CN105506072A - 检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用，其正义引物Psm240F序列为：5ˊ-AAGGTAACGGGGCTAAT-3ˊ，反义引物Psm434R序列为：5ˊ-GCTGTTGACCGATGATAT-3ˊ。本发明基于桑丁香假单胞菌区别于其他丁香假单胞菌致病变种的特异性致病基因片段(hrpZ？gene)设计和筛选了一对特异性引物对Psm240F/Psm434R，同时利用该引物对建立一种桑丁香假单胞菌的荧光定量PCR检测方法，具有特异性好、灵敏度高的特点，且大大缩短了检测所需时间，从样品处理至得出结果只需4～5h。因此该方法适用于桑疫病的早期诊断。
Description
技术领域
本发明为一种检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用，专用于检测桑丁香假单胞菌，属于农作物病害诊断与防治技术领域。
背景技术
丁香假单胞菌细菌性病害(Pseudomonassyringaepathovars)是世界上分布最广、危害最严重且最难防治的重大细菌性病害，于2012年被列为十大细菌性病害之首(Mansfield,J.etal,2012,13(6),614-629)。此病广泛流行于热带、亚热带及温带地区，有40多个类型的致病变种，可对包括草本、灌木和乔本在内的200多种植物造成危害(Rudolph,K.W,1995,1,47-138)。该病害可造成农作物最高减产90％，每年在全球范围内造成直接经济损失高达350亿美元，引起了人们的广泛关注。
桑疫病(mulberrybacterialblight)是由桑丁香假单胞菌(Pseudomonassyringaepv.mori)引起的，桑丁香假单胞菌属于丁香假单胞菌的一个致病变种。桑疫病的发生主要是其病原菌通过植株叶片气孔进入植株体内，并在植物维管束中进行大量繁殖，导致导管阻塞，植物水分运输受阻，同时致病菌还不断合成分泌大量的毒素蛋白破坏植株组织结构，使得植株最终表现出萎缩及腐烂症状，而植株的病变部位主要出现在植株的顶端或者嫩梢，故桑疫病又称“烂头病”。该病因发病周期短，蔓延态势严峻，已成为制约蚕桑产业可持续发展的重要因素。桑疫病一旦发生，很难进行有效的根治，而处在潜伏期的植物组织从外观上很难与正常组织分开，因此，快速有效的早期诊断对于控制桑疫病的蔓延和避免重大损失的发生具有重要意义。
快速、精确的早期病原菌检测手段是提高病害检测效率的基础，也是降低生物防治成本的前提。对于丁香假单胞菌的检测，目前最主要的有选择性培养基和分子生物学的方法。选择性培养基最早是由Mohan,S.K.等于1987年报道利用一种改良的KBC琼脂培养基平板法快速检测紫丁香和菜豆致病变种的丁香假单胞菌。Goszczynska,T.等在前人的基础上作出改进，于1998年指出利用MT培养基可以进行丁香假单胞菌与其他病原菌的区分，从而达到检测丁香假单胞菌的目的。目前使用的分离筛选丁香假单胞菌的培养基大多也是基于以上几种培养基或改良而来的。指示植物检测法是检测病原菌的方法之一，但由于周期长，并且受季节性限制，因此该法不能广泛应用于快速检测丁香假单胞菌。
分子生物学方法主要包括普通PCR法及荧光定量PCR法。2005年，Zaccardelli,M.等根据番茄丁香假单胞菌的致病基因hrpZ为目的片段设计特异性引物利用PCR扩增对番茄丁香假单胞菌进行快速检测。ReesGeorge,J.等于2010年依据16S-23SrDNA序列的间隔区设计出特异性的引物对猕猴桃丁香假单胞菌进行PCR检测。随着病原菌检测手段的不断提高，2014年，Gallelli,A.等在普通PCR检测方法的基础上进行改进，利用荧光定量PCR方法对猕猴桃丁香假单胞菌进行快速检测。荧光定量PCR方法近年来凭借其灵敏度高、可靠性强、稳健性好的三大优点而广泛应用于食物病原菌及部分植物病原菌的快速检测，具有良好的应用前景。然而，截止目前为止，尚未有文献报道关于应用荧光定量PCR方法进行桑疫病病原菌的快速检测。
