ES2260793T3 - Expresion genica en monocitos y macrofagos. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION PROPORCIONA UN POLINUCLEOTIDO CLONADO QUE TIENE LA FUNCION DE UNA SECUENCIA REGULATORIA TRANSCRIPCIONAL (SRT) Y COMPRENDE: (A) UN FRAGMENTO DE POLINUCLEOTIDO QUE TIENE AL MENOS UN 70% DE IDENTIDAD CON EL POLINUCLEOTIDO DE LA SEQ ID NO. 2; (B) UN POLINUCLEOTIDO QUE ES COMPLEMENTARIO AL POLINUCLEOTIDO DESCRITO EN (A); O (C) UN POLINUCLEOTIDO QUE COMPRENDE AL MENOS 15 BASES SECUENCIALES DEL POLINUCLEOTIDO DE LOS PARRAFOS (A) O (B).

Description

Expresión génica en monocitos y macrófagos.

La presente invención se refiere a las secuencias reguladoras de nucleótidos asociadas al gen CD68.

Antecedentes de la invención Regiones de control del locus

La expresión de genes de mamíferos se regula mediante las secuencias de ADN unidas en cis. Las secuencias de los promotores caen inmediatamente 5' del sitio de inicio de la transcripción de los genes y secuencias potenciadotas pueden caer dentro o cerca de del gen que regulan. En 1987 se mostró que las secuencias de ADN encontradas dentro de 40 kilobases (kb) 5' del gen de \beta-globina sobre el cromosoma 11 humano eran capaces de efectuar un alto nivel de número de copias dependiente de la expresión del gen de la \beta-globina en células eritroides de ratones transgénicos (1) Grosveld, F., y col. Cell, 1987, 51, 975-985. Estas secuencias de ADN que juegan un papel clave en al regulación in vivo de la expresión del gen de globina se denominan Secuencias De Control Dominante (DCR) - más tarde renombradas Regiones de Control del Locus (LCR). Las regiones de control del Locus se han descrito para otros genes de glóbulos rojos tales como los genes del locus de la \alpha-globina (2) Greaves, D. R., y col Cell, 1989, 56, 979-986 y las LCR se han descrito que dirigen la expresión génica de alto nivel en otros tipos de células. Los ejemplos incluyen el gen CD2 humano que tiene una LCR específica de células T y el extremo 3' del locus de cadena pesada de la que dirige la expresión de alto nivel en células B (3) Madisen, L. y Groudine, M, Genes and Development, 1984, B, 2212-2226. El documento WO 94/21806 describe diversas Regiones de Control de Locus, tales como secuencias de LCR de CD2 o magrófagos, y su uso para regular la expresión génica específica de tejido.

El gen CD68 se expresa en todas las células de macrófagos. La especificidad de expresión in vivo es alta. El origen de esta especificidad se ha investigado y sorprendentemente se ha encontrado que son responsables pequeñas regiones del gen CD68.

Sumario de la invención

Por lo tanto, la presente invención proporciona un polinucleótido clonado o aislado que tiene la función de una secuencia reguladora de la transcripción (trs) y que comprende:

(a)

un fragmento de polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad con el polinucleótido de la Seq ID Nº. 2;

(b)

un polinucleótido que es complementario con el polinucleótido (a); o

(c)

un polinucleótido que comprende al menos 15 bases secuenciales del polinucleótido de (a) o de (b).

Preferiblemente el fragmento de polinucleótido tiene al menos 80% de identidad al polinucleótido de la Seq ID Nº. 2, más preferiblemente al menos 90% de identidad de la Seq ID Nº. 2. Lo más preferiblemente el polinucleótido aislado de acuerdo con la invención comprende el polinucleótido de la Seq ID Nº. 2.

La presente invención además proporciona un polinucleótido aislado que comprende la región reguladora de la transcripción de CD68.

La presente invención adicionalmente proporciona un polinucleótido aislado que comprende la región reguladora de la transcripción de CD68 y un polinucleótido unido operativamente a ella que codifica un polipéptido heterólogo.

La presente invención también proporciona un vector que comprende un polinucleótido como se ha definido en esta memoria descriptiva y una célula huésped que comprende el vector.

La presente invención además proporciona un procedimiento para producir un polipéptido dicho procedimiento comprende la transformación o transfección de una célula con un vector como se define en esta memoria descriptiva de manera que la célula expresa el polipéptido codificado.

En un aspecto adicional esta invención se produce por el descubrimiento de secuencias de ADN que muestran las propiedades de una región de control del locus asociadas al gen CD68. En un aspecto la invención proporciona un vector para la integración de un gen en el material genético de una célula huésped de mamíferos de manera que el gen se puede expresar en la célula huésped, el vector que comprende un promotor y dicho gen y una Región de Control de Locus capaz de mostrar la expresión restringida al tipo de célula huésped, independiente del sitio de integración, dependiente del número de copias de dicho gen, caracterizada porque la región de control del locus está localizada dentro de una región que se extiende desde 14 kb cadena arriba a 25 kb cadena abajo del gen CD68.

Definición funcional de una LCR

Las regiones control del locus son fundamentalmente diferentes de otras secuencias reguladoras de genes porque no están sometidas a efectos de posición después de la integración en cromosomas de células huéspedes. El trabajo con la LCR del gen de la \beta-globina humana reveló los tres criterios que distinguen esta clase de secuencia de ADN a partir de otras secuencias reguladoras tales como promotores y potenciadores (1, 4, 5). Grosveld, F., y col., Cell, 1987, 51, 975-985., Blom van Assendelft, M., y col., Cell, 1989, 56, 969-977., Talbot, D., y col., Nature, 1989, 338, 352-355.

1)

Las LCR dirigen la expresión independiente de la posición de genes coligados después de la integración en genomas hospedadores o bien en animales transgénicos o en líneas celulares. Como consecuencia todos los animales transgénicos que llevan una copia intacta del transgen expresará el transgen a alto nivel. Esto es un fuerte contraste con los resultados obtenidos con otras secuencias de ADN.

2)

Las LCR muestran especificidad de tejido estricta en el patrón de expresión transgénica. Un gen de la \beta-globina humana colocado cadena abajo de de una LCR de la \beta-globina humana se expresa solamente en glóbulos rojos de ratones transgénicos (1, 4). El mismo exacto del gen de la \beta-globina humana se colocó cadena debajo de la RCL de CD2 humano a altos niveles en todas las células T pero no los glóbulos rojos de animales transgénicos (2). Greaves, D. R. y col., Cell, 1989, 56, 979-986.

3)

Las LCR dirigen la expresión de alto nivel dependiente del número de copias. Los transgenes de la \beta-globina humana se pueden expresar tan eficientemente sobre una base por copia como genes de la \beta-globina humana murina endógeno en las células eritroides de ratones transgénicos. Cuando cada transgen se expresa al mismo alto nivel esto conduce a una relación directa entre la expresión transgénica y número de copias transgénicas.

Las LCR se espera de esta manera que tengan una región que proporciona actividad de apertura de cromatina, dicha región proporciona al menos la primera y tercera actividades descritas anteriormente. Una LCR generalmente contiene al menos una secuencia reguladora de transcripción de manera que un promotor o potenciador además de la secuencia que proporciona actividad de apertura de la cromatina.

Las enfermedades genéticas \beta-talasemia y anemia de células falciformes están causadas por mutaciones dentro del locus del gen de la \beta-globina humana. Todos los glóbulos rojos del cuerpo están derivados de un número limitado de células del tronco hematopoyético encontradas en la médula ósea. La demostración de que la LCR de al \beta-globina era capaz de dirigir la expresión específica de los glóbulos rojos independientemente de su sitio de integración en el genoma conduce a los inventores a proponer la idea de terapia génica somática para la \beta-talasemia y anemia de células falciformes introduciendo, los vectores de LCR de la \beta-globina humana en células hematopoyéticas y usando tales células transfectadas en transplante de médula ósea.

Esto se describe en una de las solicitudes propuestas establecidas en las patentes de las LCR de la \beta-globina humana originales presentadas en 1987 y 1989 (patentes de Reino Unido 8718779 y 8904009.1).

La Región de Control del Locus (LCR) de la invención se puede localizar dentro de una región que se extiende entre 5,5 kb cadena arriba hasta 12 kb cadena abajo del gen CD68; particularmente entre 2940 pares de bases (bp) cadena arriba del gen CD68 a 335 pares de bases cadena abajo (mostrado en la Seq ID Nº 3) y más particularmente entre un locus BstX1-BstX1 de 3 kb inmediatamente cadena arriba del gen CD68. La LCR puede ser una sola secuencia continua o puede consistir en dos o más de tales secuencias ligadas junto con o sin polinucleótidos intermedios. La LCR puede consistir en, o derivarse de, o corresponde a uno o más sitios hipersensibles de ADN. Si la LCR del locus del gen de origen natural comprende dos o más subsecuencias discretas separadas por secuencias no funcionales intermedias (por ejemplo, dos o más sitios hipersensibles) el vector de al invención puede comprender una LCR que comprende dos o más de las subsecuencias ligadas juntas con todas o parte de las subsecuencias intermedias eliminadas.

