KR20040034331A - 단일염기다형성을 이용한 산삼과 재배인삼의 판별방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산삼과 재배인삼을 단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)을 이용하여 구별하는 방법으로서, 좀 더 상세하게는 산삼과 재배인삼으로부터 DNA를 추출하고 SNP 프라이머(Primer)를 제작하여 ITS 영역을 유전자증폭기(PCR, polymerase chain reaction)로 증폭한 후에 염기서열분석(Sequencing)을 하고 이들을 비교·분석하여 SNP 부분을 찾아낸 후 이들 영역에 대하여 특이적인 프라이머를 제작한 후 이를 사용하여 유전자 증폭기로 증폭한 후 전기영동을 하여 나타나는 밴드를 관찰하여 국내야생산삼과 재배인삼을 구별하는 시스템이다.

본 시스템을 사용하면 극히 소량(50-100mg)의 시료를 사용하여 산삼과 재배인삼의 구별을 간단하고 신속하게 판별할 수 있다.

Description

단일염기다형성을 이용한 산삼과 재배인삼의 판별방법{Distinction of Wild Mountain Ginseng from Cultivated Ginseng using Single Nucleotide Polymorphism}

본 발명은 산삼과 재배인삼을 단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)을 이용하여 판별하는 방법으로, 더욱 상세하게는 산삼이나 재배인삼의 잔뿌리(50-100mg)로부터 DNA를 추출하고 PCR을 이용하여 효율적으로 산삼과 재배인삼을 판별하는 방법이다.

인삼은 원래 산삼의 종자나 유근을 집근처 산이나 밭으로 옮겨 심어 재배하기 시작한 것으로, 오늘날의 재배인삼은 산삼으로부터 유래되었다고 할 수 있다. 즉 재배인삼과 산삼 둘 다 동일한 「Panax ginseng C.A. Meyer」를 기원식물로 하고 있다. 다만 그 주변환경에 차이가 있어 생육상태가 달라진 것으로 이해 할 수 있으며, 유전적으로는 대부분 유사하지만 산삼은 깊은 산속에서 따로 격리된 상태에서 집단유전이 되어왔는데 비하여, 재배인삼은 인삼포장에서 집단유전되어 왔기 때문에 다소 유전적인 차이(변이)가 발생하였을 것으로 판단된다.

인삼은 예로부터 원기를 북돋워주고 두뇌활동과 정신력을 왕성하게 하며, 당뇨, 암, 혈압, 간, 심장 질환 등 각종 성인병 예방은 물론이고 정력부진 및 갱년기 장애 해소에 탁월한 효능을 보이고 있다. 또한 산삼을 먹게되면 스트레스에 의한 신경과민반응과 빈혈에 좋고 눈이 맑아지며 추위를 타지 않고 머리가 좋아질 뿐만아니라, 조혈, 신진대사 촉진작용을 하며 인체의 저항력을 높임과 동시에 면역기능을 향상시켜주는 것으로 알려져 있다. 산삼의 효능은 재배인삼에서보다 더욱 뛰어난 불로장생, 만병통치의 영약으로 옛부터 인식되어 왔고, 그 희귀성 때문에 한 뿌리에 수백 만원에서 수천 만원에 거래되기도 한다. 이와같이 산삼은 고가이기 때문에 재배인삼의 종자나 묘삼을 산에 옮겨 심어 재배한 산양삼(山養蔘)이나 재배방법을 달리하여 뇌두를 길게 재배한 장뇌삼(長腦蔘) 등이 산삼으로 둔갑하여 거래되기도 하여 산삼의 거래질서를 문란시킬 뿐만 아니라, 소비자들에게 많은 피해를 주고 있어 산삼의 진위여부를 판단할 수 있는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.

최근 산삼의 진위여부와 나이를 감정하는 산삼의 감정방법(특2002-0074435)과 한국산 산삼을 판별하는 방법(특2002-0022491)등이 제시되었으나 이들 방법은 일부 전문가와 고가의 분석기기를 필요로 하기 때문에 일반화하기는 어려운 방법들이다. 산삼과 인삼은 그 기원이 동일하다고는 하나 재배 인삼의 경우에는 인간에 의하여 오랫동안 재배되어왔고 산삼은 깊은 산중에 고립된 상태에서 생존하여왔기 때문에 유전적으로 차이(변이)가 존재한다는 것이 최근 연구결과 밝혀졌다.

