DE60225441T2

DE60225441T2 - Verfahren zur analyse von t-lymphozyten über die t-lymphozytrezeptoren eines organismus

Info

Publication number: DE60225441T2
Application number: DE60225441T
Authority: DE
Inventors: Jean-Paul Soulillou; Marc-Andre Delsuc; Marina Guillet; Sophie Brouard
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2001-04-13
Filing date: 2002-03-28
Publication date: 2009-02-26
Anticipated expiration: 2022-03-29
Also published as: ES2301668T3; EP1393236B1; EP1393236A2; WO2002084567A2; DE60225441D1; ATE388448T1; WO2002084567A3; US20050019764A1; CA2445181A1

Description

Die Erfindung betrifft die Untersuchung des Immunsystems von Organismen, wie Menschen oder Tieren, insbesondere die Analyse der aktivierten oder nicht aktivierten T-Lymphozyten eines Organismus über die Untersuchung von deren Rezeptor.
Die Immunantworten können in zwei große Kategorien eingestuft werden: die natürlichen Antworten und die adaptiven (oder spezifischen) Antworten. Die an der natürlichen Antwort beteiligten Zellen setzen primitive und nicht-spezifische Erkennungssysteme ein. Diese Art von Antwort repräsentiert folglich die erste Verteidigungslinie gegen Infektionen und dominiert in den anfänglichen Stadien der Infektion. In dem Falle, wo die natürliche Immunität unwirksam ist, setzt die adaptive Immunität, die an jeden Mikroorganismus angepasste spezifische Antworten ins Spiel bringt, ein. Die Lymphozyten stehen am Anfang dieser adaptiven Erkennung.
Es existieren zwei Arten von Lymphozyten: die B-Lymphozyten, die für die humorale Immunität (Produktion von Antikörpern) verantwortlich sind, und die T-Lymphozyten, die für die zelluläre Immunität verantwortlich sind. Diese Letzteren spielen eine zentrale Rolle in der Biologie. Sie erkennen Peptide, die aus dem intrazellulären Abbau von Antigenen hervorgehen, aber nur, wenn diese Peptide mit Molekülen assoziiert sind, die sich auf Antigen präsentierenden Zellen befinden, welche als Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes oder MHC bezeichnet werden (auch bezeichnet als Human Leucocyte Antigen (humanes Leukozytenantigen) oder HLA), die sich auf Antigen-präsentierenden Zellen befinden. Für diese Funktion setzen die T-Lymphozyten einen spezifischen Rezeptor ein, welcher als T-Lymphozyten-Antigen-Rezeptor oder TCR bezeichnet wird.
Der Rezeptor der T-Zellen (TCR) ist ein Heterodimer, welches aus zwei Ketten: α und β gebildet wird. Wir interessieren uns hier allein für die β-Kette, die die Gene Vβ (24 beim Menschen), Dβ (2 beim Menschen), Jβ (12 beim Menschen) und Cβ (2 beim Menschen), die anfänglich auf der DNA getrennt vorliegen, umfasst. Eines der Vβ-Gene verbindet sich zufällig mit einem der Gene Dβ, Jβ und Cβ unter Bildung eines funktionsfähigen Rezeptors. So kann theoretisch eine große Anzahl von unterschiedlichen TCRs (etwa 25 × 10⁶ unterschiedliche TCR) erzeugt werden. Die Begegnung mit einem Antigen hat die Selektion von T-Lymphozyten, die einen spezifischen TCR, welcher aus einer besonderen Vβ-Dβ-Jβ-Kombination gebildet wird, tragen, zur Folge. Die Erkennung des Antigens erfolgt hauptsächlich im Bereich der hypervariablen CDR3-Region (Complementary Determining Region 3), die durch die Umlagerung der Gene Vβ, Dβ und Jβ gebildet wird und die eine variable Länge aufweist. Normalerweise verwenden bei einem gesunden Individuum die Transkripte, die eine beliebige Vβ-Familie kodieren, alle möglichen Längen der CDR3.
Bis jetzt ist die Analyse des Rezeptors der T-Zellen hauptsächlich auf „qualitative" Weise (d. h. Untersuchung einer etwaigen Selektion) ausgeführt worden dank solcher Methoden wie jener, die durch die unter der Marke Immunoscope^® bekannte Software ausgeführt wird und die diesen Rezeptor auf der Ebene der Verteilung der Längen der CDR3-Region, der Region, die an der Erkennung des Peptids am stärksten beteiligt zu sein scheint, untersucht.
Nach Amplifizierung von dieser CDR3-Region von variabler Länge dank eines Cβ-Primers und eines Vβ-Primers liefert die Immunoscope-Software die Ergebnisse in Form von Peaks, wobei jedes Profil aus 7 bis 11 Peaks gebildet wird, d. h. 7 bis 11 unterschiedlichen Größen der CDR3, die jeweils um 3 Nukleotide voneinander getrennt sind. So beobachtet man, wenn alle Längen der CDR3 in einer gegebenen Vβ-Familie repräsentiert sind, ein Gauß-Profil, welches für eine polyklonale Antwort charakteristisch ist. Dies ist beispielsweise das, welches man im Allgemeinen bei einem gesunden Individuum beobachtet. Im Gegensatz dazu kann eine Länge der CDR3 in der Folge einer besonderen Aktivierung, die bestimmte Klone von T-Lymphozyten selektioniert hat, hauptsächlich repräsentiert sein und man beobachtet dann eine oligo- oder monoklonale „Veränderung" der Verteilung der Längen der CDR3-Region, wobei die Profile dann ihren Gauß-Charakter verlieren.
Ein Mittel, um das Profil einer Probe mit dem Vergleichsprofil zu vergleichen, besteht darin, die in der Veröffentlichung von G. Gorochov (Nat. Med., 1998, 4(2):215) beschriebene Berechnungsmethode einzusetzen, die die Differenz zwischen der Fläche unter jedem Peak des Vergleichsprofils und der Fläche unter jedem Peak des Profils der Probe berechnet. Man erhält so Veränderungsprozentsätze bezogen auf das Gauß-Profil und die Ergebnisse werden in Form von dreidimensionalen Strukturen, die erlauben, die mit jeder der Vβ-Familien einer gegebenen Probe assoziierten Veränderungen auf ein und derselben Graphik sichtbar zu machen, dargestellt. Diese Graphiken, welche üblicherweise als Reperturb bezeichnet werden, erscheinen eben, wenn das Repertoire nicht verändert ist und gestört, wenn das Repertoire verändert ist.
Trotz ihrer Vorteile erlauben diese Verfahren zur qualitativen Analyse des Rezeptors der T-Zellen nicht, eine präzise Kenntnis zu erlangen von der Menge von Vβ-mRNA, die durch einen Selektionsprozess beeinflusst wird (und folglich indirekt von dem Umfang des Pools von T-Zellen, die eine gegebene Vβ-Umlagerung einsetzen) und weisen folglich eine bedeutende Einschränkung auf, indem sie nicht in der Lage sind, die festgestellten Anomalien zu hierarchisieren.
Als Beispiel repräsentiert die 2 ein Gauß-Profil und die 1 eine monoklonale Expansion, erhalten durch Immunoscope^®. Unter Einsatz der Reperturb-Methode erscheinen in der 3 vier Peaks, welche jeweils einer Vβ-Familie, welche eine klonale Expansion aufweist, entsprechen. Trotz ihres Vorteils erlaubt diese qualitative Analyse allein nicht, zu wissen, ob die TCR, die diese Expansionen aufweisen, einen bedeutenden Anteil des Vβ-Transkriptoms ausmachen oder ob sie lediglich eine Minderheit innerhalb des Pools von T-Zellen repräsentieren. Beispielsweise weiß man anhand von 3 nicht, ob die T-Zellen, die eine der 4 klonalen Expansionen aufweisen, stärker repräsentiert sind als eine andere innerhalb der Population von gesamten T-Zellen und folglich spezieller an der untersuchten Immunreaktion beteiligt sind. Im Gegensatz dazu bleibt die Graphik eben, wenn alle Vβ-Familien eine Gauß-Verteilung der Längen der CDR3 aufweisen, wie dies die 4 zeigt. Dieses ebene Profil kann zurückzuführen sein:

– auf ein Fehlen einer Antwort (keinerlei T-Lymphozyt beteiligt);
– auf eine polyklonale Antwort aufgrund der Aktivierung einer großen Anzahl von T-Klonen, wobei diese Aktivierung das Vorhandensein von potentiellen klonalen Expansionen maskiert,
– oder auf die Aktivierung von T-Zellen ohne Modifizierung der Längenverteilung der CDR3. Dies ist beispielsweise der Fall eines Profils, das nach einer Stimulation durch polyklonale Liganden (anti-CD3-Antikörper, Concanavalin A, PHA u. s. w....) oder durch Superantigene beobachtet wird.

Die qualitative Analyse allein erlaubt nicht, zwischen diesen drei Hypothesen zu unterscheiden.
Der Anmelder ist der erste gewesen, der die Immunoscope^®-Methode eingesetzt hat, um die Abstoßung und die Toleranz von Allotransplantaten oder, seit kürzerer Zeit, von Xenotransplantaten zu untersuchen. Obgleich diese Untersuchungen an kongenen Ratten-Linien (eine viel stärker „vereinfachte" Kombination, als dies die allogene Kombination ist) ausgeführt worden sind, haben sie indessen zumeist Veränderungen vom privaten Typ (für ein Individuum spezifische Veränderungen) enthüllt, wohingegen die allgemein gefundenen Veränderungen (es wird bei mehreren Tieren eine gleiche Länge und gleiche Sequenz der CDR3 gefunden) extrem seltene Ereignisse sind. Aufgrund von diesem dominanten privaten (und folglich anscheinend chaotischen) Profil und der starken Kreuzreaktivität des TCR kann keinerlei reproduzierbare Information hinsichtlich der Physiologie der Alloerkennung erhalten werden. Ausgehend von diesen Beobachtungen und dieser Feststellung stellt sich heraus, dass eine kombinierte Analyse der qualitativen Veränderungen (privat/allgemein) und der quantitativen Abschätzung des Pools von T-Zellen, der an diesen Veränderungen beteiligt ist (Anzahl von Vβ-Transkripten für jedes veränderte Profil) das einzige Mittel ist, um Zugang zu der Kinetik der Antwort der T-Lymphozyten zu erlangen.
So ist unser Vermögen zur Auswertung und zur Untersuchung der Dynamik und des Umfangs der Antwort der T-Lymphozyten in vivo sehr begrenzt. Die Analyse des Repertoires des TCR ist eine indirekte Wiederspiegelung des Zustands der Mobilisierung und der Aktivierung der T-Zellen in einer gegebenen biologischen Situation. Indessen machen die bedeutende Kreuzreaktivität des TCR wie auch die große Diversität der zugerichteten Peptide die Verwendung der qualitativen Veränderungen des Vβ-Repertoires allein genommen (beispielsweise gemäß der Immunoscope-Methode) als Marker, um die Population von T-Zellen, die an einer komplexen Immunreaktion beteiligt sind, auf präzise Weise zu identifizieren und zu hierarchisieren, schwierig, sogar wenn die Untersuchung des Repertoires auf der Ebene der Sequenzen und der Längenvariationen der CDR3-Region erfolgt. Trotz ihrer Vorteile erlaubten die zuvor bekannten Verfahren zur Analyse des TCR folglich nicht, eine genaue Kenntnis von dem mRNA-Pool von T-Lymphozyten (bezogen auf das globale Cβ-Transkriptom) unter Einsatz einer Umlagerung von gegebenen Vβ-Ketten zu erlangen. Außerdem ist die Anhäufung der Vβ-Transkripte ein von der Expression der entsprechenden Proteine an der Oberfläche der T-Zellen verschiedener Parameter, denn diese Letzteren können nach Wechselwirkung mit dem Antigen herunterreguliert werden.
Eines der Ziele der Erfindung besteht darin, ein neues Verfahren zur Analyse bereitzustellen, das erlaubt, eine quantitative Dimension, einen für die Analyse der Veränderungen des Repertoires essentiellen Parameter, hinzuzufügen.
In Hinblick auf die Realisierung dieses Ziels schlagen wir gemäß der Erfindung ein Verfahren zur Analyse der Rezeptoren der T-Lymphozyten eines Organismus vor, das die Schritte umfasst, welche daraus bestehen:

– die Anzahl von Transkripten für jedes Vβ-Gen zu bestimmen, um erste Daten zu erhalten. Diese Anzahl von Transkripten kann dann beispielsweise dargestellt werden in Form von Bruttowerten (Anzahl von Transkripten für jede Vβ-Familie), in Form eines Verhältnisses zwischen dieser Anzahl von Transkripten und der Anzahl von Transkripten eines Referenzgens, beispielsweise des Gens HPRT (Hypoxanthinphosphoribosyltransferase), wobei dieses Letztere ein Gen ist, das in allen Zellen vorhanden ist und das erlaubt, die Daten zu vereinheitlichen, in Form eines Prozentsatzes von jedem Vβ-Transkript unter der Summe der Vβ-Transkripte oder in Form eines Messwerts der Variation zwischen der Anzahl von Transkripten in einer gegebenen Vβ-Familie einer gegebenen Probe und der Anzahl von Transkripten derselben Vβ-Familie einer Referenzprobe.
– die CDR3-Region der Rezeptoren der T-Lymphozyten für jedes der Vβ-Gene, die mit dem Organismus assoziiert sind, zu amplifizieren
– die verschiedenen Längen der CDR3 der Rezeptoren der T-Lymphozyten für jedes der mit dem Organismus assoziierten Vβ-Gene aufzutrennen und den Anteil der Transkripte von jeder Länge der CDR3 in jeder Vβ-Familie abzuschätzen, um zweite Daten zu erhalten,
– in einem Diagramm mit vier Variablen die ersten und zweiten Daten in Abhängigkeit von den Vβ-Genen und der Länge der CDR3-Regionen darzustellen.

