CN109022606A - 一种百香果品种鉴定专用引物及其品种鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种百香果品种鉴定专用引物及其品种检测方法，该百香果品种鉴定专用引物，为PE18引物对，其具体引物序列为：PE18 F：5′～GGGCATCGCAGAGTAACAG～3′，PE18 R：5′～GCCGTCCCATACCCAAGT～3′。本发明设计了27对在百香果中稳定扩增的引物，利用其中1对引物成功的构建了4个百香果品种指纹图谱，可快速、准确区分各百香果品种，可直接应用于百香果品种的分子鉴定，具有很好的实用性。

Description

一种百香果品种鉴定专用引物及其品种鉴定方法

技术领域

本发明属于植物新品种鉴定技术领域，涉及一种百香果品种鉴定专用引物及其品种鉴定方法。

背景技术

百香果属于西番莲科西番莲属草质或半木质常绿藤本植物，花朵鲜艳优美，果汁风味独特、芳香怡人，又称激情果、番石榴、巴西果等，原产南美洲巴西至阿根廷一带。目前作为国内水果市场的“新宠”，其商业化品种主要有紫果、黄果、黄果与紫果杂交品种等3大类。

20世纪80年代前后，四川、广东、广西、贵州、云南、海南等地开始大量引种百香果，在引种过程中由于栽培者的随意命名导致同物异名、同名异物现象严重。通常品种鉴定的主要依据是表型特征，但表型性状易受环境影响，为品种鉴别带来一定难度。分子标记可以直接检测不同品种或个体在DNA分子水平上的差异，具有较高的多态性和个体特异性，且不受环境和生长阶段影响，能鉴定形态标记所难以鉴定的个体。目前，还没有百香果的分子鉴定方法。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种百香果品种鉴定专用引物，克服以往形态鉴定方法存在的缺陷，提供准确、可靠、便捷、灵敏度高的分子检测和诊断方法。本发明的另一目的是提供一种百香果品种鉴定方法，可以直接应用于生产实践，对于百香果种苗的鉴定具有十分重要的意义。

技术方案：为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种百香果品种鉴定专用引物，为PE18引物对，其具体引物序列如下：

PE18 F：5′～GGGCATCGCAGAGTAACAG～3′，

PE18 R：5′～GCCGTCCCATACCCAAGT～3′。

所述的百香果品种鉴定专用引物，百香果品种为4种，分别为：平塘1号、紫香、黄金果和满天星。

应用所述的百香果品种鉴定专用引物构建获得的百香果品种指纹代码。

所获得的4个百香果品种对应指纹代码分别为：平塘1号：指纹代码1BB；紫香：指纹代码1AB；黄金果：指纹代码1CC；满天星：指纹代码1AA。

应用所述百香果品种鉴定专用引物快速鉴定百香果品种的方法，包括以下步骤：

1)待测样品DNA提取；

2)使用PE18引物对，以提取的DNA为模板，进行PCR扩增；

3)PCR产物则利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法进行检测，依据扩增产物的有无和大小进行判读，对照品种指纹代码，鉴定出待测样品的品种。

步骤1)中，利用天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒完成待测样品DNA提取。

步骤2)中，10μL PCR扩增反应体系包括：1×Buffer；0.25mM dNTP；1mM MgCl₂；0.3μM PE18引物；0.6U Taq DNA聚合酶和15ng DNA模板。

步骤2)中，PCR反应程序为：预变性94℃5min；30循环，94℃30s，58℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最终4℃保存。

所述的快速鉴定百香果品种的方法，百香果品种共计为4个，分别为：平塘1号、紫香、黄金果、满天星。

所述的应用引物快速鉴定百香果品种的方法，4个百香果品种对应指纹代码分别为：平塘1号：指纹代码1BB；紫香：指纹代码1AB；黄金果：指纹代码1CC；满天星：指纹代码1AA。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下的技术优势：

1)结果高度准确、可靠：利用本发明对百香果4个品种进行检测与鉴定，检测结果100％准确，为检测结果提供了高度的可靠性。

2)操作简便快速：本方法对样本进行简单处理、PCR扩增和常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳后即可以判断结果。一般整个检测过程可在6个小时内完成。