본 발명자들은 상기와 같은 점에 착안하여 산삼이나 인삼의 상품성을 떨어뜨리지 않고 극히 소량의 시료로도 산삼과 재배인삼을 구별해낼 수 있는 방법을 개발하고자 연구를 수행한 결과, 산삼과 재배인삼간의 유전자 염기서열차이(변이, SNP)를 발견하였고 이를 활용하여 SNP primer를 제작하였다. 그리고 50-100mg의 극히 소량의 생체시료를 사용하여 산삼과 재배인삼을 구별해 낼 수 있는 SNP(single nucleotide polymorphism) 분석시스템을 개발하였다. 본 발명의 목적은 극히 상품성을 떨어뜨리지 않고 극히 소량의 시료를 사용하여 재현성있으며 단시간에 국내 야생산삼과 재배인삼을 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기목적은 산삼과 재배인삼의 상품성을 떨어뜨리지 않고 극히 소량의 시료를 사용하여 산삼과 재배인삼을 구별하는 것으로서 산삼과 인삼의 잔뿌리를 채취하여 DNA를 추출하고 제작된 SNP 프라이머를 이용하여 유전자증폭기(PCR)로 반응시킨 후 일정시간 전기영동을 하여 나타나는 DNA 밴드패턴을 비교하여 야생국내산삼과 재배인삼을 구별함으로서 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 우선 시료로 사용되는 산삼과 재배인삼을 사진촬영을 하고 상품성을 떨어뜨리지 않기 위해서 산삼과 재배인삼의 세근 일부를 잘라서 DNA를 추출하는 단계, 산삼과 재배인삼의 ITS(internal transcribed sequence)영역의 염기서열을 비교·분석하여 특이적인 SNP 프라이머를 제작하는단계, 추출된 각 시료의 DNA와 SNP 프라이머를 혼합하여 PCR을 이용하여 증폭하는 단계 그리고 이들 각각의 증폭된 유전자 산물을 전기영동을 하여 DNA 밴드패턴을 비교하여 산삼과 재배인삼을 구별하는 단계로 구성되어 있다.

사진촬영 및 DNA 추출 : 산에서 채취된 산삼을 원형그대로의 상태를 증명하기 위해서 산삼의 뿌리를 가지런히 한 후에 카메라로 증거사진을 촬영한후 산삼의 상품가치를 떨어뜨리지 않게 세근의 극힌 일부분(50-100mg)을 채취한다. DNA 추출은 상용화되어 있는 컬럼타입의 DNA 추출킷트(Macherey-Nagel)를 사용하였으며, 전기영동을 하여 추출된 DNA량과 상태를 관찰하여 각 시료의 DNA량을 동일하게 조정하였다.

ITS 영역의 염기서열비교 및 SNP 프라이머제작 : 추출된 DNA를 이용하여 제작한 ITS 프라이머로 산삼과 재배인삼의 ITS(internal transcribed sequence)1영역과 5.8S ribosome영역, ITS2영역을 PCR로 증폭한 후 자동염기서열분석기(sequencer)를 이용하여 염기서열을 결정하고 이를 비교·분석하여 SNP를 찾아낸 후 특이적인 SNP 프라이머를 제작하였다(Philip 등 1991, Clinical Chemistry).

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법을 사용할 경우 일부전문가 또는 고가의 분석장치를 사용하여 산삼을 판별하던 기존의 기술을 대체하여 고가의 산삼의 품질을 떨어뜨리지 않고 극히 소량의 시료를 사용하여 DNA를 추출한 후 특수하게 제작된 SNP 프라이머로 단시간(5시간)에 재현성있는 결과를 얻을 수 있으므로 국내의 산삼유통의 질서를 보다 명확하고 투명하게 하는데 매우 유용할 것이다.

그림 1. 산삼과 재배인삼의 ITS 영역의 구조 및 SNP 프라이머의 제작

유전자 증폭 : 추출된 DNA 1-50 ng, 특수하게 제작된 각각의 SNP primer 0.2-2 uM, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 0.1 mM, MgCl₂200 uM, Taq polymerase 0.5-1U 등을 200 ul PCR 튜브(tube)에 첨가하고 유전자 증폭기의 조건을 94℃ 30초, 62℃ 30초, 72℃ 1분에서 30회 반복하여 증폭한 후 유전자 증폭을 완결하기 위하여 72℃에서 15분간 유지하였다.

전기영동 : 유전자 증폭기를 사용하여 증폭된 유전자산물을 관찰하기 위하여 1.0% 아가로스겔을 만들고 TAE 버퍼를 사용하여 50 volt에서 10분간 영동한 후 100 volt에서 15분간 영동하였다. 영동이 끝난 아가로스겔은 UV-transilluminator에 올려놓고 나타나는 DNA 밴드를 관찰한 후 폴라로이드필름을 사용하여 사진 촬영하였다. 그림 2의 모식도와 영동사진에서 보는 바와 같이 산삼의 경우에는 3개의 DNA 밴드가 관찰되고 재배인삼의 경우에는 2개의 DNA 밴드가 증폭되도록 하여 단시간에 판별할 수 있도록 고안하였다.

그림 2. SNP 프라이머를 이용한 산삼과 재배인삼의 PCR 증폭

Claims (3)

1. 산삼과 재배인삼의 ITS 1영역, 5.8S ribosome영역, ITS2 영역의 DNA 영기서열을 비교하여 나타나는 단일염기다형성(SNP, single nucleotide polymorphism)를 이용하여 제작되는 프라이머(primer)
2. 제1항에 있어서 제작된 SNP 프라이머를 이용하여 유전자증폭기를 사용하여 증폭된 유전자 산물을 전기영동하여 나타난 DNA 밴드패턴의 차이를 이용하여 산삼과 재배인삼을 판별하는 방법
3. 제1항에 있어서 제작된 SNP 프라이머를 이용하여 실시간유전자증폭기(real time PCR)를 이용하여 증폭되는 유전자산물의 결과를 이용하여 산삼과 재배인삼을 판별하는 방법