CN108456674A - 一种Total RNA提取试剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Total RNA提取试剂及其制备方法，包括以下重量份的原料：三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、异硫氰酸胍、Tween 80、十二烷基肌氨酸钠、β‑巯基乙醇、氯化钠、异硫氰酸胍、氯化镁、糖原、比甲基红、α‑吡咯烷酮、水饱和酚、异丙醇、RNase‑free Water、RNA酶抑制剂和固相RNase清除剂，其制备方法为：备料、制备细胞壁破除试剂、制备RNA提取试剂、混合提纯和存储；本发明的RNA提取试剂中添加了糖原作为核酸沉淀剂，与同类试剂相比，核酸的沉降效率大为提高，对组织样品中含量很低的核酸成分亦能有效分离，使核酸沉降过程短时间内即可完成，免除了‑20℃沉降数小时的过程，大大缩短了操作时间。

Description

一种Total RNA提取试剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及医疗检测试剂成型技术领域，具体为一种Total RNA提取试剂及其制备方法。

背景技术

结直肠癌在我国的发病率高居肿瘤排行榜第五位，其死亡率也一直居高不下，已成为威胁我国公众健康及生命的主要疾病之一，且目前有统计表明，近年来结直肠癌的发病率仍呈逐步升高的趋势，其早、晚期五年生存率存在巨大差距，转移性结直肠癌的五年生存率不足13％，而早期结直肠癌五年生存率可达90％以上，但由于缺乏有效的早期诊断指标和手段，其早期诊断率仍不足结直肠癌诊断的40％，大多数结直肠癌患者入院时已是晚期，错过了最佳治疗的黄金时期。目前结直肠癌的诊断主要依靠结肠镜检查及活体组织病理检查，但由于其花费高并伴随一定的检查痛苦与风险以及由于检查医师技术问题，如肠道准备不全、退镜速度过快等，存在一定漏诊率，难以达到普查要求。现有的Total RNA提取试剂在使用时检测操作繁杂，检测结果准确率不高。

所以，如何设计一种Total RNA提取试剂及其制备方法，成为我们当前要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Total RNA提取试剂及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种Total RNA提取试剂，包括以下重量份的原料：三羟甲基氨基甲烷2.30-3.60份、乙二胺四乙酸1.20-2.20份、异硫氰酸胍0.20-0.30份、Tween 80 0.12-0.34份、十二烷基肌氨酸钠0.45-0.55份、β-巯基乙醇0.11-0.23份、氯化钠0.21-0.25份、异硫氰酸胍2.21-3.10份、氯化镁1.12-1.45份、糖原0.23-0.33份、比甲基红1.00-1.23份、α-吡咯烷酮0.04-0.05份、水饱和酚0.01-0.03份、异丙醇2.34-4.34份、RNase-free Water5.43-6.35份、RNA酶抑制剂0.20-0.30份和固相RNase清除剂0.23-0.34份。

根据上述技术方案，所述三羟甲基氨基甲烷的制备方法为首先将三羟甲基甲烷加入甲醇水溶液中，加热至50-70℃搅拌溶解，其中，三羟甲基甲烷与甲醇水溶液的质量体积比按g/ml计为8:3-7，甲醇水溶液为纯净水和甲醇按照体积比2:3混合配制而成；接着向溶液中加入木炭活性炭，其中，木炭活性炭与三羟甲基甲烷的重量比为0.5-2:100，于45-55℃保温20-40分钟后趁热过滤，收集滤液；再将滤液进行减压浓缩，浓缩温度70-80℃，至出现结晶，放冷静置；最后用抽滤方法将结晶分离后，用无水乙醇淋洗，于40-60℃干燥3-5小时，即得三羟甲基氨基甲烷。