So erlaubt die Erfindung, die Existenz und die quantitative Hierarchie von Anomalien der Verteilung der Längen der CDR3-Region im Verlauf der Initiation, die Kinetik, die Expansion, das Gedächtnis und das Ausmaß von Epitope-Spreading in einer Situation einer komplexen Immunantwort (beispielsweise einem pathologischen Kontext) präzise zu verfolgen aufgrund der Tatsache, dass die beiden Parameter (Profil der Veränderung der Verteilung der Längen der CDR3-Region des TCR bezogen auf die Ruhesituation und quantitative Auswertung der Vβ-Transkripte des Pools von beteiligten T-Zellen) global auf gleichzeitige Weise auf dem Diagramm visualisiert werden können.
Die Erfindung bietet folglich eine integrierte Ansicht der Veränderungen des TCR anstelle der alleinigen individuellen Beschreibung der Veränderungen von jeder Vβ-Familie. Sie ist dementsprechend besser geeignet für das Verständnis der fundamentalen immunologischen und angewandten Ereignisse, die eine T-lymphozytäre Antwort (Infektionskrankheiten, Autoimmunkrankheiten, Krebserkrankungen, Transplantate u. s. w.) impliziert. Die Präsentation der Ergebnisse ist auch zugleich vollständig, didaktisch und leicht zu erfassen.
Die Erfindung schlägt eine neue Strategie zur Auswertung der Immunantwort in vivo vor, die vorzugsweise auf einer rechnergestützten Integration der Veränderungen des Vβ-Transkriptoms der aktivierten Tαβ-Lymphozyten gegründet ist.
Das Verfahren der Erfindung kombiniert die Analyse, die beispielsweise durch die Programme Reperturb und Immunoscope^® hinsichtlich der Veränderung der Länge der CDR3 (in einer gegebenen Vβ-Familie) erhalten wird, verglichen mit dem Gauß-Profil im Ruhezustand, mit einer quantitativen Messung von jedem Vβ-Transkript durch quantitative PCR (beispielsweise gemäß der unter dem Namen TaqMan bekannten Methode) von jeder Vβ-Familie und folglich der Transkripte für alle veränderten TCR-Signale. Eine faktorielle Analyse wird eingesetzt, um die Zusammenhänge der Verwendung der Vβ und von deren Veränderung zu definieren. Die Erfindung umfasst ein Programm zur graphischen Darstellung, welches eine generelle und beispielsweise dreidimensionale Ansicht der Hierarchie der Veränderungen und folglich des Aktivierungszustands der reaktiven T-Zellen erlaubt.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird außerdem mindestens eines der folgenden Merkmale aufweisen können:

– wenigstens eine der Variablen wird dargestellt, ohne mit einer Dimension des Raums assoziiert zu sein;
– wenigstens eine der Variablen wird durch Unterschiede des örtlichen Aussehens des Diagramms dargestellt;
– die Unterschiede des örtlichen Aussehens sind Farbunterschiede;
– die Variable, die nicht mit einer Dimension des Raums assoziiert ist, entspricht den zweiten Daten.
– die ersten Daten werden entlang der vertikalen Richtung dargestellt;
– die vorab bestimmten Werte entsprechen für jedes Vβ-Gen einer Gauß-Verteilung der Verhältnisse von Transkripten entsprechend den mit diesem Gen assoziierten CDR3-Regionen;
– es umfasst nach der Bestimmung der ersten und der zweiten Daten die Schritte, welche daraus bestehen, ein Vβ-Gen abhängig von den Ergebnissen der beiden ersten Schritte zu wählen und aus der gesamten Population von T-Zellen die T-Zellen zu extrahieren, welche einen TCR tragen, welcher durch diese zuvor ausgewählte Vβ-Familie gebildet wird; und
– wenigstens bestimmte der Schritte werden auf automatisierte Weise ausgeführt.

Es wird ein Datenverarbeitungsprogramm für die Analyse der Rezeptoren der T-Lymphozyten eines Organismus vorgesehen, das geeignet ist, das Ausführen von wenigstens dem Darstellungsschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens zu befehligen.
Es wird außerdem gemäß der Erfindung eine Einrichtung zur Analyse der Rezeptoren der T-Lymphozyten eines Organismus vorgesehen, welche umfasst:

– automatisierte Mittel, um die Mengen von jedem Vβ-Gen und gegebenenfalls das Verhältnis von diesen Mengen zu vorab bestimmten Werten zu messen, um erste Daten zu erhalten;
– automatisierte Mittel, um die CDR3-Region für jedes der Vβ-Gene der Rezeptoren der T-Lymphozyten, die mit dem Organismus assoziiert sind, zu amplifizieren und um für jedes Vβ-Gen die relative Menge von jeder CDR3-Region bezogen auf die Gesamtheit der mit einem Vβ-Gen assoziierten CDR3-Regionen zu messen, um zweite Daten zu erhalten; und
– automatisierte Mittel, um in einem Diagramm mit vier Variablen die ersten und zweiten Daten in Abhängigkeit von den Vβ-Genen und der Länge der CDR3-Regionen darzustellen. Dieses Diagramm erlaubt ein vereinfachtes und globales Betrachten des komplexen Prozesses der Mobilisierung der T-Zellen im Verlauf einer Immunreaktion.

Es wird ein Datenträger vorgesehen, welcher ein Diagramm einer Analyse der Rezeptoren der T-Lymphozyten eines Organismus, welches die folgenden vier Variablen umfasst, präsentiert:

– die mit dem Organismus assoziierten Vβ-Gene;
– die Länge der CDR3-Regionen der Rezeptoren der T-Lymphoyzten;
– erste Werte, welche die Menge von Transkripten von jedem Vβ-Gen in Form einer relativen oder absoluten Menge repräsentieren;
– zweite Werte, welche für jede der Längen der CDR3-Region in jedem Vβ-Gen den Unterschied zwischen dem Anteil der Transkripte, die einer CDR3-Region eines Vβ-Gens in einer gegebenen Probe entsprechen, bezogen auf die Transkripte, welche der gleichen CDR3-Region des gleichen Vβ-Gens einer Referenzprobe, die eine Probe ist, welche eine Gauß-Verteilung der Längen des CDR3 aufweist, entsprechen, repräsentieren.

Die Erfindung kann den Gegenstand von zahlreichen Anwendungen bilden, beispielsweise in den folgenden immunologischen Sektoren:

– Verfolgen der Entwicklung von verschiedenen Pathologien im Verlauf der Zeit, wie Krebserkrankungen, virale Erkrankungen (AIDS, EBV-Infektion...), Autoimmunerkrankungen...;
– Verfolgen der Wirkung von verschiedenen Behandlungen (Immuntherapie...);
– Untersuchung der Mechanismen der Immunantwort bei verschiedenen Krankheiten und/oder infolge von verschiedenen Therapien;
– Untersuchung der Mechanismen von Abstoßung und von Toleranz im Rahmen von Transplantationen;
– Diagnostik eines „Gedächtnis-Zustands".

Wir schlagen nachfolgend genauer einige Anwendungsbeispiele vor:

– Verfolgen der Entwicklung der Erkrankung und Untersuchung einer etwaigen Korrelation zwischen der Regression oder Verschlimmerung der Erkrankung und des Ausmaßes des „Spreading", was der Tatsache entspricht, dass die Selektion der T-Klone sich im Verlauf der Zeit weiterentwickeln wird aufgrund der Tatsache der Erkennung von neuen antigenen Strukturen durch molekulare Mimetik.
– Verfolgen der Entwicklung des Repertoires der T-Zellen bei Patienten, die eine anhaltende Regression der Krankheit nach einer Immuntherapie aufweisen oder nicht, über die Zeit. Die Erfindung wird zugleich erlauben, die Wirkung der Therapie und die Entwicklung der Immunantwort gegen die Krankheit zu verfolgen.
– Nachweis von spezifischen Markern, die mit der Entwicklung der Krankheit in Zusammenhang stehen. Beispielsweise könnte eine Verstärkung der klonalen Veränderungen, eine Erhöhung der Anzahl von Vβ-Familien, die bestimmte Veränderungen aufweisen, und/oder eine signifikante Erhöhung der Vβ-mRNAs in dem Blut, das in bedeutenden Zeitabständen abgenommen wird, erlauben, das „Epitope Spreading" zu untersuchen. Solche Unterschiede werden erlauben, die T-Antworten vor und nach einer Behandlung von den Antworten, die während der Regression der Krankheit aufgrund der Therapie stärker beteiligt sind, zu unterscheiden.
– Unterscheidung zwischen den frühen Immunprozessen und jenen, die seit längerer Zeit stattfinden, in dem Falle von beispielsweise Autoimmunerkrankungen und zwischen den Immunprozessen, die an verschiedenen Formen von ein und derselben Erkrankung beteiligt sind;
– Vergleich der durch die Erfindung bereitgestellten graphischen Darstellungen mit den Ergebnissen, die durch klassische Diagnosetechniken und die Technik einer immunologischen Analyse, die durch andere Methoden ausgeführt werden (beispielsweise: Verfolgen der T-Zellen durch Tetramere, Verfolgen der Produktion von Zytokinen durch die unter dem Namen Elispot bekannte Methode), erhalten werden, und Möglichkeit, die Entwicklung des Auftretens und des Verschwindens von T-Klonen im Verlauf der Zeit mit der klinischen Entwicklung des Patienten zu korrelieren, um wichtige Informationen über die Semiologie und die an der Erkrankung beteiligten Immunprozesse zu erhalten.
– Verschiedene Modifikationen werden nach einer Behandlung einer Krankheit beobachtet werden können (Verschwinden von Klonen, Modifizierung der quantitativen Werte, Modifizierung der globalen Topologie der Profile). Diese Modifikationen können eine Herunterregulie rung, die Deletion von autoreaktiven Klonen oder ferner die Entwicklung der beteiligten T-Zellen anzeigen. Diese Semiologie kann gemäß der eingesetzten Strategie variieren. Tatsächlich können bestimmte Mittel die Apoptose der autoreaktiven Zellen induzieren, wohingegen die zytotoxischen Drogen, wie Cyclosporin oder Mitoxantron, unspezifische Modifikationen zur Folge haben können. Theoretisch könnten die Profile der Patienten, die dank der Erfindung erhalten werden, folglich die Entscheidung bezüglich der Behandlung beeinflussen. Die Erfindung kann gleichfalls nützlich sein für die Etablierung von Toleranzkriterien bei Patienten, die offensichtlich frei von klinischen Symptomen sind;
– Möglichkeit, auf peripherer Ebene spezifische Repräsentationen von bestimmten Erkrankungen zu identifizieren. Ebenso wird die Möglichkeit ins Auge gefasst, die ausgehend von Blut erhaltenen Graphiken und jene, die innerhalb des Transplantats beobachtet werden, zu überlagern (beispielsweise für den Nachweis von Anzeichen einer chronischen Abstoßung über eine Blutabnahme);
– Die erfindungsgemäße Analyse an Proben von Patienten wird erlauben können, einen neuen Parameter für die Selektion von Kandidaten-Epitopen für eine wirkungsvollere Immuntherapie (beispielsweise Antitumor-Immuntherapie) zu definieren.
– Isolierung von nachgewiesenen T-Zellen durch die Kombination der ersten und der zweiten Daten als solche, die an der untersuchten Immunreaktion besonders beteiligt sind. Eine Analyse der Spezifität und der Funktionalität von diesen isolierten T-Zellen wird dann ausgeführt werden können. Diese Identifizierung, dann Isolierung von T-Zellen, die einen bestimmten TCR tragen, erlaubt, funktionelle oder phänotypische Untersuchungen beispielsweise nicht an der Population von gesamten T-Zellen, sondern einzig an den T-Zellen, die an der untersuchten Immunreaktion beteiligt sind, auszuführen. Diese verbesserte Maßnahme eines „Gene Searching" wird erlauben, neue Strategien für Immuntherapien zu identifizieren. Als Beispiel siehe 14.

Der Gegenstand von zahlreichen Impfverfahren ist, eine T-Antwort zu entwickeln und folglich diese zu messen. Die Erfindung repräsentiert in dieser Hinsicht einen neuen, potentiell sehr nützlichen Beitrag. Außerdem kann die Untersuchung der Topologie der repräsentierten Repertoire wichtig sein, um die spezifischen „Signaturen" eines pathologischen Prozesses bei einem Individuum aufzuschlüsseln. Tatsächlich kann die Erfindung beispielsweise nützlich sein, um die Entwicklung des pathologischen Prozesses bei Patienten zu analysieren und/oder um die Entscheidung hinsichtlich einer Behandlung zu beeinflussen.
Auf dem Gebiet der pharmazeutischen und medizinischen Forschung wird die Erfindung für das Verständnis und das Verfolgen von Pathologien und/oder Behandlungen in verschiedenen Gebieten, wie:

– der Virologie;
– der Onkologie;
– den Autoimmunerkrankungen;
– der Behandlung von Allergien (Verfolgen der Desensibilisierungen);
– der Transplantation von Organen, von Geweben oder von Knochenmark, Antizipierung des unerwarteten Auftretens einer akuten oder chronischen Abstoßung, Untersuchung von regulatorischen Klonen bei transplantierten Patienten, um zu wissen, ob diese gegenüber ihrem Transplantat in Abwesenheit einer jeglichen immunsuppressiven Behandlung tolerant sein könnten...,

Im Rahmen der medizinischen Forschung wird die Erfindung beispielsweise als klinisches Hilfsmittel (Tool) für die Unterstützung bei der Diagnostik (Viruserkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Krebs) und das Verfolgen der Therapien (Impfstoffe, Zelltherapien, Gentherapien) dienen.
Die Erfindung kann am Tier im Rahmen von Forschungsprojekten (Tierversuche, vorklinische Analysen...) und am Menschen im Rahmen der Auswertung von Behandlungen eingesetzt werden.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden ferner ersichtlich in der folgenden Beschreibung von mehreren bevorzugten Ausführungsweisen, die als nicht-einschränkende Beispiele aufgeführt werden, unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen:

– die 1 bis 8 sind Diagramme, die sich auf die Untersuchung der T-Lymphozyten beziehen und mit Techniken des Standes der Technik erhalten worden sind;
– die 9, 11 bis 13 sind Diagramme, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten worden sind;
– die 10 ist eine schematische Darstellung der Mittel zum Ausführen der Erfindung und des erhaltenen Trägers; und
– die 14 repräsentiert ein Beispiel für „Sorting". In diesem Beispiel wurde ein TcLandscape-Profil ausgehend von einem an multipler Sklerose leidenden Patienten erhalten. In der Graphik stellt man fest, dass die Vβ17-Familie verändert ist und dass die Anzahl von Vβ17-Transkripten bedeutend ist. Die T-Zellen, die einen TCR, der aus Vβ17 Genen zusammengesetzt ist, tragen, wurden durch Durchflusszytometrie isoliert und es wurden funktionelle Untersuchungen an diesen isolierten Zellen ausgeführt. Man beobachtet dann in diesen Zellen eine besonders erhöhte Transkription der Zytokine IL-6, IL-8 und TNFa. Diese Anhäufung wird in den T-Zellen, welche einen TCR Vβ17+ eines gesunden Individuums tragen, nicht beobachtet. Andererseits weisen diese aus dem Patienten isolierten Vβ17+-Zellen einen aktivierten Phänotyp auf.

