KR102317218B1 - 체리 바이러스 3종의 진단을 위한 다중 진단용 프라이머 및 이의 용도 - Google Patents

체리 바이러스 3종의 진단을 위한 다중 진단용 프라이머 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 체리 바이러스 진단용 프라이머 세트, 체리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트, 다중 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 다중 진단용 키트 및 체리 바이러스 다중 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명의 체리 바이러스 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 체리 바이러스 다중 진단 방법을 이용하면, 낮은 농도의 샘플에서도 체리 바이러스의 정확하고 신속한 다중 진단이 가능하여 국내 체리에서 발생하는 바이러스 병에 관한 스크리닝과 피해현황 분석, 무병(Virus-Free) 묘목 생산 및 저항성 품종 개발에 기여할 수 있다.

Description

체리 바이러스 3종의 진단을 위한 다중 진단용 프라이머 및 이의 용도{Primer set for simultaneous detection of three viruses in Cherry plant and use thereof}
본 발명은 체리 바이러스 진단용 프라이머 세트, 체리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트, 다중 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 다중 진단용 키트 및 체리 바이러스 다중 진단 방법에 관한 것이다.
농업적으로 중요한 작물의 대부분은 식물 바이러스 또는 바이로이드(viroid) 감염에 의해 수확량 감소 및 품질저하가 나타나고, 이로 인해 심각한 경제적 손실이 발생하게 된다. 식물 바이러스에 의한 병은 곰팡이 또는 세균에 의한 병과는 다르게 농약을 살포하여 예방하거나 치료하는 것이 불가능하다. 따라서, 식물체나 종자의 바이러스 감염 여부에 대한 정밀하고 신속한 진단은 재배 작물의 바이러스 감염에 의한 피해를 사전에 방지하고, 바이러스 병 관리를 위한 선결요건이다.
바이러스 진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법을 주로 사용하였다. 이 중 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태적 특징으로 종을 진단하기는 불가능한 방법이다. 효소 결합 면역흡수 검정법(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)은 가장 일반적으로 사용하여온 혈청학적 진단 방법이나 PCR 진단법보다 검출감도가 약 1000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비 특이적 반응으로 진단에 실패하는 경우가 종종 발생한다. 또한, 검역 등 현장에서 하나의 검사 시료에 대해 다양한 병원체의 진단을 수행해야 할 경우에는 많은 노동력과 검사 비용이 소요되어 이 방법이 적절하지 않다.
따라서 현재 바이러스의 진단에서는 검출감도가 높고 편리한 PCR 방법이 가장 일반적으로 사용되고 있다. 병원체의 PCR 진단을 위한 프라이머의 개발에 있어 중요한 점은, 첫째 바이러스 종 내에 존재하는 모든 계통 및 분리주를 검출 할 수 있어야 한다는 것이다. 이를 위하여 검출 대상 바이러스 종의 모든 계통 및 분리주에 있어서 공통되는 염기서열을 대상으로 프라이머를 설계하여야 한다. 둘째, 상이한 종 간에는 특이성이 있어야 한다는 것이다. 이를 위하여 검출 대상 바이러스 종과 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열에는 반응하지 않는 프라이머를 설계하여야 한다.
그러나, 상기와 같은 프라이머의 경우, 일반적으로 개별 바이러스에 대한 단편적 진단만이 가능한 프라이머이기 때문에, 다수의 바이러스에 감염된 작물을 진단하는데 문제가 있었다. 또한, 분리주 특이적 프라이머를 사용할 경우 진단에 실패할 수 있기 때문에 바이러스 종 내에 존재하는 모든 분리주를 검출할 수 있는 종 특이적 프라이머의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
기후변화와 자유무역협정 체결이 증가함에 따라 체리를 포함한 열대 및 아열대 작물의 국내 수입이 증가하고 있고, 국내 아열대 과수 재배지 또한 증가하고 있는 추세이다. 아울러 최근 수요가 높아져가고 있는 수입 과종의 국내 수요를 충족하기 위하여 각 도 단위 지역에서는 지방 특색 및 기후에 맞는 과수 특화 사업이 진행 중이다. 이러한 과수 특화 사업 지역 중 경주를 포함한 여러 지역에서 체리 재배 특구 단지가 조성되고 있어, 현재 수입의존도가 95%에 달하는 체리에 대하여 국내 생산 유통이 더 늘어날 전망이다.
한편, 최근 국가적으로 주요 과종인 사과를 포함한 6대 과종(배, 포도, 복숭아, 감귤, 감)에서 무병묘목의 사용을 위하여 바이러스 검사가 확대되고 있으며 이러한 과종들의 바이러스병은 농촌진흥청을 중심으로 연구 및 지속적인 모니터링이 이루어지고 있는 실정이다. 그러나 6대 과종 외의 과종에 속하는 자두, 참다래, 체리, 매실 및 기타 과종(망고, 블루베리, 아로니아 등)의 바이러스병에 대한 모니터링 및 피해 조사와 연구 등은 아직 미미한 수준이다. 따라서, 이와 같은 기타 과종들에 대하여 지속적인 모니터링을 통하여 국내 농업 생태계에 미칠 영향과 재배 과수 식물체의 바이러스 모니터링을 위한 진단법 개발이 필요한 실정이다. 특히, 최근 수요와 재배면적이 늘어나고 있는 체리에 감염되는 바이러스와 관련하여 신속하고 정확하게 여러 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 진단법을 위한 기술 개발이 필요하다.
