CN105713978A - 进境百合种球百合无症病毒核酸探针杂交快速检测方法 - Google Patents

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CN105713978A CN201610207499.2A CN201610207499A CN105713978A CN 105713978 A CN105713978 A CN 105713978A CN 201610207499 A CN201610207499 A CN 201610207499A CN 105713978 A CN105713978 A CN 105713978A
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杨志方
吴颖儿
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本发明公开了一种进境百合种球百合无症病毒核酸探针杂交快速检测方法，其特征在于包括：A、百合总RNA的提取；B、RNA检测；C、RT?PCR扩增步骤；D、RT反转录；E、PCR扩增；F、电泳分析。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，进境百合种球百合无症病毒核酸探针杂交快速检测方法。

Description

进境百合种球百合无症病毒核酸探针杂交快速检测方法
技术领域
本发明涉及一种进境百合种球百合无症病毒核酸探针杂交快速检测方法，属于生物技术领域。
背景技术
植物病毒既是我国进出境植物检疫的难点，也是重点，是植物检疫的核心内容，从某种意义上说，植物病毒的检测水平体现了一个国家植物检疫的整体水平。尤其在我国国门日益开放的今天，国际交往日趋频繁，从国外引进种子、苗木、花卉等繁殖材料也越来越多，随之带入的病毒的机率也就越来越大，对我国农业生产的危害性风险也就越来越高。因此，切实加强进境植物病毒的检疫，特别是对象种子、苗木、花卉等繁殖材料的检测，将危险性病毒拒之于国门之外，是从根本上保障我国农业和国民经济健康和可持续发展的最有效的措施，也是我们每一个植检人员的神圣职责。迄今为止，全世界共发现植物病毒909种，它们包括DNA病毒和RNA病毒二类，其中DNA病毒有141种，约占15％，而RNA病毒有768种，近占85％，而我国目前仅报道100余种。根据最新颁布的《中华人民共和国进境植物检疫危险性有害生物名录》之规定，我国对外公布的危险性病毒及类病毒共有39种，其中病毒类32种，类病毒7种。
广东地处我国的南方开放地区,地理环境优越,每年经过广东辖区口岸的进出境种子,花卉,苗木等容易携带病毒的材料约占我国总数量的一半,特别是每年百合类种球进口数量数以百万计,由于进出境批次多,数量庞大,根本不可能每个种球都检测得到,而且要求病毒检测的时间短,灵敏度要高,加上专业人才又少,致使病毒的检测工作难度巨大,一般的检测方法难免顾此失彼,急需研究出即能保证一定的检测数量,又能够检测速度快,而且灵敏度要高,成本也不太昂贵的检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种快速、简便、高效、准确性高、特异性强、灵敏性高，进境百合种球百合无症病毒核酸探针杂交快速检测方法。
为了达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种进境百合种球百合无症病毒核酸探针杂交快速检测方法,其特征在于包括：
A、百合总RNA的提取：
取1克百合样品于研钵中，加入液氮，迅速研成均匀的粉末；
将粉末全部移至冰上预冷的离心管，向离心管中加入4ml异硫氰酸胍溶液，轻轻摇晃离心管使混合均匀；