根据上述技术方案，所述乙二胺四乙酸的制备方法为首先获取一氯乙酸置于圆底烧瓶中，加入碳酸钠，直到圆底烧瓶中的液体开始冒出气泡时，加入乙二胺，静置片刻，加入35-45％的氢氧化钠50份，向圆底烧瓶中加入蒸馏水直到液体体积为300ml；接着将圆底烧瓶以及圆底烧瓶中的溶液安装冷却回流装置，对圆底烧瓶中的溶液做分级保温处理，保温结束后取下圆底烧瓶；再将圆底烧瓶取下冷却35-45min，向圆底烧瓶中加入浓盐酸调制pH值为1.2，溶液中出现白色沉淀，获取白色沉淀，白色沉淀为乙二胺四乙酸粗制品；再将获取的白色沉淀置于干净的烧杯中，向烧杯中加入去离子水溶液，搅拌均匀，静置5min，使用过滤筛过滤，保留固体滤物；接着将固体滤物置于干净的烧杯中，加入氢氧化钠溶液，静置二十分钟，加入碳酸钠调节pH值至4-5；最后将烧杯中的反应后溶液冷却1h，冷却后的溶液置于蒸馏塔中蒸馏，制取乙二胺四乙酸二钠结晶，再将乙二胺四乙酸二钠结晶置于去结晶仪器中，去除结晶水，获得乙二胺四乙酸二钠固态粉末。

根据上述技术方案，所述异丙醇的制备方法为在常温、常压下，将乙二胺四乙酸二钠盐加入到工业级异丙醇中，充分搅拌后进入电泳槽中，以3-5V/cm的电压进行正负带电粒子的分离30-60min，然后料液在0.5-1.0MPa的压力，80-150l/h的流速下，分别通过阳、阴离子交换柱进行离子交换，经分子筛、超强吸水树脂柱二级吸附脱水，经微滤器过滤后进入四级精馏塔精馏，控制回流比1.5-2.0，收集82±0.5℃的精馏馏分，在压力0.5-1.0MPa，流速50-150l/h的条件下通过纳滤器过滤，获得目标产物超纯异丙醇。

根据上述技术方案，所述α-吡咯烷酮的制备方法为将N-乙烯基吡咯烷酮生产过程中产生的废渣粉碎，放入釜中加上述废渣重量1-1.2倍的水，在50-60℃下加热搅拌，至固体废渣不再溶解为止，过滤，水溶液蒸馏后得部分α-吡咯烷酮纯品；再将上述过滤后得到的水的不溶物加入其重量0.5-15％的催化剂进行搅拌，加热至100-150℃，生成α-吡咯烷酮粗品；然后对粗品进行减压蒸馏，得到α-吡咯烷酮纯品。

一种Total RNA提取试剂的制备方法，包括如下步骤：

1)备料：按上述原料配方比准备原材料，备用；

2)制备细胞壁破除试剂：将一定量的三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、异硫氰酸胍、Tween 80、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、氯化钠、异硫氰酸胍和足量的水依次加入到离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置5min，取上清液制成细胞壁破除试剂；

3)制备RNA提取试剂：将氯化镁、糖原、比甲基红、α-吡咯烷酮和水饱和酚依次加入到离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置10min，取上清液制成RNA提取试剂；

4)混合提纯：将细胞壁破除试剂、RNA提取试剂和一定量的异丙醇、RNase-freeWater、RNA酶抑制剂和固相RNase清除剂加入到离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置10min，取上清液制成Total RNA提取试剂；

5)存储：将制成的Total RNA提取试剂进行存储。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的RNA提取试剂中添加了糖原作为核酸沉淀剂，与同类试剂相比，核酸的沉降效率大为提高，对组织样品中含量很低的核酸成分亦能有效分离，使核酸沉降过程短时间内即可完成，免除了-20℃沉降数小时的过程，大大缩短了操作时间；该方法快捷、高效，适用样品广泛，克服了传统方法样品选择性强、操作繁琐、效率较低等缺点。

