JP5662155B2 - V(d)j組み合わせ多様性を研究する方法 - Google Patents
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Description
知見#2:TCRβ組み合わせの推定。ヒトにおけるTCRβ遺伝子座の構造によると、D1セグメント上で再構成された遺伝子は、J1.1-J1.6セグメント上で再構成でき、次いで、BC1又はBC2とスプライシングされる。これらは、第2の組のセグメントJ2.1〜J2.8上でも再構成できるが、次いで、BC2上でのみスプライシングされる。用いられるのがD2セグメントである場合、J2.1〜J2.8の組のみを用いることができ、スプライシングはBC2鎖上で起こる。このことにより、D-J再構成の間に選択されたD1又はD2セグメントに従って分割された組み合わせ多様性をもたらす:(67V*1D1*6J1*2BC)+(67*1D1*(8J2-2PR)*1BC1)+67*1D2*(8J2-2PR)*1BC2=1608の可能性のある組み合わせ。
V多様性の測定
- サイトメトリーによる(Van den Beemd, van Dongenら2000)。
- ゲノム及びトランスクリプトームのレベルでのQ-PCRによる(Fuschiottiら, 2007; Langら, 1997; Pasqualら, 2002)。
CDR3結合部多様性の測定
- Immunoscope (登録商標)による(Cochetら, 1992; Pannetierら, 1995)。
- immunoscopeと連結したQ-PCRによる(TcLandscape (登録商標))。
- 配列決定による。
- ゲノムレベルでのAmplicot法による(Baum及びMcCune, 2006)。
- DNAチップによる(Bonariusら, 2006)。
体細胞超変異(SHM)の研究:
- PCR/配列決定による(Hamblinら, 1999)。
TREC切除環状産物(excision circles)の減少による間接的測定
- PCRによる(Douekら, 1998)。
- Q-PCRによる(Phamら, 2003)。
例えば、米国特許第5,296,351号及び第5,418,134号は、いくつかのV-J再構成を同時に増幅するための「コンセンサス」プライマーを用いる免疫グロブリン及び/又はT受容体をコードする配列の増幅に基づいて、リンパ性白血病又はB若しくはTリンパ腫を検出するための方法を示している。
A) 前記ゲノムDNAの複数のフラグメントを複数回のマルチプレックスPCRにより増幅する工程であって、その少なくとも1回は、以下の特徴:
(i) それぞれのプライマー対は、ある特定のV若しくはD遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するプライマーと、ある特定のJ遺伝子の下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するプライマーとで構成されているので、それぞれのプライマー対を用いて、2つの別々のV-J又はD-J再構成の特徴である少なくとも2つのフラグメントの増幅が可能になり;
(ii) 前記プライマー(すなわち同じ増幅反応で用いられる全てのプライマー)は熱力学的に併用でき(compatible);
(iii) 前記プライマーは、第1プライマー対を用いて増幅されるフラグメントが第2プライマー対を用いて増幅されるフラグメントと区別できるような様式で選択される;
を有する少なくとも2つのプライマー対を構成する少なくとも3つのプライマーの組み合わせを用いて行われるマルチ-n-プレックス(multi-n-plex) PCR (n≧2)である工程と;
B) 工程A)で得られた増幅産物を検出する工程と;
C) 結果を解釈する工程と
を含む方法に関する。
(i) 数十kbのフラグメントを増幅できる;
(ii) 伸長速度が少なくとも1 kb/分である;
(iii) 平均してkbあたり1を超える誤りを導入しないような堅牢性である。本発明の方法を行うために用いることができる酵素の限定しない例として、StratageneからのHerculaseIIポリメラーゼ、及びBioradからのIproofポリメラーゼを挙げることができる。
(i) 1つ、又は曲線の数の半分未満の数のいくつかの曲線、特に1、2又は3つに等しい曲線が、他の曲線と比較して、前記他の曲線が第1曲線の変曲点の少なくとも2サイクル後、好ましくは少なくとも3又は4サイクル後で変曲点を示すようなシフトを示すか、又は増幅を示さない場合、結果は、クローン性又はオリゴクローン性のリンパ球増殖の存在を示し;
(ii) 逆に、全ての曲線が同じサイクルにて変曲点を示すか、又は2若しくは3増幅サイクルの最大シフトを示す場合、結果は、増幅されたフラグメントに相当する再構成の1つに起因するクローンのリンパ球増殖の仮定を棄却することを可能にする。
(i) 95℃でのアンプリコンの脱ハイブリッド形成(dehybridization)の後に、増幅産物の温度を迅速に40℃未満、好ましくは30℃以下に戻す;この温度の低下は、サーマルサイクラー中、又はチューブを氷中に数分間入れることにより行うことができる;温度の低下は、短時間で、好ましくは2分未満、より好ましくは30秒未満で行うべきである;
(ii) 蛍光を、定期的に、好ましくは連続的に、再ハイブリッド形成の間に測定する;
(iii) 迅速な再ハイブリッド形成(秒程度で)は、優勢なアンプリコンの存在、すなわちクローン性リンパ球増殖の存在を示すが、より遅い再ハイブリッド形成(数十秒、又は分程度で)は、良好な分子多様性を示す(少なくとも数十、又は数千の分子)。
(i) 前記2つのプライマー対は、ある特定のV遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する共通センスプライマーを含み、それぞれは、ある特定のJ遺伝子の下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するアンチセンスプライマーを含む;
(ii) 前記2つのアンチセンスプライマーは、TRB遺伝子座のJ遺伝子の2つの別々の群に属する2つの遺伝子Jy及びJzの下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する;
(iii) 前記Jy遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーのハイブリッド形成領域と前記Jy遺伝子の始点との間の距離は、前記Jz遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーのハイブリッド形成領域と前記Jz遺伝子の遺伝子群のうちの最初のJ遺伝子の始点との間の距離よりも大きい。
- hTRBJ1.6 (CTTGGTGCATGGCTATGTAATCCTG、配列番号1)は、25ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、TCRB遺伝子座のJ1.6遺伝子のヌクレオチド2341と2365の間とハイブリッド形成する;
- hTRBJ2.7 (CTCGCCCTCTGCTCAGCTTTCC、配列番号2)は、22ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、TCRB遺伝子座のJ2.7遺伝子のヌクレオチド214と235の間とハイブリッド形成する。
(i) 前記2つのプライマー対は、ある特定のD遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する共通センスプライマーを含み、それぞれは、ある特定のJ遺伝子の下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するアンチセンスプライマーを含む;
(ii) 前記2つのアンチセンスプライマーは、TRB遺伝子座のJ遺伝子の2つの別々の群に属する2つの遺伝子Jy及びJzの下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する;
(iii) 前記Jy遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーのハイブリッド形成領域と前記Jy遺伝子の始点との間の距離は、前記Jz遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーのハイブリッド形成領域と前記Jz遺伝子の遺伝子群のうちの最初のJ遺伝子の始点との間の距離よりも大きい。
つまり、(i) hTRBJ1.6及びhTRBJ2.7プライマーとhTRBD1プライマーとで構成される3つ組のプライマーを用いるマルチ-2-プレックスPCRと、(ii) hTRBJ2.7プライマーとhTRBD2プライマーとで構成されるプライマー対を用いる単純マルチプレックスPCRとを行うことにより、ヒトTRB遺伝子座の全ての不完全再構成を分析でき、ここで、例えばhTRBD1及びhTRBD2プライマーは、以下の表で規定されるプライマーから選択される:
もちろん、当業者は、この方法を、動物のTRA遺伝子座、例えばマウスのTRA遺伝子座の分析に置き換えることができる。
- hTRDJ1do5 (TGCCTCCTTAGATGGAGGATGCC、配列番号67)は、TRD遺伝子座のJ1遺伝子のヌクレオチド90〜112の間とハイブリッド形成する23ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドである;
- hTRDJ3do2 (GCAAGGAGGCACGCATACTAGTTAGC、配列番号68)は、TRD遺伝子座のJ3遺伝子のヌクレオチド448〜473の間とハイブリッド形成する26ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
(i) 各アンプリコンを、それが相当するV(D)J再構成をそのサイズの関数として決定することにより同定する工程と;
(ii) 各アンプリコンのシグナル強度から、対応するV(D)J再構成を有する開始ゲノムDNAの割合を決定する工程と;
