KR101667548B1 - 다중 rt-pcr을 이용한 감귤 바이러스 진단 방법 - Google Patents

다중 rt-pcr을 이용한 감귤 바이러스 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1 및 2 또는 서열번호 3 및 4의 온주위축병(Satsuma dwarf virus , SDV) 계통 감귤 바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공한다. 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 RT-PCR용 조성물을 이용하여 감귤 바이러스에 발생하는 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 바이러스 진단 방법을 제공한다. 본 발명은 바이러스 감염 여부를 조기에 진단할 수 있어 감염으로 인한 농가의 경제적 손실을 방지할 수 있다.

Description

다중 RT-PCR을 이용한 감귤 바이러스 진단 방법{Method for detecting Citrus virus by multiplex RT-PCR}
본 발명은 감귤 바이러스 진단 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 감귤 바이러스의 다중 진단 방법에 관한 것이다.
우리나라 감귤에 발생하는 바이러스는 최소 4 가지 즉, 갈색줄무늬오갈병(CTV, Citrus tristeza virus), 접목부이상병(CTLV, Citrus tatter leaf virus), 온주위축병(SDV, Satsuma dwarf virus) 및 모자이크바이러스(CiMV, Citrus mosaic virus)가 존재하는 것으로 보고되고 있다.
CTV는 접목전염을 주로 하나 많은 종류의 진딧물에 의하여 전파되는 것으로 알려져 있다. CTV에 의한 병징에는 크게 3가지(스템피팅, 급격한 고사, 황화)가 보고되고 있으나 우리나라에서는 스템피팅 병징과 유자에서의 궤양성 호반증상만이 보고되어 있다.
CTLV는 접목에 의해 전염되는 것으로 알려져 있으며, 외관상으로 접목부위가 비대현상을 보이고, 나무전체가 왜화 되면서 수세가 나빠진다. 비대화된 접목부위의 껍질을 벗겨보면 접수와 탱자나무 대목부분 사이에 경계층이 형성되어 쉽게 부러지며, 어린 묘목의 경우 황화되고 강한 바람이나 약간의 충격에도 쉽게 그 부위가 부러지는 것으로 알려져 있다.
SDV는 주로 접목에 의해서 전염되고, 토양 전염된다는 보고가 있으나 매개 수단은 알려져 있지 않다. 1952년 일본에서 처음으로 밝혀졌으며 수세 약화 및 수량 감소 등의 피해가 있는 것으로 알려져 있고, 제주의 온주밀감에서는 약 15%정도가 감염된 것으로 조사된다.
그리고, CiMV는 접목에 의해서 전염되며 토양 매개체에 의해서도 매개되지만 그 매개체는 확실히 밝혀져 있지 않다. SDV와는 혈청학적으로 같은 그룹에 속하여 혈청학적으로 구분이 어려운 것으로 알려져 있다.
곰팡이나 세균병과는 달리, 이러한 바이러스 병은 현재까지 뚜렷한 치료 방법이 개발되지 못한 실정이며, 바이러스 병 방제를 위해서 식물체가 감염되는 것을 막거나 억제하는 물리적 방제방법에 의존하고 있는 실정이다. 따라서, 바이러스 병의 사후 치료 대책이 미흡하므로 바이러스 감염여부를 조기에 진단하고 예방하는 것이 가장 중요하다.
본 발명은 상기와 같은 기술적 과제를 달성하기 위하여, SDV 바이러스 그룹 특이적 프라이머 및 진단 키트를 제공한다.
또한 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 감귤류에 발생하는 여러 종의 바이러스를 신속하고 효과적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
특히, 감귤류 바이러스 중에서 갈색줄무늬오갈병(CTV, Citrus tristeza virus), 접목부이상병(CTLV, Citrus tatter leaf virus), 온주위축병(SDV, Satsuma dwarf virus) 및 모자이크바이러스(CiMV, Citrus mosaic virus)를 동시에 검출하는 방법을 제공한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 감귤류의 온주위축병(SDV, Satsuma dwarf virus) 계통의 바이러스를 검출하기 위한 프라이머를 제공한다.