附图说明

图1是本发明的Total RNA提取试剂的成型流程方框图；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：请参阅图1，本发明提供一种Total RNA提取试剂，包括以下重量份的原料：三羟甲基氨基甲烷2.30份、乙二胺四乙酸1.20份、异硫氰酸胍0.20份、Tween 80 0.12份、十二烷基肌氨酸钠0.45份、β-巯基乙醇0.11份、氯化钠0.21份、异硫氰酸胍2.21份、氯化镁1.12份、糖原0.23份、比甲基红1.00份、α-吡咯烷酮0.04份、水饱和酚0.01份、异丙醇2.34份、RNase-free Water5.43份、RNA酶抑制剂0.20份和固相RNase清除剂0.23份。

根据上述技术方案，三羟甲基氨基甲烷的制备方法为首先将三羟甲基甲烷加入甲醇水溶液中，加热至50-70℃搅拌溶解，其中，三羟甲基甲烷与甲醇水溶液的质量体积比按g/ml计为8:3，甲醇水溶液为纯净水和甲醇按照体积比2:3混合配制而成；接着向溶液中加入木炭活性炭，其中，木炭活性炭与三羟甲基甲烷的重量比为0.5:100，于45-55℃保温20-40分钟后趁热过滤，收集滤液；再将滤液进行减压浓缩，浓缩温度70-80℃，至出现结晶，放冷静置；最后用抽滤方法将结晶分离后，用无水乙醇淋洗，于40-60℃干燥3-5小时，即得三羟甲基氨基甲烷。

根据上述技术方案，乙二胺四乙酸的制备方法为首先获取一氯乙酸置于圆底烧瓶中，加入碳酸钠，直到圆底烧瓶中的液体开始冒出气泡时，加入乙二胺，静置片刻，加入35％的氢氧化钠50份，向圆底烧瓶中加入蒸馏水直到液体体积为300ml；接着将圆底烧瓶以及圆底烧瓶中的溶液安装冷却回流装置，对圆底烧瓶中的溶液做分级保温处理，保温结束后取下圆底烧瓶；再将圆底烧瓶取下冷却35-45min，向圆底烧瓶中加入浓盐酸调制pH值为1.2，溶液中出现白色沉淀，获取白色沉淀，白色沉淀为乙二胺四乙酸粗制品；再将获取的白色沉淀置于干净的烧杯中，向烧杯中加入去离子水溶液，搅拌均匀，静置5min，使用过滤筛过滤，保留固体滤物；接着将固体滤物置于干净的烧杯中，加入氢氧化钠溶液，静置二十分钟，加入碳酸钠调节pH值至4-5；最后将烧杯中的反应后溶液冷却1h，冷却后的溶液置于蒸馏塔中蒸馏，制取乙二胺四乙酸二钠结晶，再将乙二胺四乙酸二钠结晶置于去结晶仪器中，去除结晶水，获得乙二胺四乙酸二钠固态粉末。

根据上述技术方案，异丙醇的制备方法为在常温、常压下，将乙二胺四乙酸二钠盐加入到工业级异丙醇中，充分搅拌后进入电泳槽中，以3V/cm的电压进行正负带电粒子的分离30-60min，然后料液在0.5-1.0MPa的压力，80-150l/h的流速下，分别通过阳、阴离子交换柱进行离子交换，经分子筛、超强吸水树脂柱二级吸附脱水，经微滤器过滤后进入四级精馏塔精馏，控制回流比1.5-2.0，收集82±0.5℃的精馏馏分，在压力0.5-1.0MPa，流速50-150l/h的条件下通过纳滤器过滤，获得目标产物超纯异丙醇。

根据上述技术方案，α-吡咯烷酮的制备方法为将N-乙烯基吡咯烷酮生产过程中产生的废渣粉碎，放入釜中加上述废渣重量1-1.2倍的水，在50-60℃下加热搅拌，至固体废渣不再溶解为止，过滤，水溶液蒸馏后得部分α-吡咯烷酮纯品；再将上述过滤后得到的水的不溶物加入其重量0.5％的催化剂进行搅拌，加热至100-150℃，生成α-吡咯烷酮粗品；然后对粗品进行减压蒸馏，得到α-吡咯烷酮纯品。