按顺序加入2M pH4.0的NaAc 400ul，pH4.5的水饱和酚2ml、氯仿/异戊醇＝49：1的混合液2ml,轻轻摇晃均匀，最后将离心管颠倒几次混合均匀；冰浴15min；4℃离心，13000rpm 20min；将上清转移至另一离心管中；然后加入等体积预冷的异丙醇，混匀后-20℃沉淀2小时；4℃，13000rpm离心25min，小心去除上清，沉淀溶于600ul异硫氰酸胍溶液中，再加600ul异丙醇，混匀-20℃沉淀1小时；4℃，13000rpm 20min；弃上清，沉淀用70％预冷的乙醇洗一遍，稍微晾干后溶于80-120ul DEPC处理过的双蒸水中，检测后分装，-70℃保存；
B、RNA检测：
4ul RNA+1ml ddw装入石英杯，测260nm和280nm OD值
RNA的含量是:OD×10ug/ul
260/280≥2则RNA纯，如果<1.6则有杂质，再用酚仿抽提，乙醇沉淀。
C、RT-PCR扩增步骤：
RT-PCR检测步骤：由于这个病毒的基因组是RNA，所以要采用RT-PCR方法进行检测：
D、RT反转录：
在0.5ml灭菌离心管中加入：
总RNA 1μg
Oligo dT 6 0.5μg
灭菌双蒸水至 11ul
混匀后置于70℃5分钟然后在冰上冷却后再加入：
E、PCR扩增：
在0.5ml无菌薄壁离心管中加入：
其中所述上游引物LSV-P11:5’-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’
下游引物LSV-P22:5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’
充分混匀后离心10sec,反应条件：94℃预变性3min,冷却至延伸温度72℃时加入2.5u Taq酶，然后按照94℃1min,退火温度47℃或52℃1min,72℃2min,循环35次，最后72℃延伸10min，4℃保存反应产物，以健康植株总核酸和无菌水为阴性对照，其中LSV的退火温度：47℃；ArMV的退火温度：52℃反应完毕后，取2ul反应液在0.8％agrose胶上电泳分析。
如上所述的进境百合种球百合无症病毒核酸探针杂交快速检测方法,其特征在于步骤A中所述的异硫氰酸胍变性液的按以下方法配制：
异硫氰酸胍 2.363g
1M柠檬酸钠 125μl
10％十二烷基肌氨酸钠 250μl
将上述组分溶于用DEPC处理过的双蒸水中并定容至5ml,4℃保存,使用前加入2-ME 35ul。
如上所述的进境百合种球百合无症病毒核酸探针杂交快速检测方法,其特征在于所述RT-PCR结果琼脂糖电泳分析具体包括：
用1×TAE缓冲液和琼脂糖按1.5％的浓度配好，在微波炉中熔化均匀，冷却至50-60℃；加入GREEN I核酸染料或溴化乙锭1μg/mL,混合均匀，倒入凝胶平台上，插上样品梳；待凝胶凝固后，拔出梳子，加入适量的TAE缓冲液，缓冲液没过凝胶上表面1mm；取1μL加样缓冲液与5μL PCR反应液混合均匀，然后分别将其和合适的DNA分子量标准物加入样品孔中；接通电源进行电泳，电压5V/cm；当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，停止电泳，将整个胶置于凝胶成像系统中观察，并照像记录，并对产物进行回收，进行序列测定。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述：
实施例1
一.材料
1.样品：
从进境的百合种球中截获的含有百合无症病毒的合种球样品，保存于-20℃冰箱中；
2.主要仪器：
台式离心机，普通电泳仪，普通PCR仪，杂交仪等；
3.试剂：
普通PCR使用TAKARA公司生产的(Master Mix)，dNTPs，RNase抑制剂,M-MLV反转录酶,，MgCl2,Taq聚合酶,pGEM-T Easy克隆载体,广州普博生物技术公司PCR片段回收试剂盒、琼脂糖、GREEN I核酸染料、DNA分子量标准物、异硫氰酸胍、柠檬酸钠、十二烷基肌氨酸钠、pGEM-T-载体、地高辛标记试剂盒等；
4. RT-PCR引物的设计
根据LSV保守序列设计二对特异性引物：
LSV-1:5'-GAY GAR YTY TTY AAR ATG AAR GT-3'
LSV-2:5'-ARY TGY TTR TGY GCR TTR TG-3'(R＝A+G；Y＝C+T)
扩增片段大小为483bp.