본 발명의 발명자들은 계통학적으로 유사도가 매우 높은, SDV 계통 바이러스인, SDV 및 CiMV를 검출할 수 있는 프라이머를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에서 '프라이머'는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 'RT-PCR (reverse transcript-polymerase chain reaction) 조성물'은 감귤 바이러스의 다중 검출을 위한 조성물로, 상기 조성물에는 본 발명에서 설계한 프라이머 이외에 역전사 반응과 중합반응을 수행하기 위한 당업계에 공지된 DNA 중합효소, 역전사효소, dNTP 및 반응 완충액을 포함할 수 있다.
나아가 필요한 경우 DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수도 있다.
본 발명에서 'RT-PCR 키트'는 상기 RT-PCR 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 RT-PCR 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함된다.
상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명자들은 감귤류에 동시에 발생할 수 있는 갈색줄무늬오갈병(CTV, Citrus tristeza virus), 접목부이상병(CTLV, Citrus tatter leaf virus), 온주위축병(SDV, Satsuma dwarf virus) 및 모자이크바이러스(CiMV, Citrus mosaic virus)를 효율적으로 검출하기 위한 진단 방법을 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
SDV 계통 바이러스에 속하는 SDV 및 CiMV는 바이러스의 변이가 심하여 기존 프라이머를 이용한 RT-PCR 에서는 검정이 제대로 되지 않는 문제점이 있었다. 이에 본 발명의 발명자들은 SDV 계통 바이러스의 변이체들도 효과적으로 검출할 수 있는 진단방법을 개발하기에 이르렀다.
본 발명은 서열번호 1 및 2 또는 서열번호 3 및 4의 SDV 계통 감귤 바이러스를 진단하기 위한 진단용 프라이머를 제공하며, 바람직하게는 서열번호 1 및 2의 SDV 계통 감귤 바이러스를 진단하기 위한 진단용 프라이머를 제공한다.
본 발명의 상기 SDV 계통 감귤 바이러스는 감귤 온주위축병(SDV) 및 감귤 모자이크바이러스(CiMV) 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, CiMV는 SDV와 항형철학적으로 구분이 거의 되지 않고 계통학적으로 유사도가 매우 높은 것으로 알려져 있다. 이러한 CiMV와 SDV의 계통학적 유사도는 도 1에 나타냈다.
본 발명은 또한 SDV 계통 바이러스를 검출하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머, CTV 검출을 위한 서열번호 5 및 6의 프라이머 및 CTLV 검출을 위한 서열번호 7 및 8의 프라이머를 포함하는 RT-PCR용 조성물을 제공한다.
본 발명의 발명자들은 본 발명의 RT-PCR용 조성물이 각 바이러스에 특이적인 프라이머 세트들을 이용하여 동시에 RT-PCR을 진행할 때, 각 프라이머 세트들 간에 간섭없이 효과적으로 다중 진단이 가능하다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 프라이머 조성물은 감귤류에 발생하는 상기 4 종의 바이러스, SDV, CiMV, CTV 및 CTLV를 검출하기 위한 것이며, 상기 조성물은 RT-PCR용 DNA 중합효소, dNTPs 및 반응버퍼를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, SDV 계통 바이러스를 검출하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머, CTV 검출을 위한 서열번호 5 및 6의 프라이머 및 CTLV 검출을 위한 서열번호 7 및 8의 프라이머를 포함하는 감귤류 바이러스 다중 진단을 위한 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, (a) 감귤 시료로부터 RNA를 수득하는 단계; (b) SDV 계통 바이러스를 검출하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머, CTV 검출을 위한 서열번호 5 및 6의 프라이머, 및 CTLV 검출을 위한 서열번호 7 및 8의 프라이머를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 RT-PCR의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 감귤 바이러스 감염 여부를 진단하기 위한 다중 RT-PCR 방법을 제공한다.
상기 생물시료로부터 RNA를 추출하기 위해 통상적으로 당업자들이 사용하는 RNA 추출키트를 사용할 수 있으며, 이에 한정되지 않지만 TRIzol Reagent(Invitrogen) 또는 AccuZol Total RNA extraction reagent(Bioneer)를 사용하여 생물시료로부터 RNA를 수득할 수 있다.
상기 증폭산물의 검출은 통상적인 RT-PCR 방법 및 장치를 사용하여 수행할 수 있다.