El término "vector" como se usa en esta memoria descriptiva connota en su sentido más amplio cualquier material de ADN recombinante capaz de transferir ADN de una célula a otra.

En otro aspecto la invención proporciona una célula huésped de mamífero transformada con un vector como se ha definido. La célula huésped de mamífero se selecciona entre macrófagos, monocitos y células dendríticas y sus precursores.

En otros aspectos la invención proporciona: un procedimiento de producción de un polipéptido cultivando una célula huésped como se ha definido; un procedimiento de modificación de una célula huésped o del tronco de mamífero mediante transformación con un vector como se ha definido; células huéspedes o células del tronco de mamífero para uso en el tratamiento de una afección patológica en un ser cuerpo de un ser humano o de animal; y el uso de un vector como se ha definido, o células huéspedes o del tronco de mamífero como se ha definido, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una afección patológica del cuerpo humano o de animal provocada por una deficiencia génica.

Figuras

Figura 1 - mapas de restricción de cósmidos que contienen el gen CD68 humano.

Figura 2 - secuencia de ADN de las regiones flanqueantes de 5' del gen CD68 humano (también mostrada en la Seq ID Nº 1).

Figura 3 - Análisis de transferencia de Northern de la expresión de ARN en células RAW establemente transfectadas.

Figura 4 - análisis de PCR de TR de CD68 y ARNs de macrosialina en células RAW establemente transfectadas.

Figura 5 - Análisis de transferencia de Northern de expresión de ARN en células RAW y A20 establemente transfectadas.

Figura 6 - Análisis de PCR de RT de ARNs de CD68 y HPRT en células RAW y A20 establemente transfectadas.

Descripción detallada

De acuerdo con la presente invención los genes CD68 incluyen CD68 humano, CD68 no humano de mamífero, por ejemplo, ratón, perro, gato, conejo, cerdo, vaca, caballo o rata, o CD68 de no mamífero. El CD68 de ratón se conoce como macrosialina. Preferiblemente el CD68 es humano.

Las secuencias de nucleótidos que regulan la transcripción del gen CD68 están contenidas dentro de CD68C1 de cósmicos que se puede obtener a partir de una genoteca de cósmicos de ADN genómico humano (Stratagene).

Una secuencia reguladora de la transcripción (trs) generalmente comprende al menos una región promotora y opcionalmente al menos una región potenciadora. Una trs puede ser una secuencia continua de nucleótidos o puede consistir en dos o más secuencias ligadas juntas con o sin polinucleótidos intermedios. Las regiones trs están generalmente 5' (cadena arriba) de la región codificadora pero también se puede encontrar en 3' (cadena abajo) del codón de inicio ATG, por ejemplo en regiones de la secuencia codificadora o en un intrón. Específicamente las regiones de las trs de CD69 humano se han identificado en el primer intrón cadena abajo del codón de inicio ATG.

En la trs del locus del gen de origen natural comprende dos o más subsecuencias discretas separadas por secuencias intermedias no funcionales (por ejemplo, dos o más sitios súper hipersensibles) el vector de la invención puede comprender una trs que comprende dos o más de las subsecuencias eliminadas.

El vector de la invención se puede usar para integrar en el genoma un módulo de expresión que comprende una trs de CD68 y un polinucleótido ligado operativamente a ella que codifica un polipéptido heterólogo. El vector también se puede usar para integrar un gen quimérico.

En cualquier caso la fase abierta de lectura o secuencia codificadora del gen o módulo se expresa en la célula huésped.

El vector comprende al menos una trs y una fase abierta de lectura. Una fase abierta de lectura puede comprender intrones. Una fase abierta de lectura puede comprender solamente regiones codificadoras.

Un gen quimérico comprende al menos una trs y una fase abierta de lectura. Opcionalmente un gen quimérico comprenderá adicionalmente regiones de polinucleótidos que regulan la replicación, transcripción o traducción o cualquier otro proceso importante para la expresión del polinucleótido en la célula huésped.

La posición de las secuencias con relación al gen CD68 se mide generalmente al codón de inicio ATG para las regiones cadena arriba y con relación al codón de parada para las regiones cadena abajo.

Aislado o clonado significa separado "por la mano del hombre" a partir de su estado natural; es decir, que, si existe en la naturaleza, se puede cambiar o eliminar a partir de su ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presentes un organismo vivo en su estado natural no está "aislado", pero el mismo polinucleótido o polipéptido se separan de los materiales coexistentes de su estado natural se "aísla", como el término se emplea en esta memoria descriptiva. Como parte o después del aislamiento, tales polinucleótidos se pueden unir a otros polinucleótidos, tales como ADNs, para mutagénesis, para formar proteínas de fusión, y para la propagación o expresión en un huésped, por ejemplo. Los polinucleótidos aislados, solos o unidos a otros polinucleótidos tales como vectores, se pueden introducir en células huéspedes, en cultivos o en organismos enteros. Introducidos en células huéspedes en cultivo o en organismos enteros, tales ADN estarán todavía aislados, como el término se usa en esta memoria descriptiva, debido a que no estarían en su forma o ambiente de origen natural. De manera similar, los polinucleótidos y polipéptidos pueden aparecer en una composición, tal como formulaciones de medios, soluciones para la introducción de polinucleótidos o polipéptidos, por ejemplo, en células, composiciones o soluciones para las reacciones químicas o enzimáticas, por ejemplo, que no son composiciones de origen natural, y, en ese respecto permanecen polinucleótidos
o polipéptidos aislados dentro del significado que ese término como se emplea en esta memoria descriptiva.

Los módulos de expresión ellos mismos se conocen bien en la técnica de biología molecular. Tal módulo de expresión contiene secuencias de ADN esenciales requeridas para la expresión de la enzima heteróloga en una célula de mamífero. Por ejemplo, un módulo de expresión preferido contendrá una quimera molecular que contiene una secuencia codificadora de una señal de poliadenilación para el gen de mamífero (es decir, la señal de poliadenilación que funcionará en una célula de mamífero), y potenciadores y secuencias promotoras en la orientación
correcta.

Normalmente, se requieren dos secuencias de ADN para la regulación eficaz de la transcripción de los genes que codifican ANN mensajeros en células de mamíferos; promotores y potenciadores. Los promotores están generalmente localizados inmediatamente cadena arriba (5') del sitio de inicio de al transcripción. Las secuencias promotoras se requieren para el inicio requerido y preciso de la transcripción. Diferentes promotores específicos de genes revelan un patrón común de organización. Un promotor típico incluye una región rica en AT llamada una casilla TATA (que está localizada aproximadamente 30 pares de bases de 5' al sitio de comienzo de la transcripción) y uno o más elementos promotores cadena arriba (UEP). Los UEP son una diana de principio para la interacción con factores de transcripción nuclear específicos de secuencias. La actividad de secuencias promotoras está modulada por otras secuencias llamadas potenciadotas. La secuencia potenciadora puede estar a una gran distancia del promotor en o bien una posición cadena arriba (5') o cadena abajo (3'). Por lo tanto, los potenciadores de una manera independiente de la orientación y posición. Sin embargo, basándose en una organización y función estructural similar que se pueden intercambiar, la distinción absoluta entre promotores y potenciadores es algo arbitraria. Los potenciadores incrementan la velocidad de transcripción a partir de la secuencia promotora. Es predominantemente la interacción entre los factores de transcripción específicos de secuencia con el UPE y secuencias potenciadotas que permiten que las células de mamífero logren la expresión génica específica de tejido. La presencia de estos factores de proteína de la transcripción (factores transactivadores, específicos de tejido) unidos a UEP y potenciadores (secuencias que actúan en cis, reguladoras) que capacitan a otros componentes de la maquinaria de transcripción, incluyendo al ARN polimerasa, para iniciar la transcripción con selectividad y precisión específica de
tejido.

Identidad, como se conoce en la técnica, es al relación entre dos o más secuencias de polinucleótidos, como se determina comparando las secuencias. En la técnica, identidad también significa el grado de relación de secuencias entre secuencias de polinucleótidos, como puede ser el caso, como se determina por la concordancia entre hebras de tales secuencias. La identidad se puede calcular fácilmente (Computacional Molecular Biology, Lesk, A. M., ed, Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J. eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991). Aunque existen numerosos procedimientos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos, el término los conocen bien los expertos en la técnica (Sequence Análisis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J. eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos empleados comúnmente para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a los descritos en Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Los procedimientos preferidos para determinar la identidad se diseñan para proporcionar la concordancia mayor entre las secuencias ensayadas. Los procedimientos para determinar la identidad están codificados en programas de ordenador. Los procedimientos de programa de ordenador preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, paquete de programas GCG (Devereux, J. y col., Nucleic Acids Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Atschul, S. F. y col., J. Molec. Biol. 215: 403
(1990)).

