KR20240045385A - 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 다중 진단방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 실시간 유전자증폭기를 활용하여 원예작물에 발생하는 주요 바이러스인 잠두위조바이러스(Broad Bean Wilt Virus), 사탕무황화바이러스(Beet Western Yellow Virus), 토마토덤불위축바이러스(Tomato Bushy Stunt Virus), 토마토퇴록바이러스(Tomato chlorosis Virus), 고추얼룩바이러스(Pepper Mottle Virus), 고추연한얼룩바이러스(Pepper Mild Mottle Virus), 오이모자이크바이러스(Cucumber Mosaic Virus), 토마토반점위조바이러스(Tomato Spotted Wilt Virus), 토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)를 동시에 진단할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 마커용 조성물, 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 다중 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 실시간 유전자증폭기를 활용하여 원예작물에 발생하는 주요 바이러스인 잠두위조바이러스(Broad Bean Wilt Virus), 사탕무황화바이러스(Beet Western Yellow Virus), 토마토덤불위축바이러스(Tomato Bushy Stunt Virus), 토마토퇴록바이러스(Tomato chlorosis Virus), 고추얼룩바이러스(Pepper Mottle Virus), 고추연한얼룩바이러스(Pepper Mild Mottle Virus), 오이모자이크바이러스(Cucumber Mosaic Virus), 토마토반점위조바이러스(Tomato Spotted Wilt Virus), 토마토황화잎말림바이러스(Tomato Yellow Leaf Curl Virus)를 동시에 진단할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
국내 주요 과채류 시설재배면적은, 고추, 토마토 등 10작목에 47,921㏊이며 생산량은 2,122,417톤으로 이 중 가지과 작물인 고추, 토마토, 파프리카가 차지하는 비율은 전체 재배면적의 22.2%이며, 생산량은 28.7%이다(농림통계, 2020).
가지과 작물의 강원도 재배면적 및 생산량으로는 토마토 906㏊/47,733톤, 풋고추 812㏊/26,467톤, 파프리카 258㏊/22,289톤으로 전국 재배면적과 비교해 보면 토마토는 16.4%/13.8%, 고추 18.5%/14.4%, 파프리카 35.1%/27.2%이다. 이런 가지과 작물은 대부분의 시설재배지에서 집약적인 재배를 하고 있으며, 기후변화로 인해 노지면적이 줄어들고 있는 만큼 농가의 고소득원으로 중요한 작물이다.
이러한 채소류에 발생하는 바이러스는 총 19종이고, 가장 피해를 많이 주는 바이러스로서 2008년(Kim 등, 2009) 및 2009년(Choi등, 2010)의 경우 Cucumber mosaic virus(CMV), Tomato spotted wilt virus(TSWV), Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV), Broad bean wilt virus2(BBWV2) 등 4종을 보고하였다.
2014년부터 2018년까지 강원도 가지과 작물에 발생한 바이러스 또한 Cucumber mosaic virus(CMV), Tomato spotted wilt virus(TSWV), Tomato yellow leaf curl virus(TYLCV), Broad bean wilt virus2(BBWV2)등 8종 바이러스가 보고되었다(Won 등, 2018).
이런 바이러스병은 기후변화의 영향으로 바이러스를 매개하는 매개충이 증가함에 따라 매년 높아지고 있는데 2017년부터 2022년까지 강원도에 접수된 병해 민원건수는 총 374건이며 이 중 바이러스는 52%를 차지하고 있다.
진단 바이러스 종류로는 CMV 등 24종이며, 가장 많이 진단된 바이러스로는 TSWV, CMV, BBWV, TYLCV이다. 바이러스병 발생 민원이 많은 이유는 치료제가 없기 때문이다. 따라서 바이러스병이 발생을 했을 때는 매개충 방제, 이병주 제거 등 능동적 방제가 최선인데 효과적인 능동적 방제를 위해서는 무엇보다도 포장에 발병한 바이러스가 어떤 종류의 바이러스인지 신속하게 진단하는 것이 중요하다.
현재 바이러스병이 발생했을 때 진단하는 방법으로는 간이 진단키트를 활용하거나, 통상적인 PCR 방법을 활용하고 있다. 간이 진단방법은 스트립 키트를 이용하여 바이러스 의심주에 대한 항원항체 반응으로 양성 여부를 확인하는 방법인데, 10분 이내에 확인할 수 있는 장점이 있지만, 단일 바이러스만 가능하며 진단할 수 있는 바이러스 종류 또 한 제한적이다.
특허문헌 1, 특허문헌 2 등과 같은 통상적인 PCR 방법은 여러 종류의 바이러스 진단이 가능하나 진단을 위한 바이러스 프라이머를 각각 추가를 해야 하며, PCR이 완료된 후 전기영동 과정을 통해 결과를 확인하기 때문에, 시간이 5~6시간 정도 소요되며 이로 인해 진단결과가 나오면 이미 포장에는 바이러스병 확산 되었을 우려가 있다.
따라서, 빠른 시간 내에 의심되는 바이러스를 신속하게 진단하는 것만이 병이 확산되는 것을 막을 수 있다.
