遺伝子、および前記遺伝子の宿主細胞タイプ制限性、組み込み部位非依存性、コピー数依存性の発現を誘発し得る遺伝子座調節領域を含み、前記遺伝子座領域がＣＤ６８遺伝子の１４ｋｂ上流から２５ｋｂ下流までの領域内に位置することを特徴とする、ベクター。１１．前記遺伝子座調節領域がＣＤ６８遺伝子の５．５ｋｂ上流から１２ｋｂ下流までの領域内に位置する、請求項１０に記載のベクター。１２．前記遺伝子座調節領域がＣＤ６８遺伝子の直ぐ上流の３ｋｂのＢｓｔＸ１−ＢｓｔＸ１遺伝子座内に位置する、請求項１１に記載のベクター。１３．マクロファージ、単球および樹状細胞ならびにそれらの前駆体から選択され、請求項１０〜１２いずれか１項に記載のベクターで形質転換された哺乳動物宿主細胞。１４．成熟マクロファージである請求項１３に記載の哺乳動物宿主細胞。１５．請求項１３または請求項１４に記載の哺乳動物宿主細胞を培養する工程を含むポリペプチドの製造法。１６．哺乳動物幹細胞を請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のベクターで形質転換する工程を含む哺乳動物幹細胞および前駆細胞を改変する方法。１７．ヒトまたは動物身体における病態の治療に使用するための請求項１６に記載の改変された哺乳動物幹細胞および前駆細胞。１８．遺伝子の欠失によって生じるヒトまたは動物体の疾患の治療用薬剤を製造するための請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のベクターあるいは請求項１７に記載の哺乳動物幹細胞または前駆細胞の使用。１９．ＣＤ６８転写調節配列の制御下で発現される単離ポリペプチド。２０．転写調節配列の制御下で発現される単離ポリペプチドであって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のヌクレオチド配列を含む、単離ポリペプチド。２１．医学的治療に使用するための請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載の発現カセット、請求項７に記載の発現ベクターまたは請求項８に記載の宿主細胞。２２．治療に使用するための薬剤の製造における請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載の発現カセット、請求項７に記載の発現ベクターまたは請求項８に記載の宿主細胞の使用。