(iii) 第1軸に沿ってVx遺伝子又はVx遺伝子ファミリー、第2軸に沿ってJy遺伝子、第3軸に沿ってVxJy再構成の頻度を示す3次元グラフの形で結果を提示する工程。
A) 個体からの生体試料を用いてリンパ球計数を行う工程と;
B) 同じ試料又は同じ個体から同時に由来する別の試料を用いて、前記個体のリンパ球のレパートリーの組み合わせ多様性の程度を、上記の方法を行うことにより決定する工程と;
C) 工程A)及びB)で得られたデータを組み合わせる工程と
を含む個体の免疫不全の程度をインビトロで決定する方法にも関する。
(i) 低い計数(<1000 Ly/μL)及び低いV-J組み合わせ多様性(<40%):高い死亡の危険性を伴う高い感染の危険性;
(ii) 低い計数(<1000 Ly/μL)、しかし正常なV-J組み合わせ多様性(>65%):低い感染の危険性;
(iii) 正常の計数(1000〜3200 Ly/μL)及び低いV-J組み合わせ多様性(<40%):中程度の感染の危険性;
(iv) 正常の計数(1000〜3200 Ly/μL)及び正常なV-J組み合わせ多様性(>65%):免疫レパートリーは健常である;
(v) 正常を超える計数(>3200 Ly/μl)及び低いV-J組み合わせ多様性(<40%):高いリンパ球増殖の危険性;
(vi) 正常を超える計数(>3200 Ly/μl)及び正常なV-J組み合わせ多様性(>65%):中程度のリンパ球増殖の危険性。
A) 個体のリンパ球のレパートリーの多様性を、異なる2つの日時に採取された、個体からの2つの試料を用いて上記の方法を行うことにより測定する工程と;
B) 前記2つの試料を、
(i) 2つの試料中で観察される再構成の数S;
(ii) より最近の試料で観察されるがより古い試料では観察されない再構成の数A;
(iii) より古い試料で観察されるがより最近の試料では観察されない再構成の数D;
(iv) どちらの試料でも観察されない再構成の数Z
を評価することにより比較する工程と
を含む個体のT及び/又はBリンパ球のレパートリーの多様性における変更を監視する方法に関する。
(i) 数十kbのフラグメントを増幅できる;
(ii) 伸長速度が少なくとも1 kb/分である;
(iii) 平均してkbあたり1を超える誤りを導入しないような堅牢性である。
特に、本発明の方法及びキットは、以下の:
A) ワクチンプロトコルの前後に、リンパ球の量及び多様性を測定する工程と;
B) 工程A)で行われた測定を比較する工程と;
C) ワクチン接種後のリンパ球多様性の少なくとも10%、好ましくは少なくとも15%の減少は、ワクチン接種プロトコルが有効であることを示す、結果を解釈する工程と
を含む、ワクチンプロトコルの有効性を評価する方法を行うために用いることができる。
A) 2つの異なるプロトコルでのワクチン接種に付された2群に対して、ワクチン接種の前後に、制御性Tリンパ球の量と免疫多様性とを測定する工程と;
B) 群ごとに結果を比較する工程と
を含み、最も有効なプロトコルが、制御性Tリンパ球の数を最も減少させるか、及び/又はリンパ球多様性を最も減少させるものである、
2つのワクチンプロトコルの有効性を比較する方法にも関する。
オリゴヌクレオチド選択基準
本発明の方法を行うために用いることができるプライマーを、1) それらの熱力学的特性(オリゴヌクレオチドがそれらの標的配列に結合する能力を、特に水素結合の数に従って同定するために当業者が通常用いるアルゴリズムに基づいて決定される);2) 同じチューブで用いられる他のプライマーとのその併用性(熱力学的観点及び種々のプライマーの互いにハイブリッド形成できない能力の観点の両方);及び3) 分離できるアンプリコンのサイズを得ることを可能にするそれらのそれぞれの位置に従って選択する。
V遺伝子について、オリゴヌクレオチドが転写の方向を向いている場合、これらは「センス」とよばれる。これらは非コードDNA鎖に相補的である。
J遺伝子について、オリゴヌクレオチドは、「アンチセンス」とよばれる。これらはコードDNA鎖に相補的であり、リバースである(これらは、3'→5'方向にあるともいわれる)。
V遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドについて、位置はV遺伝子の末端、すなわちRSSの前の最後の塩基により示す。この位置は、オリゴヌクレオチドの1番目の塩基とV遺伝子の最後の塩基との間の距離(オリゴヌクレオチドを含む)に相当する。
ケース1:ファミリーの全てのメンバー間で100%相同性の領域の存在。この場合、配列アラインメントを行うことにより、問題のVファミリーの全てのメンバー間で100%共通し、上記のオリゴヌクレオチド選択基準に合致する領域を見出すことができる。この場合、1つのVオリゴヌクレオチドのみが、このファミリーの全てのメンバーを監視するために必要である。
- この位置で選択されたVオリゴヌクレオチドは、互いに熱力学的に併用できる。この場合、n個のVオリゴヌクレオチド(上記の例において3オリゴヌクレオチド)を、同じPCRチューブ中でまとめる。これらのオリゴヌクレオチドは全て、いくらか異なる塩基を有していても、同じ位置で設計されているので、アンプリコンは同じサイズである。
- Vオリゴヌクレオチドは、充分に熱力学的に併用できず、二量体の問題が生じるので、これらを同じPCR反応に付すことができない。この場合、プライマーが他のものと併用できないVメンバーを特異的に監視するために、2又はn回のPCRを異なるチューブ中で行うことができる。
- 同じファミリーのV遺伝子が同じサイズを有さないという特定の(希な)場合が存在する。これは、Vファミリーの1つ又はn個のメンバーのイントロンが、該Vファミリーのその他のメンバーのサイズと異なるサイズを有するという事実による(知見:V遺伝子あたり1つのイントロンだけである)。この状況は、Vオリゴヌクレオチドがこの「異なるサイズの領域」の下流に設計されていれば、問題でない。これが可能でなければ、2つ又はn個のオリゴヌクレオチドを2回又はn回のPCRに分けることにより解決する。
J遺伝子に特異的なプライマーの位置は、J遺伝子の始点、すなわちRSSの後のJ遺伝子のセグメント(コード配列)の1番目の塩基に対するその距離を示すことにより示す。この位置は、Jの始点の下流にあり、J遺伝子の1番目の塩基とオリゴヌクレオチドの1番目の塩基(すなわちプライマーの5'末端の塩基)との間の距離(オリゴヌクレオチドを含む)に相当する。
配列を得るためにいくつかの方法が可能である。2つの可能性をここに記載する。
第1の可能性
第1の可能性は、欧州のインターネットサイト「Ensembl Genome Browser」http://www.ensembl.orgにログオンし、興味対象の遺伝子座を調べることを必要とする:種(ヒト、マウスなど)を選択した後に、興味対象の染色体、例えばTRA遺伝子座について第14染色体をクリックすることが必要である。次いで、この目的のために与えられたブロック内で、染色体領域の始点(例えば:21158000)及び領域の終点(例えば:22125000)を示す数を示すことが必要である。Ensemblデータベースは、遺伝子座内に存在するTCR及びIg遺伝子の配置を図で明らかにし、当業者はDNA配列を、全ての対応する遺伝子アノテーションとともにEMBL又はGenBANKフォーマットにエクスポートできる(考慮しているコンティグ上で左クリックすることにより)。よって、当業者は、TCR及びIg遺伝子の全ての配列の位置を、その上流及び下流の配列も含めて自由にできる。
ホモ・サピエンス(Homo sapiens) TRA/TRD:14q11.2の遺伝子座:
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/contigview?region=14&vc_start=21158000&vc_end=22125000
ホモ・サピエンスTRB:7q34の遺伝子座:
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/contigview?region=7&vc_start=141640000&vc_end=142275000
ホモ・サピエンスTRG:7p14の遺伝子座:
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/contigview?region=7&vc_start=38242000&vc_end=38385000
ホモ・サピエンスIgH:14q32.33の遺伝子座:
IgHV:
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/contigview?region=14&vc_start=105476000&vc_end=106368585
IgHD及びIgHJ:
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/contigview?region=14&vc_start=105400000&vc_end=105460000
IgHC:
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/contigview?region=14&vc_start=105120000&vc_end=105400000
ホモ・サピエンスIgK:2p11.2の遺伝子座:
IgKV (近位のクラスター)、IgKJ及びIgKC:
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/contigview?region=2&vc_start=88920000&vc_end=89480000
IgKV (複製デジタルクラスター):
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/contigview?region=2&vc_start=89550000&vc_end=89950000
ホモ・サピエンスIgL:22q11.2の遺伝子座:
http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/contigview?region=22&vc_start=20700000&vc_end=21650000.