因此本发明尝试使用荧光定量PCR方法对桑疫病病原菌进行绝对定量，不但提高了检测的特异性和灵敏度，而且可避免生产上对桑树病害的误判，同时也降低了病原菌检测所需的时间，为桑疫病的早期诊断和及早防治打下了基础。
发明内容
解决的技术问题：本发明通过设计用于检测桑丁香假单胞致病菌的特异性引物而建立一种灵敏、可靠、稳定的检测桑丁香假单胞菌的引物及其应用，从而克服桑疫病病原菌传统检测方法和半定量PCR检测方法的不足。
技术方案：检测桑丁香假单胞菌的引物，正义引物Psm240F序列为：5'-AAGGTAACGGGGCTAAT-3'，反义引物Psm434R序列为：5'-GCTGTTGACCGATGATAT-3'。
所述的引物在荧光定量PCR检测中的应用，包括以下步骤：1)利用KB液体培养基培养病原菌，制备病原菌菌悬液，同时采用Biospin细菌全基因组DNA提取试剂盒(BioerTechnologyCo.,Ltd.)提取病原菌总DNA，制备菌液和DNA标准样品；2)特异性引物设计，对致病性的桑丁香假单胞菌设计了其特异性的引物对Psm240F/Psm434R，所述引物对为：正义引物Psm240F序列为：5'-AAGGTAACGGGGCTAAT-3'，反义引物Psm434R序列为：5'-GCTGTTGACCGATGATAT-3'；3)实时荧光定量PCR检测方法反应体系为：20μL反应体系中，包含10μLSYBRPremixExTaqⅡ(TliRNaseHPlus)(2×)，0.8μLPsm240F10μM，0.8μLPsm434R10μM，0.4μLROXReferenceDye(50×)，2.0μL模板为标准病原菌菌悬液和DNA稀释液或待测样品的菌悬液，6μL双蒸水；4)实时荧光定量PCR检测方法扩增程序为：两步法扩增程序：第一步：95℃预变性10min；第二步：95℃变性15s，60℃延伸31s，反应共计45个循环，PCR完成后，按0.1℃/s升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证；5)取步骤1)中得到的病原菌菌悬液经平板计数法定量并进行梯度稀释，稀释成9个不同的浓度梯度：1×108cfu/mL，5×107cfu/mL，1×107cfu/mL，5×106cfu/mL，1×106cfu/mL，1×105cfu/mL，1×104cfu/mL，1×103cfu/mL，1×102cfu/mL，同时，取步骤1)中病原菌的全基因组DNA经ND-1000V3.7.1(ThermoSCIENTIFIC，USA)定量并10倍梯度稀释，稀释成6个不同的浓度梯度：6.0ng/μL，6.0×10-1ng/μL，6.0×10-2ng/μL，6.0×10-3ng/μL，6.0×10-4ng/μL，6.0×10-5ng/μL，以不同浓度梯度的菌悬液和DNA为模板按照上述PCR反应体系和扩增程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值(Ct)采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。
桑树桑疫病的动态监测试剂盒，含有上述的引物。
桑树植株带菌及带菌量的检测试剂盒，含有上述的引物。
有益效果
本发明基于桑丁香假单胞菌区别于其他丁香假单胞菌致病变种的特异性致病基因片段(hrpZgene)设计和筛选了一对特异性引物对Psm240F/Psm434R，同时利用该引物对建立一种桑疫病病原菌的荧光定量PCR检测方法，具有特异性好、灵敏度高的特点，且大大缩短了检测所需时间，从样品处理至得出结果只需4～5h。因此该方法适用于桑疫病的早期诊断。
附图说明