LSV-P11:5’-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’
LSV-P22:5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’
扩增片段大小为297bp
二、检测方法
1.百合总RNA的提取：
A：异硫氰酸胍变性液的配制：异硫氰酸胍 2.363g
1M柠檬酸钠 125μl
10％十二烷基肌氨酸钠 250μl
溶于用DEPC处理过的双蒸水中并定容至5ml,4℃保存,使用前加入2-ME 35ul。
B：百合总RNA的提取
取一克百合样品于研钵中，加入液氮，迅速研成均匀的粉末；
将粉末全部移至冰上预冷的离心管，向离心管中加入4ml异硫氰酸胍溶液，轻轻摇晃离心管使混合均匀；
按顺序加入2M NaAc(pH4.0)400ul，水饱和酚(pH4.5)2ml、氯仿/异戊醇(49：1)2ml,轻轻摇晃均匀，最后将离心管颠倒几次混合均匀；
冰浴15min；4℃离心，13000rpm 20min；将上清转移至另一离心管中；然后加入等体积预冷的异丙醇，混匀后-20℃沉淀2小时；4℃，13000rpm离心25min，小心去除上清，沉淀溶于600ul异硫氰酸胍溶液中，再加600ul异丙醇，混匀-20℃沉淀1小时；4℃，13000rpm20min；弃上清，沉淀用70％预冷的乙醇洗一遍，稍微晾干后溶于适量体积(约100ul)DEPC处理过的双蒸水中，检测后分装，-70℃保存。RNA检测：
4ulRNA+1ml ddw(DEPC)装入石英杯，测260nm和280nm OD值
RNA的含量是:OD×10ug/ul
260/280≥2则RNA纯，如果<1.6则有杂质，再用酚仿抽提，乙醇沉淀。
2. RT-PCR扩增步骤：
RT-PCR检测步骤：由于这个病毒的基因组是RNA，所以要采用RT-PCR方法进行检测：
2.1 RT反转录：
在0.5ml灭菌离心管中加入：
总RNA 1μg
Oligo(dT)6 0.5μg
灭菌双蒸水至 11ul
混匀后置于70℃5分钟然后在冰上冷却后再加入：
2.2 PCR扩增：
在0.5ml无菌薄壁离心管中加入：
反应条件：94℃预变性3min,冷却至延伸温度72℃时加入2.5u Taq酶，然后按照94℃1min,退火温度℃1min,72℃2min,循环35次，最后72℃延伸10min。4℃保存反应产物，以健康植株总核酸和无菌水为阴性对照。
(其中LSV的退火温度：47℃；ArMV的退火温度：52℃)
反应完毕后，取2ul反应液在0.8％agrose胶上电泳。
3. RT-PCR结果琼脂糖电泳分析：
3.1用1×TAE缓冲液和琼脂糖按1.5％的浓度配好，在微波炉中熔化均匀，冷却至55℃左右；
3.2加入GREEN I核酸染料或溴化乙锭(1μg/mL),混合均匀，倒入凝胶平台上，插上样品梳；
3.3待凝胶凝固后，拔出梳子，加入适量的TAE缓冲液(缓冲液没过凝胶上表面约1mm)；
3.4取1μL加样缓冲液与5μL PCR反应液混合均匀，然后分别将其和合适的DNA分子量标准物加入样品孔中；
3.5接通电源进行电泳，电压5V/cm；
3.6当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，停止电泳。将整个胶置于凝胶成像系统中观察，并照像记录。并对产物进行回收，送大连宝生物公司进行序列测定。
4. PCR片段回收与克隆测序
按照广州普博生物技术有限公司PCR片段回收试剂盒说明书操作进行。即琼脂糖切胶回收DNA片段,然后按照pGEM-T克隆载体克隆的要求进行克隆,经过酶切验证后送大连宝生物公司进行序列测定.具体主要过程是：
4.1 PCR扩增片段的回收。
采用低熔点琼脂糖回收DNA片段：
制备1％低熔点琼脂糖凝胶→将扩增样品与Loading buffer混合后上样→EB染色，切下目的条带装入1.5ml离心管中→加入3倍体积TE(pH8.0),65℃保温至胶块完全熔化→加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提→12000rpm 5min→将上层水相移至一新离心管中→加入1/10V 3M NaAC(pH5.2)和2V的无水乙醇→-20℃沉淀8小时→12,000rpm 10min→70％乙醇洗涤沉淀→真空干燥沉淀→溶于适量的TE(pH8.0)中备用。
4.2基因的克隆
A.感受态细胞的制备：采用上海生工生物公司推荐的方法操作：取-20℃保存的大肠杆菌JM109菌株→LB平板划线，37℃培养12小时→挑取单个菌落接种于50ml LB液体培养基中,37℃摇培12小时→取该细菌培养物，以1/100的比例接种LB液体培养基，37℃摇培2-2.5小时(OD600＝0.6～0.7)→将菌液冰浴30min→取50mL菌液4℃4000rpm离心5min→弃上清，加入1ml感受态细胞缓冲液：SSCS溶液悬浮菌体→在冰浴上分装或50ul小包装→-70℃冻存或立即使用。
B.与pGEM-T Easy载体连接：按pGEM-T试剂盒操作说明进行：
C.细菌的转化：采用热击法进行:取新制的感受态细胞50ul，加入T载体连接物4ul混匀，冰浴30min,42℃ 2min,立即置于冰上，加入950ul LB液体培养基，37℃水浴60min，然后取200ul涂Amp(50ug/ml)LB平板(800ug X-gal,800ug IPTG)，37℃培养16小时，挑选白色菌落进行鉴定。
D.重组质粒的鉴定：采用碱法提取的方法进行：
溶液的配制：
溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH8.0)；10mM EDTA(pH8.0)高压灭菌后于4℃备用；
溶液II:0.2M NaOH,1％SDS,现配现用；
溶液III:5M KAC 60ml,HAc 11.5ml,H2O 28.5ml.