以下に示す第2の可能性は、TCR又はIg遺伝子座の配列を含む全てのコスミドをまとめることを必要とする。このために、ヒト及びマウスにおけるIg及びTCR鎖についてのコスミドのアクセッション番号のリストを、基本となる文献(Lefrancs, The Immunoglobulin Facts Book 2001及びLefrancs The T cell receptor Facts Book 2001)又は他のもの(Baumら, 2006; Baumら, 2004)を用いて同定した。
遺伝子の命名法が時とともに変更されていることに注意することが重要である。当業者が命名法に関する情報を見つけるために、TCR及びIgについての対応表を以下の2つの本において見出すことができる:[1] Lefranc, M.-P.及びLefranc, G., The Immunoglobulin Facts Book, Academic Press, 全458頁 (2001) ISBN:012441351X [2] Lefranc, M.-P.及びLefranc, G., The T cell receptor Facts Book, Academic Press, 全398頁(2001) ISBN:0124413528。この情報は、IMGTサイト(http://imgt.cines.fr)でも見出すことができる。
必要量は、試料の性質によって最適化される(細胞;PBMC;胸腺抽出物など)。細胞試料について、実験を行うために必要な量は106細胞である。
プロトコルの種々の工程の連続を、模式的に図19に示す。
高純度の抽出DNAが、ImmunTraCkeRキットを用いてV-J再構成を検出するために必要である。当業者は、このためにどの方法又はキットが適切であるかを理解している。特に、当業者は、この抽出が、PCRを阻害する可能性があるEDTA又はその他の物質のいずれも用いることなく行われるべきであることを理解している。本発明者らは、Roche (登録商標)からのHigh Pure PCR Preparation Templateキットを用いてDNAを抽出することを推奨する。
推奨されるDNA濃度は、100 ng/μlである。
分光光度計(例えばAmersham GenQuant Pro)を用いて260 nmで試料の吸光度を測定する。この測定により、DNA濃度、抽出の程度及びDNA/タンパク質の比を算出することが可能になり、このことにより、DNAの質が推定される。
さらに、DNAの分解状態をアガロースゲル上で制御し、その後、DNA濃度をアクチン対照との比較により標準化する。
ImmunTraCkeRキットは、すでにチューブに分配されたプライマーの組み合わせ(脱水されているか又は液相中)を含む。反応混合物を調製し、上記の反応チューブに分配する。
PCRを、最適サイクル条件で行う。Primus 96+ (MWG)装置を用いてHerculase (登録商標) II Fusion DNAポリメラーゼでPCRを行うために提案されるサイクルパラメータを、以下の表に示す。
0.8% (w/v)アガロースゲルを、1×TBEバッファー中で調製する。
ローディングバッファー(0.25%ブロモフェノールブルー、0.25%キシレンシアノールFF、30% Ficoll 400、水中)とあらかじめ混合したPCR産物を、およそ10μlのPCR産物と2μlのローディングバッファーの割合で載せる。
適切なDNAサイズマーカーをゲルの両端に載せる。
電圧を1×TBEバッファー中のゲルに、バッファーを再循環させることなく、1時間30分間、250V及び120mAにて印加する。
ゲルを、150 mlの1×TBEバッファー中で希釈した40μlのエチジウムブロミドで30分間染色する。
ゲルをUVトランスイルミネータ上におき、画像を写真撮影により取得する。PCRの特異的産物の存在又は不在を記録する。
図2aは、ヒトTRBJ及びTRAJ領域での平均GC含量の分析を示す。J2領域は、平均40〜45%に対して60%という非常に高いGC含量である。
図2bは、TRB遺伝子座上のJ遺伝子の特定の再構成を示す(2つの別々のクラスター内で)。
図2cは、Jクラスターに近い1つのアンチセンスプライマーとJクラスターから遠い第2のアンチセンスプライマーでの、プライマーを選択する原理を示す。これにより、J1クラスター全体をJ2クラスターの上に配置できる。
図2dは、この方法により得られる結果の例を示す。
この構成は、必要な生物学的材料の量を2等分し、同様に、試験の費用を低減させることを可能にする。試験を行うための時間も低減される。さらに、このことにより、ゲルのレーン(又は他の型の分離)の読み取りが単純化できる。なぜなら、J遺伝子が遺伝子座の順に並んでおり、よって容易に同定できるからである。
図3は、同じ反応においていくつかの遺伝子座の再構成を分析して、免疫レパートリー全体を監視するために必要な生物学的材料の量を3〜4の係数で低減させる可能性を示す。この実施例において、TCRB及びTCRDレパートリーの再構成を、単一工程において観察する。このことにより、全てのTアルファ/ベータ及びTガンマ/デルタリンパ球を監視することが可能になる。
図4は、「埋め込まれた」、すなわち種々のプライマー対を用いて得られた一連のアンプリコンが、第1プライマー対を用いて得られたアンプリコンが第2プライマー対を用いて得られた2つのアンプリコンと接することができるようであるマルチ-n-プレックスPCRの原理を示す。
図4aは、TRG遺伝子座の図である。
図4bは、hTRGVファミリーを用いた分離の原理を図で示す。
TRG遺伝子座について、2つのTRGJクラスターを、1つのJオリゴヌクレオチドのみを用いて監視することが可能であることに注目されたい。これは、J1及びJ2遺伝子の下流の100%配列相同性による。
図4dは、2つのTRAJプライマーを用いる埋め込まれたマルチ-2-プレックスPCRの例を示す。
図4eは、6回のみのマルチ-2-プレックスPCRを用いた、AJ領域の95%の分離の例を示す。プライマーの位置は、J遺伝子(の始点)の下流のオリゴヌクレオチドのJ遺伝子の名称の下に示す。この位置が重要である。これは、予測されるバンドが、それらが分離されることを可能にするサイズを有することを確実にすることを可能にする。
図5及び6は、マルチ-n-プレックスPCRにより得られた全てのPCR産物のアガロースゲルでの泳動後に得られた種々のバンドを示す。図5は、ヒトTRB ImmunTraCkeRキットを用いて得られた理論的な結果の図による提示を示す(この提示は、他の種でも同様である:ラット、マウス、サルなど)。それぞれの縦列は1つのTRBVファミリーに相当し、それぞれのバンドはある特定のV-J再構成に相当する。TRBV遺伝子を、以下の順序で研究した:BV2、BV3、BV4、BV5、BV6、BV7、BV9、BV10、BV11、BV12、BV13、BV14、BV15、BV16、BV18、BV19、BV20、BV24、BV25、BV27、BV28、BV29、BV30。図6は、3種類の試料を用いて2重(横に並べて載せた)で得られた対応する実験結果を示す:胸腺から抽出したgDNA、リンパ球減少状況でPBMCから抽出されたgDNA、そしてそれぞれ1又は2のTRBV-J再構成を含む4つのT系統のDNAのプール。
レーンのそれぞれに、ローディング及び/又はPCRの再現性マーカーを加える(任意に)ことも可能である(知見:これらの2つの再現性マーカーは必須でない)。求める利点:バンド間のシグナルの標準化を向上する。
図7は、網羅的でかつ分離している、不完全D-Jβ再構成の検出のための試験の結果を示す(レーンA:J1クラスター及びJ2クラスターとD1の再構成。レーンB:J2クラスターとのD2の再構成)。この試験により、再構成されたD及びJ遺伝子の名称を特定することによりクローンを特徴決定することが可能になる。
パートA:予測されるバンドの数が、陽性対照(PBMC及び胸腺)で明確に観察される。J1.1及びJ1.2遺伝子とD1遺伝子との再構成に対応するバンドは融合されている。なぜなら、用いた技術の分離限界が、最大バンドのサイズの10%を超えないサイズの違いがあるバンドの分離を可能にしないからである。このバンドの配列決定又は標識プライマーの使用が、この知見の確認のために必要であろう。
2つの非常に強いバンドが陰性対照に出現する。これらのバンドは非特異的でないが、胚性DNA増幅に相当する。大きいフラグメントを増幅する技術の能力と結びついた遺伝子座の特徴とは、この厳密な場合において生成物を観察するために、再構成がある必要がないことを意味する。これらの2つのバンドは、試験したDNAの存在及び質、並びに酵素の有効性についての非常に良好な内部対照である。