본 발명의 목적은 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 가지과 작물의 바이러스 다중 진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 19의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 20의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트; 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 프로브로 이루어진 제3 프라이머 세트; 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 22의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트; 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 23의 프로브로 이루어진 제5 프라이머 세트; 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 프로브로 이루어진 제6 프라이머 세트; 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 25의 프로브로 이루어진 제7 프라이머 세트; 서열번호 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 26의 프로브로 이루어진 제8 프라이머 세트; 및 서열번호 17의 정방향 프라이머와 서열번호 18의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 프로브로 이루어진 제9 프라이머 세트를 포함하는, 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 제1 프라이머 세트는 옆맥두명병바이러스(BBWV) 진단용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 제2 프라이머 세트는 사탕무황화바이러스(BWYV) 진단용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 제3 프라이머 세트는 토마토덤불위축바이러스(TBSV) 진단용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 제4 프라이머 세트는 토마토황화바이러스 또는 토마토퇴록바이러스(ToCV) 진단용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 제5 프라이머 세트는 고추얼룩바이러스(PepMoV) 진단용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 제6 프라이머 세트는 고추연한얼룩바이러스(PMMoV) 진단용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 제7 프라이머 세트는 오이모자이크바이러스(CMV) 진단용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 제8 프라이머 세트는 토마토반점위조바이러스(TSWV) 진단용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 제9 프라이머 세트는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV) 진단용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 가지과 작물은 고추, 파프리카, 토마토, 가지, 감자 및 피망 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 상기 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 포함하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 상기 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 마커 조성물을 포함하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, (a) 바이러스가 감염된 감염 식물로부터 RNA를 추출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 추출한 RNA를 주형으로 하며, 제11항의 마커 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단게에서 얻어진 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 가지과 작물의 바이러스 다중 진단방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 (b) 단계의 증폭은 다중 정량적 중합효소연쇄반응(multiplex qRT-PCR)의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 (c) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명은 가지과 작물인 고추, 수박, 오이 등에서 일어나는 바이러스 9종에 의한 옆맥두명병 (broad bean wilt virus, BBWV), 사탕무황화바이러스 (beet western yellow virus, BWYV), 토마토덤불위축바이러스 (tomato bushy stunt virus, TBSV), 토마토황화바이러스 또는 토마토퇴록바이러스 (tomato chlorosis virus), 고추얼룩바이러스 (pepper mottle virus, PepMoV), 고추연한얼룩바이러스 (pepper mild mottle virus, PMMoV), 오이모자이크바이러스 (cucumber mosaic virus, CMV), 토마토반점위조바이러스 (tomato spotted wilt virus, TSWV), 토마토황화잎말림바이러스 (tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) 질병을 프라이머 세트 및 프로브를 이용하여 신속하게 검출할 수 있으며, 한 번의 실험으로 최대 9개에 대해서 동시 검출할 수 있는 multiplex qRT-PCR 방법으로 검출 및 진단하는데 소요되는 시간을 단축할 수 있으므로, 가지과 작물 질병 진단에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
9개의 바이러스는 3개씩 각각 3개의 세트로 이루어져 있으며, 3개의 세트는 분석자의 편리성을 위하여 실험 방법 및 실험 조건을 모두 동등하게 진행하여 분석자 임의로 바이러스 세트를 3개, 6개, 9개로 나누어 분석 가능할 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 증폭 곡선(amplification curve) 결과에서 Ct 값이 20보다 작게 나타나며, NTC에서 위양성 결과가 발생하지 않고 2회 반복 결과에서 재현성이 있어, PCR 효율이 가장 좋은 프라이머 세트를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2e는 9개의 바이러스를 검출하는 프라이머 및 프로브 세트를 디자인하기 위하여 선별된 각각의 유전자 영역을 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는 증폭곡선 결과에서 Ct값이 20보다 작게 나타나며, NTC에서 위양성 결과가 발생하지 않으며 PCR 효율이 가장 좋은 프로브를 각 바이러스 별로 1개 씩 선별한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 도 5에서 구성된 바이러스를 검출하기 위한 프라이머와 프로브를 나타낸 것으로서, 튜브별로 프라이머 6개, 프로브 3개가 포함되어 있다. 각각의 프라이머와 프로브가 서로 결합하여 비특이적인 형광을 발생시키면 안되기 때문에, 프라이머/프로브의 서열을 이용하여 모노 다이머 발생여부(동일 프라이머 끼리의 결합)/헤테로 다이머 발생여부(서로 다른 프라이머끼리의 결합)/헤어핀(한 프라이머, 프로브 서열 안에서 결합) 구조 생성 여부를 확인한 예시자료이다.
도 5는 Multiplex qPCR 진단키트를 개발하기 위해서 가지과작물 관련 바이러스 9종을 각 3종씩 나누어 #A, #B, #C tube로 구성한 것으로서, 각 튜브의 형광에 따라 검출 바이러스의 종류를 나타낸 것이다.