图1是引物对Psm240F/Psm434R特异性检测PCR扩增结果，其中泳道1为阴性对照；泳道2、3模板为桑丁香假单胞菌Psm14-7(保藏编号为：CGMCCNO.11139)和M4-13(保藏编号为CGMCCNO.3621)的全基因组DNA；泳道4、5、6模板为紫丁香假单胞菌(ICMP3189)、紫丁香假单胞菌(BCCM-LMG5083)、番茄DC3000丁香假单胞菌(ATCC10862)的全基因组DNA；泳道7—17的模板分别为恶臭假单胞菌(PSY12-1)、食树脂假单胞菌(PS-N)、莓实假单胞菌(R-PS-2)、黄毛榕假单胞菌(PS-K)、荧光假单胞菌(A.S.31)、魔氏假单胞菌(BQM5)、蒙氏假单胞菌(LY107)、变形假单胞菌(PS-L)、嗜麦芽寡养单胞菌(PS-E)、大肠杆菌(DH5α)、洋葱伯克霍尔德氏(ATCC25416)的全基因组DNA；M为100bpDNALadder；
图2-1是普通PCR灵敏性扩增结果，其中泳道1-9的模板为阳性标准品，反应体系中菌液的浓度分别为：1×108cfu/mL，5×107cfu/mL，1×107cfu/mL，5×106cfu/mL，1×106cfu/mL，1×105cfu/mL，1×104cfu/mL，1×103cfu/mL，1×102cfu/mL；10为空白对照；11为阴性对照；M为100bpDNALadder；
图2-2是普通PCR灵敏性扩增结果，其中泳道2-7的模板为阳性标准品，反应体系中DNA浓度分别为：6.0ng/μL，6.0×10-1ng/μL，6.0×10-2ng/μL，6.0×10-3ng/μL，6.0×10-4ng/μL，6.0×10-5ng/μL；1为空白对照；M为100bpDNALadder；
图3是实施例1荧光定量PCR引物特异性扩增溶解曲线，纵轴为Derivative；横轴为Temperature，反应体系中菌液浓度分别为1×108cfu/mL，5×107cfu/mL，1×107cfu/mL，5×106cfu/mL，1×106cfu/mL，1×105cfu/mL，1×104cfu/mL，1×103cfu/mL，1×102cfu/mL，特异性产物的Tm值为86.7℃。
图4a以CT值为纵坐标，DNA浓度的Log值为横坐标绘制的荧光绝对定量标准曲线图：DNA浓度在6.0-6.0×10-5ng/μL范围内，其Log值与Ct值呈良好的线性关系，y＝-2.79612x+15.27236，R2＝0.96606。
图4b以CT值为纵坐标，菌液浓度的Log值为横坐标绘制的荧光绝对定量标准曲线图：菌液浓度在102-108cfu/mL范围内，其Log值与Ct值呈良好的线性关系，y＝-4.56215x+46.91167，R2＝0.98872。
图5是实施例2田间爆发桑疫病桑树发病叶片中的病原菌和阳性对照菌株荧光定量PCR扩增的溶解曲线，纵轴为导数(Derivative)；横轴为温度(Temperature)，引物为Psm240F/Psm434R，特异性产物的Tm值为86.7℃。
具体实施方式
实施例1桑丁香假单胞菌的特异性引物检测
(1)参试菌株的培养和DNA提取
参试的18株菌株包括2株分离于桑疫病爆发的桑园的桑丁香假单胞菌Psm14-7(保藏编号为：CGMCCNo.11139)和M4-13(保藏编号为CGMCCNo.3621)，3株其他致病变种的丁香假单胞菌包括紫丁香假单胞菌(ICMP3189)、紫丁香假单胞菌(BCCM-LMG5083)、番茄DC3000丁香假单胞菌(ATCC10862)，其他13株非丁香假单胞菌属的菌株包括恶臭假单胞菌(PSY12-1)、食树脂假单胞菌(PS-N)、莓实假单胞菌(R-PS-2)、黄毛榕假单胞菌(PS-K)、荧光假单胞菌(A.S.31)、魔氏假单胞菌(BQM5)、蒙氏假单胞菌(LY107)、变形假单胞菌(PS-L)、嗜麦芽寡养单胞菌(PS-E)、大肠杆菌(DH5α)、洋葱伯克霍尔德氏(ATCC25416)、桑青枯菌(RS-5)、桑肠杆菌(LGD8)。将菌株接种到KB液体培养基中(胰蛋白胨20g，七水合硫酸镁1.5g，三水合磷酸氢二钾1.5g，甘油10mL，蒸馏水1000mL，pH7.2±0.2)，28℃，在转速为200rpm的恒温振荡培养箱中过夜培养，使用BiospinGenomicDNAExtractionKit提取参试菌株的全基因组DNA。