不完全D-J及びD1-D2再構成は機能的でないが、リンパ球増殖(B若しくはTリンパ腫又は白血病)を同定するための唯一の生物学的マーカーである場合があることに注目することが重要である。
図8は、単一ページ上に、特に計数、及び/又は試料の多様性、及び/又はシグナルの強度、及び/又は参照レパートリーを用いて得られた%多様性を比較することによりその患者がリンパ球減少症に罹患しているかを同定するための情報である別の患者若しくは同じ患者に由来する参照多様性との比較、及び/又は画像中で検出されたクローン数についての情報、及び/又は2次元及び/若しくは3次元の表示図、及び/又は検出されたシグナルの減少量により分類される全てのV-J再構成のリスト、及び/又は画像中の%標本性(representativeness)を含む、免疫レパートリーの分析からの全てのデータをまとめる方法を示す。
1- 患者の病歴及び試料の生物学的経歴(計数の結果、細胞数測定、試料採取条件など)に関して収集された情報をまとめる;
2- 統計学的方法を用いてデータを調べ、免疫レパートリーの分析の結果(組み合わせ多様性又はその他のアプローチ)を、臨床及び生物学的データと相関させる。このことにより、特に、全てのV(D)J再構成を、検出頻度(アンプリコンのシグナル強度)の順序で分類することが可能になる。この順序は、個体のリンパ球レパートリーが遭遇した治療及び感染によって、個体ごとに変動する。このことにより、瞬間Tにおける個体の免疫レパートリーのサインを得ることが可能になる。このサインは、自己免疫疾患、アレルギー、白血病、リンパ腫などの病態についての生物学的マーカーであり得る。
注意:このアプローチが、免疫レパートリーを分析するための他のアプローチ(結合部多様性、対形成多様性、体細胞変異多様性などを分析するための全てのアプローチ)とも両立できることに注目することが重要である。
CBC又は細胞数計数における標識の間に行われたリンパ球計数は、試料中のリンパ球の数を与える。この数を用いて、患者が免疫不全を示さないことを確認する。「正常」の範囲は、通常、1000〜3200リンパ球/μLの血液である。1000未満では、患者はわずかに免疫抑制されていると考えられる。450未満では、重篤な免疫抑制を伴っている。逆に、3200を超えると、患者はリンパ球増殖の危険がある可能性があると考えられる。このアプローチには2つの弱点がある。第1は、最小値と最大値の間の3の係数に相当するその範囲のサイズである。第2点は、よりやっかいなもので、この計数が患者の免疫レパートリーの真の多様性を予想しないことである(図9、グラフ1)。本発明は、従来の計数を、V-J組み合わせ多様性の測定と結びつけることを可能にする(図9、グラフ2)。
1. 低い計数(<1000 Ly/μL)及び低い組み合わせ多様性(<40%):患者は免疫抑制された患者である。
取るべき行動:この患者を臨床研究に含めないこと。血液学者によりこの患者を監視させること。
2. 低い計数(<1000 Ly/μL)、しかし正常なV-J組み合わせ多様性(>65%):この患者は、免疫細胞の他の集団と比較して低いレベルの循環リンパ球を有するが、この患者の特異的免疫防御の質は、特に問題がない。
取るべき行動:研究が老齢者に関する研究であれば、この特徴を有する患者を含めることは興味深いだろう。
3. 正常の計数(1000〜3200 Ly/μL)及び低い組み合わせ多様性(<40%):免疫レパートリーに「ギャップ」がある。このリンパ球計数は、正常であるようにみえるが、1つ以上のクローン性増殖を伴い得る免疫不全状態を隠している。ワクチン有効性には疑問が生じるかもしれない。
取るべき行動:この患者を臨床試験に含めないことを推奨する。腫瘍学-血液学者にこの患者を監視させること。
4. 正常の計数(1000〜3200 Ly/μL)及び正常な多様性(>65%):免疫レパートリーは健常である。
取るべき行動:この患者を臨床試験に含めることができる。
5. 正常を超える計数及び低い多様性:高危険性ゾーン、試料は1又は少数のリンパ球クローンのみを含有する。
取るべき行動:この患者を臨床試験に含めないこと。腫瘍学-血液学者にこの患者を監視させること。
6. 正常を超える計数、しかし正常な多様性:全身性リンパ球増加症、この個体の特異的免疫系は過剰活性化されているが、白血病又はリンパ腫につながり得るモノクローナル増殖を意味する要素はない。
取るべき行動:この患者を臨床試験に含めないこと。リンパ球増加症の進行を監視するために、腫瘍学-血液学者にこの患者を監視させること。
図10は、LCDを用いた腫瘍学-血液学における決定樹を示す。
示したスキームによると、2組のプライマーを逐次的に用いて(第2の組を用いる試験は任意である)、TRBのVJ及びDJ再構成を検出する。第2の組のプライマーは、対応するプライマーのハイブリッド形成部位で出現した多型又は体細胞超変異などによりクローンが逃れることを避けるために、第1組のプライマーと比較してシフトしている。
この手順により、リンパ球増殖の危険性のレベルに関する診断と、同時に、免疫不全の危険性のレベル(感染の危険性と関連することになる)に関する診断を行うことが可能になる。
図11は、存在する可能性がある類似性又は相違性を同定するために、2つの免疫レパートリーを比較することを可能にするグラフを示す。下に示すものは、それぞれの成分の読み取りと表示の順序であり、また、結果の解釈の具体例でもある。
解釈:2つの試料に共通して観察される多くの再構成の数(184)は、2つのレパートリーが同一であるようであることを示す。
さらに、ここに記載する方法は、出現又は消滅した再構成の数を2つの試料を採取する間に経過した時間と関連させることにより、再構成の速度又はレパートリーの減少の速度に関する指針を得ることを可能にする。このことにより、特に、治療の刺激効果、又は逆に免疫抑制効果を比較することが可能になる。
図12は、本発明の方法の特定の実施形態を模式的に示し、これは、アンプリコンを電気泳動により分離するいずれの(任意の)工程の前のリンパ球増殖の存在を検出するために、マルチ-n-プレックスPCRをリアルタイムで監視する。
PCR増幅は、例えば上記の実施例2に記載するプロトコルを用いてリアルタイム定量PCR装置で行われ、さらに、各増幅サイクルにて蛍光測定が行われる。
今回の場合、高度な多重度及びアンプリコン間の強度(頻度)の変動が、リアルタイムPCRを開発することを難しくしている。
- 多様化された免疫レパートリー:健常な胸腺又はPBMC試料において、50 ngのgDNAをQ-PCRあたりに用いて、全てのVファミリーが、20サイクル及び最大で27までのサイクルを用いて通常、検出される。
リンパ球を含有しない試料において、20〜27サイクルの間ではシグナルは検出されない。
同様に、試料中に大量にn個のVファミリーが存在する場合、n個の曲線が20〜27サイクルのウィンドウで検出され、他のVファミリーは、その後>27サイクルで検出されるか、又は全く検出されない場合もある。
このことにより、リアルタイムかつ2時間未満で、ゲノムレベルにて1つのVファミリーに関するリンパ球増殖の診断を、マルチ-n-プレックスPCR法を用いて行うことが可能になる。
- まとめると、この再ハイブリッド形成工程は、試料の「分子」多様性の大きさの程度を、PCR生成物を泳動することなく測定するための情報を提供できる。分子多様性が大きいほど、それぞれのVファミリーについての曲線のディレクター係数(director coefficients)の合計がより小さい。
しかし、過剰に存在するJ遺伝子の名称を決定することも、組み合わせ多様性を測定することもできない。科学者がこのさらなる情報を得ることを望むならば、PCR生成物を分離して、再構成のそれぞれに相当するバンドの強度を分析しなければならない(図12cのグラフD)。
結論として、この方法は、類のない程度の巧妙な処理を用いて、治療の後の免疫多様性の変化を監視することを可能にする。特に、免疫不全の程度を非常に早期に診断できる。
図13は、治療に応答した、患者でのIgH及びTCRレパートリーの変化を監視するための、種々の時間でのこれらのレパートリーの分析の2つの例を示す。
B細胞慢性リンパ性白血病(B-CLL)の場合、この病態は、1つ又はいくつかのみのBクローンについての強いシグナルを同定することにより診断される。本発明により開発された分離アプローチは、PCR産物を配列決定する必要なく、V及びJ遺伝子の名称を同定することを可能にする。これは、特に、残存疾患を監視するために有利である。図13は、2つの状況:陽性である一方の見通し(患者1)、陰性である他方(患者2)を示す。具体的には、治療が有効であれば(応答性の患者)、試験は、IgH組み合わせ多様性及び安定性における増加、又はTCRb及びTCRgの鎖の増加さえも測定する。逆に、非応答性(NR)の患者について、1つのレパートリーの多様性又は3つのレパートリーの多様性さえも減少する。患者は、治療の後で、より免疫抑制されている。