Los polinucleótidos que tienen 70% o más de identidad con los polinucleótidos en esta memoria descriptiva definidos pueden diferir entre las secuencias definidas en virtud de al menos una sustitución de nucleótidos, adición, supresión, fusión o truncamiento en el polinucleótido.

Una de las regiones en el gen CD68 que se ha encontrado que es crítica para la especificidad de macrófagos del gen CD68 es al región que se extiende entre el codón de inicio ATG y el nucleótido aproximadamente 80 pares de bases cadena arriba (5') del codón de inicio ATG. Esto se denominará como la región de -80 pares de bases.

Una segunda región que se ha encontrado que es crítica es la región cadena abajo (3') del codón de inicio ATG del gen CD68 y que contiene el primer sitio PU.1 cadena abajo del codón de inicio. Un sitio PU.1 es una secuencia de ADN capaz de unir el factor PU.1 de transcripción de la familia etf, que se expresa en macrófagos, neutrófilos y células B.

El primer sitio PU.1 cadena abajo está comprendido dentro de un intrón. En el CD68 humano el intrón que contiene el primer sitio PU.1 está entre el nucleótido 32 y el nucleótido 137 cadena abajo del codón de inicio.

La región que contiene el primer sitio PU.1 cadena abajo y la región de 80 pares de bases cuando están unidos operativamente proporcionan especificidad de macrófago. La Seq ID Nº 2 comprende la secuencia de la CD68 humano entre -80 pares de base y el codón de inicio ATG y comprende un sitio PU. 1 y el primer intrón cadena debajo de la región de inicio ATG.

Una región adicional que se ha encontrado que es crítica proporcionando especificidad en la región que contiene el sitio PU.1 aproximadamente 11 parees de bases cadena arriba del codón de inicio ATG. Así la secuencia de nucleótidos entre el codón de inicio ATG y aproximadamente 150 pares de bases cadena arriba del codón de inicio ATG confiere expresión específica potenciada de macrófagos.

Una región adicional que confiere especificidad en el sitio PU. 1 que se encuentra aproximadamente 432 pares de bases cadena arriba del codón de inicio ATG. De este modo la secuencia de nucleótidos que se extiende entre el codón de inicio ATG y aproximadamente 480 pares de bases cadena arriba del codón de inicio confiere expresión específica potenciada de macrófagos.

La alta especificidad de macrófagos se observa cuando un gen se expresa bajo el control de cualquiera de las secuencias anteriores. La alta especificidad de macrófagos también se puede obtener cuando un gen se expresa bajo el control de la región que se extiende entre 2940 pares de bases cadena arriba del codón de inicio ATG y 335 pares de bases cadena abajo del codón de parada TGA.

La presente invención proporciona por lo tanto un polinucleótido que comprende

(a)

un fragmento de polinucleótidos que tiene al menos 70% de identidad a un polinucleótido como se ha definido en esta memoria descriptiva;

(b)

un polinucleótido que es complementario al polinucleótido de (a); o

(c)

un polinucleótido que comprende al menos 15 bases secuenciales del polinucleótido de (a) o (b).

Preferiblemente el fragmento de polinucleótido tiene al menos 80% de identidad a un polinucleótido como se ha definido en esta memoria descriptiva, más preferiblemente al menos 90% de identidad al polinucleótido como se define en esta memoria descriptiva. Lo más preferiblemente el polinucleótido aislado de acuerdo con la invención comprende el polinucleótido como se define en esta memoria descriptiva.

Específicamente la presente invención proporciona un polinucleótido que comprende un polinucleótido aislado que comprende:

(b)

un fragmento de polinucleótidos que tiene al menos 70% de identidad al polinucleótido de la Seq ID Nº 3;

(c)

un polinucleótido que es complementario al polinucleótido de (a); o

(d)

un polinucleótido que comprende al menos 15 bases secuenciales del polinucleótido de (a) o (b).

Un nucleótido preferido de acuerdo con la invención comprende la región que contiene el primer sitio de PU1 y la región de -80 pares de bases.

Un nucleótido preferido adicional comprende la región de + 150 pares de bases a -137 pares de bases con relación al codón de inicio ATG.

Todavía un nucleótido preferido adicional comprende la región de + 460 pares de bases a -137 pares de bases con relación al codón de inicio ATG.

La secuencia de nucleótidos de cada una de estas regiones se puede determinar a partir de la Seq. ID Nº 3 que muestra la secuencia del cósmido CD68C1 entre 2951 pares de bases 5' del codón de inicio ATG de CD68 (mostrado en letra negrita) y 2090 pares de bases 3' del codón de inicio ATG de CD68 (mostrado en letra negrita). Las secuencias de intrón están en letra minúscula, y CD68 que codifica y las regiones no traducidas 3' están subrayadas.

Cada una de las secuencias de nucleótidos de la invención se puede usar en forma invertida.

Más de una copia, por ejemplo, tres o cuatro copias, de cada una de las regiones descritas anteriormente se pueden usar para controlar la expresión de un solo gen. Cuando se usan más de una copia de una región, las copias están ligadas de manera preferible operativamente. Las regiones se pueden usar en combinación o separadamente.

La secuencia ID Nº 2 se puede usar como una sonda para localizar la secuencia ID Nº 3, que después se puede manipular de acuerdo con técnicas convencionales usando sitios de restricción conocidos.

En una investigación de secuencias reguladoras de genes específicos de macrófagos se aislaron cósmicos cósmidos recombinantes que contienen el gen CD68 humano mediante al selección por PCR de una genoteca genómica humana de ADN en el vector pWE15 del cósmido. El CD68 es el homólogo humano. El CD68 humano es el homólogo humano de macrosialina de ratón, una proteína que se encontró en el compartimiento fagosomal de todos los monocitos y macrófagos. Se obtuvieron dos tipos de cósmicos de Cd68 que contenían el gen CD68 completo con 14 kilobases de secuencias flanqueadoras 5' y 25 kilobases de secuencias flanqueadoras 3' (figura 1).

Los cósmicos se usaron como sondas para demostrar que el gen CD68 humano se localiza sobre el brazo corto del cromosoma humano 17. Los cósmicos se usaron como moldes para determinar la secuencia de ADN del gen CD68 y 1870 pares de bases del promotor CD68 (figura 2).

Los cósmicos CD68 se transfectaron en la línea celular de macrófagos murinos RAW264.7 y poblaciones y policlones de células RAW transfectadas establemente se seleccionaron mediante crecimiento en G418. El análisis de transferencia Northern de ARN aislado a partir de células RAW resistentes a G418 se realizó usando una sonda del gen CD68 humano marcado con radioisótopos (Figura 3 A) y una sonda de lisozima de ratón para controlar la carga y transferencia de ARN (Figura 3 B). El ARN preparado a partir de cultivos de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se analizó en el mismo filtro. Las células RAW transfectadas del cósmido CD68 humano expresan niveles muy altos de ARNm de CD68 humano del tamaño esperado. Los niveles de ARNm del CD68 humano son más altos en las células RAW transfectadas de cósmicos que en monocitos cultivados humanos. Este resultado se confirmó mediante análisis de ARN de células RAW transfectadas mediante análisis de reacción en cadena de la polimerasa - transcripción inversa (RT-PCR) usando CD68 humano y cebadores de PCR específicos de macrosialina de tipo murino (figura 4). El gen CD68 humano transfectado se expresa a niveles mayores que el gen de macrosialina de ratón endógeno.

Los mismos ADN de cósmicos de CD68 se transfectaron en células A20 B y fibroblastos d 3T3. El análisis de transferencia de Northern de la expresión de ARN CDCD68 mostró niveles de ARNm de CD68 a menos 50 veces menor que la observada en la línea celular RAW264.7 de macrófagos murinos transfectados con los mismos cósmicos (figura 5). Estos resultados se confirmaron mediante análisis de RT-PCR de ARN de células transfectadas usando cebadores de PCR específicos de CD68 y HPRT. (figura 6).

Se han aislado clones de células individuales a partir de poblaciones de células RAW resistentes a G418 y se analizarán para determinar si existe una relación directa entre número de copias transgénicas y expresión transgénica en células RAW264.7 transfectadas que se predeciría si existe una Región de Control de Locus específica de macrófagos en los cósmidos de CD68.

El nivel extremadamente alto de ARNm de CD68 humano observado en células RAW transfectadas de cósmido (figuras 3, 4 y 5) muestran que los elementos reguladores genéticos específicos de macrófagos están contenidos dentro de los cósmicos de CD68 cosCD68C1 y cosCD68G1. El trabajo previo de los inventores usando el promotor de lisozima humano en experimentos con animales transgénicos ha mostrado un papel importante para las secuencias intermedias y las secuencias de adición poli A+ para la expresión transgénica en macrófagos (7, 8) Dighe, A. S., y col., Immunity, 1995, 3, 657-666 y Clarke, S., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos), 1996, 93, 1434-1438. Un papel de las secuencias intermedias que aseguran la expresión eficaz transgénica se ha descrito en numerosos sistemas diferentes.