一种Total RNA提取试剂的制备方法，包括如下步骤：

1)备料：按上述原料配方比准备原材料，备用；

2)制备细胞壁破除试剂：将一定量的三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、异硫氰酸胍、Tween 80、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、氯化钠、异硫氰酸胍和足量的水依次加入到离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置5min，取上清液制成细胞壁破除试剂；

3)制备RNA提取试剂：将氯化镁、糖原、比甲基红、α-吡咯烷酮和水饱和酚依次加入到离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置10min，取上清液制成RNA提取试剂；

4)混合提纯：将细胞壁破除试剂、RNA提取试剂和一定量的异丙醇、RNase-freeWater、RNA酶抑制剂和固相RNase清除剂加入到离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置10min，取上清液制成Total RNA提取试剂；

5)存储：将制成的Total RNA提取试剂进行存储。

实施例2：请参阅图1，本发明提供一种Total RNA提取试剂，包括以下重量份的原料：三羟甲基氨基甲烷3.60份、乙二胺四乙酸2.20份、异硫氰酸胍0.30份、Tween 80 0.34份、十二烷基肌氨酸钠0.55份、β-巯基乙醇0.23份、氯化钠0.25份、异硫氰酸胍3.10份、氯化镁1.45份、糖原0.33份、比甲基红1.23份、α-吡咯烷酮0.05份、水饱和酚0.03份、异丙醇4.34份、RNase-free Water6.35份、RNA酶抑制剂0.30份和固相RNase清除剂0.34份。

根据上述技术方案，三羟甲基氨基甲烷的制备方法为首先将三羟甲基甲烷加入甲醇水溶液中，加热至50-70℃搅拌溶解，其中，三羟甲基甲烷与甲醇水溶液的质量体积比按g/ml计为8:7，甲醇水溶液为纯净水和甲醇按照体积比2:3混合配制而成；接着向溶液中加入木炭活性炭，其中，木炭活性炭与三羟甲基甲烷的重量比为2:100，于45-55℃保温20-40分钟后趁热过滤，收集滤液；再将滤液进行减压浓缩，浓缩温度70-80℃，至出现结晶，放冷静置；最后用抽滤方法将结晶分离后，用无水乙醇淋洗，于40-60℃干燥3-5小时，即得三羟甲基氨基甲烷。

根据上述技术方案，乙二胺四乙酸的制备方法为首先获取一氯乙酸置于圆底烧瓶中，加入碳酸钠，直到圆底烧瓶中的液体开始冒出气泡时，加入乙二胺，静置片刻，加入45％的氢氧化钠50份，向圆底烧瓶中加入蒸馏水直到液体体积为300ml；接着将圆底烧瓶以及圆底烧瓶中的溶液安装冷却回流装置，对圆底烧瓶中的溶液做分级保温处理，保温结束后取下圆底烧瓶；再将圆底烧瓶取下冷却35-45min，向圆底烧瓶中加入浓盐酸调制pH值为1.2，溶液中出现白色沉淀，获取白色沉淀，白色沉淀为乙二胺四乙酸粗制品；再将获取的白色沉淀置于干净的烧杯中，向烧杯中加入去离子水溶液，搅拌均匀，静置5min，使用过滤筛过滤，保留固体滤物；接着将固体滤物置于干净的烧杯中，加入氢氧化钠溶液，静置二十分钟，加入碳酸钠调节pH值至4-5；最后将烧杯中的反应后溶液冷却1h，冷却后的溶液置于蒸馏塔中蒸馏，制取乙二胺四乙酸二钠结晶，再将乙二胺四乙酸二钠结晶置于去结晶仪器中，去除结晶水，获得乙二胺四乙酸二钠固态粉末。