この実施例の場合、グラフはIgH、TCRb及びTCRgの鎖の組み合わせ多様性の測定の結果である。
- 患者の分類を促進する。
- B又はTクローンを、そのV-J再構成の名称により、特に全てのT及びBリンパ球レパートリーを同時に分類することにより診断及び特徴決定する。
- 病態に関与するV-Jクローンに従って病態の進行についての見通しを提供する。
- 残存疾患を監視し、V-J組み合わせ多様性と比較する。
- リンパ球増加症の患者の進行の監視を改善する。
- 種々の試料の供給源:血液、脾臓、リンパ節間の病態を比較し、可能であれば、「病態の起源」を、これらの種々の集団の間のV-Jクローンの存在を定量することにより特定するように尽くす。
- 各患者のリンパ球計数/多様性(LCD)レベルと感染の危険性との相関に近づく。
図14は、LCD (リンパ球計数/多様性)の3次元表示を示す。このグラフは、Bリンパ球及びTリンパ球の多様性の測定と、%又は絶対値としての試料中に存在するリンパ球の数の計数とをまとめる。
応答性の患者は、危険性ゾーン(高い計数(およそ80%)、低いIgH多様性(8%)及びTCRについての中程度又は低い多様性(44%))から、PBMC試料(健常な対照)に近い、より低い危険性のゾーンに、計数の減少(20%)、IgH多様性(75%)、TCRb多様性(75%)及びTCRg多様性(90%)の再構成を伴って移動する。
図15は、本発明の方法を、幹細胞(骨髄)移植を受けた患者における免疫レパートリーの再構成の監視に応用することを図示する。
工程1:免疫多様性の測定、最初の診断、T細胞又はB細胞のクローン(より濃い色のクローン)の検出。
工程2:治療の有効性の評価。
工程3:残存疾患の監視。
工程4:受容患者のレパートリーの調製物の評価(移植の前処置)。
工程5:患者のV-J多様性の再構築の測定及びGVHD (移植片対宿主病)の場合の早期診断。
工程6:治療の有効性の評価。
工程7:残存疾患の監視。
ここに示す試験の結果は、疾患の重篤度を測定し、治療に非応答性の患者に治療を施すことを避けることにより、治療ができる限り有効であるようにすることを可能にする。免疫レパートリーは、ここでは、個体の健康状態の全般的なバイオマーカーとして用いられる。これは、2つのレベルで用いられる:1/ 患者の感染の危険性を評価するため、2/ 分離様式で、病態のサインであり得るT又はBリンパ球クローンを同時に監視する。患者から採取された逐次的な血液試料に対して行われる長期の研究により、治療が実際に有効でありかつ患者が細菌又はウイルス感染に対して患者自身を防御するために多様化された免疫レパートリーを保存することを確実にするために、治療の間を通して免疫レパートリーのレベルを監視することが可能である。この動的診断は、医師が、患者に正しい用量及び正しい時間での適切な医療を提案することによりできるだけその患者に治療を適合させることを可能にする。
図16の4つのマッピングは、前の図面の工程5及び6を説明する。4つのマッピングは、治療前の2回(およそ200及び250日)、及び治療後の2回(およそ300及び600日)での同じ患者からの試料を用いて測定された免疫レパートリーの多様性を示す。これらの4つの試料に関する結果を、強度、計数及び多様性に従って示す。
2. PBMCにおけるリンパ球の割合(計数)は、D300付近でその最大に到達し、D600付近でわずかに減少する。
3. 組み合わせ多様性の程度は、逆行傾向(reverse tendency)に従う。Tリンパ球の割合の増加は、多様性の増加に対応しない。予測されたこととは逆に、多様性は、ポイント1及びポイント2の間で減少する。
結果を図17に示す。
本発明の方法は、ヒトTRB ImmunTraCkeRキットを用いて、「ヒト化」トランスジェニックマウスの免疫レパートリーの再構築の質を評価することを可能にする。この実施例において、研究した生物学的試料は、CD34+細胞を注射された「免疫不全マウス」(免疫細胞がないマウス)の脾臓に由来する。これらの細胞は、多様化し、免疫系を再構築する能力を有する。この方法は、V-Jレパートリーの多様性を2次元グラフで示すことを可能にする。それぞれのヒストグラムはVファミリーに対応し、ヒストグラム中での細区分は、ある特定のJ遺伝子に対応する。それぞれのヒストグラムでの最低の細区分は、この例ではJ2.7に相当し、最高の細区分はJ1.1に相当する。完全に再構成された免疫レパートリーを有する「ヒト化」マウスを(右のグラフ)、よく多様化されたレパートリー(中央のグラフ)を有するマウスから、ヒトPBMCの試料で観察されたものに近い再構成の分布(左のグラフ)を用いてスクリーニングできる。
図18に示す研究は、Tリンパ球を含有する試料の免疫レパートリーの多様性の減少を測定することによる、治療(ワクチン)の進行におけるエピトープ(抗原)の有効性の評価を示す。多様性が減少するほど、エピトープ特異的リンパ球の選択が大きくなることが示される。
この図は、3つの場合を示す。
A:試験したエピトープは、多様性の減少により示されるように、かなりのリンパ球選択をもたらす。
B:試験したエピトープは、陰性対照との比較により観察できるように、あまり選択的ではない。
C:陰性対照。
もちろん、選択的免疫応答を誘導する抗原の選択に加えて、注射の最良の方法を同定する能力がある(注射の回数及び頻度、注射部位並びに用量)。
つまり、ここに示す方法は、新しい治療アプローチ、特にワクチンを評価するためのツールとして、臨床前及び臨床の研究に特に有利なツールである。培養細胞、動物モデル又はヒトにおいてであっても、このように記載されるツールの目的は、特定の活性化によるか又は活性化がないことにより、免疫系に対する予測される影響の質に対する判断を提供することである。
拡張により、例えば研究モデル又は再注入前のリンパ球培養物の生成(治療目的のため)について特徴決定された1つ以上のクローンを監視することにより、免疫レパートリーの質を管理することが可能である。
図19は、免疫細胞レパートリーの免疫監視のための種々の方法との比較を示す結果のまとめを示す。種々の試料を、それぞれに技術により研究した。細胞試料は、試料の調製によるいずれの偏向も避けるために、対照を用いる様式で処理した。
2つのその他の試料を選択して、胸腺試料よりも多様性がかなり低い細胞集団を代表した。これらは、Jurkat細胞系統(モノクローン性)に相当する「Jurkat」試料と、既知の割合での3つの細胞系統(オリゴクローン性)の混合物に相当する「T系統プール」試料であった。最後に、「C(-)」と呼ばれる試料は、免疫細胞を含まない細胞混合物である陰性対照に相当する。
本明細書に記載される方法を用い、良好な条件下で「ImmunTraCkeR」キットの1つを用いて分析を行い、さらに、試験を行うための工程を監視する(図20に示す)ために、以下の作製プロトコル、かつ良好な作製のプラクティスに従って試験を作製することが好ましい。
hTRベータ試験を行うためのキット(又はヒトTRベータ「ImmunTraCkeR」キット)を管理下で作製するために、最終的に試料の研究において用いるための試験を行わなければならない個人が、所望の使用によって以下に記載される種々の工程に忠実であることを確実にすることが必要である。
12 hTRBeta試験の作製
「オリゴミックス」の調製
材料の調製
One Greinerプレート(基体)
3つの8ウェルアレイ+ストッパー
0.5 mL及び1.5 mLのマイクロチューブ
ピペット、チップ
滅菌H2O
EB
100μMから20μM
計算:20×Vf / 100 = Vi
よって、0.5 mLマイクロチューブ内で:ViμLの100μMのオリゴ+(Vf-Vi)のEB。
12キット+10%の作製に必要な容量の計算:12*1.67=20.04+10% = 22μL
計算:3.5×22 / 20 = 3.86μL
よって、0.5 mLマイクロチューブ内で:3.85μLの20μMのオリゴ+18.15μLのH2O。
100μMから20μM
計算:20×Vf / 100 = Vi
よって、0.5 mLマイクロチューブ内で:ViμLの100μMのオリゴ+(Vf-Vi)のEB。
12キット+10%の作製に必要な容量の計算:23*12*1.67=461+10% = 507.1μL
計算:3.5×507.1 / 20 = 88.74μL
1.5 mLのエッペンドルフチューブ内で:88.74μLの20μMのオリゴ+418.36μLのH2O
滅菌溶血チューブ中の3.5μMに希釈したBc1do2及び2S7do1のプール。