Desarrollo de un vector de expresión génica específico de macrófagos

Con el fin de expresar genes heterólogos a un alto nivel en monocitos y macrófagos sería deseable diseñar un vector de expresión de CD68. Tal vector incluiría todas las secuencias de ADN en los cósmidos de CD68 humanos que dirigen la expresión génica específica de macrófagos de alto nivel junto con los intrones de CD68 y secuencias poli A + y sitios de reconocimiento de enzimas de restricción para la inserción de los ADNc que codifican genes heterólogos de interés.

Para facilitar la manipulación de las secuencias de gen CD68 humano presentes en el cósmido cosCd68C1 un fragmento EcoRI de 20 Kb que contiene el gen CD68 humano completo junto con secuencias flanqueantes en 5' de 5,5 kb y en 3' de 12,5 kb se clonó en el único sitio EcoRI del vector de plásmido Bluescript SK - (Stratagene) para proporcionar el plásmido recombinante pCD68R1A (figura 1). Se derivaron dos plásmidos recombinantes adicionales a partir de pCD68R1A que contiene secuencias flanqueantes en 5' y flanqueantes en 3' del gen CD68 humano, pCD68RS1 y pCD68SR1 (figura 1). Con el fin de modificar genéticamente la inserción de los ADNc que codifican genes heterólogos inmediatamente cadena abajo del promotor del gen CD68 e inmediatamente cadena arriba del codón de inicio ATG del gen CD68 el plásmido pCD68RS1 se digirió con al enzima de restricción BstX1 y un fragmento BsTX1 de 3 kb se clonó en el vector del plásmido Bluescript SK (Stratagene) después del tratamiento con la ADN polimerasa de T4 que elimina el codón de inicio ATG de CD68 (figura 2). Los fragmentos de ADN genómicos de CD68 humano presentes e los plásmidos recombinantes mostrados en la figura 1 permiten el desarrollo de un sistema de expresión de CD68 humano versátil y fácilmente manipulado para uso en líneas celulares de macrófagos, animales transgénicos y células primarias humanas.

Tabla 1

Actividad promotora de las series de supresión en 5' promotoras de CD68 en células RAW264.7 y P388.D1 transfectadas de manera transitoria

Se sometieron a electroforesis células RAW264.7 y P388.D1 en presencia de 20 \mug de los plásmidos indicadores de CAT indicados y 5 \mug del plásmido indicador de la \beta-galactosidasa pcADN3 \beta-gal. Cuarenta y ocho horas después de la transfección los lisados de células se ensayaron para evaluar la actividad de las enzimas \beta-galactosidasa y CAT como se describe en Procedimientos Experimentales. Las actividades de la enzima CAT de lisado de células se corrigieron para evaluar la eficacia de transfección y los datos se expresan como un porcentaje de la actividad enzimática de CAT obtenida con el plásmido pCATControl promotor/potenciador de SV40 en el mismo experimento. Todas las actividades de la enzima CAT de lisado de células estaban dentro del intervalo lineal del ensayo como se determina a partir de una serie de dilución de enzimas de CAT analizada en el mismo experimento. Los datos mostrados son de un experimento de transfección individual y las actividades promotoras relativas eran reproducibles en al menos tres experimentos de transfección independiente con cada construcción en ambas líneas celulares.

Tabla 2

Comparación de actividades promotoras del gen mieloide en líneas celulares de macrófagos de tipo murino transfectadas de manera transitoria

Se sometieron a electroforesis células P388.D1 y RAW264.7 en presencia de 20 \mug de los plásmidos indicadores de CAT indicados y 5 \mug del plásmido indicador de la \beta-galactosidasa pcADN3 \beta-gal. Veinticuatro horas después de la transfección los lisados de células se ensayaron para evaluar la actividad de las enzimas \beta-galactosidasa y CAT como se describe en Procedimientos Experimentales. Las actividades de la enzima CAT de lisado de células se corrigieron para evaluar la eficacia de transfección y los datos se expresan como un porcentaje de la actividad enzimática de CAT obtenida con el plásmido pCATControl promotor/potenciador de SV40 en el mismo experimento. Todas las actividades de la enzima CAT de lisado de células estaban dentro del intervalo lineal del ensayo como se determina a partir de una serie de dilución de enzimas de CAT analizada en el mismo experimento. Los datos mostrados son de un experimento de transfección individual y las actividades promotoras relativas eran reproducibles en al menos dos experimentos de transfección independiente con cada construcción en ambas líneas celulares.

TABLA 3

Plásmido	Gen	Promotor	Nº de acceso
-2940CD68pCAT	hCD68	-2940 a +2*	Este documento
lLZMpCAT	hLisozima	-517 +26	X57103
mLZMpCAT	mLisozima	-487 a +11	D13263
CD11b pCAT	hCD11b	-1706 a +91	M76724
c-fes pCAt	h c-fes	-446 +71	X06292
hMSRpCAT	h MSR	-487 a +11	D13263

La tabla 3 muestra los promotores mieloides usados en este estudio.

Todos los fragmentos de promotores de genes mieloides se clonaron en el sitio de clonación múltiple del vector indicador de CAT pCATBasic (véase procedimientos experimentales). Los genes humanos se designan mediante el prefijo h y los genes murinos mediante el prefijo m.

Las coordenadas de los promotores mostradas se toman a partir de de los números de acceso de GenBank y el sitio de inicio de la transcripción principal se denomina como + 1 excepto para CD68 cuando el A del codón de inicio de la traducción ATG se designa como + 1 (*).

Tabla 5

El efecto del primer intrón de CD68 en líneas de células RAW264.7 y CHO transfectadas de manera transitoria

Se sometieron a electroforesis células RAW264.7 en presencia de 20 \mug de los plásmidos indicadores de CAT indicados y 5 \mug del plásmido indicador de la \beta-galactosidasa pcADN3 \beta-gal. Cuarenta y ocho horas después de la transfección los lisados de células se ensayaron para evaluar la actividad de las enzimas \beta-galactosidasa y CAT. Las células CHO se transfectaron con 4,5 \mug de los plásmidos indicadores de CAT indicados y 0,5 \mug del plásmido indicador de la \beta-galactosidasa complejados con 50 \mug del lípido catiónico Lipofectamina (Gibco BRL). Las actividades de la enzima CAT de lisado de células se corrigieron para evaluar la eficacia de transfección y se expresaron como un porcentaje de la actividad de la enzima CAT obtenida con el plásmido pCATControl promotor/potenciador de SV40 en el mismo experimento. Todas las actividades de la enzima CAT de lisado de células estaban dentro del intervalo lineal del ensayo como se determina a partir de una serie de dilución de enzimas de CAT analizada en el mismo experimento. Los datos mostrados son de un experimento de transfección individual y las actividades promotoras relativas eran reproducibles en al menos tres experimentos de transfección independientes con cada construcción en cada línea celular.

\newpage

Tabla 4

El efecto del primer intrón de CD68 en promotores de CD68 y VIH

Se sometieron a electroforesis células RAW264.7 y P388.D1 en presencia de 20 \mug de los plásmidos indicadores de CAT indicados y 5 \mug del plásmido indicador de la \beta-galactosidasa pcADN3 \beta-gal. Cuarenta y ocho horas después de la transfección los lisados de células se ensayaron para evaluar la actividad de las enzimas \beta-galactosidasa y CAT. Las actividades de la enzima CAT de lisado de células se corrigieron para evaluar la eficacia de transfección y se expresaron como un porcentaje de la actividad de la enzima CAT obtenida con el plásmido pCATControl promotor/potenciador de SV40 en el mismo experimento. Todas las actividades de la enzima CAT de lisado de células estaban dentro del intervalo lineal del ensayo como se determina a partir de una serie de dilución de enzimas de CAT analizada en el mismo experimento. Los datos mostrados son de un experimento de transfección individual y las actividades promotoras relativas eran reproducibles en al menos tres experimentos de transfección independientes con cada construcción en cada línea celular.