도 6은 증폭곡선 결과에서 Ct값이 20보다 작게 나타나며, NTC에서 위양성 결과가 발생하지 않는지 여부로 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 7 내지 도 9는 가지과 작물 바이러스 9종의 RNA를 10ng에서 100fg까지 희석하고, 증폭곡선 결과의 Ct 값을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2e는 9개의 바이러스를 검출하는 프라이머 및 프로브 세트를 디자인하기 위하여 선별된 각각의 유전자 영역을 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는 증폭곡선 결과에서 Ct값이 20보다 작게 나타나며, NTC에서 위양성 결과가 발생하지 않으며 PCR 효율이 가장 좋은 프로브를 각 바이러스 별로 1개 씩 선별한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 도 5에서 구성된 바이러스를 검출하기 위한 프라이머와 프로브를 나타낸 것으로서, 튜브별로 프라이머 6개, 프로브 3개가 포함되어 있다. 각각의 프라이머와 프로브가 서로 결합하여 비특이적인 형광을 발생시키면 안되기 때문에, 프라이머/프로브의 서열을 이용하여 모노 다이머 발생여부(동일 프라이머 끼리의 결합)/헤테로 다이머 발생여부(서로 다른 프라이머끼리의 결합)/헤어핀(한 프라이머, 프로브 서열 안에서 결합) 구조 생성 여부를 확인한 예시자료이다.
도 5는 Multiplex qPCR 진단키트를 개발하기 위해서 가지과작물 관련 바이러스 9종을 각 3종씩 나누어 #A, #B, #C tube로 구성한 것으로서, 각 튜브의 형광에 따라 검출 바이러스의 종류를 나타낸 것이다.
도 6은 증폭곡선 결과에서 Ct값이 20보다 작게 나타나며, NTC에서 위양성 결과가 발생하지 않는지 여부로 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 7 내지 도 9는 가지과 작물 바이러스 9종의 RNA를 10ng에서 100fg까지 희석하고, 증폭곡선 결과의 Ct 값을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 제1 구현예는 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 19의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트; 서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 20의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트; 서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 프로브로 이루어진 제3 프라이머 세트; 서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 22의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트; 서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 23의 프로브로 이루어진 제5 프라이머 세트; 서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 프로브로 이루어진 제6 프라이머 세트; 서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 25의 프로브로 이루어진 제7 프라이머 세트; 서열번호 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 26의 프로브로 이루어진 제8 프라이머 세트; 및 서열번호 17의 정방향 프라이머와 서열번호 18의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 프로브로 이루어진 제9 프라이머 세트를 포함하는, 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상 보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효 소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3 회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 용도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이 상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다.
또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출 될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법 (1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
상기 제1 프라이머 세트는 옆맥두명병바이러스(BBWV) 진단용, 상기 제2 프라이머 세트는 사탕무황화바이러스(BWYV) 진단용, 상기 제3 프라이머 세트는 토마토덤불위축바이러스(TBSV) 진단용, 상기 제4 프라이머 세트는 토마토황화바이러스 또는 토마토퇴록바이러스(ToCV) 진단용, 상기 제5 프라이머 세트는 고추얼룩바이러스(PepMoV) 진단용, 상기 제6 프라이머 세트는 고추연한얼룩바이러스(PMMoV) 진단용, 상기 제7 프라이머 세트는 오이모자이크바이러스(CMV) 진단용, 상기 제8 프라이머 세트는 토마토반점위조바이러스(TSWV) 진단용, 또한 상기 제9 프라이머 세트는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV) 진단용일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 가지과 작물은 고추, 파프리카, 토마토, 가지, 감자 및 피망 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제2 구현예는 상기 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 포함하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 마커 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 반응 증폭 혼합물을 더 포함할 수 있으며, 반응 증폭 혼합물은 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 중합 효소, 데옥시뉴클레오티드, 뉴클레아제가 없는 멸균수 및 2가 금속 양이온을 함유하 는 용액 등을 지칭하며, 바람직하게는 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드, DNA 중합효소를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제3 구현예는 상기 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 포함하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 상술한 가지과 작물 바이러스 다중 진단용 마커 조성물 이외에도 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용 되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소 (polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제 (sequenase) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태일 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다.
상기 키트의 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 상기 키트는 외부 패키지를 포함할 수 있으며, 외부 패키지는 구성 요소들 의 사용에 관한 사용설명서를 포함할 수 있다.
본 발명의 제4 구현예는 (a) 바이러스가 감염된 감염 식물로부터 RNA를 추출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 추출한 RNA를 주형으로 하며, 제11항의 마커 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단게에서 얻어진 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 가지과 작물의 바이러스 다중 진단방법을 제공한다.
상기 (b) 단계의 증폭은 다중 정량적 중합효소연쇄반응(multiplex qRT-PCR)의 방법을 이용하는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (c) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 가지과 작물 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 이용한 가지과 작물 바이러스 다중 진단방법에 따르면, 가지과 작물 내 상이한 종류의 작물에서 관찰되는 바이러스를 조기에 다중으로 진단할 수 있는 장점이 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시 예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위는 이들 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 가지과 작물 바이러스 9종의 RNA 염기서열 확보
가지과 작물을 기주로 하는 바이러스 검출 키트 개발을 위해 해당 바이러스의 염기서열을 획득하였다. 고시안에서 제안하는 프라이머 세트의 염기서열을 NCBI nucleotide BLAST tool을 이용하여 목적 유전자(target gene)의 염기서열을 확인하였다.