このプールの44.1μLを、希釈Vβを含有する0.5 mLマイクロチューブにそれぞれ分配する。
逆さまにすることにより混合し、充分にボルテックスし、次いで短く遠心する。
オリゴVβ-Bc1do2-2S7do1の分配
以下のVβ順序を維持しながら、66μLの「Vβ-Bc1do2-2S7do1」ミックスを8ウェルアレイに分配する:
アレイ番号1:Vβ2up2、Vβ3up2、Vβ4up_ex、Vβ5pool、Vβ6pool、Vβ7pool、Vβ9up_ex、Vβ10pool
アレイ番号2:Vβ11up_ex、Vβ12pool、Vβ13up1、Vβ14up_ex、Vβ15up_ex、Vβ16up1、Vβ18up1、Vβ19up2
アレイ番号3:Vβ20-1up_ex、Vβ24up_ex、Vβ25up_int、Vβ27up2、Vβ28up_G、Vβ29up_G、Vβ30up1
材料の調製
3枚のGreinerプレート(基体)
3*12 8ウェルアレイ+ストッパー
ピペット、チップ
マルチチャネルピペットを用いて、アレイ1〜3の5μLのミックス(ウェルあたりの容量=64μL)をを、対応する12のアレイのそれぞれのウェルに分配する。
n回の試験のバッチについて、少なくとも2回の試験を、作製の品質及び適合を管理するために用いる。トレーサビリティ及びバッチに対するいずれのドリフトをも制御することを可能にするために作製の間に行われる種々の対照のうち、バッチの妥当性検査の前の品質の確認を可能にする機能的対照が重要である。この観点において、図21は、作製バッチに由来する試験の対照の3つの試料に対する例を提案する。これらの3つの試料は、作製の間に系統的な管理が行われたものである。結果を、いずれの相違点を同定するために、以前の結果と系統的に比較する。それぞれの新しい結果は、免疫レパートリーの研究において試験を用いることができるようにするための傾向並びに許容できる上限及び下限を改善することを可能にする。
上記のプロトコルは、以下の実施例21に記載されるようなオリゴヌクレオチドのキットを用いてマウスTRB試験を作製するため、及びその他のいずれの試験の作製のために適合できる。
本明細書に記載されるプロトコル及び方法は、以下の表に示すプライマーを用いてマウスTRBレパートリーの研究に適合できる。
本発明による定量PCRの使用は、以下の3つのカテゴリーの1つにある患者を迅速に分類することを可能にする:健常(該患者の免疫系の状態に関して)、リンパ球増殖、又はリンパ球減少症。 リアルタイムPCRにより、増幅産物の泳動を必要とする「非リアルタイム」PCRによる分析での5時間の代わりに、2〜3時間で結果を得ることが可能になる。結局は、この報告速度の増加は、患者の健康を監視することを可能にする。
第1の状況(試料A)は、「健常」個体のものであり、ここでは全ての増幅が5サイクル未満のCt範囲でまとめて検出され、これは、ハウスキーピング遺伝子の検出後2〜6サイクルの場合である。
定量PCRによる、リンパ球減少症に関連するリンパ球多様性の欠如の直接の同定
本発明者らは、本発明の方法により得られる結果を解釈するため、特にリンパ球減少症を伴うリンパ球多様性の欠如を同定するための2つの新規な指標を同定した。
第1の指標は、ここでは「divpenia比」と呼ぶが、以下のようにして算出される:
「divpenia比」= [アクチン品質管理対照の出現サイクル数] / [試料のV再構成の出現サイクル数の平均(又は中央値)]。
もちろん、多様性の欠如を容易に同定することを目的とするこの指標は、当業者により、アクチン以外のいずれの対照遺伝子にも適合され得る。本実施例の場合、0.78未満の比、より具体的には0.74未満の比(QPCRにより測定される)は、低い組み合わせ免疫多様性を指示する(本明細書で「divpenia」と記載する状況)。
- 試料A 「正常」
「divpenia比」= 20サイクル(Ctアクチン) / 平均(又は中央値)再構成25サイクル= 0.80。
- 試料C 「リンパ球減少症」
「divpenia比」= 20サイクル/28サイクル = 0.71。
ある試料において、(リンパ球の)リンパ球増殖は、対応するV-J再構成の検出の増加を伴う。QPCRにおいて、このことは、非常に低い数のQPCRサイクルから先で対応するV遺伝子を検出することである。このリンパ球においてリンパ球増殖が大きいほど、リンパ球により代表される試料の割合がより大きい。結果として、対応する再構成の検出は、アクチン遺伝子に近いサイクル数で生じる(又はもっと前でさえある、実施例22での知見を参照)。逆に、試料の他の再構成はより頻度が低く、それらの検出はより多数のQPCRサイクルを必要とする。結局、このことは、検出される最初及び最後の再構成の検出に相当するCt間の差の増加をもたらす。この差(デルタCt)がnサイクルよりも大きい場合、このことは、リンパ球増殖の存在を示し、このデルタが大きいほど、これはより大きい。
注意:PBMCで優勢に検出される10のTRB再構成のリストの知見に鑑みて、このリストに存在しないTRBV遺伝子のファミリーが検出されるならば「新生の」クローン性の疑いを得ることができる場合もある。
* ΔCt指標= [Ctmax] - [Ctmin] サンプルについて。
実際上、ΔCt<6サイクルであればリンパ球増殖はなく、ΔCt指標>6サイクルはクローンのリンパ球増殖を示し、これは次いで、試料のリンパ球の少なくとも10%を表すと考えられる。
ΔCt = 27-24 = 3サイクル。
- 試料B:
ΔCt = 30-23 = 7サイクル、これはリンパ球増殖を明確に示す。
注意:誤りを回避し、対照遺伝子(ハウスキーピング遺伝子など)の検出により測定される試料のゲノムDNAの量に関して標準化された様式で作業することを可能にするために、多様性の欠如を測定するための比及びクローンを同定するためのCtの差又はその逆を用いることが好ましい。
この実施例は、上記の実施例18ですでに示したことをさらに深く掘り下げる。
本発明の方法により、本発明者らは、個体が>50%の最初の組み合わせ多様性を有する場合に、制御性T細胞又はCD25++細胞の検出の減少と組み合わせた組み合わせ多様性の減少が観察されることが、ワクチン接種の有効性を指示することを観察できた。
同じ系統に沿って、生物での制御性T細胞の量を一過的に減少させることを目的とする任意のストラテジーは、ワクチン及び抗腫瘍効果を増大させることができるだろう。
Claims (30)
- 個体における、TRA、TRB、TRG、TRD、IgH、IgK及びIgL遺伝子座から選択される少なくとも1つの遺伝子座のV(D)J再構成の組み合わせ多様性を、前記個体からの生体試料に由来するゲノムDNAから、インビトロ分析する方法であって、以下の:
A) 前記ゲノムDNAの複数のフラグメントを複数回のマルチプレックスPCRにより増幅する工程であって、その少なくとも1回は、単一の反応でnの異なるプライマー対が用いられるマルチ-n-プレックスPCR (n≧2)であり:
(i) nの異なるプライマー対のそれぞれは、ある特定のV若しくはD遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するセンスプライマーと、ある特定のJ遺伝子の下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するアンチセンスプライマーとで構成されているので、nの異なるプライマー対のそれぞれは、2つの別々のV(D)J又はD-J再構成の特徴である少なくとも2つのフラグメントの増幅を可能にし;
(ii) nの異なるプライマー対の少なくとも2つは:
(a) 共通センスプライマーと第1アンチセンスプライマーとの第1対と、共通センスプライマーと第2アンチセンスプライマーとの第2対(ここで、第1アンチセンスプライマーと第2アンチセンスプライマーとは異なる)、又は
(b) 第1センスプライマーと共通アンチセンスプライマーとの第1対と、第2センスプライマーと共通アンチセンスプライマーとの第2対(ここで、第1センスプライマーと第2センスプライマーとは異なる)
を含み;
(iii) 前記プライマーは熱力学的に併用でき;
(iv) 前記プライマーは、それぞれのプライマー対を用いて増幅されるフラグメントがその他のプライマー対を用いて増幅されるフラグメントと区別できるような様式で選択される;
工程と;
B) 工程Aで得られた増幅産物を検出する工程と;
C) 結果を解釈する工程と
を含む方法。 - 工程B)が、DNAフラグメントの増幅のリアルタイム測定の工程を含み、工程C)が、以下:
(i) 1つ、又は複数の曲線の半分未満の数であるいくつかの曲線が、他の曲線が第1曲線の変曲点の少なくとも2サイクル後、好ましくは第1曲線の変曲点の少なくとも3又は4サイクル後で変曲点を示すという、他の曲線と比較したシフトを示すか、或いは増幅を示さない場合に、結果は、クローン性又はオリゴクローン性のリンパ球増殖の存在を示し;