3)取材方便、经济效益明显：本方法采样方便，叶片、芽、花等组织或器官均可为实验材料，幼苗、大苗及多年生植株均可取样，不受季节、地点限制。

4)通过对百香果种苗进行分子鉴定可以避免种苗生产与销售过程中出现鱼龙混杂的现象，对于百香果不同品种的引种、生产与销售具有十分重要的经济效益。

附图说明

图1是PE18引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为平塘1号、紫香、黄金果、紫香、满天星；

图2是PE1引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为平塘1号、紫香、黄金果、紫香、满天星；

图3是PE2引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为平塘1号、紫香、黄金果、紫香、满天星；

图4是PE32引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为平塘1号、紫香、黄金果、紫香、满天星。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

采用Illumina HiSeq 2500高通量测序平台，分别对百香果不同组织器官的RNA进行测序得到百香果转录组序列，利用MISA软件对所得序列进行短串联重复序列位点的寻找，利用Primer 5.0软件进行引物设计。最后成功设计17059对引物，随机合成50对引物，有27对可以稳定扩增。利用27对引物对4个百香果品种材料进行PCR扩增，最终选择1对多态性好、重复性高的引物作为百香果品种鉴定专用引物，命名为PE18，其最佳退火温度Tm为58℃，引物序列如下：

PE18 F：5′～GGGCATCGCAGAGTAACAG～3′，

PE18 R：5′～GCCGTCCCATACCCAAGT～3′。

实施例2

应用实施例1的百香果品种鉴定专用引物组合构建百香果品种指纹代码，简要构建过程如下：

1)PCR扩增及产物检测：利用实施例1筛选出的PE18引物对4个西番莲品种进行PCR扩增。所得产物利用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法进行检测。10μL反应体系中包括：1×Buffer；0.25mM dNTP；1mM MgCl2；0.3μM genic-STR引物；0.6U Taq DNA聚合酶和15ng DNA模板。PCR反应程序为：预变性94℃5min；30循环，94℃30s，最佳Tm 58℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最终4℃保存。

2)数据处理：聚丙烯酰胺凝胶电泳结果读取采用大写英文字母表示，同一对引物而言，对不同模版的扩增产物会因其片段大小的不同而在电泳过程中表现为迁移速度的不同，在相同时间内，移动到同一位置的若干条带便认为是同一个等位基因。依据条带大小从大到小依次用字母A、B、C、D等表示。

图1是PE18引物利用相同模板进行扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图，各泳道从左往右依次分别为平塘1号、紫香、黄金果，紫香、满天星。根据凝胶电泳图中短串联重复序列分型结果，对所有基因型进行判读，并转换成指纹代码。所构建4个百香果品种指纹代码如表1所示。

表1百香果4个品种对应指纹代码

品种名称	指纹代码
		平塘1号	1BB
紫香	1AB
		黄金果	1CC
满天星	1AA

注：代码中相同字母代表同一等位基因类型。

实施例3

应用实施例1百香果品种鉴定专用引物快速鉴定百香果品种的方法，包括以下步骤：

1)DNA提取：利用天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒(DP305)完成。

2)按照如下的PCR反应体系和反应程序据PE18引物进行PCR扩增。

10gL反应体系包括1×Buffer；0.25mM dNTP；1mm MgCl2；0.3μM genic-STR引物；0.6U Taq DNA聚合酶和15ng DNA模板；

PCR反应程序为：预变性94℃5min；30循环，94℃30s，最佳Tm58℃30s，72℃30s；延伸72℃3m，最终4℃保存；所用PCR仪APPLIED BIOSYSTEMS GeneAmp PCR system 9700。

3)对PCR产物加5μL溴酚蓝缓冲液，上样量为1μL，进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳(500mL 8％丙烯酰胺含尿素210g，甲叉1g，丙烯酰胺39g，10×TBE 50ml)，120V电压下电泳120min，所用电泳仪为北京六一仪器厂生产的DYCZ-30A型垂直电泳仪。

4)电泳完成后进行固定染色，固定10min(固定液10％乙醇，0.5％乙酸)，ddH2O漂洗2次每次2min；再用0.15％硝酸银染色7min，ddH2O漂洗2次每次2min，最后显影(1.5％氢氧化钠，0.00756％四硼酸钠，1％甲醛)至条带清晰，然后对扩增产物进行大小判断，并拍照记录。