이에 본 발명의 발명자들은 체리 바이러스에서 발생하는 바이러스 병의 다중 진단을 위한 프라이머를 연구하던 중, 국내에서 다수 발병되는 것으로 보고된 3종의 체리 바이러스(체리 바이러스 A(CVA), 작은 체리 바이러스 2(LChV -2) 및 작은 체리 바이러스 1(LChV-2))에 대한 다중 진단용 프라이머를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은, 체리바이러스 진단용 프라이머 세트, 체리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트, 다중 진단용 조성물 상기 조성물을 포함하는 다중 진단용 키트 및 체리 바이러스 다중 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 3, 4, 5 및 6으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 프라이머;를 포함하는 프라이머 쌍; b) 서열번호 7, 8, 9 및 10으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 프라이머; 및 서열번호 11, 12, 13, 14 및 15로 표시되는 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 프라이머;를 포함하는 프라이머 쌍; 및 c) 서열번호 16 또는 17로 표시되는 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 프라이머; 및 서열번호 18, 19, 20, 21, 22 및 23으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 프라이머;를 포함하는 프라이머 쌍;으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 체리 바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 a) 서열번호 2 및 3; 또는 서열번호 2 및 5로 표시되는 프라이머 쌍; b) 서열번호 7 및 11; 서열번호 8 및 12; 서열번호 8 및 13으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머 쌍; 및 c) 서열번호 16 및 18; 서열번호 17 및 20; 서열번호 16 및 20; 서열번호 17 및 21; 서열번호 17 및 22; 서열번호 17 및 23으로 표시되는 프라이머 쌍; 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 체리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 체리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 포함하는, 체리 바이러스 다중 진단용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 체리 바이러스 다중 진단용 조성물을 포함하는, 체리 바이러스 다중 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 a) 시료로부터 DNA를 얻는 단계; b) 체리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 이용하여 상기 a) 단계에서 얻어진 DNA를 증폭하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 체리 바이러스 다중 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 체리 바이러스 진단용 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 체리 바이러스 다중 진단 방법을 이용하면, 낮은 농도의 샘플에서도 체리 바이러스의 정확하고 신속한 다중 진단이 가능하여 국내 체리에서 발생하는 바이러스 병에 관한 스크리닝과 피해현황 분석, 무병(Virus-Free) 묘목 생산 및 저항성 품종 개발에 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명의 체리 바이러스 A(Cherry virus A, CVA) 종 특이적 프라이머 위치 모식도를 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 작은 체리 바이러스 2(Little cherry virus 2, LChV -2) 종 특이적 프라이머 위치 모식도를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 작은 체리 바이러스 1(Little cherry virus 1, LChV-1) 종 특이적 프라이머 위치 모식도를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 체리 바이러스 A 의 종 특이적 진단용 프라이머 8세트의 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 작은 체리 바이러스 2의 종 특이적 진단용 프라이머 8세트의 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 작은 체리 바이러스 1의 종 특이적 프라이머 8세트의 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 체리 바이러스 A 종 특이적 진단용 프라이머와 작은 체리 바이러스 2 종 특이적 진단용 프라이머 조합을 이용한 duplex-PCR 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 체리 바이러스 A 종 특이적 진단용 프라이머, 작은 체리 바이러스 2 종 특이적 진단용 프라이머 및 작은 체리 바이러스 1 종 특이적 진단용 프라이머 조합을 이용한 multiplex-PCR 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 체리 바이러스 A, 작은 체리 바이러스 2 및 작은 체리 바이러스 1의 종 특이적 진단용 프라이머 조합을 이용한 multiplex-PCR의 최적 annealing 온도조건 확인을 위한 실험의 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 체리 바이러스 A, 작은 체리 바이러스 2 및 작은 체리 바이러스 1의 종 특이적 진단용 프라이머 조합을 이용한 multiplex-PCR의 최적 프라이머 세트 농도 조건 확인을 위한 실험의 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 체리 바이러스 A(도 11A), 작은 체리 바이러스 2(도 11B) 및 작은 체리 바이러스 1(도 11C)의 종 특이적 진단용 프라이머 검출한계 확인을 위한 10배 단계별 희석 후 monoplex-PCR 반응 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 체리 바이러스 A, 작은 체리 바이러스 2 및 작은 체리 바이러스 1의 종 특이적 진단용 프라이머 조합의 검출한계 확인을 위한 10배 단계별 희석 후 multiplex-PCR 반응 전기영동 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 서열번호 1 또는 2로 표시되는 프라이머; 및 서열번호 3, 4, 5 및 6으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 프라이머;를 포함하는 프라이머 쌍; b) 서열번호 7, 8, 9 및 10으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 프라이머; 및 서열번호 11, 12, 13, 14 및 15로 표시되는 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 프라이머;를 포함하는 프라이머 쌍; 및 c) 서열번호 16 또는 17로 표시되는 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 프라이머; 및 서열번호 18, 19, 20, 21, 22 및 23으로 표시되는 프라이머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 프라이머;를 포함하는 프라이머 쌍;으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 체리 바이러스 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 체리바이러스는 체리 바이러스 A(Cherry virus A), 작은 체리 바이러스 2 (Little cherry virus 2) 및 작은 체리 바이러스 1 (Little cherry virus 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 a) 군의 프라이머 쌍은 체리 바이러스 A(Cherry virus A, CVA)를 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, b) 군의 프라이머 쌍은 작은 체리 바이러스 2(Little cherry virus 2, LChV - 2)를 진단할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다. c) 군의 프라이머 쌍은 작은 체리 바이러스 1(Little cherry virus 2, LChV-1)를 진단할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트에 포함되는 상기 서열번호 1 내지 23 에 기재된 염기서열은 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 23 의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2 +의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
또한 본 발명은 a) 서열번호 2 및 3; 또는 서열번호 2 및 5로 표시되는 프라이머 쌍; b) 서열번호 7 및 11; 서열번호 8 및 12; 서열번호 8 및 13으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머 쌍; 및 c) 서열번호 16 및 18; 서열번호 17 및 20; 서열번호 16 및 20; 서열번호 17 및 21; 서열번호 17 및 22; 서열번호 17 및 23으로 표시되는 프라이머 쌍; 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함하는, 체리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 상기 a) 군의 프라이머 쌍은 체리 바이러스 A(Cherry virus A, CVA)를 진단할 수 있는 프라이머 쌍이며, b) 군의 프라이머 쌍은 작은 체리 바이러스 2(Little cherry virus 2, LChV - 2)를 진단할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다. c) 군의 프라이머 쌍은 작은 체리 바이러스 1(Little cherry virus 2, LChV-1)를 진단할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 체리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트는 서열번호 2 및 3; 서열번호 7 및 11; 및 서열번호 17 및 20의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 상기 서열번호의 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머 세트를 이용하게 되면, 각 바이러스에 대한 종 특이적인 다중 진단이 가능하며 낮은 농도의 샘플에서도 바이러스를 정확하게 진단할 수 있다.
본 발명의 체리 바이러스 진단용 프라이머 세트 또는 체리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 이용하게 되면, 다수의 바이러스, 바람직하게는 체리 바이러스 A, 작은 체리 바이러스 2 및 작은 체리 바이러스 1 에 감염된 작물을 진단할 수 있으며 종 특이적으로 바이러스를 진단할 수 있으며, 동시에 다수의 바이러스의 감염여부를 손쉽게 진단할 수 있다.
또한 본 발명은 체리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 포함하는, 체리 바이러스 다중 진단용 조성물을 제공한다.
상기 체리바이러스 다중 진단용 조성물은 a) 서열번호 2 및 3; 또는 서열번호 2 및 5로 표시되는 프라이머 쌍; b) 서열번호 7 및 11; 서열번호 8 및 12; 서열번호 8 및 13으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머 쌍; 및 c) 서열번호 16 및 18; 서열번호 17 및 20; 서열번호 16 및 20; 서열번호 17 및 21; 서열번호 17 및 22; 서열번호 17 및 23으로 표시되는 프라이머 쌍; 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함하는 체리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2 및 3; 서열번호 7 및 11; 및 서열번호 17 및 20의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 반응 증폭 혼합물을 더 포함할 수 있으며, 반응 증폭 혼합물은 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 중합 효소, 데옥시뉴클레오티드, 뉴클레아제가 없는 멸균수 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액 등을 지칭하며, 바람직하게는 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드, DNA 중합효소를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 체리 바이러스 다중 진단용 조성물을 포함하는, 체리 바이러스 다중 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 상술한 체리 바이러스 다중 진단용 조성물 이외에도 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소 (polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제 (sequenase) 등을 포함할 수 있다.
상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 a) 시료로부터 DNA를 얻는 단계; b) 체리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 이용하여 상기 a) 단계에서 얻어진 DNA를 증폭하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는 체리 바이러스 다중 진단 방법을 제공한다.
상기 체리 바이러스는 체리 바이러스 A(Cherry virus A), 작은 체리 바이러스 2 (Little cherry virus 2) 및 작은 체리 바이러스 1 (Little cherry virus 1)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 체리 바이러스일 수 있다.