Procedimientos Construcción de plásmidos indicadores promotores

Un fragmento BstXi de 2940 pares de bases se purificó a partir del fragmento EcoRI-SpeI subclonado a partir de cosCD68C1. El fragmento BstXi se convirtió teminado romo mediante incubación con la ADN polimerasa de T4 y los cuatro dNTP y se clonaron en el sitio EcoRV de pBluescript SK- (Stratagene) proporcionando el plásmido pCD68Bst3-2. El sitio BstXi en 3' contiene el codón de inicio ATG de CD68 que se retiró mediante la actividad de la exonucleasa de 3' de la ADn polimeradsa de T4. Un fragmento HindIII-XabaI que contiene 2940 pares de bases de ADn cadena arriba del codón ATG de CD68 se clonó en el vector indicador Prat Basic (Promega, nº de acceso del GenBank X65322) proporcionando el plásmido -2940 CD68pCAT. El plásmido -2940 CD68pCAT se digirió con XhoI, BgIII o Astl y extremos protuberantes se cargaron mediante tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa de la ADN polimerasa de T4 antes del ligamiento de los engarces HindIII fosforilados. Después de la digestión con HindIII y XbaI, los fragmentos promotores de CD68 truncados en 5' se purificaron por gel y se subclonaron en pCATBasic digerido con HindIII y XbaI proporcionando los plásmidos -2258CD68pCAT, -1576CD68pCAT y -951CD68pCAT. Todos los otras supersiones del promotor de CD68 se prepararon mediante PCr usando el plásmido -2940 CD68pCAT como molde y cebadores de oligonucleótidos en 5' que añadieron un sitio HindIII y un cebador de PCR en 3' que se extienden sobre el sitio de clonación XbaI del plásmido -2940 CD68pCAT (enumerado en la lista 1). Los fragmentos amplificados se digirieron con HindIII y XbaI, se purificaron con gel y se subclonaron en pCATBasic digerido con HindIII y XbaI proporcionando los plásmidos -333CD68pCAT, -232CD68pCAT, -150CD68pCAT y -80CD68pCAT. El primer intrón del gen CD68 se amplificó mediante PCR usando los cebadores 5' ccggaattcTGCTGGGGCTACTGG
CAG y 5' tgatctagaGTCCCCTGGGCTTTTGGCAG que se añadió a los sitios EcoRI y XbaI (subrayados). Después de al digestión con EcoRI y XbaI el fragmento del intrón de CD68 se clonó en pCD68Bst3-2 diferido con EcoRI y XbaI proporcionando el plásmido pCD68BstIVS y el fragmento de 3022 pares de cabes EcoRI-XbaI se clonó en pCATBasis proporcionando el plásmido -2940 IVSpCAT. La construcción VIH Prat de LTR mínima de VIH es a partir de Lew y col., (1991) Mol. Cel. Biol. 11, 182-191. La construcción VIH IVS Prat se preparó ligando el EcoRI al fragmento Xba I IVS de pcCD68BstIVS en el único sitio BgIII en la secuencia tar de VIH. Todas las construcciones indicadoras promotoras de CD68 se secuenciaron usando los cebadores inversos M13 y CAT y se muestra que coinciden exactamente con la secuencia promotora de CD68 mostrada en al figura A. El fragmento de 1,7 kb HindIII-BamHI (romo) que contiene las secuencias CD11b entre -1706 y +91 se escindió a partir del plásmido pB202 (Dzjemmis y col., 1995, Blood, 85, 319-329 y se clonó entre los sitios HindIII y XbaI (rimo) de pCATBasic proporcionando clon CD11b Prat. Un fragmento HindIII-XbaI de 516 pares de bases que contiene las secuencias c - fes entre -446 y +71 se escindió a partir del plásmido p446 (un amable regalo de Ceelste Simon, Heydemann y col., 1996) y se clonó entre los sitios HindIII y Xba I de pCATBasic proporcionando el plásmido c-fes Prat. Se clonaron otros promotores de genes mieloides mediante PCR usando los cebadores diseñados a partir de secuencias publicadas en la tabla I con moldes de ADN clonado o ADN genómico. Un fragmento Sma-BmaHI que contiene el ayuste SV40 temprano y secuencias de poliadenilación del plásmido pH2KBS que contiene el ADNc de H2K de 1,6 kb clonado en el sitio EcoRV de pBluescript (un amable regalo del Dr. D. Mokophidis) proporcionando el plásmido pH2KSV. Un fragmento HindIII-BamHI de 2,5 kb de pH2KSV se hizo con extremos romos mediante tratamiento con la ADN polimerasa de T4 y se ligó en el plásmido promotor de CD68 pCD68Bst3-2 digerido con Smal proporcionando el plásmido pCD68-H2KSV y el mismo fragmento pH2KSV se ligó en el plásmido pBH7.4 promotor de lisozima humana digerido con HincII (Clarke y col., 1996) proporcionando hLZM-H2KSV. El plásmido pkb-HindIII contiene un fragmentod e ADN genómico de 7,4 kb del gen H2Kb (Weiss y col., 1992).

Los ADN del plásmido superenrollados se prepararon a partir de cultivos de 500 ml mediante lisis con NaOH/SDS y se purificaron mediante centrifugación de equilibrio en gradienets de CsCl/bromuro de etidio seguido de la extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol (Sambrook, Fritsch y Maniatis 1989).

Cultivo de células de mamíferos y transfección transitoria

Las líneas celulares de macrófagos murinos RAW264.7 y P388.D1 se mantuvieron en RPMI 1640 (Gibco BRL) suplementado con suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (FCS) (Sigma), 100 unidades/ml de penicilina, 100 \mug/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM y Hepes 10 mM (pH 7,0). Células CHO K1 se mantuvieron en medio F12 de Ham (Gibco BRL) suplementado con FCS al 10%, antibióticos y glutamina. Todas las células se desarrollaron a 37ºC en un incubador humidificado en CO_{2} al 5%/aire. Las células RAW264.7 y P388.D1 se hicieron crecer hasta confluencia en matraces T175, se recogieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se lavaron una vez y se volvieron a suspender en medio sin suero Optimem 1 (Gibco BRL) para células RAW o RPMI 1640 (no FCS) para células P388D1. Las células se contaron y se ajustaron hasta una densidad final de 4 x 10^{7} células/ml. Se mezclaron alícuotas de 2 x 10^{7} células (0,5 ml) con 50 \mug de ADn de plásmido indicador de CAT y 5 \mug de ADN de plásmido de b-galactosidasa pcADN3, se añadieron a una cubeta de electroporación de hueco de electrodo de 0,4 cm (BioRad) y se sacudieron en un GenePulser de BioRad (300 V, 960 \muF a temperatura ambiente. Las células se recuperaron inmediatamente en 100 ml de medio de crecimiento de células que se habían precalentado hasta 37ºC y se sembraron en placas petri de cultivo de tejidos de 35 mm y 9 cm (Nunc). Las células se analizaron 24 ó 48 horas después de la electroporación para evaluar la eficacia de transfección mediante la tinción de células permeabilizadas fijadas con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranósido (X-gal, Sigma) como se describe en (Hogan y col, 1994). Las eficacias de transfección transitoria se entre 20 y 30% se obtuvieron de manera rutinaria con macrófagos murinos P388.D1 y después de optimización eficacias de transfección transitoria con un exceso de 40% se podrían obtener con células RAW364.7. Las células CHO se hicieron crecer hasta 70-80% de confluencia en placas petri de 9 cm, se lavaron dos veces con Optimem antes de la adición de 5 ml de complejo de ADN de plásmido : lípido catiónico (5 \mug de ADN : 50 \mug de Lipofectamina (Gibco BRL) en Optimem). Después de 6-16 horas de incubación el medio se aspiró, se lavaron las células dos veces con PBS y se recuperaron en medio completo durante 24-36 horas antes de análisis. La tinción por X-gal y FACS mostró de manera rutinaria las eficacias de transfección transitoria de CHO con un exceso de 40%.

Ensayos de genes indicadores

Se recogieron células transfectadas raspando en PBS, se lavaron una vez con PBS y se volvieron a suspender los sedimentos en 100 \mul de Tris-HCl 0.25 M (pH 7,8) y se sometieron a tres ciclos de lisis por congelación descongelación. Los lisados celulares de ensayaron para evaluar la actividad de la enzima \beta-galactosidasa usando el sustrato colorimétrico clorofenolrojo \beta-D-galactopiranósido (CPRG, Boehringer Mannheim) en un ensayo de placas de 96 pocillos en tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,3) con MgCl2 2 mM. la actividad de la enzima se determinó mediante espectrofotometría a 570 nm después de 30 minutos de incubación a 37ºC usando diluciones de enzima \beta-galactosidasa de E. coli (Sigma) para generar una curva patrón. La actividad de la enzima CAT de lisados de células se determinó después de tratamiento por calor usando 10 \muCi de cloranfenicol marcado con C^{14} (54 Ci/mmol, Amersham) como sustrato en una reacción de 125 \mul en Tris-Hcl 0,25 M (pH 8,0) que contiene 0,2 mg/ml de n-butiril CoA como cofactor. La actividad de la enzima CAT se midió determinando la cantidad de butiril - ^{14}C cloranfenicol extraído en mezcla de xilenos (Aldrich) después de una incubación de 2 horas a 37ºC (Seed ref.). Se generó una curva patrón de la enzima CAT usando diluciones de la enzima CAT purificada (Promega) en cada experimento y los ensayos de enzimas CAT que usan extractos de células transfectadas estaban dentro del intervalo lineal del ensayo de la enzima.