본 발명에 따른 검출방법은 4 종의 감귤 바이러스에 대한 감염 여부를 다중 RT-PCR로 동시 진단할 수 있다. 따라서 하나의 특이적 프라이머를 사용하여 단일 종 바이러스만 검사하는 종래의 방법에 비해 시간과 경제적인 측면에서 매우 유리한 발명이다.
본 발명에 따른 감귤 바이러스 진단용 프라이머 세트는 바이러스 감염 여부를 조기에 진단할 수 있어 감염으로 인한 농가의 경제적 손실을 방지할 수 있다.
본 발명에 따른 바이러스 진단 방법은 1회의 PCR 수행으로 4종의 바이러스를 동시에 검출할 수 있어 시간 및 경제적 측면에서 우수한 발명이다.
본 발명의 바이러스 진단 방법은 변이가 심한 SDV 계통의 바이러스를 검출하는데 탁월한 효과를 나타낸다.
본 발명에 따른 바이러스 진단 방법을 통하여 빠르고 간단하며 정확한 진단이 가능하다.
도 1은 SDV 및 CiMV의 계통 발생도를 나타낸 그림이다.
도 2는 SDV 계통 바이러스 특이적 프라이머를 나타낸 그림이다.
도 3은 감귤 바이러스 다중 진단을 위한 RT-PCR 실시를 위해 이용한 프라이머 세트를 나타낸 그림이다.
도 4는 감귤류에 발생하는 바이러스 복합 진단을 위해 다중 진단을 위한 RT-PCR를 실시하여 증폭산물을 확인한 결과를 나타낸 그림이다. Lane M : DNA 100bp ladder, lane 1: CTV, SDV 그룹 감염주, lane 2, 4, 6, 7 : CTV감염주, lane 3: CTV, CTLV감염주, lane 5: CTV, CTLV, SDV그룹 감염주
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. CTV , CTLV , SDV 및 CiMV RNA 샘플 준비
감귤 바이러스의 감염여부를 확인하기 위하여 감귤 조직으로 부터 아래와 같은 방법으로 RNA를 추출하여 시료를 준비하였다. 어린 잎 2-3개로부터 조직 약 0.1 g을 채취하여 액체질소를 이용하여 약자 사발에서 완전히 가루가 될 때까지 간 후 가루가 된 시료를 2ml튜브에 옮기고 여기에 TRIzol reagent 1ml 첨가하고 완전히 혼합한 후 5분간 상온에서 보관하고 여기에 클로로포름:이소아밀알콜 (24:1) 200㎕를 첨가하여 온전히 혼합한 후 15분간 상온에서 유지 한 후 4℃, 12,000rpm으로 20분간 원심분리하고 생겨난 상등액 약 600㎕를 새 튜브에 옮기고 Isopropanol 600㎕(1 Volum)를 첨가하고 손으로 잘 흔들어 주고 상온에 10분간 유지하였다. 이것을 4℃, 12,000rpm으로 20분간 원심분리한 후 상등액은 버리고 생겨난 침전물에 70-80% EtOH를 500㎕를 첨가하고 잘 흔들어 준 후 4℃, 12,000rpm으로 5분간 원심분리하고 진공건조기에서 5분간 건조한 후 핵산-Free water 100㎕에 녹인 후 여기에서 1㎕를 채취하여 cDNA를 합성하고 바이러스 검정에 사용하였다. cDNA는 Topscript cDNA Synthesis kit(Enzynomics)를 사용하여 제공된 메뉴얼에 따라 합성하였다.
실시예2 . 프라이머 세트 제작
SDV계통에 특이적인 프라이머를 디자인하기 위하여 SDV 3개체, CiMV 20개체로 부터 PP2 전체 유전자의 염기서열을 분석하여 SDV와 CiMV에 공통적인 염기서열을 바탕으로 PP2-1프라이머를 디자인하였고 PP2-2 프라이머는 CiMV만에 특이적인 염기서열을 바탕으로 디자인 하였다.