상기 체리바이러스 다중 진단용 프라이머 세트는 a) 서열번호 2 및 3; 또는 서열번호 2 및 5로 표시되는 프라이머 쌍; b) 서열번호 7 및 11; 서열번호 8 및 12; 서열번호 8 및 13으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 프라이머 쌍; 및 c) 서열번호 16 및 18; 서열번호 17 및 20; 서열번호 16 및 20; 서열번호 17 및 21; 서열번호 17 및 22; 서열번호 17 및 23으로 표시되는 프라이머 쌍; 으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 프라이머 쌍을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2 및 3; 서열번호 7 및 11; 및 서열번호 17 및 20의 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
상기 b) 단계의 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 듀플렉스 중합효소연쇄반응(duplex Polymerase Chain Reaction, duplex PCR), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip), 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법일 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 본 발명의 증폭은 중합효소연쇄반응, 듀플렉스 중합효소연쇄반응, 다중 중합효소연쇄반응 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법일 수 있다.
또한 상기 b) 단계의 증폭 중 어닐링(annealing) 단계의 온도가 55.5℃ 내지 59℃일 수 있으며, 바람직하게는 56℃ 내지 57.5℃일 수 있고, 더욱 바람직하게는 56.8℃일 수 있다.
또한 상기 b) 단계의 증폭을 다중 중합효소연쇄반응을 이용하는 경우, 증폭에 사용하는 체리 바이러스 A : 작은 체리 바이러스 2 : 작은 체리 바이러스의 프라이머 세트의 농도비는 1 : 1 내지 3 : 3 내지 5일 수 있으며, 바람직하게는 1 : 2 : 4일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일예로 서열번호 2 및 3; 서열번호 7 및 11; 및 서열번호 17 및 20의 프라이머 쌍을 포함하는 체리 바이러스 진단용 프라이머 세트를 이용하여 상기와 같은 최적의 어닐링(annealing) 단계의 온도 및 프라이머 세트 농도비 조건에서 진단을 수행하는 경우, 체리 바이러스 A, 작은 체리 바이러스 2 및 작은 체리 바이러스 1 모두를 낮은 농도의 샘플에서도 더욱 우수하게 높은 특이도로 각각의 바이러스에 대한 다중 진단이 가능하다.
상기 c) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법일 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 바람직하게는 본 발명의 증폭 산물의 검출은 겔 전기영동 방법을 통해 이루어질 수 있다.
본 발명의 체리 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 이용한 체리 바이러스 다중 진단 방법에 따르면, 체리에서 관찰되는 바이러스를 동시에 다중으로 손쉽게 진단할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 전체 RNA 추출 및 First-strand complementary DNA ( FS cDNA) 합성
1.1 전체 RNA 추출
전체 RNA 추출을 위한 시료로 국립종자원에서 2016년 7월에 경상북도 경주시에서 채집하고 곱게 마쇄하여 초저온냉동고에 보관 중인 체리시료 2점을 사용하였다. 상기 2점의 시료를 Nuclisens EasyMag bio-robot(Biom
Figure 112018064258064-pat00001
rieux) 자동핵산추출 장치를 이용하여, 최종적으로 50μL의 전체 RNA를 추출하였다.
1.2 First-strand complementary DNA ( FS cDNA) 합성
상기 실시예 1.1에서 추출한 전체 RNA를 Tecan Infinite M200 Pro(Tecan Group Ltd., M
Figure 112018064258064-pat00002
nnedorf, Switzerland)를 이용하여 정량하였다. 이후 상기 실시예 1.1의 전체 RNA를 주형으로 사용하여 cDNA를 합성하였고, M-MLV(Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 제공사의 매뉴얼에 따라 First-strand complementary DNA (FS cDNA)를 합성하였다.
실시예 2. 종 특이적 프라이머 설계
2.1 체리 바이러스 A ( Cherry virus A, CVA ) 의 종 특이적 프라이머 설계
체리 바이러스 A (Cherry virus A, CVA)의 종 특이적 프라이머를 설계하기 위하여 우선, NCBI GenBank로부터 기 보고된 CVA와 CVA가 속해 있는 Capillovirus 속(genus)과의 비교를 위하여, Capillovirus 속 바이러스의 전체 게놈 시퀀스 정보를 다운로드 하였다. 상기 종 특이적 프라이머 설계를 위해 다운로드한 기보고 염기서열 정보를 표 1에 나타내었다.
No. Virus Host Origin Accession no. Isolate
1 CVA* Cherry cv. Sunburst China KX370827 ChYT52
2 CVA Prunus avium var. Manigam India FN691959 JK
3 CVA Prunus armeniaca Japan LC125634 J
4 CVA Prunus mume South Korea KY286055 OC
5 CVA Sweet cherry China KU131205 Taian
6 CVA Prunus mume cv. Wolyeong South Korea KY445749 WY
7 ASGV Pyrus pyrifolia China KR185346 Cuiguan
*CVA: Cherry virus A, ASGV: Apple stem grooving virus
상기 표 1의 CVA 및 Capillovirus 속 바이러스의 전체 염기서열을 DNAMAN ver 5.0 software를 이용하여 서열 정렬을 하였다.
이후, CVA만을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머를 설계하기 위하여, 상기 CVA의 보존영역(conserved domain) 및 CVA 와 Capillovirus 속 바이러스 간 비보존영역(non-conserved domain)에서 프라이머를 최종적으로 설계하였고, 이를 표 2에 나타내었다. 또한, 상기와 같이 설계한 CVA의 종 특이적 프라이머의 위치 모식도를 도 1에 나타내었다.
세트번호 프라이머 명칭 서열
(5'→3') 		위치 타겟 크기
(b.p)
1 CVA-D-F1 CAGGAGACGAATCCAGAATTT 5491-5511 MP 349
CVA-D-R3 CTAAAACCTGCTTGGCATGC 5820-5839
2 CVA-D-F1 CAGGAGACGAATCCAGAATTT 5491-5511 415
CVA-D-R4 TCATGTGTGGACATTGGATAAT 5884-5905
3 CVA-D-F1 CAGGAGACGAATCCAGAATTT 5491-5511 483
CVA-D-R5 GGGAATTGTCAACAACATTGAT 5952-5973
4 CVA-D-F1 CAGGAGACGAATCCAGAATTT 5491-5511 565
CVA-D-R6 CCAACATCTGCGGCAGTTG 6037-6055
5 CVA-D-F2 AGTGCTCACAGCTGTTAAAAG 5570-5590 270
CVA-D-R3 CTAAAACCTGCTTGGCATGC 5820-5839
6 CVA-D-F2 AGTGCTCACAGCTGTTAAAAG 5570-5590 336
CVA-D-R4 TCATGTGTGGACATTGGATAAT 5884-5905
7 CVA-D-F2 AGTGCTCACAGCTGTTAAAAG 5570-5590 404
CVA-D-R5 GGGAATTGTCAACAACATTGAT 5952-5973
8 CVA-D-F2 AGTGCTCACAGCTGTTAAAAG 5570-5590 486
CVA-D-R6 CCAACATCTGCGGCAGTTG 6037-6055
2.2 작은 체리 바이러스 2 (Little cherry virus 2, LChV - 2 )의 종 특이적 프라이머 설계
작은 체리 바이러스 2 (Little cherry virus 2, LChV - 2)의 종 특이적 프라이머를 설계하기 위하여 우선, NCBI GenBank로부터 기 보고된 LChV -2 와 LChV-2가 속해 있는 Ampelovirus 속(genus)과의 비교를 위하여, Ampelovirus 속 바이러스 9종의 전체 게놈 시퀀스 정보를 다운로드 하였다. 상기 종 특이적 프라이머 설계를 위해 다운로드한 기보고 염기서열 정보를 표 3에 나타내었다.