확보한 염기서열을 NCBI nucleotide BLAST tool을 이용하여 옆맥두명병 (broad bean wilt virus, BBWV) 100개 스트레인, 사탕무황화바이러스 (beet western yellow virus, BWYV) 24개 스트레인, 토마토덤불위축바이러스 (tomato bushy stunt virus, TBSV) 62개 스트레인, 토마토황화바이러스 또는 토마토퇴록바이러스 (tomato chlorosis virus) 57개 스트레인, 고추얼룩바이러스 (pepper mottle virus, PepMoV) 49개 스트레인, 고추연한얼룩바이러스 (pepper mild mottle virus, PMMoV) 100개 스트레인, 오이모자이크바이러스 (cucumber mosaic virus, CMV) 100개 스트레인, 토마토반점위조바이러스 (tomato spotted wilt virus, TSWV) 100개 스트레인, 토마토황하잎말림바이러스 (tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) 100개 스트레인을 각각 확보하였다.
9개의 바이러스를 검출하는 프라이머 및 프로브 세트를 디자인하기 위하여 각각의 유전자 영역을 선별하였다. BBWV (NCBI accession No:MH447988) 폴리 단백질 유전자(서열번호 28), BWYV (NCBI accession No: AF473561.1) ORF (Open reading frame) 유전자(서열번호 29), CMV (NCBI accession No: LC528236.1) 코팅 단백질 유전자(서열번호 30), PepMoV (NCBI accession No: KX446795.1) 코팅 단백질 유전자(서열번호 31), PMMoV (NCBI accession No: MN057681.1) 코팅 단백질 유전자(서열번호 32), TBSV (NCBI accession No:GQ206144.1) RNA 폴리머라제 유전자(서열번호 33), ToCV (NCBI accession No:EU625350.1) RNA2 단백질 유전자(서열번호 34), TSWV (NCBI accession No: AJ418781.1) 뉴클레오캡시드 단백질 유전자(서열번호 35), YLCV (NCBI accession No: MN966555.1) V1 단백질 유전자(서열번호 36) 영역을 선별하였다 (도 2).
<제조예 2> 가지과 작물 바이러스 9종의 합성 유전자 확보
가지과 작물 바이러스 9종의 RNA를 확보하기 위해 각 바이러스의 유전자 영역을 DNA로 합성하였다. 합성된 DNA에서 RNA로 전사를 진행하기 위해 유전자 영역 앞에 T7 프로코터를 삽입하여 플라스미드 DNA로 합성을 진행하였다.
합성 완료된 플라스미드 DNA를 이용하여 Megascript™ T7 Transcription Ki t(Invitrogen)를 이용하여 RNA로 합성하여 사용하였다. 합성된 플라스미드 DNA 및 RNA는 Qubit Flex Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) 장비를 이용하여 DNA 및 RNA 농도를 정량한 뒤 사용하였다.
<제조예 3> 가지과 작물 바이러스 9종의 프라이머 및 프로브 세트 디자인
각 각의 바이러스의 프라이머 세트를 디자인하기 위해 Primer3 프로그램을 이용하여 100-200bp의 PCR 산물이 형성되도록 디자인하였으며, 디자인 조건에서 GC 함량은 20~70%, 길이는 17~30bp, 융해온도(Tm)은 55~65℃이었다.
프로브를 디자인하기 위해 eurofins genomics의 qPCR Primer & Probe Design Tool을 참고하였으며, 프라이머 세트가 디자인된 영역 안에서 프로브의 뉴클레오티드 올리고 길이는 25~32bp, 융해온도(Tm) 65~69℃, GC 비율은 40~70%를 기준을 달성하도록 디자인하였다.
하기 표 1 및 표 2에서 디자인된 프라이머 세트 및 프로브 목록을 정리하였다.