이름 염기서열 크기(bp) 분석대상
PP2-1 F: 5'-ACATTCGGGCAGCAGCAAGAT-3', (서열번호 1) 881 SDV, CiMV
R: 5'-TCCCTGAGTGAGAGACCGTGC-3', (서열번호 2)
PP2-2 F: 5'-TGCACGGTCTCTCACTCAGGG-3', (서열번호 3) 835
CiMV
R: 5'-TCAGCGCTTGTGCCTGGTGG-3', (서열번호 4)
상기 표 1의 프라이머를 이용하여 4개의 감귤 바이러스를 동시에 진단하기 위한 프라이머 셋트를 하기 표 2와 같이 준비하였다. SDV와 CiMV 검정을 위해서는 PP2-1프라이머를 사용하였고 CTV검정을 위해서는 제주 감귤에서 분리한 CTV 외피 단백질 유전자로부터 위 PP2-1프라이머와 ASGV프라이머들간 상보적으로 작용할 수 있는 염기서열을 가지고 프라이머를 디자인하였다. CTLV를 검정하기 위한 프라이머는 기존의 ASGV프라이머를 사용하였다.
이름 염기서열 크기(bp) 분석대상
PP2-1 F: 5'-ACATTCGGGCAGCAGCAAGAT-3', (서열번호 1) 881 SDV, CiMV
R: 5'-TCCCTGAGTGAGAGACCGTGC-3', (서열번호 2)
CTV-M F: 5'-GTGGCCAATAGGTCCGTAGA-3', (서열번호 5) 412 CTV
R: 5'-CGGGTCTCAACCTAGCCATA-3', (서열번호 6)
ASGV-up F: 5'-CTCGAGACCCTCCAGTTCCAAGTTA-3', (서열번호 7) 720 CTLV
R: 5'-CATATGAGTTTGGAAGACGTGCTTC-3', (서열번호 8)
실시예 3. RT - PCR 실시
멀티플렉스 실시간 PCR
상기에서 제작된 프라이머 세트가 감귤 바이러스를 동시에 진단할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 상기 실시예 1에서 얻은 cDNA 1.0㎕를 주형으로 하고, 다중 검정용 프리 믹스 키트인 Enzyme-mediated Hot start PCR kit(Accupower Gold Multiplex PCR Premix, Bioneer (Top DNA polymerase 1unit, dNTP 각 250μM, 2mM MgCl2)에 표 2의 각각의 프라이머의 forward와 reverse 프라이머 각각 10pmole(서열번호 1, 2, 5, 6, 7 및 8)를 포함한 20㎕의 반응액을 만들었다. 이를 95℃에서 2분 동안 초기 변성(denaturation)시킨 후, 94℃에서 30초간 변성, 55℃에서 60초간 어닐링(annealing), 72℃에서 2분간 합성(extension)을 35회 반복한 후 72℃에서 10분간 final extension을 실시하였다. 바이러스 유전자의 합성 여부는 아가로오즈 겔상에서 전기영동하여 확인하였다.
결과
하기 표 3에 나타난 바와 같이, SDV 계통의 바이러스들에 대한 감염여부를 항혈청과 여러가지 프라이머들을 이용하여 검정해 본 결과 PP2-1 프라이머가 가장 검정 효율이 높음을 알 수 있었다.
항혈청과 여러 프라이머를 이용한 SDV그룹 바이러스 검정 결과
시료명 항혈청 프라이머
CIDS SDV Iwanami SRNA RV-FW PP2-1 PP2-2
SDV-SM-1 · + + + + + + +
SDV-Mya-2 · - - - - - + -
SDV-Mya-3 + - - - - - + +
SDV-SM-5 · + + - + + + +
SDV-SM-7 · + + - + - + +
SDV-SM-12 · + + - + + + +
SDV-SM-16 · - + - - - + +
SDV-SM-18 · + + - - + + +
SDV-SM-20 ·　 - - - - - + +
SDV-SM-21 + + + + + + + +
SDV-SM-23 + - - - - - + +
Dosun-SDV · - - - - - + +
CTV-SM-27 · - + - - - + +
CTLV-SM-1 · - - + - - + +
CTLV-SM-2 · - - - - - + +
CTLV-SM-5 - + - + + + + -
Jung-CiMV3 · + + - + + + +
Seto-CiMV-1 · - - - - - + +
Seto-CiMV-3 · + + - + - + +
Namwon-CiMV · - + - - - + +
Sun-CiMV · - - - - - + +
SDV-SM-26 · - + - + + + +
Seto-SDV-1 · · · · · · + -
Seto-SDV-2 · · · · · · + -
그리고 하기 표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1, 2, 5, 6, 7 및 8을 모두 포함하는 감귤 바이러스 복합 진단 셋트를 이용하여 검정해본 결과 각각의 프라이머를 이용하여 진단했을 때와 동일하게 모든 시료에서 바이러스들을 진단할 수 있음을 알 수 있었다.