Figura 1 Mapas de restricción de cósmicos que contiene el gen CD68 humano

Los cósmicos recombinantes que contienen el gen CD68 humano en el vector PWE15 se aislaron mediante selección de PCR de conjuntos de colonias HB101 resistentes a ampicilina recogidas robóticamente usando los cebadores PCR CD68 L 1 y CD68 L2. Las colonias individuales positivas de PCR de CD68 se usaron para preparar ADN de cósmido que se analizó mediante mapeo por restricción y transferencia de Southern usando sondas de gel CD68 marcadas radiactivamente. Se muestran los sitios para las enzimas de restricción Spe I (Spe), Cla I y Not I. Los sitios Not I en paréntesis (Noy I) se derivan a partir del sitio de clonación del vector de cósmicos pWE 15 y flanquean la inserción de ADN genómico humano.

Debajo del mapa del cósmido cosCD68C1 se muestra la posición de un fragmento de EcoRI de 20 kb clonado en el vector de plásmido pBluescriptSK - para proporcionar el plásmido recombinante pCD68R1A. También se indican las posiciones de otros fragmentos de restricción de cosCD68C1 clonados en el vector de plásmido pBluescriptSK-. Se indica el fragmento de 3 kb BstXi el extremo 3' del cual contiene el codón de inicio ATG del gen Cd68.

Figura 2 Secuencia de ADN de la región flanqueante 5' del gen CD68 humano

La secuencia de ADN de al región flanqueante en 5' del gen CD68 se determinó mediante la secuenciación de hebras dobles usando los cósmicos CD68 como molde y los cebadores de oligonucleótidos derivados de la secuencia de ADNc de CD68 humano publicadas (17). El iniciador metionina que codifica el codón ATG del gen CD68 que está contenido dentro de un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción BstXI está en casillas. Las regiones que codifican CD68 están subrayadas y las secuencias intermedias inferidas de la comparación con la secuencia de ADNc de CD68 publicadas se delimitan mediante flechas verticales. La secuencia todavía no se ha confirmado en ambas hebras, las ambigüedades el las lecturas de secuencias múltiples se indican mediante letras minúsculas de acuerdo con los patrones de IUPAC-IUB descritos en Nuc. Acids. res. 13, 3021-3030 (1985). Las líneas de puntos en la secuencia indican un enlace químico.

Figura 3 Análisis de transferencia Northern de la expresión de ARN en células RAW establemente transfectadas

El ARN total se preparó a partir de poblaciones de células EAW resistentes a G418 (derivadas de al menos 10.000 colonias independientes resistentes a G418) o policlones (derivados de 50-100 colonias resistentes G418). Las células RAW se transfectaron con 10 \mug de cósmidos de CD68 linealizados de Puv I o linealizados o un plásmido de CAT pcADN3 que confiere resistencia a G418.

Se desnaturalizó ARN total (10 \mug) con formaldehído, sometido a electroforesis de gel de agarosa, se transfirió a membranas de nylon y se hibridaron con sondas de CD68 humano y de lisozima de ratón marcadas radiactivamente. Para comparación se analizó ARN total (5 \mug) preparado a partir de células de THP1 humanas tratadas con PMA durante 24 horas y cultivos de PBMC humano. Se muestra una exposición autorradiográfica de 6 horas.

Figura 4 Análisis de PCR RT de los ARN de CD68 y macrosialina en células RAW transfectadas de manera estable

Los ARN (10 \mug) preparados a partir de poblaciones de células RAW resistentes a G418 analizadas mediante transferencia de Northern en la figura 3 se usaron para preparar ADNc oligo dT - cebado en una reacción de transcripción inversa (RT) en un volumen final de 100 \mul. Las reacciones de control de RT que omite la transcriptaza inversa se realizaron usando las mismas muestras de ARN (-RT). Una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de 30 ciclos que usa cebadores de microsialina y específicos de CD68 se realizó usando 1 \mul de la reacción RT pura o diluciones indicadas como molde. Los productos de PRC RT se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se indican la posición de los productos de PCR de microsialina de ratón y de CD68 humano de los tamaños indicados.

Figura 5 Análisis de transferencia de Northern de la expresión de ARN en células RAW y A290 transfectadas de manera estable

Células RAW y A20 B se transfectaron con 10 \mug de cósmicos de CD68 superenrollados o linealizados de Pvu o un plásmido pcADN3 CAT que confiere resistencia a G418. El ARN total (10 \mug) preparado a partir de poblaciones de células resistentes a G418 se desnaturalizaron con formaldehído, se sometieron a electroforesis con gel de agarosa, se transfirieron a membranas de nylon y se hibridaron con una sonda de CD68 humana marcada radiactivamente. Para comparación ARN total preparado a partir de células THP1 humanas tratadas con PMA durante 24 horas (5 \mug) y cultivos de PMBC humano (2 \mug) se analizó. Se muestra al exposición autorradiográfica de 6 horas.

Figura 6 Análisis de PCR RT de los ARN de CD68 y HPRT en células RAW y A20 transfectadas de manera estable

Los ARN (10 \mug) preparados a partir de poblaciones de células RAW resistentes a G418 analizadas mediante transferencia de Northern en la figuras 3 y 5 se usaron para preparar ADNc oligo dT - cebado en una reacción de transcripción inversa (RT) en un volumen final de 100 \mul. Una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de 30 ciclos que usa cebadores específicos de CD68 y de HPRTe realizó usando 1 \mul de la reacción RT pura o diluciones indicadas como molde. Los productos de PRC RT se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se indican la posición de los productos de PCR de CD68 y HPRT de los tamaños indicados.

TABLA 1

Esta tabla muestra el efecto de la supresión de las secuencias del promotor en 5' de CD68 en transfecciones RAW y P388.D1.

	-2940pCAT	38,6	78,4
	-666pCAT	37,5	74,4
	-575pCAT	48,4	129,5
	-460pCAT	71,6	132,2
	-333pCAT	30,5	112,3
	-232pCAT	34,4	96,4
	-150pCAT	11,6	176
	-80pCAT	0,64	9,5
	pCATBasic	0	2
	pCATControl	100	100
	Construcción de plásmido	RAW264.7	P388.D1

TABLA 2

Esta tabla compara el nivel de la actividad del gen indicador de CAT de plásmidos con referencia a los promotores del gen mieloide diferente en P388.D1 y RAW264.7,

	pCAT Control	100	100
	pCAT Basic	0	8,4
	-2940CD681VS	117	163,9
	-2940CD68 pCAT	39	50
	hLZM pCAT	17,6	66
	mLZM pCAT	20,1	73,3
	CD11 pCAT	42	23
	-c-fes pCAT	4,8	47,3
	hMRS pCAT	3	35,5
	Plásmido indicador de CAT	RAW264.7	P388.D1

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4

Esta tabla compara el nivel de la actividad del gen indicador de CAT de plásmidos con los promotores LTR mínimos de CD68 y VIH en P388.D1 y RAW264.7.

	pCAT Control	100	100
	pCAT Basic	0	8,4
	-2940 CD681VS	117	163,9
	-2940 CD68 pCAT	39	50
	VIH IVS pCAT	0,8	15
	VIH pCAT	0,8	69
	Plásmido indicador de CAT	RAW264.7	P388.D1

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5

Esta tabla muestra el efecto de añadir en intrón de CD68 IVS sobre los fragmentos promotores de CD68 en células RAW y CHO.

	pCAT Control	100	100
	pCAT Basic	0	0
	-2940 CD68pCAT	31	56
	-2940 IVS	154	63
	-80 pCAT	0,6	5
	-80 IVS	53	1,9
	Construcción de plásmido	RAW264.7	CHO

Aplicaciones potenciales para la LCR de CD68 El macrófago como un vehículo de distribución para la terapia génica

Los macrófagos tienen varias ventajas importantes sobre otros tipos de células para distribuir productos génicos terapéuticos en un intervalo de enfermedades humanas importantes.

Los macrófagos tienen una alta capacidad biosintética.

Los macrófagos secretan cantidades fisiológicamente significativas de citoquinas, factores de crecimiento, mediadores inflamatorios, proteasas, inhibidores de proteasas y otras macromoléculas importantes biológicamente activas.

Los macrófagos tienen una duración de vida limitada.

Después los macrófagos residentes y reclutados por tejidos por obligación experimentan solamente una o dos divisiones celulares como mucho, esto sería una ventaja distinta en muchos protocolos de terapia génica humana.

Los macrófagos se encuentran en todos los tejidos virtualmente.