No. Virus Host Origin Accession no. Isolate
1 LChV-2* - USA AF531505 USA6b
2 BVBaV Blackberry USA NC_022072 Mississippi1
3 GLRaV-1 Grapevine cultivar Kober 125 AA Czech Republic KY827404 Ti23
4 GLRaV-3 - South Africa EU259806 GP18
5 GLRaV-4 Vitis vinifera cultivar Mantua Spain KJ810572 Man086
6 GLRaV-13 Vitis vinifera Japan NC029783 a177
7 PMWaV-1 - - AF283103 -
8 PMWaV-2 - - NC010178 -
9 PMWaV-3 - USA DQ399259 -
10 PBNSPaV Sweet cherry China KU240013 Taian
*LChV-2: Little cherry virus 2, BVBaV: Blackberry vein banding associated virus, GLRaV-1: Grapevine leafroll-associated virus 1, GLRaV-3: Grapevine leafroll -associated virus 3, GLRaV-4: Grapevine leafroll-associated virus 4, GLRaV-13: Grapevine leafroll -associated virus 13, PMWaV-1: Pineapple mealybug wilt-associated virus 1, PMWaV-2: Pineapple mealybug wilt associated virus 2, PMWaV-3: Pineapple mealybug wilt-associated virus 3, PBNSPaV: Plum bark necrosis stem pitting-associated virus.
상기 표 3에 나타난 LChV -2 및 Ampelovirus 속 바이러스의 전체 염기서열을 DNAMAN ver 5.0 software를 이용하여 서열 정렬을 하였다.
이후, LChV -2만을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머를 설계하기 위하여, 상기 LChV - 2 의 보존영역(conserved domain) 및 LChV -2 와 Ampelovirus 속 바이러스 간 비보존영역(non-conserved domain)에서 프라이머를 최종적으로 설계하였고, 이를 표 4에 나타내었다. 또한, 상기와 같이 설계한 LChV -2의 종 특이적 프라이머의 위치 모식도를 도 2에 나타내었다.
세트번호 프라이머 명칭 서열
(5'→3') 		위치 타겟 크기(b.p)
1 LCh2-D-F1 TCGTGTATAGACCTTTGTATGA 11506-11527 HSP90
p22
 570
LCh2-D-R1 AAACTTCGAGAACCGGACTC 12056-12075
2 LCh2-D-F1 TCGTGTATAGACCTTTGTATGA 11506-11527 748
LCh2-D-R2 TCTGCTGGTAAGAATTTTGAATA 12231-12253
3 LCh2-D-F1 TCGTGTATAGACCTTTGTATGA 11506-11527 855
LCh2-D-R3 TTTAACTCCAAACAAGCTCCC 12340-12360
4 LCh2-D-F2 TGATACGAGATCGAGGTTTTAA 11824-11845 252
LCh2-D-R1 AAACTTCGAGAACCGGACTC 12056-12075
5 LCh2-D-F2 TGATACGAGATCGAGGTTTTAA 11824-11845 430
LCh2-D-R2 TCTGCTGGTAAGAATTTTGAATA 12231-12253
6 LCh2-D-F2 TGATACGAGATCGAGGTTTTAA 11824-11845 537
LCh2-D-R3 TTTAACTCCAAACAAGCTCCC 12340-12360
7 LCh2-D-F3 GGAAAAACACGGTGAGAGTG 8624-8643 p55 214
LCh2-D-R4 TACCGGATTTGGGTACAACG 8818-8837
8 LCh2-D-F4 TCTAACTTGTACCCCATGCTT 6989-7009 p14 444
LCh2-D-R5 GAACTAGGAGAAACTACCACT 7412-7432
2.3 작은 체리 바이러스 1 ( Little cherry virus 1, LChV - 1 )의 종 특이적 프라이머 설계
작은 체리 바이러스 1 (Little cherry virus 1, LChV - 1)의 종 특이적 프라이머를 설계하기 위하여 우선, NCBI GenBank로부터 기 보고된 LChV - 1와 LChV -1가 속해 있는 Velarivirus 속(genus)과의 비교를 위하여, Velarivirus 속 바이러스 9종의 전체 게놈 시퀀스 정보를 다운로드 하였다. 상기 종 특이적 프라이머 설계를 위해 다운로드한 기보고 염기서열 정보를 표 5에 나타내었다.
No. Virus name Host Origin Accession no. Isolate
1 LChV-1* Prunus avium cv. Hongdeng China KR736335 Taian
2 LChV-1 Sweet cherry Spain KX192367 Ponferrada
3 LChV-1 Sweet cherry Spain KX192366 Jerte
4 APV1 Areca palm China NC027121 APV1_HN
5 CoV-1 Cordyline fruticosa USA HM588723 Kahaluu-1
6 CoV-2 Cordyline fruticosa USA JQ599282 SJ1
7 CoV-3 Cordyline fruticosa USA JQ599283 SJ1
8 CoV-4 Cordyline fruticosa USA JQ599284 SJ1
9 GLRaV-7 - Albania NC_016436 AA42
*LChV-1: Little cherry virus 1, APV1: Areca palm velarivirus 1, CoV-1: Cordyline virus 1, CoV-2: Cordyline virus 2, CoV-3: Cordyline virus 3, CoV-4: Cordyline virus 4, GLRaV-7: Grapevine leafroll -associated virus 7.
상기 표 5에 나타난 LChV -1 및 Velarivirus 속 바이러스의 전체 염기서열을 DNAMAN ver 5.0 software를 이용하여 서열 정렬을 하였다.
이후, LChV -1만을 특이적으로 검출하기 위한 프라이머를 설계하기 위하여, 상기 LChV - 1 의 보존영역(conserved domain) 및 LChV -1 와 Velarivirus 속 바이러스 간 비보존영역(non-conserved domain)에서 프라이머를 최종적으로 설계하였고, 이를 표 6에 나타내었다. 또한, 상기와 같이 설계한 LChV -1의 종 특이적 프라이머의 위치 모식도를 도 3에 나타내었다.