(2)利用特异性引物对Psm240F/Psm434R进行普通PCR扩增
以桑丁香假单胞菌及丁香假单胞菌属下其他致病变种以及其他常见细菌性病害病原菌基因组DNA为模板利用引物对Psm240F/Psm434R(该引物对由上海生工生物公司合成)进行普通PCR扩增，以检测该引物的特异性。普通PCR反应体系如下：总反应体积25μL，包含2μLDNA模板，12.5μL2×TaqMasterMix(含2.5UTaqPolymerase/μL，20mMTris-HCl，3mMMgCl2，500μMdNTP，100mMKCl)，8.5μL双蒸水，10uM引物Psm240F，10uM引物Psm434R。反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环，最后72℃延伸5min。PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测，同时将凝胶产物进行回收，克隆，测序，将测序获得的数据序列与用于引物设计的模板基因序列(hrpZgene)进行序列比对，查看二者的序列相似度；
以不同浓度梯度的桑丁香假单胞菌Psm14-7菌株的菌悬液及全基因组DNA为模板进行普通PCR扩增，以检测该引物对的灵敏性。反应体系和扩增程序如上述所示，PCR扩增模板为：将桑丁香假单胞菌Psm14-7的DNA用DNA提取试剂盒中的ElutionBuffer进行十倍梯度稀释，使其终浓度分别为5.0×102ng/μL，5.0×101ng/μL，5.0×100ng/μL，5.0×10-1ng/μL，5.0×10-2ng/μL，5.0×10-3ng/μL，5.0×10-4ng/μL；将桑丁香假单胞菌的菌悬液使用培养液进行梯度稀释，使其终浓度分别为1.0×108cfu/mL；5.0×107cfu/mL；1.0×107cfu/mL；5.0×106cfu/mL；1.0×106cfu/mL；1.0×105cfu/mL；1.0×104cfu/mL；1.0×103cfu/mL；1.0×102cfu/mL；1.0×101cfu/mL。最后将PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测，观察该引物对的灵敏度。
(3)利用特异性引物对Psm240F/Psm434R进行荧光定量PCR反应
将桑丁香假单胞菌Psm14-7的全基因组DNA用DNA提取试剂盒中的ElutionBuffer进行十倍梯度稀释，使其终浓度分别为6.0ng/μL，6.0×10-1ng/μL，6.0×10-2ng/μL，6.0×10-3ng/μL，6.0×10-4ng/μL，6.0×10-5ng/μL。同时将桑丁香假单胞菌的菌悬液使用培养液进行梯度稀释，使其终浓度分别为1.0×108cfu/mL；5.0×107cfu/mL；1.0×107cfu/mL；5.0×106cfu/mL；1.0×106cfu/mL；1.0×105cfu/mL；1.0×104cfu/mL；1.0×103cfu/mL；1.0×102cfu/mL。以该不同浓度梯度的DNA和菌悬液为模板，在20μL荧光定量PCR反应体系中，包含10μLSYBRPremixExTaqⅡ(TliRNaseHPlus)(2×)，0.8μLPsm240F(10μM)，0.8μLPsm434R(10μM)，0.4μLROXReferenceDye(50×)，2.0μL模板，6μL双蒸水。每个样品进行3次重复。荧光定量PCR扩增程序为：两步法扩增程序：第一步：95℃预变性10min；第二步：95℃变性15s，60℃延伸31s，反应45个循环。最后分别以DNA和菌悬液的浓度为横坐标，以CT值为纵坐标绘制绝对定量的标准曲线。
实施结果