La presencia de macrófagos en cada tejido virtualmente en el cuerpo den números significativos incrementa la utilidad de una LCR que dirige la expresión génica específica de macrófagos. La presencia de macrófagos en el pulmón e intestino permite la distribución de ADN recombinante a macrófagos mediante un número de vías diferentes.

Los macrófagos se reclutan rápidamente en los sitios de inflamación.

La capacidad de dirigir la expresión génica heteróloga en un tipo de célula que se recluta a sitios de inflamación ofrece la única avenida para la intervención terapéutica en enfermedad inflamatoria crónica.

Terapia génica somática

No existen actualmente trastornos monogénicos humanos descritos que afecten específicamente a la función de macrófagos que serían candidatos para la terapia génica somática "clásica". Sin embargo, la LCR de CD68 se podría usar para dirigir la expresión de productos génicos terapéuticos en macrófagos humanos en un intervalo completo de enfermedades humanas importantes. Los genes candidatos incluirían: la distribución local de IL-1Ra soluble a articulaciones de la rodilla de rata inflamada mediante vectores retrovirales recombinantes se ha mostrado que es 10.000 veces más eficaz que la administración sistémica de sIL-1RA reduciendo la artritis inducida experimentalmente (9) Makarov, S. S., u col., Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos), 1996, 93, 402-406.

Actualmente existe mucho interés en la terapia anti TNF-\alpha en el tratamiento de síndrome de choque tóxico y un número de enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide que afecta al 1% de la población del Reino Unido. Muchas enfermedades importantes humanas son el resultado de un fallo en la regulación del sistema inmune. Los macrófagos y citoquinas secretadas por los macrófagos tales como IL-12 e IL-10 juegan un papel clave en la regulación de la función de linfocitos T. La expresión específica de macrófagos de receptores de IL-4 negativos trans-dominante podría encontrar aplicación en enfermedades autoinmunes tales como colitis ulcerosa y enfermedad de Chron.

Apo E y varios otros productos génicos se ha propuesto que juega un papel calve en el desarrollo de placas ateroscleróticas que son la causa de la oclusión de vasos sanguíneos en aterosclerosis y accidentes cerebrovasculares. Apo E expresada en macrófagos presentes en placas ateroscleróticas podría encontrar aplicación en el tratamiento de oclusión vascular (10). El CD68 está presente en células espumosas derivadas de macrófagos encontradas en el tejido enfermo humano y los inventores han mostrado el homólogo de ratón de CD68, macrosialina, que está presente en altos niveles en las placas ateroscleróticas de un modelo de ratón apo E^{-/-} de aterosclerosis.

El homólogo murino de CD68, macrosialina se ha reseñado que se une a LDL oxidado (11). La sobreexpresión de CD68 humano, macrosialina murina o receptor de depurador de macrófagos humanos en los macrófagos presentes en placas ateroscleróticas puede reducir de manera útil la cantidad de LDL oxidado aterogénico en lesiones ateroscleróticas.

La enfermedad granulomatosa Crónica (CGD) en una enfermedad genética causada por la mutación del gen de la NAPDH oxidasa. Los pacientes CDG no hacen reactivos los metabolitos de oxígeno en sus células fagocíticas que matan las bacterias y por lo tanto los pacientes sufren infecciones bacterianas recurrentes. La expresión de la NAPDH oxidasa en macrófagos de pacientes de CGD mediante la terapia génica somática sería altamente beneficiosa (12).

Existen varias enfermedades genéticas humanas relativamente raras que se pueden tratar proporcionando proteínas purificadas que se pueden recoger por las células defectuosas para corregir su defecto genético. Los ejemplos incluyen Beta cerebrosidasa en pacientes con enfermedad de Gaucher y otros genes defectuosos en trastornos de almacenamiento lisosomal (13). Una atracción particular de la LCR de CD68 para el tratamiento de de enfermedades de almacenamiento lisosomal es el hecho de que el CD68 de expresa en células fagocíticas mononucleares de la microglía residentes en el cerebro. Algunas células de la microglía en adultos de derivan de monocitos sanguíneos reclutados y por lo tanto la LCR de CD68 puede ofrecer al posibilidad de expresar los productos génicos terapéuticos en el cerebro mediante monociotos sanguíneos reclutados transfectados con vectores de LCR de CD68.

Tratamiento de enfermedades infecciosas

Varios patógenos humanos importantes sobreviven y se replican en el compartimiento endosomal de los macrófagos. Éstos incluyen los agentes causantes de la tuberculosis, leismaniasis y lepra. El virus VIH sobrevive y se replica en monocitos. Al dirigir la producción de \gamma-interferón a macrófagos infectados con Mycobacterium bovis podría ser una estrategia viable para el tratamiento de Tb. La distribución de las secuencias tar de señuelo de VIH y otros reactivos anti VIH para monocitos y macrófagos crearía un conjunto de monocitos resistente a la infección por VIH. Se han propuesto protocolos similares de terapia génica para la "vacunación intracelular" de linfocitos T.

\newpage

Sistemas de expresión de macrófagos

Los vectores originales de LCR de la \beta-globina se han usado para desarrollar sistemas de expresión para la sobreproducción de productos génicos heterólogos en líneas celulares de eritroides cultivados (14). La LCR de CD68 se podría usar para la sobre expresión de genes heterólogos en líneas celulares de macrófagos de tipo humano y murino por ejemplo en la producción de citoquinas y receptores solubles cuyo patrón de glicosilación era importante para su actividad biológica.

Vacunación génica

Recientemente se ha mostrado que ADN desnudo se podría usar en animales para conferir inmunidad protectora contra la exposición a virus letales y para provocar respuestas de anticuerpo humoral significativa. Los protocolos actuales para la vacunación genética usan vectores de expresión de mamíferos convencionales basándose en los promotores y potenciadores de SV40 o HCMV. Los genes heterólogos se expresan en miofibras pero las células que presentan antígeno foráneo para la elaboración de una respuesta inmune eficaz son desconocidas (15). Usando un vector de LCR de CD68 para dirigir la expresión génica heteróloga a macrófagos y posiblemente células dendríticas debe aumentar la eficiencia y eficacia de los protocolos de vacunación genética.

Inmunoterapia

Las células dendríticas procesan antígenos para la presentación a las células del sistema inmune. Las células dendríticas humanas que expresan el antígeno de CD68 son importantes porque confieren tolerancia en el rechazo de transplante de órganos y enfermedades autoinmunes. Una LCR de CD68 permitirá la dirección genética de un importante subconjunto de células dendríticas desarrolladas en cultivo de médula ósea o precursores de sangre periférica.

Composiciones

La invención también se refiere a composiciones que comprenden el polinucleótido, vector o célula transfectada. De este modo, los polipéptidos de la presente invención se pueden emplear en combinación con un vehículo o vehículos no estériles o estériles para uso con las células, tejidos u organismos, tales como un vehículo farmacéutico adecuado para la administración a un sujeto. Tales composiciones comprenden, por ejemplo, un adictivo de medio o una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de la invención y un vehículo como excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales vehículos pueden incluir, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y las combinaciones de los mismos.

Kits

La invención además se refiere a paquetes y kits diagnósticos y farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes llenos con uno o mas de los ingredientes de las composiciones anteriormente mencionados de la invención. Asociados a tal (es) recipiente (s) puede ser un aviso en la forma prescrita por una agencia del gobierno que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos o biológicos, que reflejan la aprobación por la agencia de la fabricación, uso o venta del producto para la administración humana.

Administración

Los polinucleótidos y otros compuestos de la presente invención se pueden emplear solos o junto con otros compuestos, tales como compuestos terapéuticos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar de cualquier forma eficaz, conveniente que incluye, por ejemplo, la administración por vías tópica, oral, anal, vaginal, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intranasal o intradérmica entre otras.

Las composiciones farmacéuticas generalmente se administran en una cantidad eficaz para el tratamiento o profilaxis de una afección o afecciones específicas. En general, las composiciones se administran en una cantidad de al menos aproximadamente 10 \mug/kg de peso corporal. En al mayoría de los casos se administrarán en una cantidad que no exceda de aproximadamente 8 mg/kg de peso corporal al día. Preferiblemente, en al mayoría de los casos, la dosis está entre aproximadamente 10 \mug/kg y aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal al día. Se apreciará que la dosificación óptima se determinará mediante procedimientos convencionales para cada modalidad y afección de tratamiento, teniendo en cuanta la afección, su gravedad, vía de administración, condiciones de complicación y similares.

En terapia o como profiláctico, el agente activo se puede administrar a un individuo como una composición inyectable, por ejemplo como dispersión acuosa estéril, preferiblemente isotónica.