세트번호 프라이머 명칭 서열
(5'→3') 		위치 타겟 크기(b.p)
1 LCh1-D-F1 ATCTCTGATAAATGCACATGCT 12202-12223 CP 398
LCh1-D-R1 CCTCACTACGTGTAGTATCG 12580-12599
2 LCh1-D-F1 ATCTCTGATAAATGCACATGCT 12202-12223 507
LCh1-D-R2 AGTTCATTACTAGCTTGACTCT 12687-12708
3 LCh1-D-F1 ATCTCTGATAAATGCACATGCT 12202-12223 671
LCh1-D-R3 CTAATTTAGTTGTAGTCGATTGT 12850-12872
4 LCh1-D-F1 ATCTCTGATAAATGCACATGCT 12202-12223 945
LCh1-D-R5 TGAGCTTTATGCATCGGTGTA 13126-13146
5 LCh1-D-F2 GAAGCCTTGAAACTTCTGACA 12446-12466 427
LCh1-D-R3 CTAATTTAGTTGTAGTCGATTGT 12850-12872
6 LCh1-D-F2 GAAGCCTTGAAACTTCTGACA 12446-12466 620
LCh1-D-R4 GAACTTACATACCCAGCAGC 13046-13065
7 LCh1-D-F2 GAAGCCTTGAAACTTCTGACA 12446-12466 701
LCh1-D-R5 TGAGCTTTATGCATCGGTGTA 13126-13146
8 LCh1-D-F2 GAAGCCTTGAAACTTCTGACA 12446-12466 768
LCh1-D-R6 AGTCGTATCAGTATCAGTAGC 13193-13213
실시예 3. 체리 바이러스 3종에 대한 다중 진단용 프라이머 세트의 설계
3.1 중합효소 연쇄 반응( poymerase chain reaction, PCR ) 을 통한 프라이머의 효용성 확인
설계한 프라이머의 효용성을 확인하기 위해 우선, 상기 실시예 2에서 설계한 프라이머의 합성을 Macrogen(Seoul, Korea)에서 진행하였다. 또한, 상기 실시예 1.2 에서 합성한 cDNA 를 주형 가닥으로 하여 중합효소 연쇄 반응(poymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다.
중합효소 연쇄 반응(PCR)은 2X TOPsimple DyeMix (aliquot)-HOT (Enzynomics, Korea)를 이용하여 수행하였으며, PCR 반응을 위한 조성물로 template cDNA 2 μL 와 상기 실시예 2에서 설계한 각각의 프라이머 1 μL (10 pmol/μL), 그리고 탈이온수 16 μL 를 Prime Taq Premix(2×) 10 μL와 함께 사용하였다. PCR 반응 조건으로는, 95 ℃ 에서 10 분간 Initial denaturation 을 실시하고, 95 ℃ 에서 30 초간 Denaturation 후 55 ℃ 에서 30 초간 Annealing 및 72 ℃ 에서 1 분간 Extension 하는 반응을 35 사이클 수행하였으며, 72 ℃ 에서 5분간 Final Extension 을 실시하였다. 그 후, 증폭된 PCR 산물 10 μL를 EcoDye DNA Staining Solution (Biofact, South Korea)이 첨가된 1.0 % 아가로즈 겔에 로딩하여, 100 V에서 35 분 동안 전기영동 하였고, Bio-Rad ChemiDoc XRS+ imaging system을 이용하여 반응여부를 확인하였다.
본 발명의 이하 실시예에서 바이러스를 증폭하기 위하여 사용한 프라이머 세트를 하기 표 7에 정리하였다.
서열번호 프라이머 명칭 서열
(5'→3')
1 CVA-D-F1 CAGGAGACGAATCCAGAATTT
2 CVA-D-F2 AGTGCTCACAGCTGTTAAAAG
3 CVA-D-R3 CTAAAACCTGCTTGGCATGC
4 CVA-D-R4 TCATGTGTGGACATTGGATAAT
5 CVA-D-R5 GGGAATTGTCAACAACATTGAT
6 CVA-D-R6 CCAACATCTGCGGCAGTTG
7 LCh2-D-F1 TCGTGTATAGACCTTTGTATGA
8 LCh2-D-F2 TGATACGAGATCGAGGTTTTAA
9 LCh2-D-F3 GGAAAAACACGGTGAGAGTG
10 LCh2-D-F4 TCTAACTTGTACCCCATGCTT
11 LCh2-D-R1 AAACTTCGAGAACCGGACTC
12 LCh2-D-R2 TCTGCTGGTAAGAATTTTGAATA
13 LCh2-D-R3 TTTAACTCCAAACAAGCTCCC
14 LCh2-D-R4 TACCGGATTTGGGTACAACG
15 LCh2-D-R5 GAACTAGGAGAAACTACCACT
16 LCh1-D-F1 ATCTCTGATAAATGCACATGCT
17 LCh1-D-F2 GAAGCCTTGAAACTTCTGACA
18 LCh1-D-R1 CCTCACTACGTGTAGTATCG
19 LCh1-D-R2 AGTTCATTACTAGCTTGACTCT
20 LCh1-D-R3 CTAATTTAGTTGTAGTCGATTGT
21 LCh1-D-R4 GAACTTACATACCCAGCAGC
22 LCh1-D-R5 TGAGCTTTATGCATCGGTGTA
23 LCh1-D-R6 AGTCGTATCAGTATCAGTAGC
3.2 Monoplex - PCR 반응
설계한 프라이머가 타겟 바이러스를 진단할 수 있는지 확인하기 위해서 상기 실시예 3.1 과 같은 PCR 조건으로 Monoplex-PCR 를 실시하였고 이의 전기영동 결과는 도 4 내지 도 6에 나타내었다.
도 4는 체리 바이러스 A (CVA)의 결과이며, 도 4에서 확인한 바와 같이, 표 2의 CVA 종 특이성 프라이머 8 세트에 대해서 모두 양성반응이 나온 것을 확인할 수 있었다. 도 4에서 Lane 1 내지 8은 각각 표 2의 세트 1(CVA-D-F1/R3, 349 bp), 세트 2(CVA-D-F1/R4, 415 bp), 세트 3(CVA-D-F1/R5, 483 bp), 세트 4(CVA-D-F1/R6, 565 bp), 세트 5(CVA-D-F2/R3, 270 bp), 세트 6(CVA-D-F2/R4, 336 bp), 세트 7(CVA-D-F2/R5, 404 bp) 및 세트 8(CVA-D-F2/R6, 486 bp)의 전기영동 결과를 나타낸다.
도 5는 작은 체리 바이러스 2 (LChV - 2)의 결과이며, 도 5에서 확인한 바와 같이, 표 4의 LChV - 2 종 특이성 프라이머 8 세트에 대해서 모두 양성반응이 나온 것을 확인할 수 있었다. 도 5에서 Lane 1 내지 8은 각각 표 4의 세트 1(LCh2-D-F1/R1, 570 bp), 세트 2(LCh2-D-F1/R2, 748 bp), 세트 3(LCh2-D-F1/R3, 855 bp), 세트 4(LCh2-D-F2/R1, 252 bp), 세트 5(LCh2-D-F2/R2, 430 bp), 세트 6(LCh2-D-F2/R3, 537 bp), 세트 7(LCh2-D-F3/R4, 214 bp) 및 세트 8(LCh2-D-F4/R5, 444 bp)의 전기영동 결과를 나타낸다.
한편, 도 6은 작은 체리 바이러스 1 (LChV - 1)의 결과이며, 도 6에서 확인한 바와 같이, 표 6의 LChV - 1 종 특이성 프라이머 8 세트에 대해서 모두 양성반응이 나온 것을 확인할 수 있었다. 도 6에서 Lane 1 내지 8은 각각 표 6의 세트 1(LCh1-D-F1/R1, 398 bp), 세트 2(LCh1-D-F1/R2, 507 bp), 세트 3(LCh1-D-F1/R3, 671 bp), 세트 4(LCh1-D-F1/R5, 945 bp), 세트 5(LCh1-D-F2/R3, 427 bp), 세트 6(LCh1-D-F2/R4, 620 bp), 세트 7(LCh1-D-F2/R5, 701 bp) 및 세트 8(LCh1-D-F2/R6, 768 bp)의 전기영동 결과를 나타낸다.