| 가지과 작물 바이러스 검출 프라이머 세트 후보 | ||
| No. | 이름 | 서열 |
| 1 | BBWV2 F_1 | ATTYAGYYGTTCTTGGCYTGYG |
| 2 | BBWV2 R_1 | GCCRTCTCRTTGGCATGGR |
| 3 | BBWV2 F_2 | GGCTTGTGTGGCTTCGGAAAG |
| 4 | BBWV2 R_2 | CAGYAYGATGCAAATGGCCGTGG |
| 5 | BBWV2 F_3 | AAAACAAACAGCTTTCGTTCCGA |
| 6 | BBWV2 R_3 | GCCATCTCATTGGCATGGA |
| 7 | BWYV F_1 | CGCCAACGTCACCGTTTG |
| 8 | BWYV F_2 | GCCTCATTACATTCCTCAGGCG |
| 9 | BWYV R_1 | GCTCAGCATCGGCACACC |
| 10 | CMV F_1 | CCGTAAAGTTCCTGCCTCATCGG |
| 11 | CMV R_1 | CATGAAGTACCAATTCGTCCGTCTCG |
| 12 | CMV F_2 | CTACCGTGTGGGTGACAGTC |
| 13 | CMV R_2 | CGGCGTACTTTCTCATGTCGC |
| 14 | CMV F_3 | GGGTGACAGTCCGTAAAGTTCC |
| 15 | CMV R_3 | GATGTAGGAATGCGTTGGTGC |
| 16 | PepMoV F_1 | GTCACATCGCGTACGTCAACAC |
| 17 | PepMoV R_1 | GGCTCACATCTACAGTGGTGTG |
| 18 | PMMoV F_1 | CCTACAACTGCCGAGACGCTTG |
| 19 | PMMoV R_1 | GTTGTAGCCCAGGTGAGTCCACTC |
| 20 | PMMoV F_2 | GGGTTTGAATAAGGAAGGGAAGC |
| 21 | PMMoV R_2 | GTGTACTTCGGCGTTAGGCAATC |
| 22 | PMMoV F_3 | CTGCCGAGACGCTTGATG |
| 23 | PMMoV R_3 | GAGTCCACTCGCGCTCTCG |
| 24 | TBSV F_1 | CAGGAGGTGCTAGAGGTTCG |
| 25 | TBSV R_1 | GGCTACCCCAACCTTCTCAC |
| 26 | ToCV F_1 | GACGGCATTTTGGAACTGTCG |
| 27 | ToCV R_1 | CGACGGAGTGTTGAACATGG |
| 28 | TSWV F_1 | CATCTCAAAGCTATCAACTGAAGC |
| 29 | TSWV R_1 | CAGGGTCAGGCTTGTAGAGG |
| 30 | TSWV F_2 | GCCAAGACAACACTGATCATCTC |
| 31 | TSWV R_2 | AGGCTTGTAGAGGAAACTGGG |
| 32 | tylcv F_1 | GTAAGGGCCCGTGACTATGTCG |
| 33 | tylcv F_2 | CTATGTCGAAGCGACCAGGC |
| 34 | tylcv R_1 | GCTTCCGGTACATGGGCCTG |
| 35 | tylcv R_2 | GCCTTCACATCCACGAGGAAC |
| 36 | tylcv R_3 | CGTCAGGGCTTCGATACATTCTG |
| 가지과 작물 바이러스 검출 프로브 후보 | ||
| No. | 이름 | 서열 |
| 1 | BBWV2 LNA probe | FAM-CCCGGAAAAAGGGAGYGYGAYYAAAAGCG-BHQ1 |
| 2 | BBWV2 LNA probe | FAM-AGGGAGTGTGATTAAAAGCGCACCA-BHQ1 |
| 3 | BBWV2 set5_TaqMan probe | FAM-CCRGARCAYGCYTTRGCRGCWAGYGGRAA-BHQ1 |
| 4 | BBWV2 NTP1 MGB | FAM-CAGCTTTCAGTTACTAAACAGCTTTCGTTC-BHQ1 |
| 5 | BWYV TaqMan probe | HEX-GACTGCCCCCCACCCAAGACGTTGCAG-BHQ1 |
| 6 | BWYV NTP MGB | HEX-CCACCCAAGACGTTGCAGGA-BHQ1 |
| 7 | CMV TaqMan probe_1 | FAM-CCGCCATCTCTGCTATGTTCGCGGACGGAG-BHQ1 |
| 8 | CMV TaqMan probe_2 | FAM-CGTCGTGGTTCCCGCTCCGCTTCC-BHQ1 |
| 9 | PepMoV LNA probe | HEX-CGAAGCCCATATCCAAATGAAAGCGGCGGC-BHQ1 |
| 10 | PepMoV TaqMan probe | HEX-CCCATATCCAAATGAAAGCGGCGGCATTG-BHQ1 |
| 11 | PepMoV TaqMan probe_2 | HEX-CGAGGCGGGTAGATGATGCGACGGTGGC-BHQ1 |
| 12 | PMMoV LNA probe_1 | Texas Red-CGAAGCCCATATCCAAATGAAAGCAGCAGCC-BHQ1 |
| 13 | PMMoV TaqMan probe_2 | Texas Red-GGCAGAACTCGGAGTCATCGGACGCCG-BHQ1 |
| 14 | PMMoV TaqMan probe_3 | Texas Red-CGAGGCGGGTAGATGATGCGACGGTGGC-BHQ1 |
| 15 | TBSV TaqMan probe | Texas Red-GGTTGCAGGTTGCCCATCACAGGCACGG-BHQ1 |
| 16 | ToCV TaqMan probe | FAM-CCACTGGCAAGTCGTGGGTCCTTCCGAAC-BHQ1 |
| 17 | TSWV TaqMan probe | HEX-CCTCCCAGCATTATGGCAAGCCTCACAGAC-BHQ1 |
| 18 | tylcv TaqMan probe | Texas Red-CGCCCGTCTCGAAGGTTCGCCGAAGGC-BHQ1 |
| 19 | tylcv TaqMan probe_2 | Texas Red-CCACGCCCGTCTCGAAGGTTCGCCG-BHQ1 |
<실시예 1> 가지과 작물 바이러스 9종의 검출을 위한 최적의 프라이머 세트 및 프로브 확인
1. 가지과 작물 바이러스 9종의 검출 프라이머 선별
프라이머 선별을 위하여 합성된 플라스미드 DNA(positive control)를 107 copies/㎕로 희석하여 사용하였다. 프라이머 선별을 위하여 실시간 PCR을 수행하였으며, 수행 조건 및 방법은 아래와 같다.