根据上述技术方案，异丙醇的制备方法为在常温、常压下，将乙二胺四乙酸二钠盐加入到工业级异丙醇中，充分搅拌后进入电泳槽中，以5V/cm的电压进行正负带电粒子的分离30-60min，然后料液在0.5-1.0MPa的压力，80-150l/h的流速下，分别通过阳、阴离子交换柱进行离子交换，经分子筛、超强吸水树脂柱二级吸附脱水，经微滤器过滤后进入四级精馏塔精馏，控制回流比1.5-2.0，收集82±0.5℃的精馏馏分，在压力0.5-1.0MPa，流速50-150l/h的条件下通过纳滤器过滤，获得目标产物超纯异丙醇。

根据上述技术方案，α-吡咯烷酮的制备方法为将N-乙烯基吡咯烷酮生产过程中产生的废渣粉碎，放入釜中加上述废渣重量1-1.2倍的水，在50-60℃下加热搅拌，至固体废渣不再溶解为止，过滤，水溶液蒸馏后得部分α-吡咯烷酮纯品；再将上述过滤后得到的水的不溶物加入其重量15％的催化剂进行搅拌，加热至100-150℃，生成α-吡咯烷酮粗品；然后对粗品进行减压蒸馏，得到α-吡咯烷酮纯品。

一种Total RNA提取试剂的制备方法，包括如下步骤：

1)备料：按上述原料配方比准备原材料，备用；

2)制备细胞壁破除试剂：将一定量的三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、异硫氰酸胍、Tween 80、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、氯化钠、异硫氰酸胍和足量的水依次加入到离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置5min，取上清液制成细胞壁破除试剂；

3)制备RNA提取试剂：将氯化镁、糖原、比甲基红、α-吡咯烷酮和水饱和酚依次加入到离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置10min，取上清液制成RNA提取试剂；

4)混合提纯：将细胞壁破除试剂、RNA提取试剂和一定量的异丙醇、RNase-freeWater、RNA酶抑制剂和固相RNase清除剂加入到离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置10min，取上清液制成Total RNA提取试剂；

5)存储：将制成的Total RNA提取试剂进行存储。

基于上述，本发明的优点在于，本发明的RNA提取试剂中添加了糖原作为核酸沉淀剂，与同类试剂相比，核酸的沉降效率大为提高，对组织样品中含量很低的核酸成分亦能有效分离，使核酸沉降过程短时间内即可完成，免除了-20℃沉降数小时的过程，大大缩短了操作时间；该方法快捷、高效，适用样品广泛，克服了传统方法样品选择性强、操作繁琐、效率较低等缺点。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种Total RNA提取试剂，其特征在于：包括以下重量份的原料：三羟甲基氨基甲烷2.30-3.60份、乙二胺四乙酸1.20-2.20份、异硫氰酸胍0.20-0.30份、Tween 80 0.12-0.34份、十二烷基肌氨酸钠0.45-0.55份、β-巯基乙醇0.11-0.23份、氯化钠0.21-0.25份、异硫氰酸胍2.21-3.10份、氯化镁1.12-1.45份、糖原0.23-0.33份、比甲基红1.00-1.23份、α-吡咯烷酮0.04-0.05份、水饱和酚0.01-0.03份、异丙醇2.34-4.34份、RNase-free Water5.43-6.35份、RNA酶抑制剂0.20-0.30份和固相RNase清除剂0.23-0.34份。

2.根据权利要求1的一种Total RNA提取试剂，其特征在于：所述三羟甲基氨基甲烷的制备方法为首先将三羟甲基甲烷加入甲醇水溶液中，加热至50-70℃搅拌溶解，其中，三羟甲基甲烷与甲醇水溶液的质量体积比按g/ml计为8:3-7，甲醇水溶液为纯净水和甲醇按照体积比2:3混合配制而成；接着向溶液中加入木炭活性炭，其中，木炭活性炭与三羟甲基甲烷的重量比为0.5-2:100，于45-55℃保温20-40分钟后趁热过滤，收集滤液；再将滤液进行减压浓缩，浓缩温度70-80℃，至出现结晶，放冷静置；最后用抽滤方法将结晶分离后，用无水乙醇淋洗，于40-60℃干燥3-5小时，即得三羟甲基氨基甲烷。