BEISPIELE
Wir werden eine erste Ausführungsweise des erfindungsgemäßen Verfahrens in dem Kontext der zellulären Antwort im Rahmen einer Xenotransplantation beschreiben.
Bei einer Transplantation können die T-Zellen die antigenen Peptide, die durch die präsentierenden Zellen des Empfängers (indirekter Weg) oder des Spenders (direkter Weg) präsentiert werden, erkennen. Da der direkte Präsentationsweg im Verlauf von akuten Abstoßungen besonders beteiligt ist, haben die Erfinder den Einfluss von dieser Art von Erkennung auf das Repertoire des TCRβ untersucht. Dank der Erfindung, die erlaubt, zu den qualitativen Veränderungen der Verteilung der Längen der CDR3-Region eine quantitative Dimension hinzuzufügen, hat es sich herausgestellt, dass diese Verteilung bei der direkten Erkennung nicht verändert war, wohingegen die T-Zellen abhängig von ihrem Vβ-Segment selektioniert werden. Außerdem wird, indem die Regulation der Expression des TCR als Aktivierungsmarker verfolgt wird, gezeigt, dass ein bedeutender Anteil der naiven T-Zellen „fremde" präsentierende Zellen erkennen kann, ein Phänomen, das erlaubt, den Umfang der direkten Antwort und ihre Beteiligung an der akuten Abstoßung besser zu verstehen.
Die Analyse des Repertoires des TCR erlaubt, die Diversität einer Population von T-Lymphozyten auszuwerten und deren Entwicklung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen oder im Verlauf des Fortschreitens einer gegebenen Pathologie zu verfolgen. Man kann so Restriktionen (Abwesenheit von bestimmten Vβ-Familien) oder Veränderungen des Repertoires (Modifizierung der Verteilung der CDR3-Längen in einer Vβ-Familie) nachweisen.
Die Analyse des Repertoires des TCR erlaubt, die Diversität einer Population von T-Lymphozyten auszuwerten und deren Entwicklung unter verschiedenen experimentellen Bedingungen oder im Verlauf des Fortschreitens einer gegebenen Pathologie zu verfolgen. Man kann so Restriktionen (Abwesenheit von bestimmten Vβ-Familien) oder Veränderungen des Repertoires (Modifizierung der Verteilung der CDR3-Längen in einer Vβ-Familie) nachweisen.
Es wurden verschiedene Techniken entwickelt, um die CDR3-Region zu analysieren und/oder die Variationen des Repertoires auf der Ebene der Vβ-Kette des TCR zu quantifizieren. Aktuell kann die quantitative Analyse des TCR ausgeführt werden durch verschiedene Methoden: den „RNAse Protection Assay", der den Nachteil aufweist, technisch schwierig zu sein, die Quantifizierung ausgehend von einer kompetitiven PCR an CD3, die zwischen den verschiedenen Vβ-Familien nicht unterscheidet, die monoklonalen anti-Vβ-Antikörper. Für die quantitative Analyse stehen zahlreiche monoklonale Antikörper, die gegen die verschiedenen variablen Regionen des TCRαβ gerichtet sind, beim Menschen und bei der Maus zur Verfügung und erlauben eine Analyse der Expression auf der Proteinebene. Indessen sind bei der Ratte nur drei Antikörper verfügbar und wirksam, was den Nutzen dieser Methode begrenzt. Außerdem berücksichtigt die Analyse allein auf der Proteinebene nicht Selektionsereignisse, die auf der Ebene der CDR3-Region, die die Grundlage für die Spezifität der Erkennung des Antigens darstellt, stattfinden. Außerdem ist der Prozentsatz der Expression eines Vβ-Proteins für den Prozentsatz von entsprechenden Vβ-Transkripten nicht repräsentativ. Tatsächlich riskiert eine solche Quantifizierung durch Antikörper, die Anzahl von TCR zu unterschätzen, denn jene werden nach Aktivierung internalisiert. Andere Techniken, die auf der Amplifizierung der variablen Regionen des TCR durch PCR mit Hilfe von spezifischen Primers beruhen, erlauben, das Repertoire ausgehend von genomischer DNA zu analysieren. Die so erhaltenen Amplifizierungsprodukte können durch Autoradiographie analysiert, kloniert und sequenziert werden.
Die qualitative Analyse der β-Kette des TCR (zweite Daten) basiert auf der Untersuchung der Verteilung der Längen der hypervariablen CDR3-Region des TCR in jeder Vβ-Familie einer gegebenen Population von T-Lymphozyten. Ein Pool von T-Zellen im Ruhezustand ist durch eine Gauß-Verteilung der verschiedenen Längen der CDR3 in jeder Vβ-Familie charakterisiert. Die Mobilisierung von spezifischen T-Klonen infolge der Erkennung eines Antigens wird von der präferentiellen Verwendung von bestimmten TCRs, die aus einer Vβ-Familie gebildet werden, und einer besonderen Länge der CDR3 begleitet.
Das Prinzip der Immunoscope^®-Technik besteht in einer Amplifizierung der verschiedenen CDR3-Regionen durch PCR unter Verwendung eines gemeinsamen 3'-Primers, der in dem Cβ-Segment platziert ist, und eines für jede Vβ-Familie spezifischen 5'-Primers (siehe Sequenzprotokoll). Die amplifizierten Produkte werden dann einem Verlängerungsschritt unterworfen, der mit einem zweiten, durch ein Fluorophor markierten Cβ-Primer ausgeführt wird. Die fluoreszierenden Amplifizierungsprodukte werden abhängig von ihrer Länge durch Wanderung in einem Polyacrylamidgel aufgetrennt. Das Wanderungsprofil wird durch ein DNA-Sequenzierungsgerät, gekoppelt mit der Immunoscope^®-Software, analysiert. Man erhält so unter Bezugnahme auf die 5 ein Bild von der Verteilung der CDR3-Längen für jedes Primerpaar. Man kann zwischen 1 und 11 Amplifizierungspeaks beobachten, welche jeweils einer bestimmten Größe der CDR3-Region entsprechen und jeweils um drei Nukleotide voneinander getrennt sind. Diese Analyse kann noch verfeinert werden, wenn man einen für ein Jβ-Segment spezifischen Primer anstelle des gemeinsamen Cβ-Primers verwendet. Wie in der 6 veranschaulicht, erlaubt die Analyse der Verteilung der verschiedenen Längen von CDR3, etwaige oligoklonale Expansionen zu identifizieren.