| PCR 프로토콜 | |||
| 단계 | 온도 | 시간 | 씨이클 |
| 프리 변성 | 95℃ | 10 min | 1 |
| 변성 | 95℃ | 5 sec | 40 |
| 어닐링 & 합성 | 58℃ | 30 sec** | |
※ 어닐링(Annealing) & 합성(extension) 과정에서 SyBr green 형광 측정
실시간 PCR을 수행하기 위해 정방향 프라이머 10pmole 1㎕, 역방향 프라이머 1pomole 1㎕, SyBr Green (Biofact) 1㎕, EzAmp™ HS One-Step RT-qPCR 2X Master Mix (Elpis biotech) 10㎕, DW 6㎕, DNA (>1ng) 1㎕로 총 볼륨 20㎕의 PCR조성물을 만들어 실험을 진행하였다.
실시간 PCR 조성에 사용되는 프라이머는 바이러스 9개에 총 38개 프라이머에 대한 선별과정을 진행하였으며, 증폭 곡선(amplification curve) 결과에서 Ct 값이 20보다 작게 나타나며, NTC에서 위양성 결과가 발생하지 않고 2회 반복 결과에서 재현성이 있어, PCR 효율이 가장 좋은 프라이머 세트를 각 바이러습 별로 1쌍씩 선별하였다 (도 1a 및 도 1b).
도 1a 및 도 1b와 같이 최종 선별된 프라이머 목록은 하기 표 4와 같다.
| 가지과 작물 바이러스 검출 프라이머 세트 최종 선별 목록 | ||
| 서열번호 | 이름 | 서열 |
| 1 | BBWV2_F3 | AAAACAAACAGCTTTCGTTCCGA |
| 2 | BBWV2 R_3 | GCCATCTCATTGGCATGGA |
| 3 | BWYV F_2 | GCCTCATTACATTCCTCAGGCG |
| 4 | BWYV R_1 | GGTGTGCCGATGCTGAGC |
| 5 | TBSV F_1 | CAGGAGGTGCTAGAGGTTCG |
| 6 | TBSV R_1 | GTGAGAAGGTTGGGGTAGCC |
| 7 | ToCV F_1 | GCGTCGGTGGTAATGCTCTGTTC |
| 8 | ToCV R_1 | GTCAATGCGTTTACGGTCCGGA |
| 9 | PepMoV F_1 | GTCACATCGCGTACGTCAACAC |
| 10 | PepMoV R_1 | CACACCACTGTAGATGTGAGCC |
| 11 | PMMoV F_3 | CTGCCGAGACGCTTGATG |
| 12 | PMMoV R_3 | CGAGAGCGCGAGTGGACTC |
| 13 | CMV F_1 | CCGTAAAGTTCCTGCCTCATCGG |
| 14 | CMV R_3 | GCACCAACGCATTCCTACATC |
| 15 | TSWV F_2 | GCCAAGACAACACTGATCATCTC |
| 16 | TSWV R_2 | CCCAGTTTCCTCTACAAGCCT |
| 17 | TYLCV_F1 | GTAAGGGCCCGTGACTATGTCG |
| 18 | TYLCV_R2 | GTTCCTCGTGGATGTGAAGGC |
1-2. 가지과 작물 바이러스 9종의 검출 프로브 선별
real time PCR을 통해 유효성을 확인한 원자재를 이용하여 프로브를 선별하기 위해 ssRNA를 1ng/ul로 희석하여 주형 템플레이트로 RT-qPCR을 진행하였다. 뉴클레오타이드 프로브 선별을 위해서 qRT-PCR을 수행하였으며 수행 조건 및 방법은 하기 표 5와 같다.
| PCR 프로코콜 | |||
| 단계 | 온도 | 시간 | 싸이클 |
| 역전사 | 50℃ | 30 min | 1 |
| 프리 변성 | 95℃ | 10 min | 1 |
| 변성 | 95℃ | 5 sec | 40 |
| 어닐링 & 합성 | 58℃ | 30 sec** | |
※ 어닐링(annealing) & 합성(extension) 과정에서 형광(FAM, HEX, Texas Red) 측정
qRT-PCR을 수행하기 위해 정방향 프라이머 10 pmole 1㎕, 역방향 프라이머 10 pmole 1㎕, 프로브 10 pmole 1㎕, EzAmp™ HS One-Step RT-qPCR 2X Master Mix (Elpis biotech) 10㎕, DW 6㎕, RNA (1ng) 1㎕ 로 총 볼륨 20㎕의 PCR 조성물을 만들어 실험을 진행하였다.
qRT-PCR 조성에 사용되는 프라이머는 “1-1. 프라이머 선별”에서 최종 선별된 9쌍의 프라이머를 사용하였으며, 후보로 디자인된 총 19개의 뉴클레오타이드 프로브를 각각 적용하여 검출결과를 확인하였다.