Como alternativa la composición se puede formular para la aplicación tópica por ejemplo en forma de pomada, cremas, lociones, pomadas de ojos, gotas de ojos, gotas de oídos, enjugues de boca, vendajes impregnados y suturas y aerosoles, y pueden contener aditivos convencionales apropiados, incluyendo, por ejemplo, conservantes, disolventes para ayudar a la penetración del fármaco, y emolientes en pomadas y cremas. Tales formulaciones tópicas también pueden contener vehículos convencionales compatibles, por ejemplo, bases de cremas o pomadas, y etanol o alcohol oleico para lociones. Tales vehículos pueden constituir entre aproximadamente 1% y aproximadamente 98% en peso de la formulación; más usualmente constituirán hasta aproximadamente el 80% en peso de la formulación.

Para la administración a mamíferos, y particularmente a seres humanos, se espera que el nivel de dosificación diaria del ingrediente activo estará entre 0,01 mg/kg y 10 mg/kg, típicamente alrededor de 1 mg/kg. El médico en cualquier caso determinará la dosificación real que será la más adecuada para un individuo y variará con al edad, peso y respuesta del individuo particular. Las dosificaciones anteriores son ejemplares del caso medio. Pueden, por supuesto, ser ejemplos individuales cuando se necesitan intervalos de dosificación más altos o más bajos, y tales están dentro del alcance de esta invención.

Una composición de vacuna está convenientemente en forma inyectable, o se puede administrar mediante otras técnicas, por ejemplo, una pistola de genes que usa, por ejemplo, partículas de oro, o ex vivo. Se pueden emplear adyuvantes convencionales para potenciar la respuesta inmune.

Una dosis adecuada unitaria para la vacunación es 0,5 - \mug/kg de antígeno, y tal dosis se administra preferiblemente 1-3 veces y con un intervalo de 1-3 semanas.

Con el intervalo de dosis indicado, no se observarán ningún efecto toxicológico adverso con los compuestos de la invención que imposibilitan su administración a individuos adecuados.

Las secuencias de polinucleótidos, vectores y células huéspedes de la presente invención se pueden usar en el tratamiento de enfermedades infecciosas que incluyen infecciones virales y bacterianas tales como VIH y TB, enfermedades inflamatorias, enfermedades cardiovasculares, artritis reumatoide, aterosclerosis, reestenosis, cáncer, por ejemplo, cáncer del intestino, colon, mama o pulmón.

Otras patentes de LCR

La LCR publicada más similar en la dirección de la expresión transgénica a macrófagos en la LCR de clase II. Este elemento se ha reivindicado para dirigir al expresión a macrófagos (presumiblemente activados), células dendríticas y B-linfocitos (16). Los datos de los investigadores con la línea de macrófagos de tipo murino RAW 264.7 transfectados establemente y la línea de células B de tipo murino A20 ya muestran que los cósmidos de CD68 dirigen la expresión que está restringida a macrófagos (figuras 5 8 a 6)

\vskip1.000000\baselineskip

Referencias

1.

Grosveld, F., Blomvam Assendelft, M., Greaves, DR. and Kollias, G.

Position-independent, high-level expression of the human \beta-globin gene in transgenic mire.

Cell, 1987, 51, 975-985.

\vskip1.000000\baselineskip

2.

Greaves, D.R., Wilson, F.D., Lang, G. and Kioussis, D. Human CD2

3' flanking sequences confer high-level, T-cell specific, position independent gene expression in transgenic mice.

Cell, 1989, 56, 979-986.

\vskip1.000000\baselineskip

3.

Madisen, L. and Groudine, M.

Identification of a locus control region in the immunoglobulin heavy-chain locus that deregutates c-myc expression in plasmacytoma and Burkitt's lymphoma cells.

Genes and Development, 1994, 8, 2212-2226.

\vskip1.000000\baselineskip

4.

Blom van Assendetft, M., Hanscombe, O., Grosveld, F. and Greaves, D.R.

The \beta-globin dominant control region activates homologous and heterologous promoters in a tissue-specific manner.

Cell, 1989, 56, 969-977.

\newpage

5.

Talbot, D., Collis, P., Antoniou, M., Vidal, M., Grosveld, F. & Greaves, D.R.

A dominant control region from the human, \beta globin locus conferring integration site-independent gene expression.

Nature, 1989, 338, 352-355.

\vskip1.000000\baselineskip

6.

Therexsys and gene therapy

Nature Medicine, 1995, 1, 502.

\vskip1.000000\baselineskip

7.

Dighe, A.S., Campbell, D., Hsieh, C-S, Clarke, S., Greaves, D.R., Gordon, S., Murphy, K.M. and Schreiber, R.D.

Tissue-specific targeting of cytokine unresponsiveness in transgenic mice.

Immunity, 1995, 3, 657-666.

\vskip1.000000\baselineskip

8.

Clarke, S., Greaves, D.R., Ping Chung, L., Tree, P. and Gordon,S.

The human lysozyme promoter directs reporter gene expression to activated myelomonocytic cells in transgenic mice.

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1996, 93; 1434-1438.

\vskip1.000000\baselineskip

9.

Makarov, S.S., et al.

Suppression of experimental arthritis by gene transfer of interleukin 1 receptor antagonist cDNA

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1996, 93; 402-406.

\vskip1.000000\baselineskip

10.

Linton, M.F., Atkinson, J.B. and Fazio, S.

Prevention of Atherosclerosis in Apolipoprotein E-deficient mice by bone marrow transplantation.

Science (1995) 267; 1034-1037.

\vskip1.000000\baselineskip

11.

Ramprasad, M.P., Fischer, W., Witzum, J.L., Sambrano, G.R., Quehenberger, O. and Steinberg, D.

The 94-97-kDa mouse macrophage membrane protein that recognises oxidized low density lipoprotein and phosphatidylserine-rich liposomes is identical to macrosialin, the mouse homologue of human CD68.

Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1995), 92; 9580-9584.

\vskip1.000000\baselineskip

12.

Segal, A.W.

The NAPDH oxidase and chronic granulomatous disease.

Molecular Medicine Today, 1996, 2; 129-135.

\vskip1.000000\baselineskip

13.

Zhou, X.Y., Morreau, H., Rottier, R, Davis, D., Bonten, E., Gillemans, N., Wenger, D., Grosveld, F.G., Doherty, P., Suzuki, K., Grosvefd, G.C. and d'Azzo, A.

Mouse model for the lysosomal disorder galactosiafidosis and correction of the phenotype with overexpressing erythroid precursor cells.

Genes and Development (1995) 9; 2623-2634.

\newpage

14.

Needham, M. et al.

LCR/MEL: A versatile system for high-level expression of heterologous proteins in erythroid cells.

Nucleic Acids Research, 1992, 20; 997-1003.

\vskip1.000000\baselineskip

15.

Maurice, J.

Gene vaccines

Molecular Medicine Today, 1995, 1; 64-71.

\vskip1.000000\baselineskip

16.

Carson, S. and Wiles, M.

Far upstream regions of class 11 MHC Ea are necessary for position-independent, copy-dependent expression of an Ea transgene.

Nucleic Acids Research, 1993, 21; 2065-2072.

\vskip1.000000\baselineskip

17.

Holness, C. and Simmons, D.

Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins.

Blood, 1993, 81;1607-1613.

Seq ID Nº 1

\vskip1.000000\baselineskip

\begin{minipage}[t]{158mm} COMPLEMENTO INVERSO de: Drg 237. Con check: 1236 desde 1 a: 3601 Drg 237. rev longitud: 3601 29 de abril de 1996 111.13 Tipo N Check: 6126\end{minipage}

1

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Seq ID Nº 2

3

\newpage

Seq ID Nº 3

4

5

6

7

8

9

10

\newpage

Secuencia ID Nº 4

11

12

Claims (9)

1. Un polinucleótido clonado que tiene la función de una secuencia reguladora de la transcripción (trs) y que comprende:

(a)

un fragmento de polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad con el polinucleótido de la Seq ID Nº. 2;

(b)

un polinucleótido que es complementario con el polinucleótido (a); o

(c)

un polinucleótido que comprende al menos 15 bases secuénciales del polinucleótido de (a) o de (b).

2. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 en el que el fragmento de polinucleótido tiene al menos un 80% de identidad con el polinucleótido de la Seq ID Nº 2.

3. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 en el que el fragmento de polinucleótido tiene al menos un 90% de identidad con el polinucleótido de la Seq ID Nº 2.

4. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1, 2 ó 3 que comprende el polinucleótido de la Seq ID Nº 2.

5. Un módulo de expresión que comprende un polinucleótido de acuerdo una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un polinucleótido unido operativamente a él que codifica un polipéptido heterólogo.

6. Un vector de expresión que comprende el módulo de expresión según la reivindicación 5.

7. Una célula huésped que comprende un vector según la reivindicación 6.

8. Un procedimiento para producir un polipéptido dicho procedimiento comprende transformar o transfectar una célula con un vector según la reivindicación 6 y cultivar la célula transformada o transfectada.

9. Un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un módulo de expresión según la reivindicación 6, un vector de expresión según la reivindicación 7 o una célula huésped según la reivindicación 8 para uso en terapia médica.