5)根据不同样品在凝胶电泳图上呈现出的结果，转制成指纹代码，用于后续鉴定。

采用上述方法，选择8个百香果样品(4个已知品种和4个疑似品种)，进行鉴定验证，具体鉴定结果如表2所示。

表2 8个百香果样品鉴定结果

样品	指纹代码	鉴定结果
			平塘1号	1BB	平塘1号
紫香	1AB	紫香
			黄金果	1CC	黄金果
满天星	1AA	满天星
			待测样品1	1BB	平塘1号
待测样品2	1BB	平塘1号
			待测样品3	1AB	紫香
待测样品4	1BB	平塘1号

可见，本发明中的引物可准确区分平塘1号、紫香、黄金果和满天星四个品种。

实施例4

从实施例1中开发的多态性良好，条带清晰的27条引物中随机挑出3对引物(PE18除外)，具体引物信息如表3所示，对11个品种进行鉴定，鉴定方法同实施例3。

表3挑选的3对引物信息

鉴定结果如图2-4和表4所示，其中，图2是PE 1引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为平塘1号、紫香、黄金果、紫香、满天星；图3是PE2引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为平塘1号、紫香、黄金果、紫香、满天星；图4是PE32号引物扩增所得产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳图；图中，各泳道从左往右依次分别为平塘1号、紫香、黄金果、紫香、满天星。选取的3对引物无法将各品种区分开来，无法完成鉴定工作。

表4利用随机挑选的3对引物对4个品种的鉴定结果

品种名称	PE 1	PE 2	PE 32
				平塘1号	AA	AA	AA
紫香	AB	AA	AB
				黄金果	BB	BB	AB
满天星	BB	AA	BB

Claims (10)

1.一种百香果品种鉴定专用引物，其特征在于：为PE18引物对，其具体引物序列如下：

PE18F：5′～GGGCATCGCAGAGTAACAG～3′，

PE18R：5′～GCCGTCCCATACCCAAGT～3′。

2.根据权利要求1所述的百香果品种鉴定专用引物，其特征在于：百香果品种为4种，分别为：平塘1号、紫香、黄金果和满天星。

3.应用权利要求1所述的百香果品种鉴定专用引物构建获得的百香果品种指纹代码。

4.根据权利要求3所述的百香果品种指纹代码，其特征在于：所获得的4个百香果品种对应指纹代码分别为：平塘1号：指纹代码1BB；紫香：指纹代码1AB；黄金果：指纹代码1CC；满天星：指纹代码1AA。

5.应用权利要求1所述百香果品种鉴定专用引物快速鉴定百香果品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)待测样品DNA提取；

2)使用PE18引物对，以提取的DNA为模板，进行PCR扩增；

3)PCR产物则利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法进行检测，依据扩增产物的有无和大小进行判读，对照品种指纹代码，鉴定出待测样品的品种。

6.根据权利要求5所述的快速鉴定百香果品种的方法，其特征在于，步骤1)中，利用天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒完成待测样品DNA提取。

7.根据权利要求5所述的快速鉴定百香果品种的方法，其特征在于，步骤2)中，10μLPCR扩增反应体系包括：1×Buffer；0.25mM dNTP；1mM MgCl₂；0.3μM PE18引物；0.6U TaqDNA聚合酶和15ng DNA模板。

8.根据权利要求5所述的快速鉴定百香果品种的方法，其特征在于，步骤1)中，PCR反应程序为：预变性94℃5min；30循环，94℃30s，58℃30s，72℃30s；延伸72℃3min，最终4℃保存。

9.根据权利要求5所述的快速鉴定百香果品种的方法，其特征在于，百香果品种共计为4个，分别为：平塘1号、紫香、黄金果、满天星。

10.根据权利要求5或9所述的应用引物快速鉴定百香果品种的方法，其特征在于，4个百香果品种对应指纹代码分别为：平塘1号：指纹代码1BB；紫香：指纹代码1AB；黄金果：指纹代码1CC；满天星：指纹代码1AA。