실험 결과에서는 증폭곡선 결과에서 Ct값이 20보다 작게 나타나며, NTC에서 위양성 결과가 발생하지 않으며 PCR 효율이 가장 좋은 프로브를 각 바이러스 별로 1개 씩 선별하였으며, 최종 프로브 리스트는 하기 표 6과 같으며 선별 결과는 도 3a 및 도 3b와 같다.
| 서열번호 | 이름 | 서열 |
| 19 | BBWV2 NTP1 MGB | FAM-CAGCTTTCAGTTACTAAACAGCTTTCGTTC-BHQ1 |
| 20 | BWYV NTP MGB | HEX-CCACCCAAGACGTTGCAGGA-BHQ1 |
| 21 | TBSV TaqMan probe | Texas Red-GGTTGCAGGTTGCCCATCACAGGCACGG-BHQ1 |
| 22 | ToCV TaqMan probe | FAM-CCACTGGCAAGTCGTGGGTCCTTCCGAAC-BHQ1 |
| 23 | PepMoV TaqMan probe_2 | HEX-CGAGGCGGGTAGATGATGCGACGGTGGC-BHQ1 |
| 24 | PMMoV TaqMan probe_3 | Texas Red-CGAGGCGGGTAGATGATGCGACGGTGGC-BHQ1 |
| 25 | CMV TaqMan probe_1 | FAM-CCGCCATCTCTGCTATGTTCGCGGACGGAG-BHQ1 |
| 26 | TSWV TaqMan probe | HEX-CCTCCCAGCATTATGGCAAGCCTCACAGAC-BHQ1 |
| 27 | TYLCV TaqMan probe_2 | Texas Red-CCACGCCCGTCTCGAAGGTTCGCCG-BHQ1 |
<실시예 2> 가지과 작물 바이러스 9종 Multiplex qRT-PCR 조건 확립
선별된 프라이머 쌍 및 프로브를 이용하여 3개의 multiplex qRT-PCR 진단법을 확립하기 위해 3개의 바이러스 그룹별로 multiplex qRT-PCR 실험을 수행하였다.
multiplex를 진행하기 위한 바이러스 그룹화를 위하여 in silico 분석을 진행하였다. 선별된 프라이머 및 프로브가 multiplex가 진행될 때의 PCR 억제 가능성을 판단하기 위해 프라이머의 셀프-다이머, 헤어핀(hairpin) 가능성, 헤테로-다이머 현상을 예측하였으며, 타겟 특이적 반응을 위하여 타겟 외 염기서열에서의 PCR 가능성을 검토한 후 multiplex로 #A, #B, #C 그룹을 선정하였다 (도 4, 5).
선별된 프라이머 세트와 프로브를 이용하여 multiplex qRT-PCR 진단법으로 각 바이러스의 검출 성능을 확인하기 위해 ssRNA를 1ng/㎕로 희석하여 주형 템플레이트로 RT-qPCR을 진행하였으며, 수행 방법 및 조성은 하기 표 7 내지 표 9와 같다.
수행 방법은 상기 표 6과 동일하게 진행하였으며, multiplex 조성을 위하여 한 세트당 프라이머 3쌍 프로브 3개를 이용한 multiplex qRT-PCR조성을 제작하였다 (하기 표 7 내지 표 9).
#A 튜브의 multiplex qRT-PCR 검출법을 위하여, BBWV2_F3 10 pmole 1㎕, BBWV2 R_3 10 pmole 1㎕, BWYV F_2 10 pmole 1㎕, BWYV R_1 10 pmole 1㎕, TBSV F_1 10 pmole 1㎕, TBSV R_1 10 pmole 1㎕, BBWV2 NTP1 MGB 10 pmole 1㎕, BWYV NTP MGB 10 pmole 0.5㎕, TBSV TaqMan probe 10 pmole 1㎕, EzAmp™ HS One-Step RT-qPCR 2X Master Mix 2X 10㎕, DW 0.5㎕, RNA 1ng 1㎕으로 총 볼륜 20㎕의 PCR 조성물을 만들어 실험을 진행하였다.
#B 튜브의 multiplex qRT-PCR 검출법을 위하여, ToCVF_1 10 pmole 1㎕, ToCV R_1 10 pmole 1㎕, PepMoVF_1 10 pmole 1㎕, PepMoV R_1 10 pmole 1㎕, PMMoV F_3 10 pmole 1㎕, PMMoVR_3 10 pmole 1㎕, ToCVTaqMan probe 10 pmole 0.5㎕, PepMoVTaqMan probe_2 10 pmole 1㎕, PMMoVTaqMan probe_3 10 pmole 0.5㎕, EzAmp™ HS One-Step RT-qPCR 2X Master Mix 2X 10㎕, DW 1㎕, RNA 1ng 1㎕으로 총 볼륜 20㎕의 PCR 조성물을 만들어 실험을 진행하였다.