3.根据权利要求1的一种Total RNA提取试剂，其特征在于：所述乙二胺四乙酸的制备方法为首先获取一氯乙酸置于圆底烧瓶中，加入碳酸钠，直到圆底烧瓶中的液体开始冒出气泡时，加入乙二胺，静置片刻，加入35-45％的氢氧化钠50份，向圆底烧瓶中加入蒸馏水直到液体体积为300ml；接着将圆底烧瓶以及圆底烧瓶中的溶液安装冷却回流装置，对圆底烧瓶中的溶液做分级保温处理，保温结束后取下圆底烧瓶；再将圆底烧瓶取下冷却35-45min，向圆底烧瓶中加入浓盐酸调制pH值为1.2，溶液中出现白色沉淀，获取白色沉淀，白色沉淀为乙二胺四乙酸粗制品；再将获取的白色沉淀置于干净的烧杯中，向烧杯中加入去离子水溶液，搅拌均匀，静置5min，使用过滤筛过滤，保留固体滤物；接着将固体滤物置于干净的烧杯中，加入氢氧化钠溶液，静置二十分钟，加入碳酸钠调节pH值至4-5；最后将烧杯中的反应后溶液冷却1h，冷却后的溶液置于蒸馏塔中蒸馏，制取乙二胺四乙酸二钠结晶，再将乙二胺四乙酸二钠结晶置于去结晶仪器中，去除结晶水，获得乙二胺四乙酸二钠固态粉末。

4.根据权利要求1的一种Total RNA提取试剂，其特征在于：所述异丙醇的制备方法为在常温、常压下，将乙二胺四乙酸二钠盐加入到工业级异丙醇中，充分搅拌后进入电泳槽中，以3-5V/cm的电压进行正负带电粒子的分离30-60min，然后料液在0.5-1.0MPa的压力，80-150l/h的流速下，分别通过阳、阴离子交换柱进行离子交换，经分子筛、超强吸水树脂柱二级吸附脱水，经微滤器过滤后进入四级精馏塔精馏，控制回流比1.5-2.0，收集82±0.5℃的精馏馏分，在压力0.5-1.0MPa，流速50-150l/h的条件下通过纳滤器过滤，获得目标产物超纯异丙醇。

5.根据权利要求1的一种Total RNA提取试剂，其特征在于：所述α-吡咯烷酮的制备方法为将N-乙烯基吡咯烷酮生产过程中产生的废渣粉碎，放入釜中加上述废渣重量1-1.2倍的水，在50-60℃下加热搅拌，至固体废渣不再溶解为止，过滤，水溶液蒸馏后得部分α-吡咯烷酮纯品；再将上述过滤后得到的水的不溶物加入其重量0.5-15％的催化剂进行搅拌，加热至100-150℃，生成α-吡咯烷酮粗品；然后对粗品进行减压蒸馏，得到α-吡咯烷酮纯品。

6.一种Total RNA提取试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)备料：按上述原料配方比准备原材料，备用；

2)制备细胞壁破除试剂：将一定量的三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、异硫氰酸胍、Tween 80、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、氯化钠、异硫氰酸胍和足量的水依次加入到离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置5min，取上清液制成细胞壁破除试剂；

3)制备RNA提取试剂：将氯化镁、糖原、比甲基红、α-吡咯烷酮和水饱和酚依次加入到离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置10min，取上清液制成RNA提取试剂；

4)混合提纯：将细胞壁破除试剂、RNA提取试剂和一定量的异丙醇、RNase-free Water、RNA酶抑制剂和固相RNase清除剂加入到离心管中剧烈震荡，样品匀浆后在室温下放置10min，取上清液制成Total RNA提取试剂；

5)存储：将制成的Total RNA提取试剂进行存储。