3.3 Duplex- PCR 반응
설계한 프라이머를 2종 이상의 바이러스 검출을 위한 다중 진단법에 이용이 가능한지 알아보기 위해서, 상기 실시예 3.1 과 같은 PCR 조건으로, 체리 바이러스 A (CVA) 종 특이성 프라이머 세트 및 작은 체리 바이러스 2 (LChV -2) 종 특이성 프라이머 세트를 이용하여 Duplex-PCR 를 실시하였다.
또한, Duplex-PCR의 경우, 위에서 설계한 프라이머 중에서 다중 진단법으로 이용 가능한 예상산물의 크기를 고려하여, 일부를 선별하는 방식으로 반응을 수행하였다. CVA 종 특이성 프라이머의 경우 세트 1 내지 세트 8 중에서 세트 3(CVA-D-F1/R5, 483 bp), 세트 5(CVA-D-F2/R3, 270 bp), 세트 6(CVA-D-F2/R4, 336 bp) 및 세트 8(CVA-D-F2/R6, 486 bp)를 사용하였고, LChV - 2 종 특이성 프라이머는 1 내지 8 세트 전부를 사용하였다. 상기 CVA 및 LChV -2 에 대한 종 특이성 프라이머 세트의 조합을 총 22개로 구성하였으며, 각 조합을 표 8에 나타내었으며, 상기 조합으로 Duplex-PCR을 수행한 결과를 도 7에 나타내었다.
세트번호 프라이머 명칭 엠플리콘 크기(bp)
1 CVA-D-F2/CVA-D-R3 + LCh2-D-F1/LCh2-D-R1 270 + 570
2 CVA-D-F2/CVA-D-R3 + LCh2-D-F1/LCh2-D-R2 270 + 748
3 CVA-D-F2/CVA-D-R3 + LCh2-D-F1/LCh2-D-R3 270 + 855
4 CVA-D-F2/CVA-D-R3 + LCh2-D-F2/LCh2-D-R2 270 + 430
5 CVA-D-F2/CVA-D-R3 + LCh2-D-F2/LCh2-D-R3 270 + 537
6 CVA-D-F2/CVA-D-R3 + LCh2-D-F4/LCh2-D-R5 270 + 444
7 CVA-D-F2/CVA-D-R5 + LCh2-D-F1/LCh2-D-R1 404 + 570
8 CVA-D-F2/CVA-D-R5 + LCh2-D-F1/LCh2-D-R2 404 + 748
9 CVA-D-F2/CVA-D-R5 + LCh2-D-F1/LCh2-D-R3 404 + 855
10 CVA-D-F2/CVA-D-R5 + LCh2-D-F2/LCh2-D-R3 404 + 537
11 CVA-D-F2/CVA-D-R5 + LCh2-D-F3/LCh2-D-R4 404 + 214
12 CVA-D-F2/CVA-D-R5 + LCh2-D-F4/LCh2-D-R5 404 + 444
13 CVA-D-F2/CVA-D-R6 + LCh2-D-F1/LCh2-D-R1 486 + 570
14 CVA-D-F2/CVA-D-R6 + LCh2-D-F1/LCh2-D-R2 486 + 748
15 CVA-D-F2/CVA-D-R6 + LCh2-D-F1/LCh2-D-R3 486 + 855
16 CVA-D-F2/CVA-D-R6 + LCh2-D-F2/LCh2-D-R1 486 + 252
17 CVA-D-F2/CVA-D-R6 + LCh2-D-F2/LCh2-D-R3 486 + 537
18 CVA-D-F2/CVA-D-R6 + LCh2-D-F3/LCh2-D-R4 486 +214
19 CVA-D-F1/CVA-D-R5 + LCh2-D-F1/LCh2-D-R2 483 + 748
20 CVA-D-F1/CVA-D-R5 + LCh2-D-F1/LCh2-D-R3 483 + 855
21 CVA-D-F1/CVA-D-R5 + LCh2-D-F2/LCh2-D-R1 483 + 252
22 CVA-D-F1/CVA-D-R5 + LCh2-D-F3/LCh2-D-R4 483 + 214
도 7에서의 Duplex-PCR을 수행한 실험 결과를 토대로 상기 체리 바이러스 2종 이상의 바이러스 검출을 위한 다중 진단법에 이용할 수 있는 프라이머 세트의 조합을 선별하였다. 최종적으로 예상산물의 크기를 고려하여 선별된 최적의 프라이머 세트의 조합은 도 7 및 표 8에서 세트 1, 4, 5, 7, 15 및 16인 것으로 확인되었다.
3.4 Multiplex- PCR 반응
설계한 프라이머를 3종 이상의 바이러스 검출을 위한 다중 진단법에 이용이 가능한 지 알아보기 위하여, 상기 실시예 3.1 과 같은 PCR 조건으로, 상기 실시예 3.3 에서 선별한 CVA 종 특이성 프라이머 세트 및 LChV - 2 종 특이성 프라이머 세트의 조합 프라이머 세트 1, 4, 5, 7, 15 및 16과 이를 LChV - 1 종 특이성 프라이머와의 프라이머 세트의 조합을 제조하여 Multiplex-PCR 를 실시하였다. Multiplex-PCR 프라이머 세트의 조합은 총 28개로 구성하였으며 각 프라이머 세트의 조합은 표 9에 나타내었으며, 상기 프라이머 세트를 이용하여 Multiplex-PCR을 수행하였다.