#C 튜브의 multiplex qRT-PCR 검출법을 위하여, CMV F_1 10 pmole 1㎕, CMV R_3 10 pmole 1㎕, TSWV F_2 10 pmole 1㎕, TSWV R_2 10 pmole 1㎕, TYLCV_F1 10 pmole 1㎕, TYLCV_R2 10 pmole 1㎕, CMV TaqMan probe_1 10 pmole 0.5㎕, TSWV TaqMan probe 10 pmole 1㎕, TYLCV TaqMan probe_2 10 pmole 0.5㎕, EzAmp™ HS One-Step RT-qPCR 2X Master Mix 2X 10㎕, DW 1㎕, RNA 1ng 1㎕으로 총 볼륜 20㎕의 PCR 조성물을 만들어 실험을 진행하였다.
qRT-PCR 조성에 사용되는 프라이머는 “1-1. 프라이머 선별”에서 최종 선별된 9쌍의 프라이머를 사용하였으며 후보로 디자인된 총 9개의 뉴클레오타이드 프로브를 각각 적용하여 검출결과를 확인하였다.
실험 결과에서는 증폭곡선 결과에서 Ct값이 20보다 작게 나타나며, NTC에서 위양성 결과가 발생하지 않는지 여부로 검출 결과를 판단하였으며, 결과는 도 6과 같다.
<실시예 3> 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브의 민감도 분석
본 발명의 프라이머 세트 및 프로브 진단 민감도를 조사하기 위해, 가지과 작물 바이러스 9종의 RNA를 10ng에서 100fg까지 희석하고, 증폭곡선 결과의 Ct 값을 분석한 결과, 본 발명의 프라이머 세트 및 프로브가 바이러스 9종의 합성 RNA 1fg에서 10fg까지 진단이 가능함을 확인하였다 (도 7 내지 도 9).
가지과 작물 바이러스 9종을 한 번의 실험으로 한꺼번에 스크리닝이 가능하며, 검출 결과가 매우 우수한 것임을 알 수 있었다. 본 발명은 기존의 단순 스크리닝 보다 시간적/경제적 측면을 절감시켜 바이러스 9종의 구별 및 진단할 수 있는 장점이 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
Claims (16)
- 서열번호 1의 정방향 프라이머와 서열번호 2의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 19의 프로브로 이루어진 제1 프라이머 세트;
서열번호 3의 정방향 프라이머와 서열번호 4의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 20의 프로브로 이루어진 제2 프라이머 세트;
서열번호 5의 정방향 프라이머와 서열번호 6의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 21의 프로브로 이루어진 제3 프라이머 세트;
서열번호 7의 정방향 프라이머와 서열번호 8의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 22의 프로브로 이루어진 제4 프라이머 세트;
서열번호 9의 정방향 프라이머와 서열번호 10의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 23의 프로브로 이루어진 제5 프라이머 세트;
서열번호 11의 정방향 프라이머와 서열번호 12의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 24의 프로브로 이루어진 제6 프라이머 세트;
서열번호 13의 정방향 프라이머와 서열번호 14의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 25의 프로브로 이루어진 제7 프라이머 세트;
서열번호 15의 정방향 프라이머와 서열번호 16의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 26의 프로브로 이루어진 제8 프라이머 세트; 및
서열번호 17의 정방향 프라이머와 서열번호 18의 역방향 프라이머 쌍 및 서열번호 27의 프로브로 이루어진 제9 프라이머 세트를 포함하는, 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 프라이머 세트는 옆맥두명병바이러스(BBWV) 진단용인 것을 특징으로 하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 프라이머 세트는 사탕무황화바이러스(BWYV) 진단용인 것을 특징으로 하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 제3 프라이머 세트는 토마토덤불위축바이러스(TBSV) 진단용인 것을 특징으로 하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 제4 프라이머 세트는 토마토황화바이러스 또는 토마토퇴록바이러스(ToCV) 진단용인 것을 특징으로 하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 제5 프라이머 세트는 고추얼룩바이러스(PepMoV) 진단용인 것을 특징으로 하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 제6 프라이머 세트는 고추연한얼룩바이러스(PMMoV) 진단용인 것을 특징으로 하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 제7 프라이머 세트는 오이모자이크바이러스(CMV) 진단용인 것을 특징으로 하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 제8 프라이머 세트는 토마토반점위조바이러스(TSWV) 진단용인 것을 특징으로 하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 제9 프라이머 세트는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV) 진단용인 것을 특징으로 하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서, 상기 가지과 작물은 고추, 파프리카, 토마토, 가지, 감자 및 피망 중에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 포함하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 마커 조성물.
- 제11항에 따른 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 마커 조성물을 포함하는 가지과 작물의 바이러스 다중 진단용 키트.
- (a) 바이러스가 감염된 감염 식물로부터 RNA를 추출하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 추출한 RNA를 주형으로 하며, 제11항의 마커 조성물을 이용하여 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단게에서 얻어진 증폭산물을 검출하는 단계를 포함하는, 가지과 작물의 바이러스 다중 진단방법.
- 제14항에 있어서, 상기 (b) 단계의 증폭은 다중 정량적 중합효소연쇄반응(multiplex qRT-PCR)의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 가지과 작물의 바이러스 다중 진단방법.
- 제14항에 있어서, 상기 (c) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정, 인광 측정 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는, 가지과 작물의 바이러스 다중 진단방법.
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