(ii) 逆に、全ての曲線が同じサイクルにて変曲点を示すか、又は2若しくは3増幅サイクルの最大シフトを示す場合、結果は、増幅されたフラグメントに相当する再構成の1つに起因するクローンのリンパ球増殖の仮定を棄却することを可能にする、
のようにして行われる請求項1に記載の方法。 - 40℃と95℃の間の温度上昇の間にそれぞれのチューブ中の蛍光を連続的に測定することによりリンパ球増殖を確認する工程をさらに含み、優勢なピークを観察することが、優勢なアンプリコン、すなわちリンパ球増殖の存在を示すが、よく似たサイズのいくつかのピークを観察することが、逆に、リンパ球多様性を示す請求項2に記載の方法。
- 少なくとも1回のマルチ-n-プレックスPCR (n≧2)が、ある特定のV遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する共通センスプライマーを含む少なくとも2つのプライマー対を構成する少なくとも3つのプライマーの組み合わせを用いて行われ、それぞれのプライマー対が、ある特定のJ遺伝子の下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するアンチセンスプライマーも含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1回のマルチ-n-プレックスPCR反応(n≧2)が、ある特定のJ遺伝子の下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する共通アンチセンスプライマーを含む少なくとも2つのプライマー対を構成する少なくとも3つのプライマーの組み合わせを用いて行われ、それぞれのプライマー対が、ある特定のV遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するセンスプライマーも含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも1回のマルチ-n-プレックスPCR反応(n≧2)が、TRB遺伝子座のある再構成を分析するために、以下の特徴を有する少なくとも2つのプライマー対を構成する少なくとも3つのプライマーの組み合わせ:
(i) 前記2つのプライマー対は、ある特定のV遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する共通センスプライマーを含み、それぞれは、ある特定のJ遺伝子の下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するアンチセンスプライマーを含む;
(ii) 前記2つのアンチセンスプライマーは、TRB遺伝子座のJ遺伝子の2つの別々の群に属する2つの遺伝子Jy及びJzの下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する;
(iii) 前記Jy遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーのハイブリッド形成領域と前記Jy遺伝子の始点との間の距離は、前記Jz遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーのハイブリッド形成領域と前記Jz遺伝子の遺伝子群のうちの最初のJ遺伝子の始点との間の距離よりも大きい
を用いて行われる請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。 - 少なくとも1回のマルチ-n-プレックスPCR 反応(n≧2)が、配列番号1の配列のhTRBJ1.6プライマー及び配列番号2の配列のhTRBJ2.7プライマーと、ある特定のV遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するセンスプライマーとを含む少なくとも3つのプライマーの組み合わせを用いて、ヒトTRB遺伝子座のある再構成を分析するために行われる請求項6に記載の方法。
- 24回のマルチ-n-プレックスPCR (n≧2)が、少なくとも3つのプライマーの組み合わせを用いて行われることによりヒトTRB遺伝子座のV(D)J再構成を分析するための請求項6又は7に記載の方法であって、プライマーのそれぞれの組み合わせは、請求項7で規定されるhTRBJ1.6プライマー及びhTRBJ2.7プライマーと、配列番号3〜25の配列で規定されるプライマーから選択される少なくとも1つのhTRBVプライマーとを含む、方法。
- 少なくとも1回のマルチ-n-プレックスPCR反応(n≧2)が、ヒトTRB遺伝子座の不完全DJ再構成を分析するために、以下の特徴を有する少なくとも2つのプライマー対を構成する少なくとも3つのプライマーの組み合わせ:
(i) 前記2つのプライマー対は、ある特定のD遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する共通センスプライマーを含み、それぞれは、ある特定のJ遺伝子の下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するアンチセンスプライマーを含む;
(ii) 前記2つのアンチセンスプライマーは、TRB遺伝子座のJ遺伝子の2つの別々の群に属する2つの遺伝子Jy及びJzの下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する;
(iii) 前記Jy遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーのハイブリッド形成領域と前記Jy遺伝子の始点との間の距離は、前記Jz遺伝子に特異的なアンチセンスプライマーのハイブリッド形成領域と前記Jz遺伝子の遺伝子群のうちの最初のJ遺伝子の始点との間の距離よりも大きい
を用いて行われる、TRB遺伝子座の不完全D-J再構成のインビトロ検出のための請求項1に記載の方法。 - 少なくとも1回のマルチ-n-プレックスPCR反応(n≧2)が、TRB遺伝子座の不完全再構成を分析するために、ある特定のD遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するセンスプライマーと、請求項7で規定されるhTRBJ1.6プライマー及びhTRBJ2.7プライマーとを含む少なくとも3つのプライマーの組み合わせを用いて行われる請求項9に記載の方法。
- (i) 配列番号1の配列のhTRBJ1.6プライマー及び配列番号2の配列のhTRBJ2.7プライマーと、配列番号26および27の配列で規定されるプライマーから選択されるhTRBD1プライマーとで構成される3つ組のプライマーを用いるマルチ-2-プレックスPCRと、(ii) hTRBJ2.7プライマーと、配列番号28および29の配列で規定されるプライマーから選択されるhTRBD2プライマーとで構成されるプライマー対を用いる単純マルチプレックスPCRとを行うことにより、ヒトTRB遺伝子座の全ての不完全再構成を分析するための請求項9又は10に記載の方法。
- ヒトTRA遺伝子のJ遺伝子の95%と、同じ遺伝子のある特定のV遺伝子との再構成を分析するための請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法であって、工程A)において、6回のマルチ-2-プレックスPCR又は3回のマルチ-4-プレックスPCRが、V遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中とハイブリッド形成するプライマーと、対(配列番号30、配列番号31)、(配列番号32、配列番号33)、(配列番号34、配列番号35)、(配列番号36、配列番号37)、(配列番号38、配列番号39)及び(配列番号40、配列番号41)から選択される1つ又は2つのアンチセンスプライマー対とからそれぞれが構成されるプライマーの組み合わせを用いて行われる方法。
- 請求項12に記載の方法が、TRA遺伝子座のV遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中とハイブリッド形成する、配列番号42〜61の配列から選択される少なくとも1つのプライマーを用いて行われる、TRA遺伝子座のVJ再構成の多様性を分析するための方法。