세트번호 프라이머 명칭 엠플리콘 크기(bp)
1 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F1/R1 270 + 570 + 398
2 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F1/R5 270 + 570 + 945
3 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F2/R3 270 + 570 + 427
4 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F2/R5 270 + 570 + 701
5 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F2/R6 270 + 570 + 768
6 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R2 + LCh1-D-F1/R3 270 + 430 + 671
7 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R2 + LCh1-D-F1/R5 270 + 430 + 945
8 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R2 + LCh1-D-F2/R4 270 + 430 + 620
9 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R2 + LCh1-D-F2/R5 270 + 430 + 701
10 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R2 + LCh1-D-F2/R6 270 + 430 + 768
11 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R3 + LCh1-D-F1/R1 270 + 537 + 398
12 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R3 + LCh1-D-F1/R5 270 + 537 + 945
13 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R3 + LCh1-D-F2/R4 270 + 537 + 620
14 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R3 + LCh1-D-F2/R5 270 + 537 + 701
15 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R3 + LCh1-D-F2/R6 270 + 537 + 768
16 CVA-D-F2/R5 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F1/R5 404 + 570 + 945
17 CVA-D-F2/R5 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F2/R5 404 + 570 + 701
18 CVA-D-F2/R5 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F2/R6 404 + 570 + 768
19 CVA-D-F2/R6 + LCh2-D-F1/R2 + LCh1-D-F1/R5 486 + 748 + 945
20 CVA-D-F2/R6 + LCh2-D-F1/R2 + LCh1-D-F2/R4 486 + 748 + 620
21 CVA-D-F2/R6 + LCh2-D-F1/R3 + LCh1-D-F1/R3 486 + 855 + 671
22 CVA-D-F2/R6 + LCh2-D-F1/R3 + LCh1-D-F2/R4 486 + 855 + 620
23 CVA-D-F2/R6 + LCh2-D-F1/R3 + LCh1-D-F2/R5 486 + 855 + 701
24 CVA-D-F2/R6 + LCh2-D-F2/R1 + LCh1-D-F1/R3 486 + 252 + 671
25 CVA-D-F2/R6 + LCh2-D-F2/R1 + LCh1-D-F1/R5 486 + 252 + 945
26 CVA-D-F2/R6 + LCh2-D-F2/R1 + LCh1-D-F2/R4 486 + 252 + 620
27 CVA-D-F2/R6 + LCh2-D-F2/R1 + LCh1-D-F2/R5 486 + 252 + 701
28 CVA-D-F2/R6 + LCh2-D-F2/R1 + LCh1-D-F2/R6 486 + 252 + 768
상기 표 9에서 조합한 28개의 CVA , LChV -2 및 LChV -1을 검출할 수 있는 프라이머 세트의 조합 중 예상산물의 크기를 고려하고 상기 28개 프라이머 세트의 Multiplex-PCR 의 수행결과를 통하여 3종의 바이러스 모두를 최적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트의 조합 10개를 선별하였고, 상기와 같은 프라이머 세트의 조합을 표 10에 나타내었다. 표 10의 프라이머 세트를 이용하여 Multiplex-PCR을 수행하였으며, 그 실험 수행 결과를 도 8에 나타내었다.
세트번호 프라이머 명칭 엠플리콘 크기(bp)
1 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F1/R1 270 + 570 + 398
2 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F2/R3 270 + 570 + 427
3 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R2 + LCh1-D-F1/R3 270 + 430 + 671
4 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R2 + LCh1-D-F2/R4 270 + 430 + 620
5 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R2 + LCh1-D-F2/R5 270 + 430 + 701
6 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R2 + LCh1-D-F2/R6 270 + 430 + 768
7 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R3 + LCh1-D-F1/R1 270 + 537 + 398
8 CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F2/R3 + LCh1-D-F2/R6 270 + 537 + 768
9 CVA-D-F2/R5 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F2/R5 404 + 570 + 701
10 CVA-D-F2/R5 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F2/R6 270 + 570 + 768
도 8에 나타난 바와 같이, 선별한 10개의 프라이머 세트 모두 CVA , LChV -2 및 LChV -1 검출할 수 있음을 확인하였으며, Lane 2, 9, 10의 프라이머 세트의 조합에서 체리 바이러스 3종이 강하게 검출되는 것을 확인하였다. 특히, 2번 조합에서 3종의 바이러스가 고른 강도로 검출되었는바, 이와 같은 3종 바이러스에 대한 양성반응 감도를 고려하여 2번 조합 프라이머 세트(CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F2/R3)를 최종적으로 선별하여 체리 바이러스 3종의 다중진단법의 최적 반응 조건을 찾아내기 위하여 사용하였다.
실시예 4. 체리 바이러스 3종의 진단을 위한 다중 진단용 프라이머 세트의 최적 반응 조건의 확인
4.1 CVA , LChV -2 및 LChV - 1를 검출하기 위한 Multiplex- PCR 최적온도 조건의 확인
상기 실시예 3.4에서 선별한 프라이머 세트의 국내 발생 체리 바이러스 3종의 다중진단을 위한 최적의 Multiplex-PCR 온도 반응 조건을 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
실시예 3.1에서 수행한 Multiplex-PCR에서 다른 조건은 동일하게 수행하였고, PCR 기계의 gradient 기능을 이용하여 PCR 수행 중 annealing 단계에서 그 수행 온도를 55.6, 56.8, 58.2, 59.4 및 60℃로 설정하고 PCR을 수행하여, 최적의 반응 온도를 확인하였으며, 그 실험 수행 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, annealing 단계의 온도가 높아질수록, LChV-2의 검출이 어려워지는 것을 확인하였으며 다른 2종의 바이러스 역시 전기영동 수행 결과 밴드가 흐릿해져 검출이 어려워지는 것을 확인하였다. 이에, 최적의 annealing 단계의 온도는 CVA, LChV -2 및 LChV -1의 밴드가 가장 뚜렷하게 나타나는 56.8℃인 것을 확인할 수 있었다.
4.2 CVA , LChV -2 및 LChV - 1를 검출하기 위한 Multiplex- PCR 최적 프라이머 세트 농도 조건의 확인
상기 실시예 3.4에서 선별한 프라이머 세트의 조합(CVA-D-F2/R3 + LCh2-D-F1/R1 + LCh1-D-F2/R3)를 통하여 다중진단을 수행하기 위한 Multiplex-PCR의 최적 프라이머 세트 농도 조건을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. CVA, LChV -2 및 LChV -1 프라이머 세트의 농도를 달리한 5개의 조성(10+10+10 pmole, 5+10+20 pmole, 5+10+30 pmole, 10+15+20 pmole, 10+15+30 pmole)을 설정하여 Multiplex-PCR 반응을 수행하였으며, 상기 실험을 수행한 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에서 Lane 1, 2, 3, 4 및 5는 CVA, LChV -2 및 LChV -1 프라이머 세트의 조성을 각각 10+10+10 pmole, 5+10+20 pmole, 5+10+30 pmole, 10+15+20 pmole 및 10+15+30 pmole 로 설정한 군들의 전기영동 결과를 나타낸다.
도 10에 나타난 바와 같이, 프라이머 농도를 달리하여 Multiplex-PCR을 수행한 결과, CVA, LChV -2 및 LChV -1 프라이머 세트의 모든 조성에서 3개의 양성밴드가 나타나는 것을 확인하였다. 특히, Lane 2 및 3의 5+10+20 pmole 및 5+10+30 pmole의 조성에서 3종의 체리 바이러스에 관한 밴드의 강도가 균일하게 나타나는 것을 확인하였다. 다만 Lane 3 조성의 경우, 3종 바이러스의 양성밴드 이외에 PCR 이합체(dimer)가 약하게 형성되는 것을 확인하여, 최종적으로 체리 바이러스 3종을 가장 효과적으로 검출할 수 있는 최적의 프라이머 세트의 농도 조성은 Lane 2의 CVA가 5 pmole, LChV -2가 10 pmole 및 LChV-1이 20 pmole 임을 확인하였다.
실시예 5. 체리 바이러스 3종의 진단을 위한 다중 진단용 프라이머 세트의 검출한계 확인
상기 실시예 3.4를 통해 최종 선발된 프라이머 세트의 검출한계를 확인하기 위하여, 주형으로 사용된 cDNA에 대하여 10배 단계별 희석을 한 후 Monoplex-PCR 및 Multiplex-PCR을 통한 실험을 수행하였다.
5.1 Monoplex - PCR 반응
우선, 최종 선발된 프라이머 세트에 포함된 각각의 프라이머의 검출한계를 알아보기 위해 Monoplex-PCR 를 실시하였으며, 그 결과는 도 11A내지 C에 나타내었다. 도 11에서 각 Lane 1, 2, 3, 4, 5 및 6 은 각각 100배 희석, 101배 희석, 102배 희석, 103배 희석, 104배 희석 및 105배 희석을 나타낸다.