LB培养液：胰蛋白冻10g,酵母提取物5g,NaCl 10g,加水定容至1升，高压灭菌；
TE(pH8.0):10mM Tris-HCl(pH8.0),1mM EDTA(pH 8.0)
E.重组质粒的提取:采用碱法少量提取质粒DNA：
挑白色单菌落接种于含相应抗生素的2mlLB培养液中，37℃振荡(250rpm)培养过夜；
取1.5ml培养物4℃离心30sec(12000rpm)；
弃去上清，将离心管倒立于纸巾上，使细菌沉淀尽可能干燥；
将细菌沉淀重新悬浮于100ul冰预冷的溶液I中，振荡混匀；
加入200ul新配制的溶液II，颠倒混匀，冰浴3-5min；
加入150ul冰预冷的溶液III，颠倒混匀，冰浴5min；
4℃，12000rpm离心5min，转移上清至一个新的离心管中；
加RNase(终浓度至20ug/ml)，37℃，30min；
用等体积的酚/仿、氯仿各抽提一次；
加入2倍体积的无水乙醇，混匀，静置5min；
4℃，12000rpm,离心5min，弃去上清；
用70％的乙醇洗涤DNA沉淀，室温干燥；
加入50ulTE溶解质粒DNA，于-20℃保存备用。
F.质粒的鉴定
反应条件：94℃预变性3min后94℃1min,退火温度1min,72℃2min35次循环后，再72℃延伸10min,取2ul反应物电泳检测。
2)酶切鉴定:
同时用双酶(XbaI+BamHI)对提取的质粒进行酶切鉴定：
混匀后37℃酶切2小时，然后取5ul酶切反应物电泳检查。
4.3基因序列的测定及分析
从重组质粒SP6及T7启动子两端同时对基因进行序列测定，序列测定由大连宝生物公司完成。
5.特异性探针制备、特异性和敏感性确认及样品检测
DIG标记探针的制备、斑点杂交和印迹杂交根据PCR DIG Probe Synthesis Kit说明书进行。具体cDNA DIG标记探针制备过程是：
50μL反应体系为:质粒模板1.8μL,10×Taq缓冲液5μL,引物各50pmol,dNTP3μL,所用dNTP中含0.7mmol/LDIG-11-dUTP,1.3mmol/L dTTP,其它dNTP浓度为2mmol/L,Taq DNA聚合酶混合液0.5μL,ddH2O加到总量为50μL,热循环反应条件:94℃预变性5min,94℃变性10s,退火30s,72℃延伸1min,共35个循环,72℃延伸10min。
DIG标记探针的杂交和显色:先将HybondN+膜在10×SSC溶液中浸泡20min,凉干后点样,用紫外交联仪UVC 500UV交联仪照射3.3min,使病毒RNA固定在尼龙膜上,接着在杂交炉中用杂交液在48℃条件下预杂交30min,将变性的探针按25ng/mL(即先将标记好的探针在100℃水浴加热5min，然后用零度的冰水迅速冷却5min)加入到预杂交液中,杂交瓶匀速转动8h或过夜。用2×SSC,0.1％SDS在室温下洗膜2次,每次5min,再用0.5×SSC,0.1％SDS65℃洗膜2次,每次15min。在洗涤液(0.1mol/L马来酸、0.15mol/L NaCl、0.3％(V/V)吐温,pH 7.5)中洗膜5min,用封闭液(1％封闭剂、0.1mol/L马来酸、0.15mol/L NaCl,pH 7.5)封闭30min,在封闭液稀释5000倍的抗地高辛抗体-碱性磷酸酶复合物中常温下反应30min,用NBT/BCIP染色后照相记录结果。
敏感性和特异性测定：病毒斑点杂交的敏感性和特异性测定进行敏感性测定时,将总RNA初始浓度调至1 000ng/μL,再按照1/2、1/4、1/8、1/16、1/32和1/64比例进行稀释。用健康叶片提取的总RNA作阴性对照,样品的总RNA在100℃水浴加热5min,立即放到冰上冷却5min使核酸变性,然后点样。