- ヒトTRG遺伝子座の全てのJ遺伝子と、同じ遺伝子座の少なくとも2つのある特定の遺伝子Vx及びVyとの再構成を分析するための請求項1〜3及び5のいずれか1項に記載の方法であって、工程A)において、少なくとも1回のマルチ-2-プレックスPCRが、前記Vx及びVy遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中とハイブリッド形成する2つのセンスプライマーと、ヒトTRG遺伝子座のJ2遺伝子中とハイブリッド形成する配列番号62の配列のhTRGJdo2アンチセンスプライマーとで構成される3つ組のプライマーを用いて行われる方法。
- ヒトTRG遺伝子座のV遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中とハイブリッド形成する少なくとも1つのプライマーが、配列番号63〜66の配列で規定されるプライマーから選択される請求項14に記載の方法。
- ヒトTRD遺伝子座の全てのJ遺伝子と、同じ遺伝子座のある特定のV遺伝子との再構成を分析するための請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法であって、工程A)において、マルチ-2-プレックスPCRが、前記V遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中とハイブリッド形成するプライマーと、配列番号67の配列のhTRDJ1do5アンチセンスプライマー及び配列番号68の配列のhTRDJ3do2アンチセンスプライマーとで構成される3つ組のプライマーを用いて行われる方法。
- 24回のマルチ-n-プレックスPCR (n≧2)が、少なくとも3つのプライマーの組み合わせ
であって、プライマーのそれぞれの組み合わせがhTRDJ1do5アンチセンスプライマー及びhTRDJ3do2アンチセンスプライマーと、配列番号69〜84の配列で規定されるプライマーから選択される少なくとも1つのプライマーとを含む組み合わせを用いて行われることにより、TRD遺伝子座のVJ再構成を分析するための請求項16に記載の方法。 - ヒトIgH遺伝子座の全てのJ遺伝子と、同じ遺伝子座の少なくとも2つのある特定の遺伝子Vx及びVyとの再構成を分析するための請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法であって、工程A)において、少なくとも1回のマルチ-2-プレックスPCRが、前記Vx及びVy遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中とハイブリッド形成する2つのセンスプライマーと、IgHJ6遺伝子の下流及び/又は該遺伝子の中とハイブリッド形成するアンチセンスプライマーとで構成される3つ組のプライマーを用いて行われる方法。
- 前記アンチセンスプライマーが、配列番号85の配列のhIgHJ6do2プライマーである請求項18に記載の方法。
- ヒトIgH遺伝子座のV遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中とハイブリッド形成する少なくとも1つのプライマーが、配列番号86〜91の配列で規定されるプライマーから選択される請求項18又は19に記載の方法。
- 少なくとも1回のマルチ-n-プレックスPCR反応(n≧2)が、ヒトIgH遺伝子座のある不完全再構成を分析するために、ある特定のJ遺伝子の下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成する共通アンチセンスプライマーを含む少なくとも2つのプライマー対を構成する少なくとも3つのプライマーの組み合わせを用いて行われ、それぞれが、ある特定のD遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するセンスプライマーを含む、IgH遺伝子座の不完全D-J再構成のインビトロ検出のための請求項1に記載の方法。
- 前記共通アンチセンスプライマーが、請求項19で規定されるhIgHJ6do2プライマーであり、且つ/又は、ヒトIgH遺伝子座のD遺伝子の上流及び/若しくは該遺伝子の中とハイブリッド形成する少なくとも1つのプライマーが、配列番号92〜98の配列で規定されるプライマーから選択される請求項21に記載の方法。
- 増幅産物を検出する工程B)が、前記産物をそれらのサイズによって分ける工程を含み、且つ工程C)が、アンプリコンをそれらのサイズにより分けることにより得られるデータを処理する工程を含み、前記処理が、コンピュータにより行われ、観察されたそれぞれのアンプリコンに、対応するV(D)J再構成の名称を割り当てることを可能にする請求項4〜22のいずれか1項に記載の方法。
- データ処理が、対応するV(D)J再構成の相対的頻度を定量するために、観察されたそれぞれのアンプリコンのシグナル強度も統合する請求項23に記載の方法。
- 以下の:
A) 個体からの生体試料を用いてリンパ球計数を行う工程と;
B) 同じ試料又は同じ個体から同時に採取された別の試料を用いて、前記個体のリンパ球のレパートリーの組み合わせ多様性の程度を、請求項1〜24のいずれか1項に記載の方法を行うことにより決定する工程と;
C) 工程A)及びB)で得られたデータを組み合わせる工程と
を含む個体の免疫不全の程度をインビトロで決定するための情報を提供する方法。 - 危険性のレベルを、少なくとも以下の4つのゾーン:
(i) 低い計数(<1000 Ly/μL)及び低いV-J組み合わせ多様性(<40%):高い感染の危険性及び感染による高い死亡の危険性;
(ii) 低い計数(<1000 Ly/μL)、しかし正常なV-J組み合わせ多様性(>65%):低い感染の危険性;
(iii) 正常の計数(1000〜3200 Ly/μL)及び低いV-J組み合わせ多様性(<40%):中程度の感染の危険性;
(iv) 正常の計数(1000〜3200 Ly/μL)及び正常なV-J組み合わせ多様性(>65%):免疫レパートリーは健常である、
に割り当てるグラフの観点から、工程C)で得られた組み合わせを解釈する工程も含む請求項25に記載の方法。 - 工程B)が、前記個体のTリンパ球及びBリンパ球のレパートリーの組み合わせ多様性の程度を決定することを含み、工程C)において、データが、第1軸に免疫グロブリン多様性の程度、第2軸にTCR多様性の程度、第3軸にリンパ球計数を示す3次元グラフにより調べられる請求項25又は26に記載の方法。
- 少なくとも2つの異なるプライマー対を構成する少なくとも3つのプライマーの組み合わせであって、以下の特徴:
(i) それぞれのプライマー対は、ある特定のV若しくはD遺伝子の上流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するプライマーと、ある特定のJ遺伝子の下流及び/又は該遺伝子の中と特異的にハイブリッド形成するプライマーとで構成されているので、2つの別々のV(D)J又はD-J再構成の特徴である少なくとも2つのフラグメントの増幅が可能になり;
(ii) 前記プライマーは熱力学的に併用でき;
(iii) 前記プライマーは、第1プライマー対を用いて増幅されるフラグメントが第2プライマー対を用いて増幅されるフラグメントと区別できるような様式で選択される;
を有するプライマーの組み合わせと、PCRを行うための試薬とを含む請求項1〜27のい
ずれか1項に記載の方法を行うためのキット。 - 前記プライマーの組み合わせが、以下の組み合わせ:
− 配列番号1のプライマーと、配列番号2のプライマーと、配列番号3〜25から選択される少なくとも1つのプライマー;
− 配列番号1のプライマーと、配列番号2のプライマーと、配列番号26及び27から選択されるプライマーと、配列番号28及び29から選択されるプライマー;
− 配列番号30〜41のプライマーと、配列番号42〜61から選択される少なくとも1つのプライマー;
− 配列番号62のプライマーと、配列番号63〜66から選択される少なくとも2つのプライマー;
− 配列番号67のプライマーと、配列番号68のプライマーと、配列番号69〜84から選択される少なくとも1つのプライマー;
− 配列番号85のプライマーと、配列番号86〜91から選択される少なくとも2つのプライマー;並びに
− 配列番号85のプライマーと、配列番号92〜98から選択される少なくとも2つのプライマー;
からなる群から選択される請求項28に記載のキット。 - それぞれのウェルが異なる組み合わせのプライマーを含むマルチウェルプレートを含み、前記マルチウェルプレートが、TRA、TRB、TRG、TRD及びIgH遺伝子座から選択される少なくとも1つの遺伝子座のV-J再構成の少なくとも50%を増幅するために必要なプライマーの組み合わせを全て含む請求項28又は29に記載のキット。
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