利用本发明设计的特异性检测引物对Psm240F/Psm434R对桑丁香假单胞菌及丁香假单胞菌属下其他致病变种以及其它常见细菌性病原菌的PCR扩增结果(附图1)，该结果表明该引物具有良好的特异性。50℃退火条件下，只有桑丁香假单胞菌扩增出195bp大小的产物，而其他菌株和阴性对照均无相应大小的扩增产物。再者通过琼脂糖凝胶电泳、胶回收、DNA克隆、DNA测序获得的序列数据与用于引物设计的目的片段进行序列比对相似度为99.3％，由此证明本发明的引物在桑丁香假单胞菌的检测水平上具有特异性。
利用该引物对Psm240F/Psm434R对桑丁香假单胞菌菌悬液和全基因组DNA检测的灵敏度结果如图2-1和2-2所示，普通PCR对桑丁香假单胞菌菌悬液的最低检测浓度为1.0×106cfu/mL，对全基因组DNA的最低检测浓度为6.0×10-2ng/μL。
利用该引物对Psm240F/Psm434R设计荧光定量PCR方法对桑丁香假单胞菌的全基因组DNA进行绝对定量检测，其标准曲线如图4a所示，DNA浓度在6.0×10-5-6ng/μL范围内，其Log值与Ct值呈良好的线性关系，y＝-2.79612x+15.27236，R2＝0.96606。利用引物对Psm240F/Psm434R设计荧光定量PCR方法对桑丁香假单胞菌菌液进行绝对定量检测，其标准曲线如图4b所示，菌液浓度在102～108cfu/mL范围内，其Log值与Ct值呈良好的线性关系，y＝-4.56215x+46.91167，R2＝0.98872。
荧光定量PCR反应的溶解曲线如图3所示，产物在86.7℃出现单一的峰，说明反应中无非特异性的扩增或引物二聚体的干扰。
实施例2对接种于健康桑树植株中的桑丁香假单胞菌进行特异性检测
将桑疫病致病菌桑丁香假单胞菌Psm14-7菌株在KB液体培养基中进行活化培养，培养温度为28℃，培养条件为：在恒温的震荡培养箱中进行振荡培养，转速为200rpm，使得菌液浓度达到1.0×108cfu/mL。然后接种于健康的桑树，以接种无菌水作为空白对照，将接种过的桑树植株置于温室玻璃房中，保持高温高湿。4天后，取接种过的桑树植株不同部位(上、中、下)的叶片组织、茎干组织、根部组织(表1)，每个处理设置3个重复。然后用无菌的研钵进行研磨制备相应的样液，分别取2μL的样液进行荧光定量PCR检测。循环结束后，采用仪器自带的分析软件，分析扩增结果，计算待测样品桑丁香假单胞菌的DNA含量。
实施结果
采用人工接种的桑树样本对荧光定量PCR体系的可靠性和灵敏性进一步进行验证。结果表明本研究建立的桑疫病病原菌荧光定量PCR检测体系具有高的可靠性及灵敏性，该检测方法能够检测到的桑丁香假单胞菌的最低菌液浓度为100cfu/mL以及最低全基因组DNA浓度为60fg/μL。在该检测方法检测范围内可以准确将其定量。
将该检测结果与田间检测结果(表1)相结合，可以建立准确的桑疫病田间预测预报系统。田间检测结果表明，桑疫病病原菌主要感染桑树顶端的嫩叶组织，而在其他组织部位菌含量几乎为0，这与之前文献中的报道相吻合。
表1荧光定量PCR的CT值和模拟病种样本的菌液浓度
| 编号 | 菌悬液浓度(cfu/ml) | 植物组织部位 | P.syringae pv.mori DNA(cfu/mL) |
| 1 | 1×108 | 顶端叶片 | 1.0×105cfu/mL |
| 2 | 1×108 | 中部叶片 | 1.0×103cfu/mL |
| 3 | 1×108 | 底端叶片 | 0 |
| 4 | 1×108 | 上部茎干 | 0 |
| 5 | 1×108 | 下部茎干 | 0 |
| 6 | 1×108 | 根部 | 0 |
该检测方法利用荧光染料(SYBRPremixExTaqⅡ)和以桑丁香假单胞菌自身特有的致病基因(hrpZgene)为模板设计的正、反向引物和阳性标准品，建立了实时荧光定量PCR(q-PCR)反应体系，可以快速、准确地定量检测桑疫病病原菌桑丁香假单胞菌，实验结果表明对桑疫病病原菌DNA的最低检测浓度为60fg/μL，对桑疫病病原菌菌液的最低检测浓度为102cfu/mL。同时，该方法可直接定量检测接种于健康桑树不同组织体内的病原菌，省去了提取病原菌DNA的步骤，大大节省检测的时间，降低检测难度，并能真实反应植株不同部位带菌量，为病害的早期预测和预警提供方法和基础。因此，该方法适合作为植物病害诊断检测方法推广应用。