样品检测方法：用印迹杂交检测这二种病毒时,先用锋利的刀片将样品横切后直接将切面用力挤压到尼龙膜上,挤压点要小，每个样品重复3次。
三.结果分析
1.提取的百合总核酸
采用异硫氰酸胍法提取商陆幼叶的总RNA。电泳结果显示,28S,18S rRNA完整，表明RNA完整性良好，未发生降解，紫外分析表明OD260/OD280＝0.444/0.215＝2.07,OD260/OD230＝0.444/0.203＝2.18,表明不存在蛋白、多糖、异硫氰酸胍盐及酚类的污染，所获得的RNA的纯度与质量符合实验要求。
2.百合无症病毒LSV RT-PCR扩增结果483bp
以百合幼叶片的总RNA为模板，通过二对特异性引物，扩增百合无症病毒LSV基因片段，电泳结果表明，扩增片段与预期一致，表明所设计的引物特异性强。
4.重组质粒的鉴定
将回收的病毒的PCR扩增片段与pGEM-T载体连接后，然后转化JM109，挑选白色菌落提取质粒进行双酶切鉴定，电泳结果显示，双酶切下的片段与PCR扩增的片段大小一致，用重组质粒做模板进行PCR鉴定也得到同样结果(结果未显示)。
测序结果表明,LSV长的扩增片段为483bp,序列比对结果表明正是LSV的特异性基因片段，序列结果如下(483bp)：
5’-GATGAGTTCTTTAAGATGAAAGTTGGCGTCGTATCTAACAACATGGCAACCACTGAACAAATGGCCAAGATAGCGTCAGACATCGCAGGGCTTGGGGTACCAACGGAGCACGTCGCGTCAGTAATATTGCAAATGGTCATCATGTGTGCTTGCGTGAGCAGTTCTGCGTTCCTTGACCCTGAGGGCAGCATTGAGTTTGAGAATGGAGCGGTGCCCGTCGACTCCATCACTGCGATCATGAAGAAGCACGCTGGACTGCGGAAAGTCTGCCGGCTCTATGCCCCTATCGTGTGGAACAGCATGCTTGTGCGAAATCAACCAGCCAGCTGATTGGCAAGCTATGGGCTTCCAATACAACACGCGGTTCGCAGCTTTTGACACCTTCGACTACGTGACTAACCAGGCGGCTATCCAACCTGTCGAGGGGATCATCAGGCGACCCACTTCTGCTGAGGTCATTGCTCACAACGCACACAAACAACT-3’
5.特异性探针制备及检测结果:
从斑点杂交检测病毒的特异性和敏感性分析可知,LSV探针只与LSV病毒发生杂交反应，不与健康植物的对照发生反应，说明制备的这个病毒的探针具有特异性，所示；
敏感性杂交结果表明,在百合样品总RNA稀释到64倍时(相当于15ng/uL)LSV探针只能与稀释16倍的样品(相当于60ng/uL)发生可见的杂交反应，在样品被稀释到32倍时(相当于30ng/uL)则反应非常微弱。
样品检测结果表明，探针都能够快速正确灵敏地检测进境百合的种球。

Claims (3)

1.一种进境百合种球百合无症病毒核酸探针杂交快速检测方法,其特征在于包括：
A、百合总RNA的提取：
取1克百合样品于研钵中，加入液氮，迅速研成均匀的粉末；
将粉末全部移至冰上预冷的离心管，向离心管中加入4ml异硫氰酸胍溶液，轻轻摇晃离心管使混合均匀；