다중 검정 시스템을 이용한 바이러스 검정 결과
시료명 CTV CTLV SDV 그룹 시료명 CTV CTLV SDV 그룹
SDV-SM-1 + - + CTV-SM-15 + - -
SDV-SM-2 - - - CTV-SM-17 + - -
SDV-Mya-2 + - + CTV-SM-27 + - +
SDV-Mya-3 + - + CTLV-SM-1 + + +
SDV-SM-5 + - + CTLV-SM-2 + + +
SDV-SM-7 + - + CTLV-SM-5 + + +
SDV-SM-12 + - + Jung-CiMV3 + - +
SDV-SM-16 + - + Seto-CiMV-1 + - +
SDV-SM-18 + - + Seto-CiMV-3 + - +
SDV-SM-20 +　 - + Namwon-CiMV + - +
SDV-SM-21 + - + Sun-CiMV + - +
SDV-SM-23 + - + SDV-SM-26 + - +
SDV-SM-27 + - - Seto-SDV-1 + - +
Dosun-SDV + - + Seto-SDV-2 + - +
CTV-SM-13 + - -
<110> EPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Method for detecting Citrus virus by multiplex RT-PCR <130> P13-153 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP2-1-F primer <400> 1 acattcgggc agcagcaaga t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP2-1-R primer <400> 2 tccctgagtg agagaccgtg c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP2-2-F primer <400> 3 tgcacggtct ctcactcagg g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PP2-2-R primer <400> 4 tcagcgcttg tgcctggtgg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTV-M-F primer <400> 5 gtggccaata ggtccgtaga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTV-M-R primer <400> 6 cgggtctcaa cctagccata 20 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV-up-F primer <400> 7 ctcgagaccc tccagttcca agtta 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASGV-up-R primer <400> 8 catatgagtt tggaagacgt gcttc 25

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 2 로 이루어진, 감귤 온주위축병(Satsuma dwarf virus, SDV) 및 감귤 모자이크바이러스(Citrus mosaic virus, CiMV) 동시 진단을 위한 감귤 바이러스 진단용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 감귤 온주위축병(Satsuma dwarf virus, SDV) 및 감귤 모자이크바이러스(Citrus mosaic virus, CiMV)를 검출하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트;
    갈색줄무늬오갈병(Citrus tristeza virus, CTV) 검출을 위한 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트; 및
    접목부이상병(Citrus tatter leaf virus, CTLV) 검출을 위한 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트를 포함하는 RT-PCR용 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 RT-PCR용 조성물은 감귤 온주위축병(Satsuma dwarf virus, SDV), 감귤 모자이크바이러스(Citrus mosaic virus, CiMV), 갈색줄무늬오갈병(Citrus tristeza virus, CTV) 및 접목부이상병(Citrus tatter leaf virus, CTLV)를 검출하기 위한 다중 RT-PCR에 사용되는 것읕 특징으로 하는 RT-PCR용 조성물.
  6. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 감귤 바이러스 검출을 위한 RT-PCR 키트.
  7. 제6항에 있어서, 상기 RT-PCR 키트는 반응 완충액, DNA 중합효소 및 역전사효소를 더 포함하는 것인 키트.
  8. (a) 감귤 시료로부터 RNA를 수득하는 단계;
    (b) 감귤 온주위축병(Satsuma dwarf virus, SDV) 및 감귤 모자이크바이러스(Citrus mosaic virus, CiMV)를 검출하기 위한 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트, 갈색줄무늬오갈병(Citrus tristeza virus, CTV) 검출을 위한 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트, 및 접목부이상병(Citrus tatter leaf virus, CTLV) 검출을 위한 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 RT-PCR의 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 감귤 바이러스 감염 여부를 진단하기 위한 다중 RT-PCR 방법.
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