上述实施方式仅为说明本发明专利，但不能以此来限定本发明的保护范围。本领域的技术人员在本发明基础上所做的任何非实质性的变化和替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (4)
1.检测桑丁香假单胞菌的引物，其特征在于正义引物Psm240F序列为：5'-AAGGTAACGGGGCTAAT-3'，反义引物Psm434R序列为：5'-GCTGTTGACCGATGATAT-3'。
2.权利要求1所述的引物在荧光定量PCR检测中的应用，其特征在于包括以下步骤：
1)利用KB液体培养基培养病原菌，制备病原菌菌悬液，同时采用Biospin细菌全基因组DNA提取试剂盒提取病原菌总DNA，制备菌液和DNA标准样品；
2)特异性引物设计，对致病性的桑丁香假单胞菌设计了其特异性的引物对Psm240F/Psm434R，所述引物对为：正义引物Psm240F序列为：5'-AAGGTAACGGGGCTAAT-3'，反义引物Psm434R序列为：5'-GCTGTTGACCGATGATAT-3'；
3)实时荧光定量PCR检测方法反应体系为：20μL反应体系中，包含10μLSYBRPremixExTaqⅡ(TliRNaseHPlus)(2×)，0.8μLPsm240F10μM，0.8μLPsm434R10μM，0.4μLROXReferenceDye(50×)，2.0μL模板为标准病原菌菌悬液和DNA稀释液或待测样品的菌悬液，6μL双蒸水；
4)实时荧光定量PCR检测方法扩增程序为：两步法扩增程序：第一步：95℃预变性10min；第二步：95℃变性15s，60℃延伸31s，反应共计45个循环，PCR完成后，按0.1℃/s升温速率从72℃升至95℃进行融解曲线的分析验证；
5)取步骤1)中得到的病原菌菌悬液经平板计数法定量并进行梯度稀释，稀释成9个不同的浓度梯度：1×108cfu/mL，5×107cfu/mL，1×107cfu/mL，5×106cfu/mL，1×106cfu/mL，1×105cfu/mL，1×104cfu/mL，1×103cfu/mL，1×102cfu/mL，同时，取步骤1)中病原菌的全基因组DNA经ND-1000V3.7.1定量并10倍梯度稀释，稀释成6个不同的浓度梯度：6.0ng/μL，6.0×10-1ng/μL，6.0×10-2ng/μL，6.0×10-3ng/μL，6.0×10-4ng/μL，6.0×10-5ng/μL，以不同浓度梯度的菌悬液和DNA为模板按照上述PCR反应体系和扩增程序进行扩增；反应结束后，根据各个浓度梯度的循环阈值(Ct)采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。
3.桑树桑疫病的动态监测试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的引物。
4.桑树植株带菌及带菌量的检测试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的引物。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR101995575B1 (ko) * | 2018-06-14 | 2019-07-02 | 충북대학교 산학협력단 | 슈도모나스 시린개 병원체변종을 구별하기 위한 프라이머 세트 및 이의 용도 |
| CN111440887A (zh) * | 2020-05-27 | 2020-07-24 | 福建农林大学 | 变形假单胞菌TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂盒及其制备方法 |
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