프라이머 세트의 Monoplex-PCR 에서의 검출한계를 확인한 결과, 도 11B 및 11C에서 확인한 바와 같이, LChV -2 및 LChV -1에서는 101까지는 양성반응이 뚜렷이 관찰되었고, 또한 도 11A에서 확인한 바와 같이, CVA의 경우에는 102까지 cDNA를 희석하여도 양성반응이 확인됨을 확인할 수 있었다.
5.2 Multiplex- PCR 반응
다음으로, 최종 선발된 프라이머 세트에 의해 3 종 이상의 바이러스가 샘플 시료 농도에 어느 정도까지 민감도를 나타낼 수 있는지 알아보기 위하여 검출한계를 알아보기 위한 Multiplex-PCR을 실시하였고, 그 결과는 도 10 에 나타내었다. 도 12에서 각 Lane 1, 2, 3, 4, 5 및 6은 각각 100배 희석, 101배 희석, 102배 희석, 103배 희석, 104배 희석 및 105배 희석을 나타낸다.
도 12에서 확인한 바와 같이, Multiplex-PCR 에서 프라이머 세트의 검출한계를 확인한 결과 101까지 양성반응을 나타내어, 낮은 농도의 샘플을 이용할 때에도 체리 바이러스 3종을 정확하게 검출이 가능함을 확인할 수 있었다. 따라서, 상기에서 확인한 결과를 종합하면 최종 선발된 프라이머 세트는 샘플 시료의 농도가 낮은 경우에도 Multiplex-PCR을 통하여 3종의 타겟 바이러스를 모두 101배까지 희석한 경우에도 우수한 효율로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> Korea Seed & Variety Service <120> Primer set for simultaneous detection of three viruses in Cherry plant and use thereof <130> 1-1P <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of CVA-D-F1 <400> 1 caggagacga atccagaatt t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of CVA-D-F2 <400> 2 agtgctcaca gctgttaaaa g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of CVA-D-R3 <400> 3 ctaaaacctg cttggcatgc 20 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of CVA-D-R4 <400> 4 tcatgtgtgg acattggata at 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of CVA-D-R5 <400> 5 gggaattgtc aacaacattg at 22 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of CVA-D-R6 <400> 6 ccaacatctg cggcagttg 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh2-D-F1 <400> 7 tcgtgtatag acctttgtat ga 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh2-D-F2 <400> 8 tgatacgaga tcgaggtttt aa 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh2-D-F3 <400> 9 ggaaaaacac ggtgagagtg 20 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh2-D-F4 <400> 10 tctaacttgt accccatgct t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh2-D-R1 <400> 11 aaacttcgag aaccggactc 20 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh2-D-R2 <400> 12 tctgctggta agaattttga ata 23 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh2-D-R3 <400> 13 tttaactcca aacaagctcc c 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh2-D-R4 <400> 14 taccggattt gggtacaacg 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh2-D-R5 <400> 15 gaactaggag aaactaccac t 21 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh1-D-F1 <400> 16 atctctgata aatgcacatg ct 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh1-D-F2 <400> 17 gaagccttga aacttctgac a 21 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh1-D-R1 <400> 18 cctcactacg tgtagtatcg 20 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh1-D-R2 <400> 19 agttcattac tagcttgact ct 22 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh1-D-R3 <400> 20 ctaatttagt tgtagtcgat tgt 23 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh1-D-R4 <400> 21 gaacttacat acccagcagc 20 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh1-D-R5 <400> 22 tgagctttat gcatcggtgt a 21 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence of LCh1-D-R6 <400> 23 agtcgtatca gtatcagtag c 21

Claims (12)

  1. 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 7 및 서열번호 11로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 7 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 7 및 서열번호 13으로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 8 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 8 및 서열번호 13으로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 11로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 13으로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 8 및 서열번호 13으로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 9 및 서열번호 14로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 11로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 13으로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 6, 서열번호 8 및 서열번호 11로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 12로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 7 및 서열번호 13으로 이루어진 프라이머쌍; 및 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 8 및 서열번호 11로 이루어진 프라이머쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머쌍;을 포함하는 체리 바이러스 A(Cherry virus A) 및 작은 체리 바이러스 2 (Little cherry virus 2) 다중 진단용 프라이머 세트.
  2. 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 16 및 서열번호 18로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 17 및 서열번호 20으로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 17 및 서열번호 21로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 17 및 서열번호 22로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 12, 서열번호 17, 서열번호 23으로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 13, 서열번호 16 및 서열번호 18로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 8, 서열번호 13, 서열번호 17 및 서열번호 23으로 이루어진 프라이머쌍; 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 17 및 서열번호 22로 이루어진 프라이머쌍; 및 서열번호 2, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 11, 서열번호 17 및 서열번호 23으로 이루어진 프라이머쌍;으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 프라이머쌍을 포함하는 체리 바이러스 A(Cherry virus A), 작은 체리 바이러스 2 (Little cherry virus 2) 및 작은 체리 바이러스 1 (Little cherry virus 1) 다중 진단용 프라이머 세트.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항 및 제2항 중 선택되는 어느 한 항의 다중 진단용 프라이머 세트를 포함하는, 체리 바이러스 다중 진단용 조성물.
  6. 제5항에 따른 체리 바이러스 다중 진단용 조성물을 포함하는, 체리 바이러스 다중 진단용 키트.
  7. a) 시료로부터 DNA를 얻는 단계;
    b) 제1항 및 제2항 중 선택되는 어느 한 항의 다중 진단용 프라이머 세트를 이용하여 상기 a) 단계에서 얻어진 DNA를 증폭하는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계에서 얻어진 증폭 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 체리 바이러스 다중 진단 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 체리 바이러스는 체리 바이러스 A(Cherry virus A) 및 작은 체리 바이러스 2 (Little cherry virus 2); 또는 체리 바이러스 A(Cherry virus A), 작은 체리 바이러스 2 (Little cherry virus 2) 및 작은 체리 바이러스 1 (Little cherry virus 1);인 것을 특징으로 하는, 체리 바이러스 다중 진단 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 b) 단계의 증폭은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction), 듀플렉스 중합효소연쇄반응(duplex Polymerase Chain Reaction, duplex PCR), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase Chain Reaction, multiplex PCR), 경쟁적 중합효소연쇄반응(competitive Polymerase Chain Reaction), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase Chain Reaction), 정량적 중합효소연쇄반응(Realtime Quantitative Polymerase Chain Reaction), DNA 칩(DNA chip), 등온증폭법(Loop-mediated isothermal amplification) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 체리 바이러스 다중 진단 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 c) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 체리 바이러스 다중 진단 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 b) 단계의 증폭 중 어닐링(annealing) 단계의 온도가 55.5℃ 내지 59℃인 것을 특징으로 하는, 체리 바이러스 다중 진단 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 b) 단계의 증폭은 다중 중합효소연쇄반응을 이용하며, 체리 바이러스 A : 작은 체리 바이러스 2 : 작은 체리 바이러스 1의 프라이머 세트의 농도비가 1 : 1 내지 3 : 3 내지 5인 것을 특징으로 하는, 체리 바이러스 다중 진단 방법.
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