按顺序加入2M pH4.0的NaAc 400ul，pH4.5的水饱和酚2ml、氯仿/异戊醇＝49：1的混合液2ml,轻轻摇晃均匀，最后将离心管颠倒几次混合均匀；冰浴15min；4℃离心，13000rpm20min；将上清转移至另一离心管中；然后加入等体积预冷的异丙醇，混匀后-20℃沉淀2小时；4℃，13000rpm离心25min，小心去除上清，沉淀溶于600ul异硫氰酸胍溶液中，再加600ul异丙醇，混匀-20℃沉淀1小时；4℃，13000rpm 20min；弃上清，沉淀用70％预冷的乙醇洗一遍，稍微晾干后溶于80-120ul DEPC处理过的双蒸水中，检测后分装，-70℃保存；
B、RNA检测：
4ul RNA+1ml ddw装入石英杯，测260nm和280nm OD值
RNA的含量是:OD×10ug/ul
260/280≥2则RNA纯，如果<1.6则有杂质，再用酚仿抽提，乙醇沉淀。
C、RT-PCR扩增步骤：
RT-PCR检测步骤：由于这个病毒的基因组是RNA，所以要采用RT-PCR方法进行检测：
D、RT反转录：
在0.5ml灭菌离心管中加入：
总RNA 1μg
Oligo dT 6 0.5μg
灭菌双蒸水至 11ul
混匀后置于70℃5分钟然后在冰上冷却后再加入：
37℃ 孵育5分钟
加入40uM--MuLV
37℃孵育60分钟，70℃10分钟终止反应并置于4℃备用；
E、PCR扩增：
在0.5ml 无菌薄壁离心管中加入：
其中所述上游引物LSV-P11:5’-AAGATGAAAGTTGGCGTCGT-3’
下游引物LSV-P22:5’-CACAAGCATGCTGTTCCACA-3’
充分混匀后离心10sec,反应条件：94℃预变性3min,冷却至延伸温度72℃时加入2.5uTaq酶，然后按照94℃1min,退火温度47℃或52℃1min,72℃2min,循环35次，最后72℃延伸10min，4℃保存反应产物，以健康植株总核酸和无菌水为阴性对照，其中LSV的退火温度：47℃；ArMV的退火温度：52℃反应完毕后，取2ul反应液在0.8％agrose胶上电泳分析。
2.根据权利要求1所述的进境百合种球百合无症病毒核酸探针杂交快速检测方法,其特征在于步骤A中所述的异硫氰酸胍变性液的按以下方法配制：
异硫氰酸胍 2.363g
1M柠檬酸钠 125μl
10％十二烷基肌氨酸钠 250μl
将上述组分溶于用DEPC处理过的双蒸水中并定容至5ml,4℃保存,使用前加入2-ME35ul。
3.根据权利要求1所述的进境百合种球百合无症病毒核酸探针杂交快速检测方法,其特征在于所述RT-PCR结果琼脂糖电泳分析具体包括：
用1×TAE缓冲液和琼脂糖按1.5％的浓度配好，在微波炉中熔化均匀，冷却至50-60℃；加入GREEN I核酸染料或溴化乙锭1μg/mL,混合均匀，倒入凝胶平台上，插上样品梳；待凝胶凝固后，拔出梳子，加入适量的TAE缓冲液，缓冲液没过凝胶上表面1mm；取1μL加样缓冲液与5μL PCR反应液混合均匀，然后分别将其和合适的DNA分子量标准物加入样品孔中；接通电源进行电泳，电压5V/cm；当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，停止电泳，将整个胶置于凝胶成像系统中观察，并照像记录，并对产物进行回收，进行序列测定。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116479185A (zh) * 2023-05-16 2023-07-25 南昌师范学院 一种RT-qPCR检测百合无症状病毒的方法

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