Die Reperturb-Software erlaubt, die Verteilung der CDR3-Längen in einer gegebenen Probe mit jener, die bei einem Referenzindividuum erhalten wird (Gauß-Profil, nicht verändert), zu vergleichen. Jede durch die Immunoscope^®-Software analysierte CDR3-Länge wird in eine Verteilungswahrscheinlichkeit übersetzt, indem die Fläche unter der Kurve von jedem Peak berücksichtigt wird. Für jede unter diesen erlaubt die Differenz des absoluten Werts zwischen der Probe (En) und dem Referenzprofil (Cn), den Prozentsatz von Veränderung der Probe verglichen mit einem Gauß-Profil zu erhalten. Diese Analyse erlaubt folglich, das mittels eines Immunoscope^®-Profils beobachtete Veränderungsniveau zu präzisieren. Die für jede CDR3- Expansion in einer Vβ-Familie erhaltenen Variationen werden folglich als Prozentsatz von Veränderung eines Peaks im Inneren von dieser Familie ausgedrückt werden. Die Summe der Veränderungen in allen Vβ-Familien erlaubt, den Prozentsatz von globaler Veränderung der Vβ-Kette des TCR in einer Population von T-Zellen abzuschätzen.
Man muss dann die Quantifizierung der Vβ-Transkripte vornehmen, die durch mehrere Techniken in Angriff genommen werden kann. Im vorliegenden Fall kann man die Methode der quantitativen PCR in Realzeit einsetzen. Dieses Verfahren, das auf der Verwendung der TaqMan^®-Technologie basiert, kann das unter dem Namen „ABI Prism 7700 Sequence Detection System" bekannte Programm einsetzen, das unter anderem erlaubt, die durch die Bindung eines Markers (Sybr^®Green) an die doppelsträngigen DNA-Moleküle emittierte Fluoreszenz nachzuweisen und zu messen. Das Fluoreszenzniveau, welches zu der Menge des Produkts in einer Vertiefung direkt proportional ist, wird im Verlauf von jedem Amplifizierungszyklus gesammelt. Parallel zu den Proben kann ein Standard, welcher einer Verdünnungsreihe der Zielsequenz entspricht, eingesetzt werden und wird erlauben, eine Eichkurve zu erstellen, die eingesetzt wird, um die Menge des Ziels in jeder Probe abzuleiten. Um experimentelle Schwankungen zwischen den verschiedenen Proben zu eliminieren, werden diese Werte auf den Messwert des Haushaltsgens HPRT bezogen.
Um die Spezifität und die Empfindlichkeit der PCR zu verbessern, wird das als AmpliTaq Gold^®-DNA-Polymerase bezeichnete Enzym eingesetzt. Eine Modifizierung von diesem Enzym macht dieses einzig bei erhöhter Temperatur, einer Temperatur, bei welcher die DNA vollständig denaturiert ist, aktiv. Um eine Verunreinigung mit anderen PCR-Produkten zu vermeiden, wird zu der Reaktionsmischung zum Zeitpunkt der Quantifizierung die AmpErase^®-Uracil-N-glycosylase (UNG) zugesetzt. Dieses Enzym, das allein unterhalb von 60°C aktiv ist, wirkt, indem es die Uracil-Brücken auf der Ebene der einzel- oder doppelsträngigen DNA, welche Uracil-Basen enthält, hydrolysiert, und hat keinerlei Aktivität auf die DNA, welche Thymidine enthält. Diese Uracil-Brücken werden durch das Hinzugeben von dUTP-Basen in die Reaktionsmischung erzeugt. Während der Amplifizierung aktiviert ein anfänglicher Schritt von 2 min bei 50°C diese Amperase und erlaubt die Eliminierung von etwaigen Verunreinigungen, die aus der vorangegangenen Amplifizierung stammen.
Die Standards werden hergestellt ausgehend von revers transkribierten RNAs, welche entweder aus Milzzellen eines naiven Tiers oder aus T-Lymphozyten, die aus dem Blut von gesunden Individuen beim Menschen stammen, stammen, hergestellt. Für die Herstellung von jedem Vβ-Standard wird die Amplifizierung in einem klassischen Thermocycler-Gerät ausgeführt. Die PCR-Produkte werden dann auf ein Agarosegel aufgetragen und die Bande von Interesse wird extrahiert. Die Konzentration des PCR-Produkts wird anhand des OD₂₆₀-Werts abgeschätzt, dann wird abhängig von der Molekülmasse die Anzahl von Kopien pro ml berechnet.
Dann werden Verdünnungen von jedem Vβ-, Cβ- oder HPRT-Standard mit 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴, 10³ und 10² Kopien pro Vertiefung hergestellt, um eine Konzentrationsreihe, die jene der Proben abdeckt, zu erhalten.
Um jeden Standard zu validieren, wird eine zweite PCR ausgeführt, dieses Mal in dem ABI PRISM 7700 Sequence Detector in Gegenwart des fluoreszierenden Markers Sybr^®Green. Die PCR-Produkte werden dann auf ein Agarosegel aufgetragen, welches erlaubt, die abnehmende Verringerung von jeder Bande in Abhängigkeit von der Verdünnung wie auch die Größe des PCR-Produkts zu kontrollieren. Parallel dazu wird die Erhöhung der Fluoreszenzintensität, welche abhängig von der Zeit verfolgt wird, mit der Anzahl von DNA-Kopien, die in jeder Verdünnung enthalten sind, in Verbindung gebracht. Dies erlaubt, die Präzision der Verdünnungen des Standards, die Ausbeute der PCR und das Fehlen von Verunreinigung zu verifizieren.
Einmal validiert, erlauben diese Standards, die Anzahl von Kopien des Ziels in jeder Probe, die doppelt getestet wird, abzuleiten, indem das Fluoreszenzniveau auf der Eichgerade aufgetragen wird. Diese Gerade wird nicht berücksichtigt, wenn die Effizienz der PCR nahe 100% liegt (Verlust = ~3,3) und wenn der Korrelationskoeffizient über 0,95 liegt.
Es handelt sich dann darum, die qualitativen und quantitativen Analysen zu kombinieren, um den Veränderungen der Verteilung der Längen der CDR3 eine quantitative Dimension zu verleihen. Diese Information kann erlauben, den repräsentativen Charakter einer oligoklonalen Expansion in einer gegebenen Population auszuwerten, und kann gleichfalls erlauben, Modifizierungen des Repertoires, die nicht mit Veränderungen auf der Ebene der CDR3-Region verbunden sind, sichtbar zu machen.
Es wird ein Datenverarbeitungsprogramm, welches entwickelt worden ist, um ein Bild, welches die Gesamtheit der Informationen, die sich auf das untersuchte Repertoire beziehen, enthält, zu erhalten, eingesetzt werden können. Die Software der Marker Matlab^® kann zu diesem Zweck eingesetzt werden, denn sie erlaubt beispielsweise die flexible Verwaltung eines sehr großen Datenvolumens und eine Bilderzeugung, welche ausreichend klar und informativ ist. Für jede Vβ-Familie wird der Prozentsatz von Veränderung bezogen auf das Gauß-Profil durch die Gorochov-Methode gemessen. Dank der Matlab^®-Software werden diese Werte mit den ersten (quantitativen) Daten derart kombiniert, dass eine 3D-Darstellung erhalten wird, die die zugleich qualitativen wie auch quantitativen Variationen des Vβ-Transkriptoms veranschaulicht, in welcher die Höhe der Peaks die Menge von entsprechenden Vβ-Transkripten veranschaulicht, wohingegen die Prozentsätze der Veränderungen durch einen Farbcode dargestellt werden.
In der Graphik der 9 sind zu sehen:

– entlang der Abszisse jede der Vβ-Familien;
– entlang der Ordinate die quantitativen Daten (d. h. die relative Bedeutung von jeder Vβ-Familie);
– entlang der z-Achse die verschiedenen möglichen Längen der CDR3; und
– gemäß einem Farbcode eine Visualisierung der Veränderungen des Repertoires verglichen mit einem Gauß-Profil.

Der Farbcode kann eine Reihe von Farben, beispielsweise von grün bis rot in der Richtung der zunehmenden Veränderung, d. h. in dem Maße, wie sie sich von 0% Veränderung entfernt, umfassen. In dem vorliegenden Falle wird es sich um unterschiedliche Graustufen handeln, wobei das Grau in dem Maße, wie die Veränderung zunimmt, immer dunkler wird.
So werden die veränderten oder nicht-veränderten Vβ-Transkripte entsprechend einer dreidimensionalen Graphik ausgedrückt, welche entlang der Abszisse jede Vβ-Familie und entlang der Ordinate die durch TaqMan (TaqMan-PCR von Cβ und von jeder Vβ-mRNA-Spezies) erhaltenen quantitativen Werte aufführt. Der Prozentsatz von Veränderung von jedem Vβ verglichen mit einem Gauß-Profil wird gemäß einem Farbcode (jeder Farbe entspricht ein „Intervall" von Veränderungen) sichtbar gemacht.
Das Verfahren wird ausgeführt werden mittels einer Einrichtung, welche die Analyse der Rezeptoren der T-Lymphozyten eines Organismus erlaubt, welche schematisch in der 10 veranschaulicht ist. Diese Einrichtung wird automatisierte Mittel, um die CDR3-Region von jedem der Vβ-Gene der Rezeptoren der T-Lymphozyten, die mit dem Organismus assoziiert sind, zu amplifizieren (Gewinnung der zweiten Werte) und um jedes Vβ-Gen zu quantifizieren (erste Daten), umfassen. Es wird sich beispielsweise um eine Maschine (2), wie das TaqMan^®-Gerät, handeln können, das dank einer Verfolgung der Amplifizierungen in Realzeit erlaubt, die Vβ-Transkripte im Verlauf von ihrer Amplifizierung zu quantifizieren: die so erhaltenen quantitativen Werte erlauben, Mengen von Transkripten einer bestimmten Vβ-Familie mit Mengen von Transkripten von einer anderen Vβ-Familie zu vergleichen (Beispiel für ein Gerät: ABI Prism 7900 von der Firma Applied Biosystems).
Die Einrichtung wird auch automatisierte Mittel umfassen, um die relativen Mengen von jeder Länge der CDR3-Region in jeder Vβ-Familie und das Verhältnis von diesen Mengen zu vorab bestimmten Werten zu messen, um zweite Daten zu erhalten. Es wird sich um ein Sequenziergerät (4) handeln können, das erlaubt, den relativen Abschnitt von jedem Transkript, welcher eine bestimmte Größe der CDR3 in einer gegebenen Vβ-Familie aufweist, kennen zu lernen, aber nicht erlaubt, die Vβ-Familien untereinander zu vergleichen: (beispielsweise das Kapillar-Sequenziergerät Megabace von der Firma Amersham Pharmacia Biotech).
Schließlich wird die Einrichtung automatisierte Mittel umfassen, um in einem Diagramm mit vier Variablen die ersten und zweiten Daten in Abhängigkeit von den Vβ-Genen und der Länge der CDR3-Regionen darzustellen. Es wird sich um einen Computer (6) handeln können, der von einem Programm gesteuert wird, welches beispielsweise mit Hilfe der vorerwähnten Matlab^®-Software entwickelt worden ist. Die Entwicklung eines solchen Programms an sich liegt im Vermögen des Fachmanns auf diesem Gebiet und wird hier nicht detailliert erläutert werden. Gegebenenfalls wird dieses Programm in der Lage sein, andere Schritte des Verfah rensablaufs, ja sogar die Gesamtheit von jenem, steuern zu können. Das Diagramm wird auf einem Informationsträger, wie einem Computerbildschirm oder einem Papierträger (8), dargestellt werden.
Diese Untersuchung kann im Verlauf der Kinetik einer Immunantwort in verschiedenen Situationen ausgeführt werden.
In diesem Kontext des Ausführens wie in anderen erlaubt die Erfindung, aussagekräftigere Analysen zu machen als mit den Verfahren des Standes der Technik. Die Erfindung erlaubt, über eine allgemeine und dreidimensionale Ansicht der Größe des Pools von T-Zellen, welche eine bestimmte Vβ-Umlagerung einsetzen, zu verfügen, und erlaubt folglich, die quantitative Bedeutung der während der Immunantwort selektionierten Vβ-Familien kennenzulernen.
So erweist sich unter Bezugnahme auf die 11, die ein Beispiel für einen Diagrammverlauf, der mit keinen besonderen biologischen Umständen in Verbindung steht, gibt, dass bestimmte Familien, obgleich sie verglichen mit dem Gauß-Profil stark verändert sind, auf der quantitativen Ebene lediglich schwach repräsentiert sind und folglich keine ausschlaggebende Rolle zu spielen scheinen (Beispiel: Familie x). Die Erfindung erlaubt gleichfalls, eine Ruhesituation von einer Situation, in welcher die T-Zellen auf polyklonale Weise aktiviert sind, zu unterscheiden. Tatsächlich entstammt die in 12 dargestellte Graphik einem Modell, worin T-Zellen auf polyklonale Weise aktiviert sind, und man beobachtet dann eine sehr starke Mobilisierung von bestimmten Vβ-Familien, die dennoch eine Gauß-Verteilung der Längen der CDR3 aufweisen (was 0% Veränderung entspricht). So erlaubt diese Technik unter anderem, polyklonale Aktivierungen (ConA, Superantigen, direkter Präsentationsweg), die durch die klassischen Hilfsmittel nicht nachgewiesen worden wären, sichtbar zu machen. Es handelt sich folglich um ein aussagekräftiges Mittel, um die Entwicklungen des Repertoires im Verlauf von verschiedenen Immunantworten zu verfolgen.
Tatsächlich entstammt die Graphik einem Modell, worin T-Zellen in vitro aktiviert sind, und man beobachtet eine sehr starke Mobilisierung von bestimmten Vβ-Familien. In eben diesem Maßstab würde eine Vergleichs- oder Kontrollprobe ein grünes Profil (hellgrau) liefern, denn alle Familie weisen eine Gauß-Verteilung der Längen der CDR3 (was 0% Veränderung entspricht) und eine ebene Verteilung, denn alle Vβ-Familien sind schwach repräsentiert, auf. Es handelt sich folglich um ein aussagekräftiges Mittel, um die Entwicklungen des Repertoires im Verlauf von verschiedenen Immunantworten zu verfolgen.
In 13 wurde das Diagramm veranschaulicht, das aus einer zweiten Ausführungsweise der Erfindung hervorgeht. Die Erfindung wird hier ausgeführt im Rahmen einer Untersuchung, die an an Melanomen leidenden und geimpften Patienten ausgeführt wurde. Die Vβ13-Familie scheint an der anti-Melanom-Antwort besonders beteiligt zu sein insoweit, als ein roter (dunkelgrauer), folglich von dem Gauß-Profil, das für eine normale Antwort charakteristisch ist, entfernter und quantitativ bedeutender Peak auftritt. Eine andere Familie scheint eine weniger wichtige Rolle zu spielen: die Familie Vβ23, die gestört, aber auf quantitativer Ebene wenig bedeutend ist. Außerdem erscheint auf der Höhe der ersten Vβ-Familien ein Massiv. Jenes könnte einem Effekt der Impfung entsprechen. Ergänzende Untersuchungen werden erlauben, dies zu bestimmen.
Wir beschreiben nachfolgend eine andere Ausführungsweise, in welcher das Verfahren der Erfindung durch einen Schritt einer Isolierung der Klone, welche veränderte Vβ-Familien aufweisen, komplettiert wird.
Die spezifischen Veränderungen des Repertoires, die mit Hilfe der Erfindung nachgewiesen werden, sind zumeist durch klassische Durchflusszytometrie-Techniken nicht nachweisbar. Tatsächlich erlaubt, während die Erfindung erlaubt, eine Veränderung und eine Anhäufung von Transkripten für eine gegebene Vβ-Familie nachzuweisen, die Durchflusszytometrie nur, die Membran-Expression des Vβ-Proteins nachzuweisen. Indessen ist die Proteinexpression an der Oberfläche nur vorübergehend und erlaubt nicht, eine Modifizierung der transkriptionellen Aktivität einer Zelle zu einem präzisen Zeitpunkt nachzuweisen.
Wie wir gesehen haben, erlaubt die Erfindung so, eine Modifizierung der transkriptionellen Aktivität für eine gegebene Familie nachzuweisen. Ist die Familie einmal angepeilt, ist es möglich, sie aus dem Rest der lymphozytären Population zu extrahieren, um ihre spezifischen Eigenschaften (Phänotyp, Aktivierung...) zu untersuchen. Wenn diese Eigenschaften in der gesamten Population untersucht würden, würden sie tatsächlich durch die Summe der Eigenschaften von allen anderen Populationen von T-Zellen maskiert werden.
Die vorliegende Ausführungsweise erlaubt folglich, besondere Populationen zu identifizieren, die an der untersuchten Immunantwort beteiligt sind. Diese T-Zellen, welche einen TCR tragen, der von einer bestimmten Vβ-Familie gebildet wird, können dann durch Durchflusszytometrie mit Hilfe beispielsweise von anti-Vβ-Antikörpern isoliert werden, was die Charakterisierung der Klone, die spezifische (qualitative und/oder quantitative) Veränderungen des Repertoires der β-Kette des TCR aufweisen, ermöglicht.
Nach einem Ausführen der Erfindung, wie in den vorhergegangen Weisen dargelegt, einschließlich des Schritts der Realisierung des Diagramms, werden die Zellen, die die verschiedenen Vβ-Familien, die durch oligoklonale Expansionen und/oder große Mengen von mRNAs charakterisiert sind, exprimieren, durch Durchflusszytometrie dank Antikörpern, die gegen die verschiedenen Vβ-Familien gerichtet sind, sortiert.
So macht jede Vβ-Familie vor dem Sortieren weniger als 5% des Vβ-Repertoires aus. Nach dem Sortieren kann man an einer sehr reinen gegebenen Population arbeiten, denn die erhaltene Reinheit liegt über 98%.
Es sind mehrere aufeinanderfolgende Sortierungen möglich und folglich können mehrere Klone von T-Zellen ausgehend von ein und demselben Zellextrakt isoliert werden, denn nach einer Selektion einer bestimmten Population von T-Zellen umfasst die übrig bleibende Populati on alle anderen Arten von T-Zellen. Eben dieser Zellextrakt, der erlaubt hat, eine erste Population von T-Zellen zu isolieren, wird folglich gleichfalls als Grundlage für die Extraktion einer anderen Vβ-Familien dienen können. Die Möglichkeiten und die Beiträge dieser Technik sind folglich sehr bedeutend und verbessern die Basistechnik der Erfindung. Ist einmal die Anzahl von extrahierten Zellen bestimmt, werden die Zellen für phänotypische und transkriptionelle Untersuchungen eingesetzt.
Diese Untersuchungen sind grundlegend, denn sie werden erlauben, die Rolle eines lymphozytären Klons in einer gegebenen Situation zu bestimmen. Diese Bestimmung der Rolle der Klone von T-Zellen ist sehr wichtig insoweit, als, wenn sich erweist, dass der identifizierte Klon eine zytotoxische Rolle spielt (Viren, wie HIV, CMV, EBV; Autoimmunerkrankungen,), man diesen im Rahmen von Immuntherapie-Strategien inhibieren muss. Wenn sich im Gegensatz dazu erweist, dass dieser Klon eine schützende Rolle spielt (Transplantation, immunsuppressive Behandlungen), wird es sich empfehlen, diesen zu stimulieren, um eine nützliche Wirkung zu erhalten.
Für das Ausführen von dieser Technik wird man ein Durchflusszytometer einsetzen können, welches erlaubt, die durch die erfindungsgemäße Technik nachgewiesenen T-Zellen nach Markierung der betreffenden Populationen von T-Zellen mit einem anti-Vβ-Antikörper, wie jenem, der unter der Bezeichnung „Facscalibur" von der Firma Becton Dickinson vertrieben wird, zu isolieren.
Wie durch die 14 veranschaulicht wird, bezieht sich die Erfindung gleichfalls auf ein Verfahren, das die Identifizierung von Genen, von Molekülen und von Mechanismen, die an pathophysiologischen Prozessen beteiligt sind, in bestimmten Populationen von T-Lymphozyten erlaubt.
Man führt das erfindungsgemäße Analysenverfahren aus und man kann die Populationen von T-Zellen, für welche die Transkripte des TCR unter den Gesamtheiten der Transkripte der gesamten T-Zell-Population stark repräsentiert sind, isolieren und den Phänotyp von diesen Zellen mit dem Phänotyp der Zellen der allgemeinen Population vergleichen, was so erlaubt, die Wege einer Antwort auf Stimuli nachzuweisen.
Selbstverständlich wird man zahlreiche Modifizierungen beitragen können, wie beispielsweise in dem Diagramm die durch Unterschiede des örtlichen Aussehens des Diagramms repräsentierte Variable eine andere wird sein können als jene, die den zweiten Daten entspricht.
Der Unterschied des örtlichen Aussehens wird auf andere Weise als durch Farben oder Graunuancen veranschaulicht werden können. Es wird sich beispielsweise um verschiedene Arten von Schraffierungen oder andere Arten von Zeichen handeln können.
Die Erfindung bezieht sich gleichfalls auf jeden Primer für die Amplifizierung der CDR3-Regionen, wie sie in dem Sequenzprotokoll angegeben sind. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Analyse der Aktivierung und der Mobilisierung von T-Zellen über eine Analyse der Rezeptoren der T-Lymphozyten eines Organismus, dadurch gekennzeichnet, dass es die Schritte umfasst, welche daraus bestehen: – die Anzahl von Transkripten für jedes Vβ-Gen zu bestimmen, um erste Daten zu erhalten, – die CDR3-Region der Rezeptoren der T-Lymphozyten für jedes der Vβ-Gene, die mit dem Organismus assoziiert sind, zu amplifizieren, – die verschiedenen Längen der CDR3 der Rezeptoren der T-Lymphozyten für jedes der mit dem Organismus assoziierten Vβ-Gene aufzutrennen und den Anteil der Transkripte von jeder Länge der CDR3 in jeder Vβ-Familie abzuschätzen, um zweite Daten zu erhalten, – in einem Diagramm mit vier Variablen die ersten und zweiten Daten in Abhängigkeit von den Vβ-Genen und der Länge der CDR3-Regionen darzustellen.
Verfahren nach dem vorangegangenen Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine der Variablen dargestellt wird, ohne mit einer Dimension des Raums assoziiert zu sein.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Variable, die nicht mit einer Dimension des Raums assoziiert ist, den zweiten Daten entspricht.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eine der Variablen durch Unterschiede des örtlichen Aussehens des Diagramms dargestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Unterschiede des örtlichen Aussehens Farbunterschiede sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die ersten Daten entlang der vertikalen Richtung dargestellt werden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es nach der Bestimmung der ersten und der zweiten Daten die Schritte umfasst, welche daraus bestehen, ein Vβ-Gen abhängig von den Ergebnissen der beiden ersten Schritte zu wählen und aus der gesamten Population von T-Zellen die T-Zellen zu extrahieren, welche einen TCR tragen, welcher durch diese zuvor ausgewählte Vβ-Familie gebildet wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens bestimmte der Schritte auf automatisierte Weise ausgeführt werden.
Einrichtung zur Analyse der Rezeptoren der T-Lymphozyten eines Organismus, dadurch gekennzeichnet, dass diese umfasst: – automatisierte Mittel, um die CDR3-Region der Rezeptoren der T-Lymphozyten für jedes der Vβ-Gene, die mit dem Organismus assoziiert sind, zu amplifizieren; – automatisierte Mittel, um die Mengen von jedem Vβ-Gen zu messen, um erste Daten zu erhalten; – automatisierte Mittel, um für jedes Vβ-Gen die relative Menge von jeder CDR3-Region bezogen auf die Gesamtheit der mit einem Vβ-Gen assoziierten CDR3-Regionen zu messen, um zweite Daten zu erhalten; und – automatisierte Mittel, um in einem Diagramm mit vier Variablen die ersten und zweiten Daten in Abhängigkeit von den Vβ-Genen und der Länge der CDR3-Regionen darzustellen.